Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изучение биологических свойств бактерий рода Bacillus и разработка пробиотического препарата для профилактики и лечения диареи новорожденных телят

В настоящее время, на этапе реконструктивных и экономических перестроек животноводческих хозяйств, сокращается поголовье животных, увеличивается заболеваемость инфекционными и незаразными болезнями, в первую очередь желудочно-кишечными, особенно у молодняка. Поэтому одной из главных задач животноводства, в частности скотоводства, от которого зависит качественное пополнение и обновление структуры стада, является получение здоровых телят.

По многочисленным данным отечественных исследователей (М.А. Сидоров, 1981; В.Н. Урбан, 1984; Л.С. Каврук, 1994; А.Н. Панин и др., 1998; В.П. Иноземцев, И.И. Балковой, Г.В. Ноздрин, 1998), массовые желудочно-кишечные заболевания новорожденного молодняка имеют повсеместное распространение и наносят значительный ущерб.

Особое место в этиологии желудочно-кишечных заболеваний с диарейным синдромом занимает условно-патогенная микрофлора.

В настоящее время, одним из перспективных направлений в области профилактики болезней животных, вызываемых условно-патогенной микрофлорой, является применение пробиотиков - биологических препаратов из полезных микроорганизмов - антагонистов, представителей нормальной кишечной микрофлоры (В .И. Никитенко,1993; А.Н. Панин, Н.И. Малик, Е.В. Малик, 1998 и др.). Поиск эффективных микробов-пробионтов является актуальной задачей современной биотехнологии. Особое место среди пробионтов занимают спорообразующие бактерии. Их полная безопасность и безвредность для приготовления пробиотиков являются основанием для широкого изучения в качестве профилактических и лечебных препаратов при различных патологических процессах у человека и животных (Б.В. Тараканов, 1987; П.И. Жданов, 1997; И.И. Братухин, И.Н. Жирков, 1999). 5

В последние годы была установлена широкая распространенность в мерзлотных почвах спорообразующих аэробных бактерий (Н.П. Тарабукина, 1992, 1996). Спорообразующие аэробные бактерии являются перспективной группой для современной биотехнологии (В.В. Смирнов, С.Р. Резник и др., 1982).

В условиях Крайнего Севера, где несмотря на экстремальные условия, скотоводство остается традиционной и главной отраслью северного животноводства, получение здоровых телят является первостепенной задачей.

В связи с этим, разработка и использование экологически безопасных биопрепаратов из представителей нормальной микрофлоры, типичных для живого организма определенного региона, способствующих сохранению здоровья животных, особенно, в экстремальных условиях Крайнего Севера, является актуальной проблемой ветеринарной медицины.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение биологических свойств бактерий рода Bacillus, выделенных из мерзлотных почв Якутии и разработка препарата-пробиотика для профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней с синдромом диареи у новорожденных телят. В соответствии с поставленной целью необходимо решение следующих задач:

• выделить и изучить распространенность бактерий рода Bacillus на объектах внешней среды;

• изучить биологические свойства бактерий рода Bacillus;

• изучить влияние штаммов бактерий рода Bacillus на кишечный микробиоценоз и естественную резистентность новорожденных телят.

• разработать препарат-пробиотик, на основе бактерий рода Bacillus, для профилактики и лечения диареи новорожденных телят;

Научные исследования по решению поставленных задач проведены на основании тематического плана НИР Якутского НИИ сельского хозяйства СО РАСХН по заданию 02.08. «Изучить возможность использования 6 природных цеолитов в дезинфекции животноводческих помещений с целью охраны окружающей среды от распространения патогенных микроорганизмов и вредных веществ»; по региональным заданиям «Разработать комплекс мероприятий по обеззараживанию навоза и птичьего помета, их использованию при выращивании картофеля на основе экологически безопасных технологий» и «Изучить возможность использования микробных препаратов в сельском хозяйстве и определить регламент по их изготовлению и применению»; по заданию Центра научного поиска СО РАСХН 08.04. (05.07.П) «Разработать и внедрить технологию применения микробных препаратов».

Научная новизна. Впервые изучены биологические свойства спорообразующих аэробных бактерий, выделенных из мерзлотных почв Якутии и на основе их разработан пробиотик Сахабактисубтил для профилактики и лечения диареи новорожденных телят.

Выделенные из мерзлотных почв Якутии штаммы Bacillus subtilis ТНП-3 и ТНП-5 паспортизированы и депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов, используемых в животноводстве и ветеринарии, в лаборатории пробиотиков и биологически активных веществ ВГНКИ ветеринарных препаратов (06.02.2001 г.).

Изучено формирование кишечной микрофлоры новорожденных телят в условиях Якутии.

Изучены свойства природного цеолита-хонгурина, в качестве адсорбента пробиотика Сахабактисубтил.

По результатам изучения биологических свойств бактерий рода Bacillus получен патент РФ за изобретение "Штамм Bacillus subtilis, используемый для обеззараживания птичьего помета и навоза, от патогенных микроорганизмов» (№2105810 от 27.02.1998 г.). Получено положительное решение о выдачи патента РФ на изобретение «Способ лечения мыта лошадей» заявка №2000107857/13 (008109) от 29.03.2000. 7

По материалам диссертации подготовлена и представлена в Федеральный институт промышленной собственности заявка на патент «Способ профилактики диарейных болезней новорожденных телят и поросят» (приоритет от 04.02.2002 г. №2002103078).

Практическая значимость работы. На основе материалов диссертации разработаны Временные наставления по применению препарата Сахабактисубтил для профилактики и лечения диареи новорожденных телят и Технические условия, утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ РФ от 12.03.2001 г. Пробиотик Сахабактисубтил рекомендован к широким производственным испытаниям в 2001-2003 гг.

Результаты изучения пробиотика Сахабактисубтил могут быть использованы в проведении научных исследований и учебном процессе.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях Ученого совета Якутского НИИСХ в 1995-2001 гг., на научно-практической конференции, посвященной 70-летию аграрной науки РС (Я) «Совершенствование научного обеспечения агропромышленного комплекса Республики Саха (Якутия) в условиях рыночных отношений» (Якутск, 1997), научно практической Российско-Монгольской конференции по проблемам развития АПК Монголии (Новосибирск, 1998), Всероссийской конференции с международным участием «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека» (Москва, 1999), в научно-практической конференции «Региональные проблемы сельскохозяйственного производства Республики Саха (Якутия)» (Якутск, 1999), в третьей международной научно-практической конференции «Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии» (Алмата, 2000), во Всероссийской научной конференции «Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов» (Москва, 2001). 8

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Материалы изучения биологических свойств бактерий рода Bacillus, выделенных из мерзлотных почв Якутии.

2. Материалы по влиянию пробиотика Сахабактисубтил, разработанного на основе бактерий рода Bacillus, на формирование кишечного биоценоза и естественную резистентность новорожденных телят.

3. Результаты применения пробиотика в профилактике и лечении диареи новорожденных телят.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 работ в материалах Международных, Всероссийских, Республиканских научных конференций, а также описаниях к патентам.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Иллюстрирована 18 таблицами, 2 графиками, 1 рисунком. Список использованной литературы включает 152 источника, в том числе 32 иностранных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Установлено значительное распространение инфекционных болезней молодняка крупного рогатого скота, таких как колибактериоз, сальмонеллез и диплококковая инфекция. Незаразные болезни желудочно-кишечного тракта у молодняка составляют 53,32%, а летальность от них - 9,7%.

2. Объекты животноводческих помещений в условиях Якутии, значительно контаминированы бактериями рода Bacillus и составляют: в воздухе-28,7%, на полу-3,7%, стенах-46,1%, клетках-15%, молочном оборудовании 35%, от общего числа выделенных микроорганизмов.

3 Наибольшее число бактерий рода Bacillus в мерзлотных почвах без удобрений доходит в летний период - до 8,3±0,5 млн/г., при внесении свежего навоза, число их увеличивается до 1141,9±42,1 млн/г.

4. Выделенные из мерзлотных почв бактерии рода Bacillus -Bac.mycoides, Bac.megatherium, Bac.pumilus, Bac.subtilis обладают типичными для этих видов культурально - морфологическими и биохимическими свойствами.

5. Бактерии рода Bacillus, выделенные из мерзлотных почв, обладают выраженной антагонистической активностью в отношении возбудителей эшерихиозов, сальмонеллезов, дизентерии, кокковых инфекций, также бруцеллеза, туберкулеза и некоторых возбудителей болезней растений -Fusarium oxysporum, Rizoctonia solani, Streptomyces.

6 Установлено, что аэробные спорообразующие бактерии являются типичными представителями кишечного биоценоза новорожденных телят в условиях Якутии, в первые сутки их число доходит до 410±18,4млн/г и доминируют над бифидо и лактобактериями, которые составляют 3,0±0,46 и 1,9±0,11 млн/г, соответственно.

7. На основе штаммов Bac.subtilis «ТНП-3» и «ТНП-5» разработан пробиотик Сахабактисубтил для профилактики и лечения диареи новорожденных телят. Применение пробиотика, с первых дней жизни,

91 способствует формированию нормальный микрофлоры кишечника: количество бифидобактерий увеличивается 10 раз, лактобактерий в 23,5 раза, а также повышает показатели естественной резистентности организма, снижает заболеваемость до 2,9% и предупреждает падеж новорожденных телят от диареи.

8. Пробиотик Сахабактисубтил антибиотикоустойчив, поэтому, может быть применен при интенсивной терапии в сочетании с антибиотиками, что положительно влияет на восстановление микрофлоры кишечника.

9. Пробиотик Сахабактисубтил, адсорбированный на цеолите-хонгурине, значительно повышает иммунобиологическую реактивность организма молодняка крупного рогатого скота в зимний стойловый период.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Материалы диссертации вошли в следующие нормативные документы:

1. Технические условия ТУ 9383-003-00670203-01 и Временные наставления по применению Сахабактисубтил для профилактики и лечения диареи новорожденных телят, утвержденные Департаментом Ветеринарии МСХ Российской Федерации (от 12.03.2001 г.) и рекомендованные к широким производственным испытаниям.

2. Патент РФ №2105810 «Штамм бактерий Вас. зиЫШб, используемый для обеззараживания птичьего помета и навоза от патогенных микроорганизмов» (соавторы Н.П. Тарабукина и др., 11.03.1996 г.).

92

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обзор доступной отечественной и иностранной литературы показал, что во многих странах зарубежья, и особенно, в нашей стране серьезной проблемой является профилактика массовых желудочно-кишечных болезней молодняка с диарейным синдромом. Все большее значение в этиологии диарейных заболеваний приобретает условно-патогенная микрофлора.

В последние годы, для профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней, обусловленных условно-патогенной микрофлорой и протекающими с признаками диареи, применяются пробиотические препараты. Пробиотики - это препараты нового поколения, они создаются из представителей нормальной микрофлоры живого организма, с целью коррекции кишечного микробиоценоза, для повышения иммунного статуса животных. Конструирование пробиотиков - новое и перспективное направление в сельскохозяйственной биотехнологии.

Исходя из этого поиск новых микробов-пробионтов является актуальной задачей современной микробиологии. Особое место среди пробионтов занимают спорообразующие аэробные бактерии рода Bacillus. Препараты, изготовленные из бактерий рода Bacillus не только корректируют микрофлору кишечника и повышают естественную резистентность организма, а также повышают усвояемость корма и прирост живой массы.

В условиях Крайнего Севера, где несмотря на экстремальные условия, скотоводство является традиционной и главной отраслью северного животноводства, получение здоровых телят является первостепенной задачей. Поэтому выделение и изучение биологических свойств микроорганизмов типичных для Крайнего Севера и разработка пробиотического препарата для профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней новорожденных телят с диарейным синдромом и повышающий иммунный статус, является актуальной проблемой ветеринарной медицины.

32

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Диссертационная работа выполнена в 1994-2002 гг. Экспериментальная часть работы проводилась в отделе ветеринарии, в лаборатории по разработке микробных препаратов Якутского научно-исследовательского института сельского хозяйства СО РАСХН. Научно-исследовательская работа в производственных условиях проводилась в ОПХ «Покровское», «Красная Звезда», КП «Хатассы», «Сырдах» и других хозяйствах Республики Саха (Якутия).

Для выделения разных видов бактерий использовали общепринятые микробиологические методы. Родовую и видовую идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили согласно «Краткому определителю бактерий Берджи» (1980), а также «Справочнику по микробиологическим и вирусологическим методам исследований» (1982) и «Определителю зоопатогенных микроорганизмов» (1995).

Изучение антагонистических свойств, антибиотикоустойчивости микроорганизмов проводили в основном методом диффузии в агар.

При изучении лечебно-профилактирующих свойств Bac.subtilis проводили исследование кишечной микрофлоры и показателей естественной резистентности новорожденных телят до и после применения пробиотика. При этом, учитывали в динамике количество лактопозитивных и негативных кишечных палочек, энтерококков, бифидо- и лактобактерий, спорообразующих бактерий, согласно общепринятым микробиологическим методам.

В качестве адсорбентов микробов-антагонистов использовали цеолит Хонгуринского месторождения фракции 2-5 мм.

Определение количества гемоглобина, эритроцитов, фагоцитарной активности лейкоцитов, бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови проводили согласно методическим рекомендациям, разработанным

33

М.П. Неустроевым, В.И. Малышевой (1995). Использовали методики, разработанные П.Н. Никаноровым (1979), П.А. Емельяненко с соавт., (1982), С.И. Плященко, В.Т. Сидоров, (1979), П.Н. Смирновым с соавт., (1989).

Биохимические исследования крови на содержание общего белка и его фракций, каротина, кальция, фосфора, магния проводили в лаборатории биохимии ЯНИИСХ. Анализы проведены на спектральном анализаторе МБ^САМЕЯ то ЬСЕ 4250 производства США.

Экономическую эффективность предлагаемого препарата определяли согласно методике, утвержденного секцией организации и экономики ветеринарного дела РАСХН (20.01.1997 г.).

Экспериментальные данные подвергали статистической обработке по Стьюденту,

В экспериментальной работе использовали 80 белых мышей,30 морских свинок, 15 кроликов, 900 новорожденных телят, 52 молодняка крупного рогатого скота, исследовано 350 проб крови, 450фекалий новорожденных телят, 120 проб воздуха, 480 смывов их животноводческих помещений, 74 проб навоза и почвы. Проведено свыше 3000 бактериологических, микроскопических, гематологических и биохимических исследований.

Подробные сведения о материалах и методах исследований приводятся в соответствующих разделах работы.

2.2. Ситуация по заразным и незаразным болезням желудочно-кишечного тракта молодняка крупного рогатого скота

Особенностью климата Якутии является не только абсолютные величины низких температур, но и, главным образом, резкая континентальность. Разность средних температур самого холодного и самого жаркого месяцев (январь и июль) достигает мирового максимума и равна 55-56°С. В Республике Саха (Якутия) несмотря на экстремальные условия, в

34 достаточной мере развито сельское хозяйство. Основной ее отраслью является животноводство. Наиболее развито мясо-молочное скотоводство, мясное табунное коневодство и оленеводство, и в меньших размерах -звероводство, свиноводство и птицеводство.

На 1 января 2002 года поголовье крупного рогатого скота во всех категориях хозяйства составило 292816 голов.

Природно-климатические условия Якутии определяют продолжительность стойлового периода содержания животных. Средняя продолжительность его равна 280 дням.

Большинство животноводческих помещений для стойлового содержания крупного рогатого скота представлены коровниками якутского типа. Производственные помещения для скота, построенные из промышленных конструкций и материалов, размещаются в основном в пригородных хозяйствах республики. Изучение микроклимата животноводческих помещений в совхозах, коллективных предприятиях, крестьянских хозяйствах Якутии, показало неудовлетворительные параметры по температурно-влажностному режиму, газовому составу воздуха, низкой освещаемостью помещений, кроме того, отмечается высокая степень запыленности и микробной обсемененности воздуха животноводческих помещений (И.С. Третьяков, 1999).

В Якутии более развиты мясное и молочно-мясное скотоводство, где преобладают холмогорская и симментальская породы крупного рогатого скота. При удовлетворительных условиях кормления, ухода и содержания крупного рогатого скота, отвечающим всем зоогигиеническим и санитарным требованиям, получают высокие показатели по удою молока и значительное количество мяса. Но, плановому увеличению поголовья крупного рогатого скота и повышению его продуктивности отрицательно влияет ряд факторов, среди которых значительное место занимают болезни инфекционной этиологии, в том числе обусловленные условно-патогенной микрофлорой,