Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Регенерация костной ткани при заживлении механических и огнестрельных переломов

Г ^ л т

» I и ил

1 а МАР 19^3

На правах рукописи

ГОЛОЛОБОВ

Валерий Григорьевич

РЕГЕНЕРАЦИЯ КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ЗАЖИВЛЕНИИ МЕХАНИЧЕСКИХ И ОГНЕСТРЕЛЬНЫХ ПЕРЕЛОМОВ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена на кафедре гистологии и эмбриологии Военно-медицинской академии и

Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор Р.К.Данилов

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Э.И.Валькович доктор медицинских наук, профессор А.А.Пузырев доктор медицинских наук, профессор В.М.Шаповалов

Ведущая организация: Научно-исследовательский центр

биологических структур НПО "ВИЛАР"

. ——* ^

Защита диссертации состоится " " —""" 1996 г. в часов на заседании диссертационного Совета Д 106.03.07 Военно-медицинской академии (адрес: 194175, Санкт-Петербург, ул.Лебедева, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Военно-медицинской академии.

М ,'П

Автореферат разослан " <——" 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор медицинских наук, доцент

В.С.Сидорин

Актуальность проблемы. Проблема реактивности и регенерации тканей и органов, разработка вопросов оптимизирующего воздействия на процессы заживления ран - актуальная проблема современной гистологии и медицины. В настоящее время, кроме важного теоретического, она приобретает особое прикладное значение в сфере медицины катастроф, военной медицины, локальных вооруженных конфликтов, в условиях резко возросшего травматика тканей и органов опорно-двигательного аппарата человека, а также для накопления опыта медицинского обеспечения подобных экстремальных ситуаций (Чиж И.М. и соавт., 1993).

Известно, что среди боевых огнестрельных повреждений опорно-двигательного аппарата, переломы трубчатых костей верхних и нижних конечностей у раненых достигают около 50%. Масштабы и характер разрушения костной ткани при поражающих свойствах современного огнестрельного оружия, особенности ее регенерации в этих условиях обусловливают необходимость проведения гистологического исследования с учетом теоретических и клинико-морфологических аспектов этого процесса.

Целостный анализ остеогистогенеза после механических и огнестрельных повреждений представляется перспективным с позиций общих закономерностей гистогенеза (Максимов A.A., 1926; Заварзин A.A., 1947; Хлопин Н.Г., 1946; Румянцев A.B., 1958) и гистогенетической концепции регенерации тканей (Клишов A.A., 1984). Большой вклад в разработку клинических аспектов проблемы огнестрельных переломов внесли ученые Военно-медицинской академии (Гирголав С.С., 1956; Беркутов А.Н., 1978; Ткаченко С.С., 1981; 1992; Цедушкин B.C. и соавт., 1990; 1992), существенное значение имеют научные труды, в которых дана патологоанатоми-ческая характеристика боевой травмы кости (Давыдовский И.В., 1952; Смольян-ников A.A., 1952). Однако по этой проблеме отсутствуют систематические исследования с общегистологическим анализом регенерации костной ткани, других тканей в составе регенерата при огнестрельных переломах.

Трактовка данных по регенерационному остеогистогенезу связана с ключевыми вопросами происхождения остеогенных клеток, их пролиферации, дифференцировки и специфической функции. В связи с вопросами об источниках регенерации следует отметить исследования, способствующие идентификации стволовых стромальных и остеогенных клеток в костном мозге (Фридечштейн А.Я. и соавт., 1986; Михайлова Л.Н., 1988; Ashton В.А. et а!., 1984). При большом объеме фактических данных по заживлению механических переломов кости имеются противоречивые мнения ученых по поводу обозначений и гистологической природы тканей, образующихся в зоне дефекта, а также допускается возможность метаплазии одних тканей в другие в этом процессе.

Актуальными для развития остеогистологми являются исследования межклеточного вещества. Архитектоника межклеточного вещества костной ткани человека, его строение в связи с возрастом, нагрузкой, взаимоотношение с костными клетками показаны с использованием современных методов анализа (Денисов-Никольский Ю.И., Докторов A.A., 1987; 1991). Назрела необходимость целенаправленного изуче-

ния формирования межклеточного вещества костной ткани после огнестрельного перелома, так как при этом виде травмы образуются крупные дефекты кости.

Особую актуальность приобретает оценка полученных результатов по остеогистогенезу с учетом теоретических положений о гистогенетических рядах, или дифферонах, внутритканевых взаимоотношениях клеток в ходе их дифференциации (Зазарзин A.A., 1938; Хрущов Н.Г., 1976; Клишов A.A. и соавт., 1981; Катикас Г.С., 1985), использование которых способствует вскрытию клеточных механизмов заживления костных переломов, ультраструктурных основ клеточно-дифферонной организации регенерационного гистогенеза. Способность тканей к регенерации обоснованно выделяется в качестве основного критерия оценки жизнеспособности поврежденных тканей (Данилов Р.К., 1993).

Исключительно важными для теоретической и практической медицины являются данные о морфологии костеообразования после механических переломов, полученные на материале от человека (Саркисов Д.С. и соавт., 1984; 1985). Наблюдений гистологов, касающихся пролиферации остеобластов, регенерационного остеогистогенеза при огнестрельных переломах длинных трубчатых костей у раненых, в литературе не имеется. Комплексная разработка вопросов данной проблемы позволит составить целостное представление о закономерных процессах посттравматической регенерации костной ткани, представит теоретические обоснования для клиницистов при внедрении новых лечебных мероприятий по восстановлению морфофункциональных свойств кости как органа человека.

Цель и задачи исследования - выявить закономерные процессы регенерации костной ткани в условиях заживления механических и огнестрельных переломов длинных трубчатых костей в экспериментальных и клинических условиях, а также возможности оптимизации регенерационного остеогистогенеза.

Для выполнения указанной цели поставлены задачи:

1. Изучить клеточно-дифферонную организацию и закономерности регенерационного остеогистогенеза при механическом переломе трубчатой кости.

2. Провести изучение регенерации костной ткани при механических переломах на фоне применения препаратов тафцин (низкомолекулярный тетра-пептид) и ЭБФ-5 (производное бензимидазола).

3. Дать комплексную ультраструктурную, радиоавтсграфическую и морфо-метрическую характеристику клеточного и тканевого состава регенерата при заживлении огнестрельного перелома трубчатой кости.

4. Изучить динамику показателей поляризационно-оптических свойств, количества суммарных белков и минеральных компонентов в межклеточном веществе новообразованной костной ткани, костных отломков и осколках при огнестрельной травме.

5. Исследовать регенерацию костной ткани при огнестрельном переломе на фоне применения препарата даларгин (синтетический аналог энкефалинов).

6. Характеризовать реактивные изменения и проявления регенерации костной ткани после огнестрельного повреждения трубчатых костей у человека.

Научная новизна. Впервые в рамках одного исследования проведена целостная морфофункциональная характеристика регенерации костной ткани после механического и огнестрельного переломов длинных трубчатых костей с позиций концепции клеточно-дифферонной организации тканей и регенерационного гистогенеза. С помощью современных методических подходов (электронная микроскопия, радиоавтография, количественная гистохимия, сканирующая поляризационная микроскопия, морфометрия, дихроматическая рентгеновская абсорбциометрия) выявлены закономерности регенерационного остеогистогенеза, формирования тканевого регенерата в условиях заживления переломов, вызванных механической и огнестрельной травмой. Представлены данные по ультраструктурным основам клеточно-дифферонной организации посттравматического гистогенеза при заживлении переломов после действия указанных повреждающих факторов.

Получены новые данные о пролиферативных свойствах детерминированных тканевых элементов - фибробластов, остеобластов, хрящевых клеток, а также пери-васкулярных клеток.

В работе дано систематизированное общегистологическое описание регенерации костной ткани после огнестрельного перелома. Предстазлена динамика формирования цито- и гистоархитектоники тканевого регенерата, количественных показателей оптической плотности суммарных белков, оптической анизотропии и минерализации межклеточного вещества костных отломков, осколков и костного регенерата, а также его ремоделяции. Дана количественная характеристика элементов различных диффероноо в тканевом регенерате, выявлены корреляционные связи, позволяющие судить о взаимодействии клеток разных гистогенетических типов, их дифференцировке и степени междифферонной гетероморфии.

При восстановлении костной ткани после огнестрельной травмы выявлен ре-генерационный эндоссальный остеогенез, вскрыт его механизм, показаны значение для обновления поврежденных костных пластинок в отломках и осколках и возможность формирования новой генерации остеонов. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что для адаптивной фазы регенерационного остеогистогенеза характерно уменьшение внутридифферонной и междифферонной гетероморфии.

Показано, что сепаративный хондро- и десмогенеэ имеют важное значение для заживления огнестрельного перелома и рассматриваются как регенерационные гистогенетические рекапитуляции.

Впервые проведена комплексная гистологическая характеристика биопсий-ного материала, полученного в условиях клиники от людей с огнестрельными переломами длинных трубчатых костей. Исследование биоптатоа, полученных от раненых, и материала от экспериментальных животных с огнестрельной травмой позволило убедиться в том, что основные закономерности регенерации костной ткани сходны по своим базисным признакам.

Впервые установлено, что при огнестрельном переломе в костных осколках, обеспеченных трофикой и реваскуяяризацией, сохранившие жизнеспособность остеогенные элементы надкостницы, эндоста, гаверсовых и фолькмановских каналов способны к пролиферации, дифференцировке и формированию

грубоволокнистой костной ткани, являясь дополнительным и существенным источником образования костного регенерата. Осколки также рассматриваются как посттразматический костный аутотрансллантат, частично заполняющий дефект в зоне перелома, и как своеобразная посттравматическая органная культура in vivo, которая за счет гистотипического роста обеспечивает соединение осколков друг с другом, с отломками и различными тканями регенерата.

Выявлено оптимизирующее действие на остеогенез примененных препаратов. ЭБФ-5 оказывал действие на процессы, проявляющиеся в дифференцировке клеток. Тафцин способствовал межклеточным внутри- и междифферонным взаимодействиям. Даларгин влиял на адаптационные реакции, вероятно, через нейро-эндокринный ответ организма на огнестрельную травму.

Практическое значение работы. В результате проведенного исследования подтверждена важность гистогенетичэского и экспериментально-гистологического подходов в разработке учения о тканях.

Полученные данные по ультраструктурным основам клеточно-дифферонной организации постгравматического гистогенеза, количественные показатели клеточного и тканевого состава регенерата, оценка гистохимических и поляризационных свойств регенерирующей костной ткани способствуют гистологическому определению фазы и прогнозированию исхода регенерации, а также адекватному выбору средств для оптимизации этого процесса.

Результаты исследования жизнеспособности остеогенных клеток в костных осколках, образовавшихся при огнестрельном переломе, их пролиферации, диффе-ренцировки и специализированной функции показали, что остеобласты костных фрагментов являются дополнительным источником продукции грубоволокнистой костной ткани, которая входит в состав общего костного регенерата. Резорбирую-щиеся осколки проявляют свойства деминерализованного костного матрикса, индуцирующего регенерационный остеогистогенез.

На основании обобщения данных экспериментов, гистологического анализа биопсийного материала, полученного от раненых с огнестрельными переломами, наблюдений клиницистов создана оригинальная программа хирургической обработки огнестрельной костной раны. В процессе медицинской реабилитации раненых с огнестрельными переломами длинных трубчатых костей достигнуто увеличение частоты сращения переломов на 28.2%, полного анатомо-функционального восстановления поврежденных сегментов у пострадавших на 39.4%, снижение показателей огнестрельного остеомиелита на 14.6%.

Результаты работы целесообразно учитывать в преподавании разделов гистологии костных тканей, органов опорно-двигательного аппарата в соответствующи) курсах учебных заведений медицинского и биологического профилей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В регенерационном остеогистогенезе основным клеточным дифферонол является остеобластический, включающий такие элементы с остеогенной детерми нацией как преостеобласты, различной степени дифференцировки остеобласты i остеоциты.

В условиях заживления костного перелома периваскулярные клетки, сопровождающие растущие кровеносные сосуды и обладающие высокой пролифератив-ной активностью, реализуют свои цитогенетические потенции путем дивергентной дифференцировки, давая начало фибробластическому, остеобластическому и хондробластическому клеточным дифферонам. Последние формируют волокнистую соединительную, костную и гиалиновую хрящевую ткани в составе регенерата.

2. Восстановление костной ткани сопровождается репаративным десмогене-зом и хондрогенезом, а также энхондральным остеогистогенезом, выраженность этих процессов связана с характером и тяжестью травмы. Регенерационный остеогистогенез при тяжелых травмах и обширных дефектах, примером которых является огнестрельный перелом кости, проходит в условиях, не способствующих полной реализации потенций элементов остеобластического дифферона и дефицита последних.

В заживлении костной раны участвуют волокнистая соединительная и хрящевая ткани, являющиеся эволюционно более древними, чем костная. С филогенетических позиций репаративный хондро- и десмогенез при заживлении костного перелома оцениваются как регенерационные гистогенетические рекапитуляции.

3. Сохранившие жизнеспособность остеогенные клетки костных осколков не утрачивают способность к синтезу ДНК, делению, дифференцировке и специализации. Продуцируемая остеобластами осколков грубоволокнистая костная ткань является составной частью костного регенерата. Осколки инкорпорированы в тканевый регенерат, проявляют при этом свойства аутотрансплантата или органной культуры пссттравматического происхождения. Резорбирующиеся и подвергающиеся деминерализации осколки рассматриваются как костный матрикс, индуцирующий остеогистогенез. Регенерационный эндоссальнкй сстеогенез обеспечивает в осколках и отломках замещение поврежденных остеонов новыми гаверсовыми системами.

4. Динамика пролиферативной активности тканевых клеточных элементов, степень выраженности внутридифферснной и междифферонной клеточкой гетеро-морфии, количественные показатели тканевого спектра регенерата, характеристика межклеточного вещества новообразованной костной ткани, отломкоа и осколков по содержанию суммарных белков, минеральных компонентов, поляризационным свойствам позволяют объективно диагностировать фазу и состояние регенераторного процесса, прогнозировать его исход, обоснованно проводить выбор средств для его оптимизации.

5. Использованные в работе препараты ЭБФ-5, тафцин и даларгин оказали оптимизирующее влияние на заживление костных переломов, их действие существенно не сказалось на скорости этого процесса. Применение тафцина способствовало преобладанию в регенерате костной ткани; использование ЭБФ-5 отразилось на морфофункциональном состоянии клеток хондробластического дифферона и объеме в регенерате хрящевой ткани; даларгин способствовал адаптационно-компенсаторным реахциям, проявляющимся в регуляции кровоснабжения зоны перелома, что создавало благоприятные условия для регенерэционного остео-гистогенеза.

6. Гистологические и ультраструкгурные основы формирования регенерата после огнестрельных переломов трубчатых костей у человека согласуются с общими закономерными процессами регенерации костной ткани, выявленными в эксперименте с огнестрельной травмой. Полученные результаты по гистологии заживления огнестрельных переломов длинных трубчатых костей в эксперименте, роли осколков в регенерационном сстеогистогенезе явились теоретическим обоснованием разработки сберегательной методики хирургической обработки костных ран и новых лечебных мероприятий при оказании помощи раненым.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научной конференции ВМедА (Л., 1985); на научных совещаниях по фундаментальным и прикладным проблемам гистологии, проведенных в ВМедА совместно со Всесоюзным, Всероссийским и Ленинградским научными обществами АГЭ (Л., 1986; 1S87; 1990; СПб., 1992; 1993; 1995); конференции морфологов "Эпителий и соединительная ткань в нормальных, экспериментальных и патологических условиях" (Тюмень, 1988); I республиканской конференции "Управление морфогенезом тканей и органов в процессе адаптации" (Иркутск, 1989); Всесоюзной научной конференции "Огнестрельная рана и раневая инфекция" (Л., 1991); научно-практической конференции "Специализированная медицинская помощь при боевой патологии" (М., 1991); Всероссийских конференциях "Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования клеток, тканей и органов человека и животных" (Саратов, 1993; Волгоград, 1995); Российской научной конференции "Антигипоксан-ты и актопротекторы" (СПб., 1994); II Всероссийском съезде АГЭ (М., 1988); XI съезде АГЭ РФ (Тюмень, 1994); Международном симпозиуме "Проблемы саноген-ного и патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма" (Чолпон-Ата, 1993); 6 съезде травматологов-ортопедов СНГ (Ярославль,

1993); Санкт-Петербургском научном обществе травматологов-ортопедов (1991;

1994); хирургическом обществе Пирогова (СПб., 1992); диссертация в цепом апробирована на совместном заседании кафедры гистологии и эмбриологии с кафедрами нормальной анатомии, патологической анатомии, военной травматологии и ортопедии и НИЛ-12 Военно-медицинской академии в 1995 году.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, получены удостоверения на 2 рационализаторских предложения, зарегистрирована заявка на изобретение (патент РФ N 94027755 от 20.07.94 г.).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4-х глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, представлена в одном томе объемом 332 страницы (текст диссертации -182 стр.).

Работа иллюстрирована 104 рисунками, которые включают 105 микрофотографий, 72 электронные микрофотографии, 25 графиков и 1 схему. Список литературы содержит 411 источников, из них 230 работ отечественных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Для изучения клеточно-дифферонной организации и ультраструктурных основ регенерационного остеогистогенеза в условиях заживления механического перелома поставлен опыт на 156 белых беспородных крысах исходной массой 160180 г. Животным под эфирным наркозом наносился стандартный закрытый перелом средней части диафиза бедренной кости. Животные были разделены на серии: контрольная серия; крысам I серии вводился подкожно препарат тафцин в дозе 10 мкг/кг массы; II серию составили животные, которым вводился подкожно препарат ЭБФ-5 в дозе 0.7 мг/кг массы. Препараты вводились крысам сразу после нанесения повреждения, ежедневно в течение 14 суток. Сроки наблюдения составили 1-7,9,14, 21,25,30,45 и 60 суток от момента нанесения травмы.

Изучение регенерации костной ткани при заживлении огнестрельного перелома проведено в эксперименте на 78 беспородных собаках массой от 10 до 15 кг. Животных вводили в наркоз внутримышечным введением растворов калипсовета (10 мг/кг) и рометара (5 мг/кг). По достижении достаточной глубины наркоза заднюю конечность готовили к опыту и накладывали аппарат внешней фиксации на основе стержней на голень. В специальном помещении на стенде наносили каждому животному огнестрельный перелом средней трети диафиза большеберцовой кости из пистолета свинцовой пулей калибра 5.6 мм с зарядом пороха, соответствующему патрону малокалиберной винтовки. Моделировалось огнестрельное повреждение устойчивыми высокоскоростными ранящими снарядами с учетом повреждающих факторов выстрела и механизма их действия (Попов В.Л., Дыскин Е.А., 1994). Раны дренировали и накладывали асептическую повязку на одни сутки. Собакам однократно вводили бициллин-5 в дозе 1.5 млн.ЕД.

Животные были разделены на две серии: I - контрольная; II - собакам внутримышечно вводили даларгин из расчета 20 мкг/кг (ВФС 42-1820-88) один раз в сутки в течение 10 дней. Сроки наблюдения составили 3,6,10,15,30,45,60,90,120 и 180 суток от начала опыта.

Крысы и собаки содержались в условиях вивария. Выведение животных из экспериментов осуществляли: крыс - передозировкой эфирного наркоза; ссбак -передозировкой тиопентала натрия в соответствии с требованиями приказа МЗМП РФ N 754.

Содействие в постановке опытсз с огнестрельными переломами, получении биопсийного материала от раненых, внедрении результатов гистологического исследования в разработку лечебных мероприятий оказано сотрудниками кафедры военной травматологии и ортопедии ВМедА: кандидатом медицинских наук, доцентом А.А.Артемьевым, кандидатом медицинских наук, преподавателем А.К.Дулаевым в процессе совместной творческой работы.

Взятие биопсийного материала у раненых (осколки, участки отломков, тканевого регенерата) производилось в условиях операционной в процессе проводимых

по показаниям хирургической обработки огнестрельного перелома, ревизии кост-но-мышечной раны, проточно-промывного дренирования области перелома, операции по удалению пули. Биоптаты взяты от 9. раненых. Материал по локализации перелома и срокам от момента травмы взят из костных ран: большеберцовых костей - через 1,3,4,5,23,24 суток; бедренных костей - через 1,5,14 суток; лучевой и локтевой костей - через 2-е суток

В работе использованы:

Гистологические светомикроскопические методы. Бедренные кости крыс фиксировали в 12% растворе нейтрального формалина, жидкостях Буэна, Карнуа, декальцинацию проводили в 5% растворе трихлоруксусной кислоты, используя приспособление и модификацию (удостоверения на рационализаторские предложения N 1038/1 1986 г. и N 1349/1 -1988 г., ВМедА). Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Маллори и по ван-Гизону.

Поврежденные кости собак фиксировали в 12% растворе нейтрального формалина, декальцинировали в жидкости Эбнера. Обеспечивали обработку материала с максимальным прижизненным сохранением гистотопографических отношений между отломками, многочисленными осколками, тканями регенерата, сосудами и параоссальными тканевыми структурами (Гололобов В.Г. и соавт., 1995). Парафиновые и целлоидиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, гематоксилином по Вейгерту, бисмарк коричневым пикроиндигокармином по Румянцеву и Овчарову, по Маллори. Биоптаты от раненых подвергали сходной обработке.

Радиоавтографический метод. С целью количественного исследования Интенсивности пролиферативных процессов крысам вводили внутрибрюшинно 3Н-ти-мидин (3Н-Т - удельная радиоактивность 240 тБк/моль) из расчета 40 тБк/г массы тела животного за час до взятия материала, который затем фиксировали в жидкости Карнуа. На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли индекс меченых ядер (ИМЯ), митотический индекс (МИ) периваскулоцитов, остеобластов, фибробластов, хрящевых клеток (при просмотре 1000-3000 клеток з препаратах от животных всех серий по механическим переломам на 6-е, 14-е и 21-е сутки опыта).

Для изучения пролиферации остеобластов при огнестрельной травме у собак под наркозом брали биопсийный материал из костной раны в виде участков отломков, интермедиарного регенерата, осколков. Биоптаты помещали в среду 199 с 3Н-Т (концентрация 5 мкКи/мл, время инкубации в среде 90-120 мин при 37"С), после чего фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина или в 2.5% растворе глутарового альдегида. ИМЯ 3Н-Т остеобластов, соотношение остеобластов и остеоцитов на препаратах определяли при регистрации 3000 костных клеток регенерата. Подобная методика применялась для выявления ДНК-синтезирующих клеток в биоптатах, взятых у раненых.

Методы количественной гистохимии. Проводили гистохимическое выявление суммарных белков с помощью 0.03% раствора амидочерного 10 Б (Брумберг В А, Певзнер Л.З., 1972) в составе межклеточного вещества проксимального и дис-тального костных отломков, осколков и костного регенерата у собак. В регенерате исследовались зоны, топографически связанные с отломками (периостальная, энд-

остальная, интермёдиарная). Выдерживали стандартные условия окраски препаратов и измерений. Цитофотометрический анализ оптической плотности суммарных белков осуществляли плаг-методом при длине волны 500 нм, диаметре зонда равном 14 мкм, при об.40 и ок.10 микроскопа на 15-е, 30-е, 60-е и 120-е сутки обеих серий эксперимента по огнестрельным переломам.

Поляризационная микроскопия. Использован метод сканирующей поляризационной микроскопии в монохроматическом свете зондом диаметром 14 мкм для исследования архитектоники пучков коллагеновых волокон межклеточного вещества проксимального, дистального костных отломков и интермедиарного костного регенерата. Интенсивность света (оптическая анизотропия) учитывалась в качестве функции угла поворота столика поляризационного микроскопа (ПОЛАМ-Р112), что регистрировалось цитоспектрофотометром-флюориметром. Костные регенераты исследовали на препаратах с соответствующими отломками при трех углах поворота: первый угол был равен углу максимального свечения волокон соответствующего отломка, два других угла выбирали по максимуму оптической анизотропии волокон в двух точках в пределах регенерата (Гололобов В.Г., Данилов Р.К., 1995). По средним величинам производили трехмерную компьютерную реконструкцию показателей оптической анизотропии костной ткани. Исследован материал I серии опыта на 15-е, 30-е, 60-е и 120-е сутки после огнестрельного повреждения кости.

Электронно-микроскопический метод. Материал, полученный в экспериментах и клинике, фиксировали в 2.5% растворе глутарового альдегида, дофиксировали в 1% растворе тетраоксида осмия, контрастировали 3% уранилацетатом на 70° спирте, заливали в смесь эпон-аралдит. Для дополнительного изучения регенерата и выбора участка для прицельной заточки блоков готовили серийные полутонкие срезы, которые окрашивали 1% раствором толуидинового синего, импрегняровали 0.5% раствором протаргола по Бодиану. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-5, контрастировали в 2.5% растворе уранилацетата и в 0.3% растворе цитрата свинца. Просмотр и фотосъемку ультратокких срезов проводили в электронном микроскопе IEM-100 СХ.

Дихроматическая рентгеновская абсорбциометрия. Метод использовался для количественной оценки уровня минеральных компонентов в межклеточном веществе костной ткани отломков и регенерата при огнестрельном переломе. Исследование выполнено на установке Gologic модели QDR-1000/w, снабженной сканирующим модулем с высокой разрешающей способностью, позволяющей определить содержание минералов в кости с ошибкой не более 2-3% (Kelly T.L. et al., 1989). Работа проведена в лаборатории костной ткани Института медико-биологических проблем МЗМП РФ (заведующий - доктор медицинских наук В.С.Оганов) совместно с кандидатом медицинских наук, преподавателем кафедры военной травматологии и ортопедии академии В.И.Вовченко. Костно-мышечные препараты конечностей 16 животных I серии поочередно располагали между коллиматором прибора диаметром 0.23 мм и источником излучения с характеристиками: 140/70 кВ; 2.0 мА; 1.708 с. Исследование проводили в трех зонах: участок проксимального отломка; зона огнестрельного перелома; участок дистапьного отломка. Изучали

также симметричный участок неповрежденной конечности. Сканирование осуществляли с шагом 1.003 мм и расстоянием между точками 0.965 мм. Определяли среднюю величину плотности минеральных веществ костной ткани на единицу площади (г/см2). Метод применен при изучении препаратов конечностей, взятых от животных через 15,30,60,90 и 120 суток после повреждения. Данные получены с помощью компьютерной адаптированной программы (IBMP BONE PROGRAM).

Морфометрическ/е и статистические методы. На препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, с использованием окулярной морфометрической сетки (Автандилов Г.Г., 1990), проведен подсчет среднего количества клеточных элементов (макрофаги, фибробласпы, фиброциты, эндотелиоциты сосудов, остеобласты, остеоциты, остеокласты, хрлщезыз клетки) различных дифферонов на стандартной единице площади перилстапы-.ой, интермедиарной и эндостальной зон регенерата на 15-е, 30-е, 60-е и 120-е сутки обеих серий по огнестрельным переломам. Для определения зависимости е изменении количества одного типа клеток в тканевом регенерате ог численности других использовался метод корреляционного анализа. Корреляционный анализ прозс.двн также при оценке связей между ИМЯ пери-васкулярных клеток, остеобластов, фибробластов и хрящевых клеток на соответствующие сроки контрольной серии, опыта по механическим переломам. Анализировались показатели, обладающие значимыми (Р<0.05) корреляционными связями.

Для оценки тканевого состава регенерата на гистологических препаратах применяли метод (Модяез В.П., Аносов А.П., 1982) с использованием морфометрической окулярной сетки, что позволило количественно отразить динамику соотношения удельного объема {%) косиной, хрящевой и волокнистой соединительной тканей в регенерате. Метод пркыэ^ялеч при анализе материала, взятого от животных всех серий экспериментов - при нанесении крысам механических (сроки - 6,14,30 и 60 суток), собакам огнестрелы-ых (сроки - 15,30,60 и 120 суток) переломов.

Полученный цифровой материал обрабатывался статистическими методами с вычислением среднего значения показателей, стандартного отклонения, ошибки средней арифметической. Зка-ммссть различий величин оценивали по t-критерию Стьюдента при Р<0.05. Вое этапы обработки препаратов и измерений вели в соответствии с рекомендациями (Кптинас Г.С., 1978) и принципами количественных методов исследования функциональной активности клеток и тканей (Данилоз Р.К., Сперанский И.И., 1983). Обработка метрических данных, графическое представление результатов произведен с применением IBM-совместимых персональных компьютеров типа AT 466 и программного обеспечения Fox Graph Three D Graphics.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Клеточно-дифферснная организация остесгистогенеза при механическом переломе бедренной кости у крыс.

В иитактной кости в надкостнице, эндосте, в каналах остеонов, в костных пластинках, в костном мозга сосредоточены элементы остеобластического клеточного дифферона, являющегося одним из основных дифферонов костной

ткани. Периваскулярные клетки, сопровождающие кровеносные сосуды надкостницы и остеонсв. имеют ультраструктуру, характерную для малодифференцированных клеток. Представителями другого клеточного дифферона являются остеокласты, принимающие участие в резорбции межклеточного вещества. Междифферонные взаимодействия лежат в основе строения, функции и обновления костной ткани.

В условиях поставленного эксперимента при закрытом переломе бедренной кости в области середины диафиза происходит нарушение ее целссгности, приводящее к разрыву надкостницы, перелому костных пластинок, разрыву экдоста, сосудов и нервов, проходящих в остеонах, костном мозге, травме тканей костного мезга.

Через сутки после повреждения в межотломковой зоне перелома преобладают подвергающиеся деструкции различные клеточные и тканевые элементы. У края костных отломков обнаруживаются пустые костные полости или остеоциты с признаками пикноза, обозначается зона посттравматического некроза. На 4-е сутки в перинекротической области надкостницы отмечаются меченные 3Н-Т остеобласты, что характерно для пролиферативной фазы регенерации. Максимальных значений пролиферация остеобластов достигает на 6-е сутки (рис.1)

Необходимо подчеркнуть, что значительная часть пролиферирующих клеток обнаруживает тесную связь со стенкой разрастающихся кровеносных сосудов. Периваскулярные клетки отличаются усиленным синтезом ДНК, для них на этот срок характерен наиболее высокий среди исследованных клеток ИМЯ - 27.7±3.9%,

з

Рис.1. Изменение индекса меченных Н-Т ядер клеточных элементов регенерата при

заживлении механического перелома кости. По оси X - время от момента повреждения (сут); К - контроль, 1,2 - номера других серий опыта. По оси 7.\ ПВК - периваскулярные клетки; Фбл - фибробласты; Обл -остеобласты; Хр.кп. - хрящевые клетки. По оси У - ИМЯ (%).

В области дефекта на 5-6-е сутки интенсивно разрастается реактивно измененная рыхлая соединительная ткань. ИМЯ и МИ фибробластов достигают высокого уровня -18.4±3.0% и 3.1±0.5%о соответственно.

При исследовании ультраструктуры клеток фибробластического дифферона при формировании соединительной ткани в межотломковой области определяются фибробласты различного уровня дифференцировки и специализации. На ранних стадиях формирования регенерата (2-е сутки) обнаруживаются и преобладают малодифференцированные фибробласты. Их ультраструктурная организация характерна для синтеза белка не для внешней секреции, а для размножения клеток (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981), а также для аутопластических внутриклеточных процессов. С позиций клеточно-дифферонной организации тканей они могут быть обозначены как унипотентные предшественники фибробластов - префибробласты. При дальнейшем цитогенезе префибробласты дифференцируются в молодые фибробласты, которые способны к активной пролиферации и миграции в область дефекта кости. По мере развертывания регенерационного гистогенеза в области бывшего дефекта кости в соединительнотканной части регенерата на 7-е сутки опыта преобладают зрелые, активно синтезирующие межклеточное вещество элементы фибробластического дифферона. В процессе созревания волокнистой соединительной ткани снижается активность синтеза и секреции межклеточного вещества зрелыми фибробластами, они дифференцируются в терминальные элементы фибробластического дифферона - фиброциты. Последние являются малоактивными клетками; утрачивают способность к делению, в них постепенно редуцируются гранулярная эндоплазматическая сеть, митохондрии и другие органеллы.

Со стороны надкостницы на 7-е сутки в перинекротической области происходило дальнейшее формирование перекладин грубоволокнистой костной ткани, которая постепенно связывала отломки между собой. В это же время в межотломковой области развертывался интермедиарный остеогистогенез, осуществляемый детерминированными остеогенными клетками, сохранившими жизнеспособность в каналах остеонов отломков.

Через две недели после начала эксперимента, кроме периостальной осси-фикации и развертывания регенерационного остеогистогенеза в интермедиарной зоне, отмечается развитие балок грубоволокнистой костной ткани со стороны эндоста, в котором также обнаруживаются пролиферирующие остеогенные элементы. К этому сроку поврежденные при переломе кости пластинки остеонов подвергаются резорбции остеокластами, в каналах сохранившихся остеонов отмечается пролиферация периваскулярных клеток, элементов остеобластического дифферона. Следует отметить, что ИМЯ и МИ периваскулярных клеток остаются наиболее высокими среди показателей пролиферации фибробластов и хрящевых клеток, но и остеобласты, наряду с активней выработкой межклеточного вещества, все еще сохраняют весьма выраженную пролиферативную активность (ИМЯ - 10.7±2.1%). Приваскулоциты и клетки, расположенные в ближайшем окружении сосудов, по-прежнему выделяются усиленным синтезом ДНК и являются основным источником пролиферации клеток в зоне формирования посггравматического регенерата.

Остеогенные клетки гаверсовых каналов, прилегающих к краям отломков, принимают участие в образовании костной ткани, развивающейся между кортикальными слоями отломхов в области бывшего дефекта кости. Таким образом, за счет специфической функции клеток остеобласгического дифферона, содержащихся в периосте, эндосте, в каналах остеонов, определенная часть дефекта заполняется грубоволокнистой костной тканью. В межклеточном веществе балок определяются дифференцирующиеся остеоциты, оно начинает постепенно подвергаться минерализации.При ультраструктурном анализе регенерации костной ткани отмечается, что среди остеобластов, покрывающих костные перекладины и вырабатывающих компоненты межклеточного вещества, кроме преобладающих молодых элементов, функционируют остеобласты другой степени дифференцировки - зрелые остеобласты.

На 21-е сутки эксперимента ИМЯ периваскулоцитов снижается по сравнению с предыдущим сроком более чем в 2 раза (Р<0.05), митозы не обнаруживаются. На этом фоне происходит также достоверное уменьшение количества ДНК-синтези-рующих остеобластов и фибробластов, но не в столь выраженной степени (см. рис.1). Хрящевые клетки продолжают делиться и включать ^Н-Т.

При корреляционном анализе с оценкой парных связей между индексами меченых ядер изученных клеток регенерата на различные сроки заживления перелома обнаружена различная степень связей. На 6-е сутки опыта устанавливается значимая (Р<0.05) сильная связь между ИМЯ периваскулярных клеток и фибробластов. Умеренной значимой связью (Р<0.05) обладают ИМЯ периваскулоцитов и остеобластов, выявляется слабая связь между подобным показателем фибробластов и остеобластов. Через 14 суток эксперимента обнаруживаются новые корреляционные связи: значимая (Р<0.05) сильная - между периваскулярными клетками и хрящевыми; слабые - между остеобластами и хрящевыми клетками, а также фибробластами и хрящевыми клетками. Между ИМЯ периваскулоцитов и остеобластов достоверно отмечается вместо умеренной положительной умеренная отрицательная связь, между ИМЯ фибробластов и остеобластов вместо слабой - умеренная. На 21-е сутки опыта в первую очередь необходимо отметить следующие изменившиеся связи. Устанавливаются отрицательные значимые (Р<0.05) сильные связи: между ИМЯ периваскулярных клеток и фибробластов (вместо положительной сильной), между ИМЯ периваскулоцитов и остеобластов (вместо отрицательной умеренной) и между подобным показателем периваскулярных и хрящевых клеток (вместо положительной сильной). Между ИМЯ остеобластов и хрящевых клеток определяется умеренная связь вместо слабой,между этим показателем пролиферации фибробластов и хрящевых клеток - отрицательная слабая вместо положительной слабой. Сохранилась умеренная связь между ИМЯ остеобластов и фибробластов.

Тщательное изучение гистологических препаратов, электронных микрофотографий, изготовленных на основе серийных срезов, исследование пролиферации клеток регенерата и корреляционный анализ этого показателя, динамика ДНК-синтезирующих клеток в процессе регенерации, пространственные взаимоотношения между разными типами клеток и их дифференцировка дают основания считать периваскулярные клетки полипотентными, способными к дивергентной дифферен-

цировке с образованием остеобластическсго, фибробластического и хондробласти-ческого клеточных дифферонов. Периваскулоциты представляют собой, наиболее вероятно, коммитированные потомки стволовых механоцитов, что не противоречит данным по их исследованию (Ashton В.А. et al., 1984; Maniatopoulos С., et al., 1988).

На 25-е сутки опыта в области надкостницы образован значительный по величине массив из грубоволокнистой костной ткани, тесно связанный с периосталь-ной поверхностью компактного вещества отломков. Эндостальные разрастания новообразованных костных перекладин также способствуют скреплению костных отломков. Срединная область бывшего перелома также занята преимущественно новообразованной костной тканью в виде интермедиарных костных балок, которые представлены более зрелой костной тканью.Часть остеобластов, усиленно выделяющих в межклеточные промежутки накопленный при активном синтезе органический материал, объем которого увеличивается и за счет подобной деятельности близлежащих костеобразующих клеток, замуровываются в органический матрикс на разную глубину, разобщаются друг от друга, постепенно дифференцируясь в остеоциты.

По мере дальнейшей дифференцировки терминальные элементы остеобла-стического дифферона - зрелые остеоциты имеют резко редуцированные белок-син-тезирующий аппарат, комплекс Гольджи и другие органеллы, но являются жизнеспособными клетками,обеспечивающими в некоторой степени синтетические процессы, а также транспортные, трофические и гомеостатические процессы в костной ткани.

Необходимо учесть, что посттравматический гистогенез регенерата усложняется тем, что среди волокнистой соединительной и грубоволокнистой костной тканей, заполняющих место бывшего перелома и связывающих между собой отломки, появляются участки гиалиновой хрящевой ткани. Осноаную массу клеточных элементов развивающейся гиалиновой хрящевой ткани в составе сложного регенерата образуют хондроциты разной степени дифференцировки. Следует отметить, что точно и последовательно идентифицировать элементы хондробластического дифферона весьма затруднительно, и справедливо мнение о том, что наиболее перспективным определением градаций зрелости хрящевых клеток являются показатели продукции сульфатированных протеогликанов, коллагена II типа, способность к синтезу ДНК и др. (Павлова В.Н. и соавт., 1988; Kosher R.A., 1983; Caplan A.I., 1984; Sin Y.M., 1984).

Таким образом, на определенном этапе репаративного гистогенеза (14, 25 суток и далее) в бывшем дефекте кости формируется сложный по тканевому составу регенерат, включающий мозаично расположенные участки, разные по занимаемой площади, состоящие из грубоволокнистой костной, гиалиновой хрящевой и волокнистой соединительной тканей, которые иногда сочетаются даже в пределах одного поля зрения светового микроскопа. Тем не менее, участки гиалиновой хрящевой ткани отграничены от соединительнотканных и костных структур. Взаимного превращения хрящевых, фибробластических и костных клеток, метаплазии соединительной, хрящевой и костной тканей в процессе регенерационного гистогенеза не наблюдалось.

Новообразованная грубоволокнистая костная ткань регенерата, которая на 14-е, 25-е сутки и последующие сроки опыта занимает большую часть межотлом-ковой зоны бывшего дефекта, начинает подвергаться перестройке с участием остеокластов. Отмечается формирование структур, сходных по архитектонике с остеона-ми. Пластинчатые структуры первичных остеонов вокруг сосудоа образуются за счет специфической деятельности клеток остеобластического дифферона.

По мере формирования гаверсовых систем происходит дальнейшее согревание грубоволскнистой костной ткани, степень выраженности мозаичности тинкториа-льных свойств межклеточного вещества кости снижается, увеличивается число дифференцированных остеоцитов, что означает начало адаптивной фазы процесса регенерации костной ткани. Линия перелома костных отломков становится слабо различимой вследствие сращения их с новообразованной костной тканью. Происходят также процессы обызвествления и рассасывания гиалиновой хрящевой ткани, врастания кровеносных сосудов, сопровождаемых периваскулсцитами, сстзогеннь;-ми клетками, способствующими энхондральному остеогнстогенезу.

В зонах активной резорбции костной и хрящевой тканей или в непосредственной близости к ним, помимо типичных многоядерных остеокластов, обнаруживались одноядерные или двуядерныз клетки остеокластического дифферона. Эти элементы имели многочисленные митохондрии, вакуоли разных размеров, пузырьки и формирующиеся лизосомы. На поверхности этих клеток имеются редкие и короткие микроворсинки и небольшие выступы цитоплазмы, гофрированная каемка еще не сформировалась. Ядра в них разные по размерам и конфигурации, содержат глыбки конденсированного хроматина на внутренней поверхности кариолеммы, среди дисперсной основной части хроматина видны крупные ядрышки. На этом уровне дифференцировки подобные элементы могут быть идентифицированы как преостеокласты. В зонах регенерационного остеогистогенеэа и в местах последующей резорбции и ремоделяции костной ткани регулярно обнаруживались типичные макрофаги с развитым лизосомальным аппаратом, способные к фагоцитозу резор-бируемого деминерализованного материала межклеточного вещества.

Адаптивная фаза регенерации проявляется в развертывающихся процессах перестройки костного регенерата, формировании остеонной системы за счет продуктивной деятельности остеобластов и ремоделирующих процессов с участием остеокластов и макрофагов. Это приводит к заживлению костного перелома и образованию на его месте пластинчатой костной ткани. Постепенно к концу исследованного срока (60 суток) восстанавливаются структуры в области бывшего перелома диафиза, которые входят з состав кости как органа: формируется надкостница с остеогенным слоем, в которую врастают кровеносные сосуды, остеонный слой и общие пластинки, восстанавливается костномозговой канал, эндост со всеми компонентами, расселяются в костномозговой полости элементы регенерирующего красного костного мозга. Место бывшего перелома можно определить пс слепо утолщенному периосту за счет новообразованных кровеносных сосудов и несколько гипертрофированному слою остеогенных элементов в нем.

Таким образом, результаты анализа клеточно-дифферонной организации ре-генерационного гистогенеза в условиях заживления костного перелома, ультраструктуры клеточных элементов дифферонов различного гистогенетического происхождения свидетельствует о том, что периваскулоциты, обладающие высокими лролифе-ративными возможностями, реализуют свои цитогенетические потенции путем дивергентной дифференцировки и дают начало фибробластическому, остеобласти-ческому и хондробластическому клеточным дифферонам с образованием соединительной, костной и хрящевой тканей. Потомки стволовой кроветворной клетки являются источниками макрофагальных элементов. Разнообразие тканей и органных структур в составе трубчатой кости обуславливает особенности регенерационного гистогенеза, сложность и динамику гистологического состава посттравматического регенерата при экспериментальном переломе в процессе его заживления.

Ультраструкгурный анализ дифференцировки элементов фибробластическо-го дифферона (префибробласт - молодой фибробласт - зрелый фибробласт - фиброцит) позволили конкретизировать клеточные механизмы формирования реактивно измененной соединительной ткани, ее дальнейшее созревание в составе регенерата, гибель части его клеток, а также степень участия соединительной ткани в заместительной регенерации. Посттравматический гистогенез усложняется формированием участков гиалиновой хрящевой ткани. Как правило, хрящевая ткань возникает в слабо васхуляризированных зонах регенерата и образуется клетками хондроблас-тического дифферона (лрехондробласт - хондробласт - молодой хондроцит - зрелый хондроцит), отличающихся ультраструктурной архитектоникой. При репаративном хондрогенезе на поздних сроках опыта происходили процессы обызвествления хряща, что приводило к гибели хондроцитов и последующему энхондральному остеогистогенезу.

Основным диффероном при регенерационном остеогистогенезе является остеобластический клеточный дифферон (преостеобласт - молодой остеобласт -зрелый остеобласт - остеоцит), элементы которого имеют остеогенную детерминацию и/или могут происходить из индуцибельных к остеогистогенезу периваску-лоцитов. Молодые и зрелые остеобласты интенсивно продуцируют и секретируют органический матрикс кости. Они имеют хорошо развитую систему гранулярной эндоплазматичесхой сети, комплекс Гольджи, многочисленные свободные рибосомы и полисомы, которые занимают практически всю цитоплазму клеток. Зрелые остеобласты интенсивно выделяют в межклеточное вещество матриксные везикулы с мелкозернистым содержимым разной дискретности и электронной плотности, которые инициируют процессы минерализации органической основы кости. Они являются элементами с ярко выраженной специализацией в составе остеоблас-тического дифферона. Остеоциты по мере дифференцировки и установления межклеточных контактов типа простых неспециализированных и щелевых обеспечивают интегрирующие взаимодействия в составе костной ткани.

Процессы резорбции и ремоделирования костной ткани, характерные для фазы адаптации, связаны с деятельностью клеток остеокластического дифферона. Изучение ультраструктурной организации остеокластов позволяет их считать

костными макрофагами, обладающими секреторной активностью. Наряду с этими клеточными дифферонами функционируют типичные макрофаги с выраженной фагоцитарной деятельностью. Эти ¡слетки после деминерализации межклеточного вещества и фрагментации коллагеновых волокон остеокластами фагоцитируют его остатки и переваривают их. Взаимодействия различных клеточных дифферонсв з процессе посттравматического сстеогистогенеза, пролиферация, дифференцмровка и специализация в первую очередь элементов остеобластического и остеокластического дифферонов определяют темпы и исход заживления костного перелома. Мсрфометрические показатели этого процесса свидетельствуют о том, что в контрольной серии опыта к концу исследованного срока регенерат на 71% состоит из костной ткани (рис.2).

Н сидшкнагя ткань §[§ хрщзгя ткань Ц костная шнь

Рис.2. Количественное соотношение тканей в составе регенерата в процессе

заживления механического перелома кости. NN 1 - 6, 2 - 14, 3 - 30, 4 - 60 суток от момента повреждения. В таблице - показатели соотношения тканей.

Регенерационный остеогистсгенез при применении тафцина согласуется с общими закономерностями регенерационного гистогенеза, но следует отметить, что начиная с 14-х суток опыта и до конца эксперимента, в регенерате значимо (Р<0.05) преобладает костная ткань над другими тканевыми компонентами. Новообразованная грубоволокнистая костная ткань занимает преимущественно периостальную зону регенерации и мозаично расположена на 7-е, 14-е сутки опыта в межотлом-ковой области бывшего перелома. У края отломков наблюдаются плотно спаянные с ними участки грубоволокнистой костной, хрящевой и волокнистой соединительной

ткани, соотношение которых по мере заживления перелома изменяется. Зоны остеогистогенеза хорошо васкуляризованы, растущие сосуды сопровождаются про-лиферирующими перизаскулярными клетками (см.рис.1) и остеогенными элементами. Развивающаяся грубоволокнистая костная ткань формирует разветвленную систему, перекладины которой имеют разную протяженность, ширину и конфигурацию. Ультраструктурный анализ подтверждает активный синтез и секрецию остеобластами межклеточного вещества костной ткани. Обращает на себя внимание повышенное присутствие моноцитов и макрофагов в межбалочных промежутках новообразованной грубоволокнистой костной ткани в период, когда начинают проявляться процессы ее резорбции остеокластами.

При использовании препарата отмечалась визуально на ранние сроки опыта (1-2-е сутки) выраженная макрофагальная реакция, при которой обнаруживались в зоне повреждения как макрофаги секреторного типа, так и типичные макрофагоциты. Позднее (4-5-е сутки) при изучении ультраструктуры клеток регенерата более часто, чем в других сериях опыта, обнаруживались межклеточные кооперативные взаимодействия: фибробласт - макрофаг, фибробласт - лимфоцит, макрофаг - липо-цит, фибробласт - фибробласт. В итоге отмечалось более быстрое очищение дефекта от деструктивных элементов, интенсивная васкуляризация и заполнение его регенератом, состав которого усложнялся в процессе заживления перелома. Заметного ускорения сращения отломков не отмечалось, но согласно данным морфомет-рического анализа тканевого состава, в регенерате и на последующие сроки эксперимента преобладала костная ткань. К концу опыта бывший перелом заполнен пластинчатой костной тканью на 85%, остальной объем приходился на гиалиновую хрящевую ткань.

При применении ЭБФ-5 темпы восстановления дефекта кости также существенно не изменялись, но в составе регенерата в процессе восстановления поврежденной кости, весьма выражен хрящевой компонент, который также способствовал сращению отломков. Вероятно, производное бензимидазола способно влиять на дифференцировку и специализацию элементов хондробластического дифферона в условиях пониженной васкуляризации. Пролиферация хрящевых клеток на 21-е сутки опыта не затухает (см.рис.1). Ультраструктурный анализ выявил резкую активацию процессов синтеза и секреции межклеточного вещества хондроцитами разного уровня дифференцировки, что и повлияло, возможно, на тканевый состав регенерата в условиях применения ЭБФ-5. Тем не менее, учитывая энхондральный остео-гистогенез, к концу исследованного срока костная часть регенерата в зоне бывшего терелома преобладала.

Полученные результаты подтверждают и углубляют положение (Клишов A.A., 1984; Данилов Р.К., 1995) о том, что посттравматическая регенерация тканей явля-гтся продолжением гистогенеза в экстремальных условиях, в связи с чем регенера-}Ионньш гистогенез имеет некоторые качественные особенности. Темпы и результат регенерации после повреждения тканей зависят от исходного состояния тканей 1 взаимодействия в них клеточных дифферонов, интеграции и адаптации тканевых гтруктур в условиях восстановительного процесса.

Гистологическая и ультраструктурная характеристика остеогистогекеза при огнестрельных переломах костей конечности у собак.

Особенности огнестрельного перелома и морфофункциональные изменения в поврежденных тканях трактуются с учетом распространенной теории прямого и бокового удара (Гирголав С.С., 1956; Максименков А.Н., 1958; Анисимов В.Н., 1991; Ткаченко С.С., 1992) и современных разработок по раневой баллистике (Попов В.Л., Дыскин Е.А., 1994). Повреждение кости происходит от непосредственного прямого удара снаряда об кость и передачи его кинетической энергии на различное расстояние от места прохождения снаряда, а также от бокового удара, вызывающего вибрацию, смещение и деформацию тканей, прилегающих к раневому каналу и отстоящих от него на некотором удалении. Для огнестрельных переломов характерен большой объем повреждений костной и других тканей.

Сразу после ранения выявлялись: зона раневого канала; зона посттравматического некроза; перинекротическая область, имеющая градиент распространения по проксимальному и дистальному костным отломкам „по направлению к эпифизам. Обозначение перинекротической области целесообразно, так как в ней происходит не только сотрясение, в том числе и молекулярное, нарушение гемодинамихи, трофики, гибель клеток, но и развертываются регенераторные реакции. В результате травмы диафизы оказывались разрушенными на множество костных осколков, часть которых была выбита из кости, часть оставалась в раневом канала, а также отбрасывалась в разные стороны от него. Некоторые осколки полностью утрачивали связь с надкостницей, другие сохраняли связь с периостом, нередко надкостница отслаивалась на значительном протяжении от поверхности отломков.

Через трое суток значительная часть раневого канала заполнялась организующейся гематомой, обрывками скелетной мышечной ткани, периоста, тканевым и клеточным детритом, костными осколками. В зоне посттравматического некроза тинкториальные свойства межклеточного вещества свидетельствовали о нарушении его морфофункциональной организации, гетерохронно выбывали из жизнедеятельности и морфологической организации костной ткани терминальные элементы осте-областического дифферона - остеоциты. В перинекротической области остеоциты находились в различном морфофункциональном состоянии. Расположение и соотношение различных по жизнеспособности костных клеток увязывалось с топографическим градиентом "край отломка - эпифиз",но нередко носило мозаичный характер.

На 6-е сутки после перелома отчетливо регистрировалась макрофагальная реакция - наблюдались клетки на стадии активного фагоцитоза, макрофаги, переполненные детритом, погибающие макрофаги, а также клетки с преобладанием в цитоплазме гранулярной эндоплазматической сети и вакуолей различных размеров, что характерно для макрофагов секреторного типа. Макрофагальная внутридиф-феронная гетероморфия обусловлена процессами фагоцитоза некротически измененных клеток и межклеточного вещества в зоне раневого канала, а также секрецией биологически активных веществ, необходимых для межклеточных взаимодействий. Подтверждается мнение исследователей о функционировании при поспзле-

нии макрофагов фагоцитарного и секреторного типов (Шехтер А.Б. и соавт., 1985; Нагорнев В.А., 1991; Хилова Ю.К., 1993).

В очищенную от детрита зону со стороны окружающей кость реактивно измененной рыхлой соединительной ткани врастали многочисленные фибробласты, значительная часть которых синтезировала ДНК.

Особый интерес представляло состояние костных осколков. В мелких осколках (менее 50-100 мкм) терялась четкость их очертаний, снижалась оксифилия межклеточного вещества, остеоциты подвергались деструкции. Более крупные осколки, особенно не утратившие связь с надкостницей и эндостом, сохраняли в основном свою остеонную организацию, но в них обнаруживались отдельные погибшие остеоциты и деструктивные изменения эндотелия сосудов остеонов. В осколках с сохранившейся надкостницей обнаруживались признаки реактивного состояния ее элементов. В камбиальном слое периоста регистрировались остеогенные клетки, проходящие Б-период митотического цикла. О начальных проявлениях регенерационного остеогистогенеза свидетельствовало образование тонких балок, аркад межклеточного вещества грубоволокнистой костной ткани, объем которой постепенно увеличивался. Это важный момент, отражающий принципиальную возможность новообразования костной ткани остеобластами, сохранившими жизнеспособность в периосте осколков, а также способность остеобластов к пролиферации, дифференцировке и специализации, выработке ими межклеточного вещества костного регенерата с последующей его минерализацией.

В перинекротической области в надкостнице отломков регистрировалось начало периостального остеогистогенеза. Остеобласты увеличивались в размерах, нарастала базофилия цитоплазмы за счет накопления структур гранулярной эндоплазматической сети, их светлые ядра с преобладанием эухроматина содержали крупные осмиофильные ядрышки. Специализация и синтетическая деятельность остеобластов сопровождалась продолжающейся пролиферацией камбиальных элементов надкостницы, что являлось дополнительным свидетельством о развертывании фазы пролиферации и дифференцировки. В перинекротической области рано и наиболее четко проявляются реакции клеток -парабиотическая, пролиферативная, дифференцировки клеточных дифферонов в новых условиях (Данилов Р.К., Хилова Ю.К., Русакова С.Э., 1994; Графова Г.Я., 1995). Значительная часть пролиферирующих клеток периоста обнаруживала связь со стенкой растущих кровеносных сосудов. Периваскулярные клетки являются полипотентными элементами, обладающими высокой пролиферативной активностью, и служили одним из источников образования сложного тканевого регенерата при огнестрельных переломах.

На 10-е сутки ранения межотломковое пространство оказывалось заполненным реактивно измененной рыхлой соединительной тканью, сращенной с краями отломков, и по своей организации в значительной степени напоминающей грануляционную ткань. В регенерате ведущим диффероном являлся фибробласгический, включавший фибробласты различного уровня дифференцировки и специализации. Учитывая разнообразие клеточных элементов этой ткани, различную степень

дифференцировки и спектр их морфофункционального состояния, констатировалось возрастание междифферонной гетероморфии. Последняя еще более узеличива-лась с появлением у края отломков остеокластов. Элементы остеокластического дифферона отличались друг от друга размерами, формой, количеством ядер, выраженностью светлой зоны и гофрированной каемки. Совершая резорбцию костной ткани в зоне посттравматического некроза, остеокласты формироаали так называемые лакуны. Остеокласты богаты лизосомами, которые транспортируются к апикальной щеточной каемке и освобождаются во внеклеточное пространство. Лакуны остеокластов не без оснований рассматриваются в качестве внеклеточных эквивалентов вторичных лизосом для резорбирования костных структур (КагЪикогр! Е.А., 1991). Внедряясь в каналы остеонов, в трещины, в места разрывов надкостницы и эндоста, остеокласты резорбируют поврежденные костные пластинки. Остеокласти-ческая резорбция поврежденных костных структур при огнестрельных переломах является важным составляющим звеном в процессе регенерационного остеог-истогенеза. Вслед за остеокластами в расчищенные костные каналы и трещины из соединительной ткани, заполнившей дефект кости, врастали гемокапилляры, сопровождаемые рыхлой соединительной тканью с малодифференцированными перизас-кулярными клетками, остеогенными клетками-предшественниками. Индуцибельные к остеогистогенезу периваскулоциты, детерминированные остеогекные элементы дифференцировались а остеобласты. Последние, располагаясь на пластинках стенок полых образований кости, синтезировали и наслаивали не сохранившиеся пластинки новое межклеточное вещество, постепенно дифференцируясь в остеоциты. При наличии сосудов в таких полостях со временем происходило их заполнение костной тканью вокруг сосудов с тенденцией формирования остеоно-подобных структур - новых генераций структурно-функциональных единиц кости. Этот процесс обозначен как регенерационный эндооссальный (эндоссальный) остеогенез (Гополобов В.Г., 1993). Наблюдения за жизнеспособностью осколков дали дополнительные результаты. Если крупный осколок, не утративший остеонной организации, вырван снарядом из кости с частью надкостницы, то остеогенез отмечался как со стороны покрытой надкостницей, так и со стороны разрыва костных пластиной остесноэ. По-видимому, в периосте и в соединительной ткани каналов остеонов сохранились клетки-предшественники, преостеоблзсты и остеобласты - элементы, способные к дифференцировке и выработке межклеточного вещества. Такие осколки были окружены хорошо васкуляризованной соединительной тканью. Продуцирующие грубоволокнистую костную ткань крупные фрагменты кости соединялись с новообразованным костным регенератом и с более мелкими осколками.

Остеогенные потенции элементов эндоста реализовались в формировании весьма выраженной эндостальной части костного регенерата, состоящего из грубо-волокнистой костной ткани.

Как правило, начало интермедиарного костеобразования проявлялось на 15-е сутки. Остеобласты не утрачивали способность вступать в митотический цикл и синтезировать ДНК, причем индекс меченных Зн-Т ядер этих элементов наиболее

высок (7.8±0.9% при Р<0.05) на этот срок после травмы (рис.3). Зона интер-медиарного остеогистогенеза хорошо кровоснабжалась, что являлось способствующим фактором для этого процесса. В этой зоне регулярно встречались меченные 3Н-Т периваскулоциты, которые при дальнейшей дифференцировке и действии факторов роста и микроокружения пополняли число остеогенных элементов.

80 70 60 50 40 30 20 10 о

[Г) Оба. Щобл.-Т ■ Цоц.

Рис.3. Динамика ИМЯ и соотношения костных клеток при регенерационном

остеогистогенезе после огнестрельного перелома. По оси абсцисс - время от начала эксперимента (сут). По оси ординат - показатели количества остеобластов и остеоцитов (%): Обл - доля остеобластов; Обл-Т - ИМЯ остеобластов с тритиевой меткой ; Оц - доля остеоцитов (%).

Для понимания и трактовки клеточных механизмов формирования регенерата, внутри- и междифферонной гетероморфии, межклеточных взаимодействий представляют интерес данные морфометрического исследования клеточных элементов тканевого регенерата с применением корреляционного анализа. На 15-е сутки опыта преобладают элементы фибробластического дифферона, причем среднее количество фибробластов (28.1±2.7) и фиброцитов (17.1 ± 1.4) в интермедиарной части регенерата достоверно (Р<0.05) отличается от их числа в периостальной и эндостальной частях. Весьма высокое количество эндотелиоцитов (16.7±2.7) сосудов в интермедиарной зоне. Среднее число остеобластов и остеоцитов и интермедиарном в эндостальном костных регенератах позволяет судить о некотором отставании темпов регенерации костной ткани в этих зонах, по сравнению с периостальной, интенсивность образования хрящевой ткани в интермедиарной зоне превосходит активность этого процесса со стороны пери- и эндоста.

При корреляционном анализе с оценкой парных связей между количественными показателями изученных клеток в костной ране показано, что устанавливаются значимые (Р<0.05) сильные связи между числом макрофагов и фибробластов,

макрофагов и эндотелиоцитов, фибробластсв и эндотелиоцитов, а также остеобластов и эндотелиоцитов сосудов.

Оценивая морфофункциональные аспекты данных корреляционного анализа на этот срок, представляется, что сильные корреляционные связи отражают взаимообусловленные взаимодействия клеток различных дифферонов в составе регенерата, что "поддерживает" междифферонную гетероморфию. Следует отметить, что из четырех сильных парных связей в трех представлены эндотелиоциты, что указывает на влияние неоваскулогенеза на функцию коллаген-продуцирующих клеток, а также на участие растущих сосудов в транспорте лейкоцитов, в том числе моноцитов, дифференцирующихся в макрофаги.

Анализируя гистохимические показатели оптической плотности суммарных белков межклеточного вещества костных отломков, осколков и костного регенерата, было установлено, что данный показатель на 20% ниже в области дистального отломка, по сравнению с проксимальным (Р<0.01). Костный регенерат (все его части), окружающий проксимальный отломок, по оптической плотности суммарных белков достоверно превосходил (Р<0.05) регенерат дистального отломка (рис.4).

Рис.4. Показатели оптической плотности суммарных белков межклеточного вещества костной ткани при регенерационном остеогистогенезепосле огнестрельного

По оси X: о.п. - отломок проксимальный; р.п.п. - регенерат периостальный проксимальный; р.э.п. - регенерат эндостальный проксимальный; р.и.п. - регенерат интерме-диарный проксимальный; р.о. - регенерат осколков; р.и.д. - регенерат интергледиар-ный дистальный; р.э.д. - регенерат эндостальный дистальный; р.п.д. - регенерат периостальный дистальный; о.д. - отломок дистальный. По оси У - оптическая плотность белка (отн.ед). По оси 7. - время от начала эксперимента (сут).

перелома.

Использование метода поляризациснно-оптической фотометрии показало, что показатели оптической анизотропии коллагеновых волокон межклеточного вещества костной ткани проксимального и дисггального отломков сходны и составляют лишь 32% от аналогичного показателя для волокон интактной кости. Это может быть связано со снижением степени минерализации межклеточного вещества, вымыванием неколлагеновых белков из органического матрикса, уменьшением плотности упаковки коллагеновых волокон. В проксимальном и дисггальиом регенератах новообразованные коллагеновые волокна оформляются в тонкие пучки, обладающие весьма слабой анизотропией (рис.5).

Рис.5. Изменения величины оптической анизотропии коллагеновых волокон межклеточного вещества костной ткани на 15-е сутки опыта.Огнестрельный перелом. По оси X - расстояние (мкм) по линии сканирования интактной кости, отломков (до их края) и регенерата (от края отломков). По оси Т - угол поворота (градусы) столика поляризационного микроскопа; к.и. - кость интактная; о.п. - отломок проксимальный; о.д. - отломок дистальный; р.п. - регенерат проксимальный; р.д. - регенерат дисталь-ный. По оси У - показатель оптической анизотропии (отн.ед).

К 15-30-м суткам после ранения периостальный регенерат приобретал сложное тканевое строение. Помимо грубоволокнистой костной ткани, которая разрасталась по направлению к противоположному отломку и в толщину, соединительнотканной части, в составе периостального регенерата обнаруживалась и гиалиновая хрящевая ткань в виде островков или больших полей. Скелетогенные элементы надкостницы, периваскулярные полипотентные клетки при заживлении тяжелого огнестрельного перелома, требующего большого объема межклеточного и клеточ-

нога материала для заполнения дефекта и сращения отломков, при недостаточном локальном кровоснабжении дифференцировались в элементы хондробластического дифферона. Гиалиновый хрящ не требует интенсивного кровоснабжения. Хондро-бласты и хондроциты способны к пролиферации, и репаративный хондрогенез происходил интенсивно, восполняя хрящевой тканью недостаток костного регенерата. Сходная картина наблюдалась и в интермедиарной части регенерата.

Через 30 суток согласно морфометрическим данным, количество остеобластов и остеоцитов в интермедиарной зоне значимо (Р<0.05) превысило число этих клеток в других зонах регенерата, а также по сравнению с предыдущим сроком наблюдения (15 суток), причем происходило это изменениз на фоне весьма выраженной пролиферации остеобластов (ИМЯ - 6.7±0.8%; Р<0.05) в составе интермедиарного костного регенерата (см.рис.3).

Резко (более, чем в 2 раза) повысились количественные показатели хрящевых клеток в интермедиарной и почти вдвое в периостальной зонах регенерата. Представляется, что при очевидном нарастании темпов остеогистогенеза, репаративный хондрогенез, сочетаясь с последним, опережает развитие грубоволокнистой костной ткани при заживлении перелома на этот срок.

На 30-е сутки заживления перелома корреляции претерпевают ряд изменений. Устанавливаются значимые (Р<0.05) сильные связи вместо умеренных между количеством фибробластов и фиброцитов, макрофагов и остеобластов, макрофагов и остеокластов, остеобластов и остеоцитов, остеобластов и остеокластов. Оценивая морфофункционапьные аспекты данных корреляционного анализа, представляется, что увеличение числа сильных корреляционных связей между указанными клетками свидетельствует о повышении функциональной активности данных элементов, активно протекающем регенерационном гистогенезе на месте бывшего дефекта кости, продолжающемся и расширяющемся взаимодействии клеток различного гистогенетического происхождения, что проявляется в весьма выраженной пролонгированной внутри- и междифферонной гетероморфии.

Общая композиция клеточных элементов в составе сложного тканевого регенерата, их ультраструктурная организация, соотношение пролиферации и диффе-ренцировки клеток костной ткани, степень корреляционных связей между количеством разных клеток одного гистогенетического ряда и представляющих различные диффероны, показатели, свидетельствующие о процессах тканевой дифференци-ровки, позволяют оценить совокупность морфофункциональных изменений клеток и тканей на 30-е сутки опыта как пик (манифестация) регенерационного гистогенеза.

Значительная часть костных осколков инкорпорируется в соединительную ткань регенерата, богатую кровеносными сосудами. Сохранившиеся остеогенные элементы в периосте, в каналах остеонов, эндосте осколков обеспечиваются трофикой путем диффузии веществ из окружающих сосудов и гемокапилляров, вросших в каналы остеонов. Остеобласты не утрачивают способность к синтезу ДНК, продуцируют грубоволокнистую костную ткань, которая в виде разветвленных тонких балок берет начало от поверхности осколка, срастается с подобным регенератом, исходящим от отломка или соседнего осколка, и включается в состав регенерата.

Взаимодействие элементов остеобластического и остеокластического клеточных дифферонов, тесное взаимоотношение их с кровеносными капиллярами, резорбция и новообразование костной ткани, полярные по значению, но сопряженные функции костных клеток способствуют восстановлению кости после огнестрельной травмы. При регенерационном эндоссальном остеогистогенезе возможно формирование пластинчатой костной ткани, минуя в этих условиях провизорную стадию -образование грубоволокнистой костной ткани. Этот процесс приводит к формированию дефинитивных структурно-функциональных единиц - остеонов, что отражает адаптивно-компенсаторные тканевые, межтканевые реакции и взаимодействия при зажизлении огнестрельного перелома.

Следует отметить, что костные отломки и особенно осколки, подвергшиеся остеокластической резорбции и различной степени деминерализации, представляли собой органический костный матрикс, состоящий в основном из белковых компонентов. Весьма часто вблизи таких осколков, краев отломков, а также в центральных частях регенерата среди хорошо васкуляризированной соединительной ткани обнаруживались остеобласты, формировавшие очаги индуцированного остео-гистогенеза. Считается, что освобождаемый из деминерализующейся костной ткани костный морфогенетический белок рекрутирует периваскулярные клетки к остеоген-ной дифференцировке (иг^ М-К. 1989). Подобный процесс являлся еще одним вкладом в регенерационный остеогистогенез при репарации крупного дефекта костной ткани.

Многочисленные осколки, представляющие кусочки кости как органа, оказавшиеся в костной ране после огнестрельного перелома, их реактивное состояние не без оснований могут быть рассмотрены в русле закономерностей роста тканей и органов в условиях культивирования их в организме. Костные осколки (подобие имплантатов) в условиях своеобразного посттравматического культивирования в организме проходят все основные стадии регенераторного процесса, вскрытые для многих других тканей и органов культивированием по оригинальному методу (Лазаренко Ф.М., 1959). Необходимо отметить, что продукция осколками грубоволокнистой костной ткани, формирование в осколках и их регенерате новых остеонов является проявлением закономерностей гистотипического и органотипического роста и дифференцировки костной ткани, несмотря на то, что подобное культивирование ее происходит в экстремальных условиях - при заживлении огнестрельного перелома. Эти данные открывают возможности для дополнительного изучения гмстобластических свойств костной ткани в связи с онтогенезом и филогенезом в условиях взаимодействующего с тканью организма, испытывающего тяжелую травму.

На 30-е сутки от начала опыта различия в оптической плотности суммарных белков межклеточного вещества в проксимальном и дистальном отломках, не были столь выраженными. Вероятно, к этому сроку регенерационного остеогистогенеза в определенной степени выравнивались условия для сстеопродукции как со стороны проксимального, так и дистального костных отломков. На этот срок эксперимента отмечается увеличение показателя оптической анизотропии волокон межклеточного

вещества костной ткани проксимального отломка, он составляет 42.6% от показателя, характеризующего интактную костную ткань. Подобный показатель дистально-го отломка, находящегося в условиях дефицита кровоснабжения, активной деятельности остеокластов, составил только 27.2% от аналогичного показателя для волокон интактной кости.

Измерение оптическоГ, плотности суммарных белков подтверждает увеличение их количества в межклеточном веществе новообразованной костной ткани на 30-е сутки эксперимента. Однако процессы коллагеногенеза и формирования пучков волокон костного регенерата происходят на фоне выраженного снижения величины плотности минеральных компонентов в костных структурах межотломковой зоны перелома. Это касается в первую очередь краев отломков и многочисленных осколков. Коллагеновые же волокна регенерата еще недостаточно минерализованы (рис.6).

Рис.6.Показатели минерализации межклеточного вещества костной ткани при

заживлении огнестрельного перелома кости. По оси X - время от начала эксперимента (сут). По оси Z: о.п. - отломок проксимальный; per. - костный регенерат; о.д. - отломок дистальный. По оси Y - средняя величина плотности минеральных компонентов костной ткани (г/см^). Примечание. Показатель плотности минеральных веществ а интактной костной ткани равен 1.12±0.035 г/см2.

Через 45-60 суток нарастают процессы минерализации костной части регенерата и наблюдались признаки обызвествления гиалиновой хрящевой ткани, приводившие к различной степени деструкции и гибели хсндроцитов. При посттравматическом костеобразовании в зоне заживления огнестрельного перелома обнаруживаются проявления закономерного процесса - энхондрального остеогистогенеза.

В условиях поставленного эксперимента своеобразная по архитектонике, весьма прочная грубоволокнистая костная ткань, требующая кровоснабжения, при регенерации конкурирует с хрящевой и волокнистой соединительной тканями, являющимися ЭВОЛЮЦИОННО более лпеиними быптпо пягп/шиым un i»»oo липи^и-и :»

функционально соответствующими, чем костная ткань. Посттравматическая регенерация тканей при столь обширной и тяжелой травме проходит в условиях, не способствующих более полной реализации остеогенных потенций соответствующих клеточных элементов и дефицита последних, и развертывается с участием в этом процессе тканей, имеющих больший эволюционный возраст и более высокий уровень и темп заместительной регенерации.

Данные, полученные с помощью морфометрического и корреляционного анализов на 60-е сутки опыта, позволяют дополнительно и объективно судить о продолжающейся дифференцировке клеток фибробластического и остеобластичес-кого дифферонов в составе соединительной и костной тканей регенерата, степени зрелости этих тканей, взаимодействии клеток различных дифферонов, определяющих междифферонную гетероморфию. Отрицательные сильные и умеренные корреляционные связи между числом эндотелиоцитов сосудов, хрящевых и костных клеток подчеркивают проявление одной из закономерностей регенерационного гистогенеза - энхондрального остеогистогенеза. Эти показатели имеют прямое отношение к ремоделированию костного регенерата, формированию пластинчатой костной ткани и новых остеонов.

При количественном учете клеточных элементов в регенерате на 120-е сутки эксперимента установлено, что произошло уменьшение среднего числа изученных клеток в нем. Сравнивая по зонам, можно отметить значимые отличия количества фибробластов в периостальной, фиброцитов, остеокластов и хрящевых клеток в интермедиарной, остеоцитов в эндостальной частях регенерата.

На этот срок опыта корреляционные связи тоже изменяются. Значимое (Р<0.05) усиление обратных корреляционных связей между количеством элементов внутри фибробластического и остеобластического дифферонов, смена положительных на отрицательные связи между числом остеоцитов и остеокластов, ослабление корреляций между количеством остеобластов и остеокластов отражает нарастание содержания конечных клеток дифферонов (фиброцитов и остеоцитов), процессы клеточной дифференцировки, продолжающееся формирование волокнистой соединительной и пластинчатой костной тканей. Изменение степени связей между числом хрящевых клеток, остеокластов и эндотелиоцитов имеет отношение к репаратив-ному хондрогенезу в составе сложного регенерата на месте бывшего перелома.

В начале восстановления костномозгового канала (120-е сутки) внутренняя поверхность эндостального регенерата становилась неровной, так как формообразовательные процессы в этой зоне приводили к появлению костных перекладин. Последние, являясь выростами внутренних генеральных пластинок, удлинялись, приобретая сложную конфигурацию к концу исследованного срока (180 суток). Между перекладинами обильно разрасталась жировая ткань, которая постепенно заселялась кроветворными элементами в виде очагов или диффузных скоплений. На 120-е сутки опыта отмечалось снижение показателей оптической плотности суммарных белков, изменение характера сканограмм отломков, осколков, интермедиарного регенерата за счет частичной резорбции костной ткани, реваску-ляризации таких участков, в которые также вселялись клетки гемопоэза. Это

является проявлением компенсаторных и'адаптационных реакций при травме органа кроветворения и индукции гемопоэза в условиях посггравматическогс остео-генеза. Адаптация рассматривается как общебиологическая реакция, свойственная всем уровням структурной организации организма, реализующаяся в экстремальных условиях (Пузырев А.А., Иванова В.Ф., 1993).

Нарастающие значения показателей анизотропии волокнистой основы межклеточного вещества костной ткани проксимального и дистального регенератов свидетельствуют об изменяющейся и упорядочивающейся фибриллоархитектонике новообразованной костной ткани на месте бывшего отестрельного перелома (рис.7).

Рис.7. Изменения величины оптической анизотропии коллагеновых волокон межклеточного вещества костной ткани на 120-е сутки опыта. Огнестрельный перелом. Обозначения те же, что на рис.5.

Междифферонные взаимоотношения и их адаптация в процессе регенера-ционного остеогистогенеза, изменения тканевого состава регенерата, ремодег.и-рование костного регенерата с участием остеобластического, остескластического и других клеточных дифферонов, увеличение количества суммарных белков и минеральных компонентов в межклеточном веществе приводят к заживлению перелома, хотя тканевый спектр регенерата на этот срок еще разнообразен (рис.8). Тем не менее следует отметить, что внутридифферонная и междифферонная гете-роморфия, являясь гистологическими диагностическими критериями состояния регенераторного процесса, заметно снизились, что является благоприятным прогностическим признаком в плане исхода восстановления костной ткани.

#12 3 4

Ни р 55 25 28 51 п >Л их 1П И

соединительная ткань Щ хрящевая ткань Д костная ткань Рис.8. Количественное соотношение тканей в составе регенерата б процессе заживления огнестрельного перелома кости. NN 1 -15, 2 - 30, 3 - 60, 4 -120 суток от момента повреждения. В таблице - показатели соотношения тканей.

Проецируя модусы филэмбриогенеза (Северцов А.Н., 1939) на регенера-ционный гистогенез при заживлении огнестрельного перелома, при котором на определенных стадиях значительный объем в регенерате занимает развивающиеся соединительная и хрящевая ткани, постоянно замещающиеся костной, эти процессы можно рассматривать как регенерационные гистогенетические рекапитуляции. В связи с этим весьма существенно и емко заключение (Кнорре А.К., 1971) о том, что гистогенетические рекапитуляции "оправданы" функционально или морфогенетичес-ки и потому закреплены естественным отбором или, по меньшей мере, не имеют отрицательного значения для выживания вида и потому не отметены отбором и в качестве одной из форм проявления наследственности являются той обязательной основой, на которой только и могут разыгрываться явления эволюционной изменчивости процессов гистогенеза.

В эксперименте с огнестрельными переломами трубчатых костей и применением даларгина было выявлено, что определенные составляющие регенерацион-ный остеогистогенез процессы интенсифицированы. Уже на 6-е сутки опыта в межотломковом пространстве, в местах, очищенных от детрита, регистрируются растущие гемокапилляры. Ткани в области перелома, в зонах регенерационного остеогистогенеза, ткани формирующегося регенерата заметно интенсивней крсво-снабжены. Усиленное кровоснабжение и неоааскулогенез отмечались и на более поздних сроках.

На 15-е сутки эксперимента при применении биорегулятора количество эндотелиоцитов растущих кровеносных сосудов больше на 37.1%, остеобластов - на

34.6%, остеокластов - в 2.7 раза. Указанные количественные изменения относятся к тем клеткам дифферонов, от которых в основном зависит развертызание и темп регенерации костной ткани.

Изменения показателей оптической плотности суммарных белхов, межклеточного вещества костной ткани проявились отчетливо. Важно отметить, что увеличение значимо (PO.Q5) регистрируется для костной ткани дистального отломка, периостальной и эндостальной частей дистального регенерата. Эти данные о значительном улучшении метаболических процессов, регенерации костной ткани в дистальной части конечности после огнестрельного перелома при использовании даларгина расширяют представления о значении децентрализации кровообращения, развития сосудистых коллатералей, высокой эффективности применения аналогов знкефалинов и эндорфинов при лечении шс;<г и травматичэской болезни (Золоев Г.К., 1968; Дедушкин B.C. и соавт., 1990). В рамках этих представлений обращает на себя внимание более равномерное соотношение количественных показателей белка в проксимальном и дистальном стломках, осколках, различных частях регенерата на 60-е и 120-е сутки эксперимента, что свидетельствует об общем оптимизирующем действии препарата на регенерацию костном ткани. Тему дополнительным доказательством является то, что жизнеспособные костные осколки, продуцирующие грубозолокнистую костную ткань регенерата, обнаруживались и на поздних сроках заживления перелома, причем осколков, сохранивших жизнеспособность в межотломкозой зоне через три ¡/есяца наблюдения, было значимо (Р<0.05) больше, чем з контрольной серии.

Применение даларгина при огнестрельных переломах оптимизировало условия, при которых протекает регенерационный гистогенез, что проявилось также в изменении междифферонных взаимоотношений, в преобладании скэлетогенных дифферонов над десмальным и, соответственно, костной и хрящевой тканей над соединительной.

Гистологические и ультраструктурные аспекты рзгенерации костной ткани при огнестрельных переломах длинных трубчатых костей у челозека.

Огнестрельные переломы длинных трубчатых костей, вызванные современными ранящими снарядами, взрывными боеприпасами, причиняют обширные разрушения костной и другим тканям (Алексеев A.S. и соавт., 1989; Дедушкин B.C., Ткаченко С.С., Шаповалов В.М., 1992; Ерюхин И.А., 1992), характеризуются образованием большого числа костных осколков. Учитывая результаты, получзнные в эксперименте, о роли осколков в регенерации костной ткани, целесообразно было обратить на них специальное внимание при взятии биоптатоз у раненых

На 1 -е, 2-е сутки после ранения состояние остеоцитоз в осколках различно. Обнаруживаются остеоциты, сохранившие признаки жизнеспособности. У других остеоцитов снижена способность воспринимать гистологичесхив красители. Часть костных клеток подвергается пикнозу. Определяются полости, не содержащие

костных клеток, причиной чего является их гибель в результате повреждения. В межклеточном веществе осколков можно наблюдать линии, территории в виде пятен с нечеткими границами, более интенсивно воспринимающие основные красители. Учитывая неравномерность отложения, ориентации волокнистых структур основного вещества, минерализации при формировании стенок костных лакун, пластинок (Богонатов Б.Н., 1975; Докторов АЛ., Денисов-Никольский Ю.И., 1983; Омельяненко Н.Р., 1991), то реактивные изменения проявляются в виде неравномерных по степени и распространенности признаков дезорганизации коллагеновых волокон и минеральных компонентов межклеточного вещества. Существует мнение, что гибель остеоцитов не является показателем омертвления костной ткани, которая в подобных случаях не теряет определенных реактивных свойств, не вызывает со стороны окружающих тканей реакцию, подобно реакции на инородное тело (Виногорадова Т.П., Лаврищева Г.И., 1974; Русаков А.В., 1989). Указанное мнение можно разделить в той его части, если учесть современные данные о содержании в межклеточном веществе костной ткани разнообразных факторов роста, остеоиндуктивных веществ, митогенных факторов и возможности быстрого высвобождения неорганических компонентов (КоЬеу Р.в. е1 а1., 1989; УиИсемс Б. е! а1„ 1990).

В межотломковом биоптате, полученном на 4-е сутки после ранения, определен костный осколок, к которому прилегают нити фибрина, остатки детрита, к нему подрастает, начиная окружать его, рыхлая соединительная ткань, сходнная по строению с грануляционной.

На 5-е сутки с момента ранения в ней кроме клеток фибробластического дифферона отмечаются макрофагоциты, отдельные лимфоциты. Определяются новообразованные растущие кровеносные капилляры, рост которых осуществляется за счет пролиферации и миграции эндотелиоцитов. Ядра эндотелиоцитов, проходящих митотический цикл, включают 3Н-Т. Растущие и формирующиеся капилляры, венулы, артериолы сопровождаются перизаскулярными клетками, которые активно пролиферируют, включают меченный предшественник ДНК.

Существенным механизмом в составе общего процесса заживления перелома, который в значительной мере определяет дальнейшую судьбу осколков в костной ране, является их реваскуляризация. Предсущесвовавшие сосуды остеонов в осколках к этому сроку после перелома (5 суток) погибают. В просвете других остеонов отчетливо регистрируются новообразованные капилляры, вросшие в гзверсовы каналы из окружающей соединительной ткани вместе с ее клеточными и тканевыми элементами, в том числе и периваскулярными клетками. Реваскуляризация костных осколков, расценивается как реабилитация ткани после повреждения за счет компенсаторно-адаптивных реакций организма. Сосуды могут врастать в надкостницу, в каналы остеонов, и в этих условиях сохранившие жизнеспособность детерминированные остеогенные элементы осколка, привнесенные индуцибельные к остеогистогенезу периваскулоциты, дифференцируясь в остеобласты, продуцируют грубоволокнистую костную ткань.

При электронно-микроскопическом изучении регенерата, формирующегося от осколка, в его составе определяются зрелые активно функционирующие остеобласты, дифференцирующиеся остеоциты, окруженные остеоидом, а также четкие признаки начала минерализации межклеточного вещества, при относительно небольшом сроке после ранения (14 суток). При исследовании состояния каналов остеонов этого осколка обнаруживаются характерные проявления регенерационного эндоссального остеогенеза.

Краевые части костных отломков, претерпевшие посттравматичесхий некроз и остеокластическую резорбцию поврежденной ткани, не являются препятствием для остеогистогенеза, если сохранились даже локально участки надкостницы или/и эндоста и костного мозга.Представляет интерес состояние осколков, которыа являются фрагментом стенки диафиза кости (они покрыты надкостницей, содержат все слои компактного вещества и эндост). В таких осколках, в которых относительно сохранена гистоархитекгониха кости, обнаруживаются различные признаки жизнеспособности их элементов. В надкостнице обнаруживаются очаги остеогистогенеза, гаверсовы системы реваскуляризуются, не выражена остескластическая реакция, по краю отрыва осколка от кости регистрируется новообразование костной ткани регенерата, в эндосте сохраняются клетки, которые по своей ультраструктурной организации могут оцениваться как жизнеспособные. По мере увеличения объема интермедиарного костного регенерата, разрастания новообразованной костной ткани, продуцируемой остеобластами осколка, происходит анастомозирование балок регенерирующей костной ткани, формирование общего костного регенерата, а состав которого включаются осколки (34 суток после ранения). Важно также следующее, что пролиферируют не только сохранившие жизнеспособность остеогенные элементы самого осколка, но и остеобласты последующих генераций, создающие и наращивающие костную ткань регенерата от осколков.

Элементы остеобластического дифферона восстанавливающейся костной ткани человека естественно имеют разную степень дифференцировки и функциональной активности. Такие составляющие регенерационного гистогенеза как пролиферация, дифференциация и специализация доказательно выявляются при изучении регенерационного остеогистогенеза на прижизненно полученном материале от раненых.

Представляется, что полученными результатами обоснован вариант схемы, отражающей клеточно-дифферонную организацию посттравматического гистогенеза при заживлении костных переломов (рис.9).

На основании обобщения полученных клинических наблюдений, данных экспериментов создана оригинальная программа хирургической обработки огнестрельной костной раны. Программа была реализована в процессе медицинской реабилитации раненых с огнестрельными переломами длинных трубчатых костей.

I JL Ж

сск скк

Рис.9.Клеточно-дифферонная организация гистогенеза при заживлении костного перелома.

ССК - стволовая стромальная клетка; СКК - стволовая кроветворная клетка; ПВК -периваскулярная клетка. 1 - префибробласт; 2 - фибробласт; 3 - фиброцит; 4 - пре-хондробласт; 5 - хондробласт; 6 - хондроцит; 7 - преостеобласт; 8 - остеобласт; 9 -остеоцит; 10 - моноцит; 11 - остеокласт; 12 - макрофаг. I - волокнистая соединительная ткань; II - гиалиновая хрящевая ткань; III - костные ткани.

ВЫВОДЫ

1. Костная ткань трубчатых костей представляет собой гистологическую систему, состоящую из взаимодействующих гетерогенных клеточных дифферонов и межклеточного вещества. Основным диффероном костной ткани является сстео-бластический, элементы которого содержатся в надкостнице, эндосте, в каналах остеонов, в прободающих каналах и в костном мозге. Дифференцированные клетки остеокластического ряда - остеокласты осуществляют функцию резорбции межклеточного вещества, являются специализированными макрофагами костной ткани. Специфические функции, полярные и сопряженные по значению, выполняемые клетками остесбластического и остеокластического дифферонов, морфофункцио-нальные взаимодействия между ними лежат в основе структурно-метаболического гомеостазиса и физиологической регенерации костной ткани.

2. Регенерационный остеогистогенез протекает на орюве активации закономерных процессов, характерных для физиологической регенерации костной

ткани, и включает две основные фазы: а) пролиферации и дифференцировки клеток остеобластического дифферона различной локализации и б) адаптивную, проявляющуюся в ремоделировании регенерата, формировании костных пластинок (остеон-ных, вставочных, общих), становлении организации белково-минерального состава межклеточного вещества новообразованной костной ткани.

3. Посттравматический остеогенез взаимосвязан с васкулогенсзом. Растущие кровеносные сосуды обеспечивают метаболические процессы в зонах косте-образования и привносят периваскулярные клетки, являющиеся индуцибельными к остеогистогенезу элементами. Периваскулоциты в условиях заживления переломов реализуют свои цитогенеические потенции путем пролиферации и дивергентной дифференцировки, являются источником развития остеобластического, фиброблас-тического и хондробластического клеточных дифферонов. Взаимодействующие в процессе регенерации клеточные диффероны формируют в составе регенерата костную, волокнистую соединительную и гиалиновую хрящевую ткани.

4. Для огнестрельных переломов, вызванных высокоскоростными ранящими снарядами, характерен большой объем тяжелых повреждений, в результате чего диафизы костей разрушаются на множество костных осколков. Признаки повреждения и гибели клеток и межклеточного вещества костной ткани имеют градиент распространения по отломкам, обусловленный трансформацией кинетической энергии ударной волны в ткани. При травме образуются зона раневого канала, зона посттравматического некроза и окружающая последнюю леринекро-тическая область. В перинекротической области регистрируется пролиферация и дифференцировка клеток с преимущественным участием элементов остеогенной детерминации.

5. Одной из особенностей огнестрельного перелома является наличие в зоне дефекта и за его пределами разных по размерам и конфигурации осколков. При формировании регенерата осколки оказываются инкорпорированными в его состав, значительная их часть в дальнейшем реваскуляризуется. Сохранившие жизнеспособность остеогенные клетки костных фрагментов пролиферируют и дифференцируются в остеобласты. Последние продуцируют грубоволокнистую костную ткань, входящую в состав периостальной, интермедиарной и эндостальной частей костного регенерата.

Костные осколки заполняют часть крупного дефекта подобно аутотрансплан-тату посттравматического происхождения, а также проявляют свойства, характерные для органной культуры в организме, в виде гистотипического роста и дифференцировки костной ткани. Подвергающиеся деминерализации осколки представляют собой костный матрикс, индуцирующий остеогистогенез в условиях заживления костной раны.

6. В процессе заживления перелома остеогастогенез сопровождается репа-ративным десмогенезом, репаративным хондрогенезом, энхондральным развитием костной ткани, что является проявлением регенерационных гистогенетических рекапитуляции Степень выраженности этих процессов и замещения морфологически к

функционально ведущей костной ткани другими тканями связана с характером и тяжестью травмы.

При огнестрельном переломе выявлен регенерационный эндоссальный остеогенез, рассматривающийся как один из механизмов восстановления костной ткани, который обеспечивает в костных отломках и осколках замещение поврежденных остеонов новыми генерациями гаверсовых систем, минуя провизорную стадию образования грубоволокнистой костной ткани. Это способствует ремоделяции костного регенерата в адаптивную фазу регенерации, а также заживлению множественных локальных костных дефектов.

7. Комплексное исследование показателей пролиферации остеобластов, периваскулоцитов, фибробпастов и хрящевых клеток, оценка внутридифферонной и междифферонной гетероморфии, цито- и гистоархитектоники регенерата, характеристика межклеточного вещества костной ткани регенерата, осколков и отломков по содержанию суммарных белков, минеральных веществ, поляризационно-оптическими свойствам - все это является объективными гистофункциональными критериями диагностики фазы и состояния регенераторного процесса. Оценка гистологического статуса процесса позволяет прогнозировать исход заживления перелома, обоснованно подходить к выбору средств для оптимизации посттравматического остеогенеза и его коррекции.

8. В опытах с использованием тафцина обнаружено более быстрое очищение макрофагами дефекта кости от деструктивных элементов, что способствовало развертыванию фазы пролиферации и дифференцировки регенерационного остеогистогенеза, а также неоваскулогенезу. При применении ЭБФ-5 выявлена активация синтеза и секреции межклеточного вещества хрящевыми клетками. Даларгин способствовал адаптационно-компенсаторным посттравматическим реакциям, что проявилось в усиленном кровоснабжении зоны повреждения кости. Темпы восстановления костной ткани при использовании препаратов существенно не менялись, но изменялся клеточный и тканевый состав регенерата, что в целом способствовало оптимизации посттравматической регенерации костной ткани.

9. Гистологическое, ультраструктурное и радиоизотопное исследование биоптатов регенерата при заживлении огнестрельных переломов длинных трубчатых костей у человека, сопоставление и анализ полученных данных с результатами эксперимента послужили теоретической основой для разработки новых методов сберегательной хирургической обработки огнестрельных костных ран, лечебных мероприятий, позволяющих сохранить функции тканей и органов опорно-двигательного аппарата при оказании помощи раненым.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Гололобов В.Г. Посттравматический гистогенез костной ткани в условиях стимулирующего воздействия // Науч.конф., посвящ. 40-летию Победы советского народа в Великой отечественной войне: Тез. докл. - П., 1985.-Т.2.- С. 216-217.

2.Гололобов В.Г. Репаративный остеогенез и его клеточно-дифферонная организация II Гистогенез и регенерация: Тез.науч.конф.- Л., 1986.- С.22.

3.Гололобов В.Г. Репаративная регенерация костной ткани в условиях применения препаратов тафцин и ЭБФ-5 II Реактивность и регенерация тканей: Тез.науч. конф,- СПб., 1990.- С.17-18.

4.Гололобов В.Г. Остеогенные элементы и заживление костных переломов // Морфология раневого процесса: Тез.науч.конф.- СПб., 1992.- С.12.

б.Гололобов В.Г. Регенерационный остеогенез при заживлении огнестрельных переломов // Критерии и методы оценки жизнеспособности тканей в раневом процессе: Материалы науч. конф.- СПб., 1993.- С.13-15.

6.Гололобов В.Г. Гистохимическая и поляризационная характеристика межклеточного вещества костной ткани при заживлении огнестрельного перелома// Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования клеток, тканей и органов человека и животных: Материалы науч. конф.- Волгоград, 1995.- С.35.

7.Гололобов В.Г. Регенерационный остеогенез при огнестрельной травме// Гистогенез и регенерация тканей: Материалы науч.конф.- СПб., 1995.- С.16-17.

З.Гололобов В.Г. Регенерация костной ткани после огнестрельного перелома // Морфология,-1996,- Т.109, N 1,- С.57-62.

Э.Гололобов В.Г., Данилов Р.К. Характеристика ко.стного регенерата при заживлении огнестрельного перелома по данным сканирующей поляризационной микроскопии // Гистогенез и регенерация тканей: Материалы науч.конф.-СПб., 1995.- С.18-19.

Ю.Гололобов В.Г., Дулаев А.К. Остеорепарация огнестрельных переломов в условиях применения даларгина II Морфология раневого процесса: Тез.науч.конф.-СПб., 1992.- С.13.

И.Гололобов В.Г., Дулаев А.К. Особенности остеорегенерации при изолированных и множественных огнестрельных переломах длинных трубчатых костей // Влияние антропогенных факторов на структурные преобразования органов, тканей, клеток человека и животных: Материалы 2-й Всерос.конф.- Саратов, 1993.-Ч.2.-С.13.

12.Гололобов В.Г., Дулаев А.К., Вовченко В.И., Попов A.C. Регенерационный остеогенез при огнестрельных переломах и его коррекция даларгином II Антигипок-санты и актопротекторы - итоги и перспективы: Материалы Рос.науч.конф,- СПб., 1994,- Вып.З,- С.237.

13.Гололобов В.Г., Михайлов С.В., Рыбина Л.П. Модификация способа обработки костной ткани после огнестрельного перелома для последующего гистологического исследования // Усовершенствование методов и аппаратуры, применяемых в учебном процессе, медико-биологических исследованиях и клинической практике: Сб.рацпредложений ВМедА.- СПб., 1995.- С.23.

14.Данилов Р.К., Гололобов В.Г., Графова Г.Я. и др. Регенерация тканей в условиях воздействия экстремального фактора // Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологических воздействий на внутреннюю среду организма: Междунар.симп.: Материалы.- Чолпон-Ата, 1993,- С.68-69.

15.Данилов Р.К., Графова Г.Я., Хилова Ю.К., Гололобов В.Г. и др. Клеточно-дифферонная организация регенерационного гистогенеза при огнестрельном поо-

реждении // 3-й Съезд анатомов, гистологов и эмбриологов Российской Федерации: Материалы.-Тюмень, 1994.- С.58-59.

16.Дедушкин B.C., Артемьев A.A., Гололобов В.Г. Современная концепция лечения огнестрельных переломов, содержание и объем хирургической обработки // 6-й Съезд травматологов-ортопедов СНГ: Материалы.-Ярославль, 1993.- С.121-122.

17.Дедушкин B.C., Гайдуков В.М., Клишов A.A., Гололобов В.Г. Микроскопическое строение межотломковых тканей и источники регенерации ложных суставов II Ред.журн. "Ортопедия, травматология и протезирование",- Харьков, 1991.- 18 с.-Деп. во ВНИИМИ 06.05.91 N D-21304.

18.Дедушкин B.C., Гололобов В.Г., Артемьев A.A., Дулаев А.К. Регенерация костной ткани при огнестрельных переломах (клинико-морфол. параллели) // Критерии и методы оценки жизнеспособности тканей в раневом процессе: Материалы науч.конф,- СПб., 1993,- С.17-18.

19.Дулаев А.К., Ерохов А.Н., Клишоа A.A., Гололобов В.Г. Система адаптации и заживление огнестрельных ран конечностей // Огнестрельная рана и раневая инфекция: Материалы Всесоюз.юбил.конф., посвящ. 180-летию со дня рождения Н.И.Пирогова и 150-летию его науч.и педагогич.деятельности в Мед.-хир.акад. России.-Л., 1991.- С.21-22.

20.Клишов A.A., Гололобов В.Г., Хилова Ю.К. и др. Гистологи Военно-медицинской академии им.С.М.Кирова - практической медицине // Арх.анатомии, гистологии и эмбриологии,-1991.- Т.100, вып. 9-10,- С.5-18.

21.Клишов A.A., Графова Г.Я., Гололобов В.Г. и др. Клеточно-дифферонная организация тканей и проблема заживления ран II Арх.анатомии, гистологии и эмбриологии.- 1990,- Т.98, вып 4.- С.5-23.

22.Клишов A.A., Данилов Р.К., Графова Г.Я., Гололобов В.Г. и др. Клеточно-дифферонная организация тканей и проблема регенерации //11-й Съезд анатомов, гистологов и эмбриологов: Тез.докл,- Смоленск, 1992.- С.110.

23.Клишов A.A., Хилова Ю.К., Гололобов В.Г. и др. Новые представления о клеточно-дифферонной организации тканей и проблема регенерации И 2-й Всерос. съезд анатомов, гистологов и эмбриологов: Материалы.- М., 1988.- С.56-57.

24.Ковалевский A.M., Гололобов В.Г., Иорданишвили А.К., Панченко М.М. Методологический подход к изучению остеогенных свойств фармакологических препаратов для челюстно-лицевой хирургии и стоматологии II Современные принципы и методы лечения стоматологических больных / Под ред.проф.В.Н.Балина.- СПб., 1994,- С.30-31.

25.Хилова Ю.К., Клишов A.A., Гололобов В.Г. и др. Клеточные механизмы раневого процесса II Гистогенез и регенерация: Тез.науч.конф,- Л., 1986.- С.74.