Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Молочнокислые бактерии в микробном биоценозе желудочно-кишечного тракта новорожденных телят.

На правах рукопису

ШЕВЧУК Роман Михайлович

МОЛОЧНОКИСЛІ БАКТЕРІЇ В МІКРОБНОМУ БІОЦЕНОЗІ ШЛУНКОВО-КИШКОВОГО КАІІ/^ЧУ НОВОНАРОДЖЕНИХ ТЕЛЯТ

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія, вірусологія, епізоотологія,мікологія та імунологія.

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації и* здобуті* наукового ступепя к*шівд»іа >гтсрнім|чіих наук

Диссртаціпо е рукопис.

Робота виконана у відділі промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України та лабораторії кафедри мікробіології і вірусології НАУ

Науковий керівник - доктор біологічних наук, провідний науковий співробітник Ковалеико Надія Констицтішівна;

Офіційні опоненти • доктор ветеринарних наук Волинець Лернід Кузьмич

• кандидат ветеринарних наук, доцент Євтушенко Анатолій Федорович

Провідна організація - Білоцерківський державний аграрний університет.

Захист дисертації відбудеться " {&“ Міо(гТняі996 р. о 10.00 годині на засіданні Спеціалізованої рада: Д.01.05.10 в Національному аграрному університеті при факультеті ветеринарної медицини за адресою: 252041, Київ-41, вул. Полковника Потехіиа, 16, уч.корп. 12 ауд. 400"д".

Просимо прийняти участь в обговоренні дисертації при її захисті або надіслати відгук на автореферат у двох примірниках, завірений печаткою, за адресою: 252041, Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, НАУ, сектор захисту дисертацій.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного ьграрного університету.

Автореферат розісланий * 6? ' " ^ЄІСсНСІ 1996 р.

Вчеииґі секретар ■

Спеціалізованої вченої ради, доктор ветеринарних наук,

професор Бортиічук О.А.’

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Нормальна мікрофлора травного каналу відіграє' ьажіиву роль б життєдіяльності організму тварини. В сучасній технології вирощування молодняка широко застосовують антибіотики, хіміотерапевтичні засоби для боротьби з захворюваннями, а також для стимуляції росту. Часто це призводить до появи антибіотикорезистентиих штамів патогенних бактерій, розвитку дисбактеріозів, що обумовлює сприятливий фон для виникнення захворювань. Створення нормального мікробного ценозу в кишечному каналі телят з перших днів життя і збереження його протягом вирощування в "молочному періоді" набуває в сучасних умовах особливої актуальності. '

Молочнокислі бактерії с обов'язковим компонентом нормальної мікрофлори шлунково-кишкового каналу новонароджених тварин. Однак їх кількість, видовий склад, ан гибіопікорезистеятність і антагонізм по відношенню до інших мікроорганізмів, які знаходяться в шлунково-кишковому каналі новоиароджепих телят практично не вивчені. Недостатньо досліджено їх культуральні і фізіолого-біохімічиі властивості. Особливий інтерес являє селекція активних штамів-антагоністів і дослідження їх впливу на організм новонароджених телят.

Мета та завдання досліджень. Мета даної робота - вивчити динаміку заселення травного каналу новонароджених телят нормальною мікрофлорою, визначити її чисельність, видовий склад, культуральні, морфологічні, біохімічні та фізіологічні властивості мікроорганізмів, а також підбір оптимальних живильних середовищ для їх культивування. Для того, щоб досягти вказаної мети, нами вирішувались слідуючі наукові завдання:

- дослідити процес формування нормальної мікрофлори у кншечинку здорових новонароджених телят;

- виділити молочнокислі бактерії з травного каналу дослідних тварин різних вікових груп;

- вивчити кількісний і видовий склад ізольованих молочнокислих бактерій, їх біологічні властивості;

- дослідити вплив ізольованих штамів молочнокислих бактерій антагоністів на патогенні штами Е.со1і, які здатні викликати захворювання у новонароджених телят;

- визначити резистентність виділених штамів молочнокислих бактерій до найбільш поширених антибіотиків, що застосовуються у ветеринарній практиці, а також дослідити їх вплив на організм новонароджених телят.

Наукова новизча. Проведені мікробіологічні дослідження мікрофлори травного каналу новонароджених телят, вивчено формування складу мікробіоценозу у тварин цього віку. Визначено кількісний і видовий склад мікрофлори різних таксономічних груп. Виявлено

з

домінуючі види молочнокислих бактерій, які знаходяться в кишковому каналі новонароджених телят. Вивчено їх морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні властивості. Виявлена біологічна активність, запропоновані критерії відбору культур дня .розробки пробіотйчного препарату.

Практичне значення роботи. Встановлено, що молочнокислі бактерії є облігатними представниками травного каналу новонароджених телят. їх кількість та видовий склад залежать від віку тварин. . (

Селекціоновано штами молочнокислих бактерій, які мають антагоністичну активність по відношенню до збудника колібактеріозу телят та- інших патогенних мікроорганізмів. Оптимізовано умови вирощування відібраних штамів при періодичному їх культивуванні.

На основі проведених в господарстві досліджень встановлено, що формування нормальної мііфофлори травного каналу у новонароджених' телят відбувається з віком і залежить від чисельності та видового складу лактобацил і стрептококів, мікрофлори молозива, способу утримання тварин. Доведено, що використання з профілактичною метою селекціонованих штамів молочнокислих бактерій до випоювання молозива або з першими його порціями сприяє кращому розвитку і збереженню молодняка, формує нормальний мікробний ценоз травного каналу.

Аппобанія роботи. Матеріали дисертації доповідались на республіканській науковій конференції "Загальна епізоотологія:імуігологічні, екологічні та методологічні проблеми" (Харків, 1995), на IV зїзді паразитоцеиологів України (Харків, 1995), науковій конференції професорсько-викладацького складу та аспірантів "Проблеми агропромислового комплексу: пошук, досягнення" (Київ, 1994, 1995). ,

Публікація результатів досліджень. Основні положення дисертації опубліковані в 5 наукових працях.

Обсяг та структура пнсеатаиїї. Дисертація викладена на 174 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, експериментальної частини, що включає опис матеріалів і методів роботи, та 4-х розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаної літератури, що містить 262 джерела, в тому числі 115 зарубіжних авторів. Робота ілюстрована 23 таблицями та 17 малюнками. .

Декларація особистого внеску. Всі матеріали дослідів, їх обгрунтування та висновки здобуті особисто иошукачем.

На захист виносяться наступні положення дисертаційної роботи:

- динаміка формування мікробіоцевозу в шлунково-кишковому каналі новонароджених телят;

- видовий склад молочнокислих бактерій, їх культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні властивості;

- антагоністична активність окремих видів молочнокислих бактерій по відношенню до патогенних штамів Е.соіі, і інших мікроорганізмів родини Hnterobacleriaceac, та їх штибіотикорезистентність;

- вплив селекціонованих культур на збереження, ріст і розпиток молодняка великої рогатої судоби.

Власні дослідження

Матеріали та методи досліджень. Основним об'єктом дослідження були телята різних вікових ■руп: 8 год. з моменту від народження, 1, 3, 5, 7, 9 і 14 днів. Дослідження проводили а радгоспі ’Хотівськнй" Києво-Святошинського району Київської області. Кожну серію дослідів проводили в Трикратній повторності на телятах чорно-рябої породи, по 10-11 голів у групі. Для виділення мікрофлори використовували диференційно-діагностичні і селективні поживні середовища. Сількість мікроорганізмів визначали методом серійних роззедень. Первинні посіви здійснювали !е пізніше, ніж через 4 години після взяття дослідного матеріалу. Молочнокислі бактерії сультнвуваїш в аеробних умовах, кількість їх визначали, використовуючи селективне для цієї ■рупп мікроорганізмів середовище - МРС (І.С. de Mann, M.Rogosa, М.Е.Sharpe, цит. за

і.К.Коьаленко, 1992). Ідентифікацію ізольованих штамів молочнокислих бактерій здійснювали за морфологічними, культуральннми та біохімічними властивостями, використовуючи визначник iepri (Bergey’s Manual, 1946), а також роботи А.АЛенцнера І спів. (1968), Є.І.Квасннкозл, ).А.Нестсренко (1975), Л.А.Банниковой (1975), M.E.Sharpe (1981), Н.К.Коваленко (1992).

Ферментацію вуглеводів і спиртів вивчали па бульйоні - МРС без м'ясного екстракту і іуглеводів За методом, запропонованим R.NVhittenbuiy (1963). Для диференціації гетеро- і ■омоферментативних молочнокислих бактерій використовували метод T.Gibson, I.Abdel-Malek цит. за Є.І.Квасниковим, О.А.Нестеренхо, 1987).

Антагоністичні властивосгі ізольованих культур молочнокислих бактерій по підношенню до гзтогенних для телят штамів Е.соіі визначали за допомогою методу відстроченого антагонізму В.А.Фшшппов, 1981).

Вшшз штамів-антагоиістів на ріст тест-культур родів: Proteus, Staphylococcus, Klebsiella, 'itrobacter, Enterobacter, Shigella вивчали методом радіальних штрихів (Н.С.Єгороч, 1986).

Чутливість лактобактерій до різних груп антибіотиків визначали за допомогою паперових іисків, які містили стандартні концентрації антибіотиків.

Нешкідливість . селекціонованих культур для новонароджених телят оцінювали на абораторних тваринах згідно з рекомендаціями Е.А.Мельннкової (1977), С.Р.Рєзніка (1990).

З метою вивчення впливу селекціонованих штамів на організм новонароджених телят активні їх клітини задавали тваринам "per os".

Статистичну обробку експериментальних даних здійснювали за методикою П.В.Терентьева (1977), використовуючи програмований мікрокалькулятор "Електроніка МК-54" за відповідною програмою. Вірогідною вважали різницю при Р < 0,05.

Результати досліджень

1. Динаміка бактеріального ценозу у кишечнику здорових новонароджених телят. Встановлено, що у телят, період після народження яких становив 8 годик, при дослідженні вмісту кишечника не спостерігали масового росту загальновідомих груп мікроорганізмів. Виняток становили спороутворюючі бактерії, загальна кількість яких досягала 10* кл/г. У тварин 1 -денного віку відмічено ріст мікроорганізмів роду ешеріхій до 109 кл/г, молочнокислих стрептококів - 10® кл/г, пропіоиовокислих бактерій • 10* кл/г.

Кількість ешеріхій у кишечному вмісті телят поступово збільшувалась, досягаючи на 3-ю добу після народження Ю10 кл/г, зростала також кількість молочнокислих та пропіоиовокислих бактерій. На 5-7 добу після народження у тварин кількість ешеріхій утримувалась на рівні 10*°-109 кл/r, спостерігалось збільшенім кількості молочнокислих бактерій до Ю10 кл/г, а також пропіоиовокислих бактерій - до 109 Кл/г. Спороутворюючі мікроорганізми в цей період виділялись в незначній кількості. їх концентрація ие перевищувала 10s кл/r. Спостерігалось також заселення дріжджами, кількість яких становила на 7-й день 103 кл/г. У 3% дослідиих тварин висівався протей (до 104 кл/г). .

В 9-денному віці відбувалося зменшення мікроорганізмів групи кишкової палички до 107 кл/г. Молочнокислі і пропіоновокислі бактерії утримувались на рівні 10® кл/г та 107 кл/г відповідно. На 14-у добу життя тварин процес становленій кишкової мікрофлори стабілізувався.

Результати досліджень (таблиця 1) показали, що кількість мікроорганізмів у фекаліях

• здорових новонароджених телят після 1-денного віку значно збільшується. Ешеріхії, молочнокислі, пропіоновокислі бактерії відносились до перших мікроорганізмів, які виділяли у абсолютної більшості тварин, починаючи з 24-годшшого віку, і усіх дослідних тварин у 3-5-добовому віці.

Кількість молочнокислих бактерій зростала поступово. Частота виявлення і чисельш , стабільність цих бактерій у здорових новонароджених телят свідчить про необхідній! присутності їх в травному каналі. ■ "

2. Молочнокислі бактерії шлунково-кишкового тракту новонароджених телят.

Видовий склад шлунково-кишкової мікрофлори вивчався протягом молочного періоду вирощування дослідних тварин, починаючи з 8-ми годин після народження до 14-денного віку Виявлено, що вміст молочнокислих бактерій в травному каналі тварин закономірно змінюється з їх віком. Кишковий тракт заселяється ними досигь інтенсивно і вже на кінець першої доби кількість лакгобактерій сягає сотень тисяч - мільйонів клітил в і грамі вмісту. У телят протягом всього періоду досліджень, а особливо в перші дні після народження, кокові форми мікроорганізмів були домінуючими. Молочнокислі палички виділялись, починаючи з третьої доби життя тварин.

■ Таблиця 1

Чисельність мікроорганізмів окремих груп у фекаліях здорових новонароджених телят (десяткові логарифми) і частота їх виявлення (% до досліджених)

Вік тварпя, годнії, днів Молоч- нокислі бактерії Лропіоново- кпслі бактерії Е.соїі Протей Спороутпо-рюючі . мікроорганізми Дріжджі Гриби

8 год. 0 0 0 0 3.60*0.1 23,1 0 0

1 день 7,63±0.І 90,0 8.39±0.3 88,6 8.95*0.2 84,8 0 5.47*0.2 5,0 0 0

3 день 8.79і0.3 100,0 8.50±0.4. 89,4 10.07*0.3 100,0 0 3.47*0.1 10,6 0 0

5 день 9.87±0.4 100,0 8.68*0.1 100,0 10.25*0.2 100,0 4.2*0.1 3,0 4.77*0.2 21,4 0 0.60*0.02 60,6

7 день 9.89±0.2 100,0 А55±М 100,0 9.46*0.3 100,0 0 4.27±0.1 28.4 2.9510.1 71,4 2.69*0.1 68,8

9 день 9.95±0.2 7.78*0.3 7.32±0.2 0 4.69*0.2 3.84*0.1 2.23*0.1

100,0 100,0 100,0 43,6 82,4 75,3

14 день 9.1І±0,І іоо,о : 7.47*0.3 100,0 7.27*0.2 100,0 0 4.47*0.1 62,1 3.21*0.1 98,0 1.04*0.04 88,2

Примітка: 0 - мікрооргаипчи не висівались із розселенім 10і; чисельник - кількість- мікроорганізмів (1®/г фекалій); знаменник - частота еиівлсиия (в % ло досліджуваних).

Встановлено, що серед представників даної групи мікроорганізмів зустрічались як гомоферментативні, так і гетероферментативнІ лаетобактерії. З них 107 штамів віднесено до родини Streptococcaoeae і 98 до родини Lactobacillaccae, роду Lactobacillus.

У перші даі доби після народження видовий склад кокових форм мікроорганізмів у телят виявився достатньо одноманітним. Були виділені штами видів: Lactococcus lactis, Enterococcus faecium, E. faecalis, E. faecalis subsp. liquefaciens. Лактобацили виділяли в значних кількостях, починаючи з третьої доби після народження тварин. Вони були представлені видами: Lactobacillus fermentum, L. plantarum, L. casei, L. viridescens, L. buchneri (табл. 2).

Таблиця 2

Видовий склад молочнокислих бактерій, виділенні з травного Каналу ііозонароджсішх телят різних вікових груп

Вік тварин, ДНІ ВИД ВИДІЛЕНИХ МІКРООРГАНІЗМІВ Граничні розведення, в яких реєстрували ріст мікроорганізмів

1. Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, E. faecium 1x10"

3. Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, . E.faecium.E.durans, Lactobacillus fermentum, L.plantarum, L.casei, L.viridescens, L.buchneri. . 1 х 10*

5. ’ Lactobacillus fermentum, L.plantarum, L.casei, L.viridescens,L.buchneri, Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, E.faccalis subspJiquefaciens, E.faccium, E.durans. 1 х Ю10 t

7. Lactobacillus fermentum, L.plantarum, L.casei,L.casei subsp. rhamnosus, L.viridescens, L.buchneri Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Enterococcus faecalis, E. faecalis subsp. liquefaciens, Eiaeciura, E.durans. 1 х Ю10

9. Lactobacillus plantarum, L.fermentum, L.casei,Lactococcus lactis, L.viridesCens,L.buchneri, Enterococcus faecium, E.faecalis, E. faecalis subsp. liquefaciens. ІхІО10

14. . Lactobacillus fermentum, L.plantarum, L.casei, L.viridescens, L.buchneri, Lactoc' ccus lactis,Enterococcus faecium, E.faecalis. 1 xlO*

Таким чипом, я результаті проведених досліджень з травного каналу піддослідних тварин виділені молочнокислі бактерії, що відрізнялись різноманітністю видового складу і характеризувались присутністю як облігатннх форм, що заЕЖдк зустрічались в дослідному магсрі&лі, так і факультативних, які виділялись нерегулярно. З граничних розведень дослідного матеріалу виділяли бактерії видів: Lactobacillus plantamm, L.casei - представники облігатнгх гомоферментаїнвних мікроорганізмів і L.ferraentum, L.viridescens - представники гетерофермептативннх бактерій. Окремі штами, виділені нами, характеризувались резистентністю до гдтибіотиків, які найчастіше застосовуються у ветеринарній практиці.

3. Моріьолого-культуралькі та фізіолого-біохімічні нпаст;шості лактобактепій. виділених з травного каналу телят '

Виділені нами з травного канал;- телят молочнокислі бактерії відповідають властивостям мікроорганізмів,що відносяться до родини Lactobacillaceae, роду Lactobacillus Beijerinsk, а також родів Enterococcus, Lactococcus, Leuconostoc, родини Streptococcaceae. Дані властивості в більшості відповідають схема:.! 9-го видання визначника Бергі (Bergey's Manual, 1986, v.2).

Всього виділено і вивчено 205 штамів молочнокислих бактерій, я?:і одержані з кишкового тракту піддослідних тварин. Встановлено, що 47,8% штамів складають п?личковидні форми мікроорганізмів, 52,2% - кокові форми.

Рід Lactobacillus об'єднує падичковидні форми бактерій, які крім властивостей, загальних для родини Lactobacillaceae, потребують складних компонентів у поживних речовинах для свого росту

і розмноження. Фізіологічно вони близькі до роду Lactococcus, хоча відрізняються від нього формою клітин, активністю росту, здатністю рости на поживних середовищах з більш низьким pH (3,8 і нижче), а також високою чутливістю до несприятливих умов, особливо до надлишку кисню. Для диференціації видів лактобацші нами використовувалися такі ознаки: тип молочнокислого бродіння, ріст при різних температурах, спектр зброджуваних вуглеводів, кількість і оптичне обертання молочної кислоти, характер росту культур в молоці. До підроду Streptobacterium були віднесені 45 штамів гомоферментативннх лактобацил, які представлені -.рьома видами: L.plantarum, L.casei, L.casei subsp.rhamnosus. Характерна властивість стюептобактерій - відсутність здатності утворювати газ з глюкози і проявляти ріст при низьких температурах (15°С). Спід відміїити те, що більшість виділених лама штамів цієї групи характеризувалися здатністю рости при температурі 37-45°С, що пов'язано очевидно з фізіолопчним станом тварин, від яких дані види мікроорганізмів були ізольовані. Ці види можна розмежувати між собою за деякими біохімічними властивостями. Штами L.plantarum, на відміну від L.casei,' зброджують рафінозу, арабінозу і гідролізукт. ескулін. Культури L.casei subsp. rhamnosus, на відміну від L. casei, активно ферментують рамнозу. Чіткі результати одержані прн вивченні вітамінної потреби

гомоферментативиих молочнокислих бактерій. Так, якщо всі культури Ь.рІаШагит проявляють ріст на середовищі без рибофлавіну і фолієвої кислоти, то для культивування Ь.сжсі присутність названих компонентів - обов'язкова.

Гетерофермеитативні молочнохнелі бактерії, виділені нами з травного каналу, віднесені до трьох видів: Е.ГегтепШт, Ь.ЬисЬпегі, Ь.уШезсеги. Всі досліджені штамп утворюють газ з глюкози, кінцевим продуктом бродіння є молочна кислота, етанол і СОг. Не продукують катал азу. Більша половина штамів бетабактерій ке утворювали аміак з аргініну. Окремі культури Ь.ГеппепШт характеризувалися здатністю утворювати вторинний ріст колоній на поверхні агаризоваїшх середовищ. В наших дослідах для ідентифікації враховувались фізіологічні і біохімічні властивості. Дифереішійішми ознхсаші ЫГепптШт від Ь.ЬисЬпегі і Ь.уіпсієзсєіи є здатність перших знебарвлювати метиленове і лакмусове молоко після 8-ми годин інкубації і відсутність росгу при 15сС, хоча остання властивість, за нашими даними, виражена не в усіх штамів цього виду. Штами Ь.ЬисЬпегі, на відміну від Ь. утскжепз, зброджували рафінозу, арабінозу, ксилозу і альфа-метид-Д-гліокозвд.

Як показалн результати проведених: досліджень, кокові форми молочнокислих бактерій виявились домінуючими в загальному складі мікробного ценозу травного каналу новонароджених телят. З дослідного матеріалу нами виділено 112 штамів кокових форм мікроорганізмів, з яких 68 віднесені до роду Етегососсив, 37.- Ьасіососсиз' 2 - Ьеисошкіос. Ідентифікувати 5 штамів не вдалося. Рід Етегососсіи представляли такі види мікроорганізмів: Е.ГаесаІіз, Еіаесаііз яДяр. ІіяиеҐасіеш, Е.Гассіит і Е.сіигааз. Дані види мікроорганізмів харакіернзуються властивостями типових представників цієї група. На основі проведених досліджень, для більш чіткого розмежування видів, зокрема Е.ґаесаіія і Еіаесіига використовувались такі ознаки: швидкість знебарвлення лакмусового і метиленового молока, зброджування арабінози, сорбіту, декстрину і альфа-метил-Д-глюкозцду, характер гемолізу, потреба як джерела вуглеводів солі лимонної кислоти. Характерною ознакою, яка дає змогу диференціювати під Е.£аеса!із їиЬгр. ІіциеГасіеш та Е. ГаесаИэ, є здатність першого активно гідролізувати желатин. Спід зазначити, що особливістю ентерококів, які виділені від новонароджених телят, е їх висока енергія иіслотоутеореши, що не властиво даним видам мікроорганізмів. На наш погіїяд, здатність більшості штамів утворювати значну «сількість молочної кислоти (0,4-0,79%) - характерна дл* лакгобадил. Але, враховуючи той факт, що тварини в перший період після народження отршуіоте в своєму раціоні молозиво і всі ферментні системи травного каналу функціонують активно, ентерококи набули таку властивість. Здатність утворювати відносно велику кількість молочної кислоти с ознакою адаптивного характеру для даної екологічної ніші.

«

З кокових форм молочнокислих бактерій, які відносяться до "молочної групи", в процесі досліджень було виділено 37 культур, які після диференціальної діагностики віднесено до виду Lactococcus lactis. Найбільш характерними ознаками цього вицу с: здатність утворювати в поживному середовищі значну кількість молочної кислоти, ріст пря температурі 15°С, неспроможність росту в середовищі з 6,5% NaCl, 40% жовчі та при pH - 9,6. Штами цього виду не утворювали газ з глюкози і не викликали гемолізу еритроцитів, проте характеризувалися здатністю швидко відновлювати лакмус і сквашувати молоко, при цьому гранична кислотність коливалась від 70 до 104°Т. Таким чином, з кишкового вмісту нами виділена група лантококіз, яку за рядом ознак можна віднести до типових представників виду L.lactis.

4. Антагоністична активність молочнокислих бактерій по відношенню до Е.соїі. патогенних для новонародженого молодняка.

Антагоністичну активність визначали по відношенню до тест-культур Е.соїі. В якості тест-культури використовували штами Е.соїі, серотипів О» та Озо, які викликали колібактеріоз у молодняка і виділялись при масовій загибелі телят. Виявлено антагоністичну активність 175-ти штамів молочнокислих бактерій, які відносились до родів: Lactobacillus, Lactococcus і Enterococcus. Штамп були виділені з травного каналу та фекалій новонароджених телят різних вікових груп. З ціао метою дослідження проводили методом відстроченого антагонізму. Про ступінь антагоністичної активності штаму до тест-міхроорганізму судили за шириною зони відсутності росту останнього: 6- 10 мм - низька (1 бал); 10-30 - середня (2 бали); 30 мм і більше -висока (3 бали) антагонісгачва активність.

Кокові форми мікроорганізмів, які наділені такою активністю, ізолювали з перших днів після народження телят і протягом всього, періоду досліджень. Лактобадили-антагоністи виділялись від тварин, починаючи з 5-добового віку і старших.

Активні штами представлені в переважній більшості такими видами: LsctcbaciKus plantarum, . L.fcrmentum, L.casei, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, рідше L.buchneri і L.viridescens (табл.

3, 4). Найбільш пригнічуючу дію на тест-культури виявляли представники видів: L.plantamm, L.lactis, Efaecium, що чітко корелювалос* з їх висохою кислотоутвопюючою активністю. При цьому золи відсутності росту становили в середньому від 8,0 до 29,8 мм. В більшості випадків всі штами виду L.plantamm виявляли високу антагоністичну активність, вони утворювали максимальні зони інгібування тест-культур і на середовищах МРС без глюкози. Штами L.lactis помірно пригнічували ріст Е.соїі, проте серед них кількість культур, що мали аятагоиістшші властивості, була значною (34 штами з 37 досліджених).

Таблиця З

Віідовиіі склад лактобацил-антагошстів, виділених від новонародженого молодняка, по підношеним до пзтогешшх мікроорганізмів групи Escherichia coli

Джерело Досліджено штамів

Вид , виділення ІІСЬОГО зона пригнічення росту, мм

6-10 10-30 >30

L.plantarum Травний канал, фекали 23 1 3 19

L.fernientum 26 ‘ 3 8 15

L.casei и 12 .4 5 3

L.casci subsp.rhamnosus т»ш 1 ' І

L.buchneri ■ 3 1 2 -

L.viridcscens . 9 3 4 2

Всього штамів 74 12 23 39

Таблиця 4

Видовий склад мікроорганізмів родів Enterococcus т» Lactococcus, виділених від новонародженого молодняк», які проявили антагонізм по відношенню до патогенних Escherichia coli

Джерело Досліджено штамів '

Вид виділення всього зона оригиічеїшя росту, мм -

6-10 10-30 >30

E.faecium Травний канал, фекалії ‘ 31 1 3 27

L.lactis N 37 3 25 9

E.faecalis 23 . 11 8 4

E.faecalis 3 2 1 -

varjiquefaciens

E.durans 7 2 4 1

Leuconostoc 2 . 2 - - • ■

mesenteroides .

Всього штамів 103 21 41 41.

Визначена стабільність антагоністичних властивостей активних штамів: L.piantarum, L.lactis і E.faecium прн використанні різних методів постановки досліду. Встановлено, що пригнічуюча дія даних культур по відношенню до патогенних штамів Е.соїі спостерігалась при використанні застосованих нами метода, гас аідстроченого антагонізму, так і радіальних штрихів. Досліджено, що інгібуюча дія аггамів виду L.plantamn збільшувалась із збільшеним часу культивування до 2472 годин, а в подальшому залишалась на досягнутому рівні. Максимальна антагоністична активність досягалась в стаціонарній фазі росту мікроорганізмів.

5. Взаємовідношення штамів-антагопістів молочнокислих бактерій з іншими мікроорганізмами.

Результати дослідів показала, що штами L.piantarum, Е. faecium і меншою мірою L.lactis, які були виділені від здорових тварин, пригнічували ріст Coiynebacterimn michiganenss, Agrobacterium tumefaciens, Bac.mesentericus, Proteus vulgaris, Staphylococcus sure us, Nocardia sp., Erwinia caxotofora і яе впливали на ріст дріжджів Candida albicans, грибів: Fusarium svenaceum, Aspergillus sp. Встановлено, що антагоністичні властивості значною мірою залежать від виду молочнокислих бактерій, штамів тест-культур та поживного середовища ях« використовується. Окремі штами -L.piantarum і E.faecium повністю пригнічували ріст Corynebacterium michiganense, Agrobacterium tumefaciens, і в меншій мірі - Proteus vulgaris. Staphylococcus aureus (таблиця S).

В результаті проведених досліджень одними з найбільш активних серед усіх вивчених нами пггамів лактобацил виявились два штами виду L.piantarum: 15/4(2), 18,7(6), а серед кокових форм мікроорганізмів - два штами виду E.faecium 9/9(5), 15/6(3) і штам L.lactis 6/8(1).

Встановлено, що окремі штами видів: L.piantarum, L.casei і меншою мірою E.faecium та L.lactis пригнічували ріст тест-культур в умовах, які виключали процес утворення молочної кислоти на середовищах, які не містили в своєму складі вуглеводів, що зброджуються. Дані види мікроорганізмів, крім молочної кислоти, утворюють у середовищі культивування специфічні антибіотичні речовини.

6. Резистентність окремих штамів молочнокислих бактерій до антибіотиків.

Вивчали антибіотикорезистентність виділених молочнокислих бактерій, а також їх морфолого-біохімічні властивості. Для цього використовуватись найбільш перспективні з них (активні кислотоутворювачі, які характеризувались високою антагоністичною активністю, а також найчастіше виділялися з дослідного матеріалу). В дослідах використовували штами таких видів: Lactobacillus plantarum, L.casei, Enterococcus faecium, E. faecalis і Lactococcus lactis. В роботі використовували стандартні паперові диски антибіотиків, що часто застосовуються у ветеринарній практиці: стрептоміцин, тетрациклін, еритроміцин, мономіцин, поліміхеїш, неоміцин, пеніцилін, левоміцетин, олеандоміцин.

Таблиця 5

Активність штамів-аігшчшістів по відношенню до різшіх тсст-мікроорганЬміа '

(цифрами вказані зони пригнічення росту в мм)

Тест- мікрооргашзми Середовище Вид, штам •

L.plantarum E.faccium L.lactis

15/4(2) 18/7(6) 9/9(5) 15/8(3) 6/8(1)

Staphylococcus aureus 1 2 0 10 2 0

2 6 2 6 . 0 0

Bac.mesentericus 1 21 . 15 21 9 7

2 13 8 16 4 5

Proteus vulgaris I 7 13 7 3 2

2 19 27 3 0 0

Escherichia coli 1 17 M 22 20 8

2 25 • 35 18 13 6

Agrobacterium 1 M M M M M

tumefaciens 2 M 36 M 34 25

Nocardia sp. 1 30 M 36 32 19

2 M M 27 20 17

Ervvinia carotovora 1 24 34 15 18 14

2 M 40 9 12 5 *

Coiynebacteriummichi 1 M M M M M

ganense 2 M M 40 38 26

Умовні позначення: .

1 - поживне середовище МРС без оцтовокислого натрію і лимоннокислого амонію;

2 - стрептоміцетннй агар з дріжджовим автолізатом;

М - максимальна зона пригнічення росту (ріст тест-мікроорганізму пригнічується повністю).

Примітка: всі штами молочнокислих бактерій пригнічували ріст Coiynebacterium michiganense, Agrobacterium tumefaciens, але не пригиічували росту Candida albicans, Fusajium avenaceum, Aspergillus sp.

Результати досліджень показали, шо ріст більшості штамів молочнокислих бактерій затримувався довкола дисків з такими антибіотиками, як: левоміцетин, тетрациклін і неоміцин, оскільки дані антибіотики створювали найбільш інгібуючу зону впливу на більшість культур цій' групи мікроорганізмів. А до поліміксину, стрептоміцину, мономіцину і частково до пеніциліну більшість досліджуваних штамів проявляли резистентність (таблиця 6). Окремі штами виду

Е.Гаесіит, ЬДасиэ, яа відміну від лактобахтерііі, виявилися стійкими до антибіотиків тетрацикліну і левоміцетину, проте було відмічено їх зони пригніченій довкола дисків з пеніциліном і, частково, олеандоміцином. З молочнокислих паличок Суло ізольовано штами, які проявляли резистентність до стрептоміцину, полімішшу, мономіцнну і пеніциліну, особливо це характерно для штамів виду: Ь.ріаіиаіит - 18/7(6), Ь.согеі - 13/4(10).

Таблиця б

Чутливість окремих ЕПТЕМга МОЛОЧНОКИСЛІЇ! бактерій, виділених від иовонародасеііого молодняка до антибіотиків (цифрами вказано розмір зон пригнічення росту в мм)

Вид Номер штаму Антибіотики

стрепт ОМІЦНІІ тетрац иклііі ери- тром ІЦ11Н мопс МІЦШІ полі- МІКСШ! пеом ІЦИИ пен іци ЛІ.'І лево міце ТІШ олеан доміц ІШ

Ь.р1гп$апіт 18/7(6) 0 1 0 0 0 2 0 4 0

15/4(2) 1 3 2 0 0 6 1 8 1

21/6(1) 0 2 4 1 0 ' 8 2 10 • 2

Ь.сахеі 13/4(10 0 1 2 0 0 3 0 3 0 .

1,. Гегшепиті 29/7(9) 0 2 0 0 0 4 0 6 1

ЕТаесіиш 15/6(3) 0 : 0 1 2 0 2 4 0 0

9/9(5) 2 0 0 0 0 8 6 0 4

28/7(1) 4 0 6 0 0 2 10 0 2

І^Ласіія 6/8(1) 0 0 0 2 0 6 3 0 0

30/5(4) б 0 4 3 0 7 12 1 б

Е.ГаесаІіз 18/6(3) 5 2 8 4 0 . 12 8 .2 8

Примітка: всі штами стіЯкІ до палшіїснг/у.

При вивченні морфологічних властивостей отриманих антибіотикорезистеитних штамів, після пофарбування їх за Грамом, встановлено, що жоден з них ие змінив морфологічних властивостей. Далі культури також ие втратили здатності активного кислотоутвбреніія, так як величина загальної титрусмої кислотності у антибіотикостійких штамів практично ие відрізнялась від інших вихідних штамів.

7. Вплив селекціонованих культур яі збереження, ріст і розвиток молодняка великої ногатої худоби. Молочнокислі бактерії, які постійно лрясуїні у травному каналі і яким властиві антагонізм, резистентність до більшості антибіотиків, здатність синтезувати вітаміни групи В,

являють інтерес в їх використанні для формування нормальної мікрофлори травного каналу новонароджених тварин. ' '

Досліджено взаємовплив відібраних культур видів: Lactobacillus plantarjm, штам 18/7(6), Enterococcus faecium, 15/6(3) і Lactococcus lactis, 6/8(1) на організм новонароджених телят при їх пероральному введенні.

Дані игттн не шкідливі для лабораторних тварин, не утворюють токсичних речовин. Живі культури селекціонованих молочнокислих бактерій позитивно впливають на організм новонароджених телят. Встановлені ефективні дози мікробних клітин для телят на кілограм живої ваги в день: L. plantarum, 18/7(6) - від 7x107 - 7x10®, L.lactis і E.faecium, штамів 6/8(1), 15/6(3) - від 7x10* - 7х109 (Імл суспензії клітин,що задавали в суміші з фізіологічним розчином або молозивом). Слід відзначити, що число молочнокислих бактерій, які вводили тваринам "per os", поступово зростало і зберігалося в травному каналі досягаючи максимальних величин -10* мікробних клітин в одному грамі вмісту. Встановлено, що в групі піддослідних телят виділялись факультативні анаероби, в основному за рахунок збільшення чисельності лахтобактерій. При цьому загальна кількість спорових мікроорганізмів у вмілі кишечника поступово зменшувалась. Таке співвідношення груп мікроорганізмів у травному каналі тварин зберігалось і в 25-30-денному віці, тобто через 5-10 днів після припинення згодовування молочнокислих бактерій.

Підсумовуючи результати досліджень, можна стверджувати, що молочнохислі бактерії в поєднанні з облігаціями мікроорганізмами, які складають мікробіоцеиоз шлунково-кишкового каналу: біфідобахтеріями, пропіоноиокислимн бактеріями, непатогенішми штамами кищко(вої палички, дріжджами та іншими видами корисної мікрофлори, сприяють внживатпо, збільшенню приросту, а також збереженню молодняка на 20-25% протягом всього мояозивпого періоду в порівнянні з контролем. Сукупність усіх позитивних властивостей дозволяє застосовувати штами у виробничих умовах, при вирощуванні молодняка великої рогатої худоби для профілактики шлунково-кишкових захворювань, підвищення його життєздатності та продуктивності.

Висновки

1. В меконії клінічно здорових новонароджених телят, період після народження яких становив 8 годин, виявляли спороутворюзочі мікроорганізми, де їх кількість була незначною і досягала десятків тисяч мікробних клітин в 1 грачі вмісту. Через 24 години у переважної більшості тварин (89%), у фекаліях з'являлись молочнокислі бактерії, пропіоиовокислі бактерії і ешеріхії, чисельність яких сягала до 100 млн/г.

Процес заселення шлунково-кишкового каналу вказаними мікроорганізмами стабілізується за кількісним рівнем па 10-14 день після народження.

2. Групу молочнокислих бактерій в перші дні представляли кокові форми мікроорганізмів, які виділяли у 90% досліджених тварин, в хількості понад 10 млн в 1 грамі вмісту.

3. На першу-друїу добу життя у новонароджених телят видовий склад молочнокислих стрептококів одноманітний і представлений видами: Lactococcus lactis, Enterococcus faecium, E.faecalis, E.faecalis subsp. liquefaciens, E.aurans. Лахтобаинли виділялись, починаючи з третього дня після народження тварин, і представлені видами: Lactobacillus plantanmi, L.fermentum, L.casei, L.viridescens і L.buchneri. Ці види мікроорганізмів, а також L.Jactis, E.faecium і E.faecalis були постійно присутні у вмісті кишечника і фекаліях тварин протягом всього періоду досліджень.

4. Видовий склад молочнокислих бактерій, виділених із вмісту кишечника новонароджених телят, в значній мірі специфічний - переважають гомоферментзтивні кокові форми мікроорганізмів і в меншій кількості паличкОвидні.

5. Ентерококи характеризуються біологічними властивостями типових представників цієї

групи. Рекомендується для більш чіткого розмежування видів, зокрема E.faecalis і E.faecium, враховувати слідуючі диференціальні ознаки: швидкість знебарвленім лакмусового і

метиленового молока, зброджування гліцерину, сорбіту, маніту і альфа-метил-Д-глюк'озиду, гідроліз саліцину і ескуліну, характер гемолізу і застосування, як джерела вуглеводного живлення солі лимонної кислоти.

6. Гомоферментативні молочнокислі палички, виділені нами, представлені трьома видами: Lactobacillus plantarum, L.casei, L.casei subsp. rhamnosus. Штами L.plantarum, на відміну від L.casei ферментували ксилозу, рафінозу і гідролізували ескулін. Вид L. casei subsp. rhamnosus активно зброджував рамнозу, на відміну від L.casei. Використання цих ознак рекомендується нрч діагностиці даних видів.

7. Виділено з дослідного матеріалу три види гетероферментативних молочнокислих паличок: L.fennentura, L.buchneri і L.viridescens. Штами L.fermentum, на відміну від двох останніх, характеризувалися здатністю гідролізувати ескулін, відновлювати метиленове і лакмусове

молоко,зброджувати сорбіт та манозу. Характерною ознакою диференціації культур L.buchneri від L.viridescens с зброджування першими альфа-метші-Д-глюкозиду. '

8. Молочнокислі бактерії є антагоністами по відношенню до мікроорганізмів групи Е.соїі, патогенних для новонародженого молодняка. Активні штами лахтохохів і ентерококів виділялися

з перших днів після народження тварин, лактобацили - з 5-добового віку. Пригнічуюча дія значно виражена серед лактобацил у окремих штамів виду L.plantanun, а серед кокових форм мікроорганізмів - у E.faeciura і L.lactis.

9. Дані штамп бактеріостатично впливали і на ріст патогенних бактерій родів: Proteus, Klebsiella, Cilrobacter, Staphylococcus, Shigella. У окремих культур антагонізм проявлявся в умовах, які виключали кислотоутворення.

10. Встановлено, що оптимальними умовами для культивування селекціонованих пггамів була температура в межах 37-4 ГС, pH середовища б.2-6.4 для виду L.plantarum і 6.8-7.0 для видів E.faecium і L.lactis, при яких активно пригнічувався ріст патогенних мікроорганізмів і відмічалася стійкість даних культур до дії антибіотиків тстрациклінового ряду та пеніциліну.

11. Виділені із вмісту кишечника молочнокислі бахтерії відіграють важливу роль в системі травлення телят молочного періоду. Вони ферментують вуглеводи і беруть участе в сингезі вітамінів. Бактерії цієї групи виконують захисну роль в організмі тварин, як антагоністи патогенних мікроорганізмів, що викликають захворювання шлунхоЕО-кишхового каналу у телят молозивного періоду. Продукти метаболізму лактобактерій, зокрема молочна кислота, є важливіш джерелом енергії для інших груп мікроорганізмів, що складають мікробний біоценоз да}іої екологічної ніші.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Шевчук P.M., Коваленко Н.К., Онуфриез В.П. Микрофлора кишечного биоценоза телят и перспективы ее практического использования. //Сборник статей Международной научной конференции "Общая эпизоотология: иммунологические, экологические и методологические проблемы". - Харьков, 1995. - С. 66-67.

2. Коваленко Н.К., Оиуфрієз В.П., Шевчук P.M. Вивчення мікробного біоценозу шлунково-кишкового тракту у новонароджених телят. //Матеріалі! IV респ. з'їзду паразнтоценологів України. 4-7 жовтая 1995 р. - Харків, 1995. - С. 90.

3. Шевчук P.M., Коваленко И.К., Онуфрій В.П. Вивчення антагоністичних властивостей молочнокислих бактерій шлунково-кишкового тракту' молодняка тварин по відношенню до збудників кишкових захворювань. //Тези доп. наук. конф. професорсько-викладацького складу та аспірантів "Проблеми агропромислового комплексу: пошук, досягнення". - К., 1995. - С. 131.

4. Шевчук P.M., Коваленко Н.К., Онуфрієв В.П. Молочпокнслі бактерії в мікробному біоценозі шлунхово-кишкового тракту телят молозивного періоду. /Яези доп. Української конф. молодих вчених "Сучасні проблеми ветеринарної медицини". - К., 1994. - С. 30. .

5. Шевчук P.M. Вивчення резистентності окремих штамів молочнокислих бактерій до різних груп антибіотиків. //Тези доп. наук, конф, професорсько-викладацького складу та аспірантів "Проблеми агропромислового комплексу: пошук, досягнення" - К., 10-11 квітня 1996.

Ашютаціш

Шевчук P.M. Молочнокислые бактерия в микробном биоценозе желудочно-кишечного тракта новорожденных телят. Диссертация на соискание учепой степени кандидата ветеринарных наук по специальности: 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

Национальный аграрный университет, Киев, 1996. Работа посвящена изучению микрофлоры желудочно-кишечного тракта поворождешилх телят, определению ее численности, видового состава, динамики' заселення. Изложены результаты экспериментальных исследований биологических свойств молочнокислых бактерий. Из их числа отобраны штаммы, высокоактивные и безвредные для теплокровных животных с выраженным антагонизмом по отношению к исследованным возбудителям кишечных заболеваний.

Показано, что отобранные культуры нгршот . существенную роль в пищеварении новорожденных животных. Они ферментируют углеводы к участвуют в витаминном обмене. Определенная роль принадлежит молочнокислым бактериям в формировании нормального микробиоценоза пищеварительного тракта.

Ключові слова: антагонізм, нормальна мікрофлора, молочнокислі бактерії, шлунково-кишковий тракт, мікробіоценоз, лактобацили, ентерококи, дисбактеріоз.

Abstract

Shevchuk R.M. The Milk-acid Bacteria in the Microbe Biocynoz of the Gastrointestinal System of

the Newborn Calves. Presented is a thesis submitted to receive a Scientific Degree of the Candidate of Veterinary Sciences on major 16.00.03, titled Veterinary Microbiology, Virology, Epizootology, Mycology and Immunology. National Agrarian University, Kiev, 1996.

The work is dedicated to the study of microflora of the newborn calves, its quantitive and biological type determination and dynamics of population. The results of experimental investigations of the biological properties of the milk-acid bacteria are pres-nted. From their number the high active and harmless cultures were selected for hot-blood organisms, showing the antagonism relatively to the studied pathogenic agents of the abdominal deseases of animals. It is showed, that selected cultures play a significant role in the functioning of the gastrointestinal system of the newborn animals.

These cultures form sugars and participate in the vitamin exchange. A certain role is given to the milk-acid bacteria in the process of formation of the normal microbiocynoz of the gastro-intestinal system.

ИВК НАУ 3AM. № 163 ТИР ICO- 1996 p.