Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Методы индикации микобактерий для санитарно-микробиологической оценки объектов животноводческих ферм при туберкулезе

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ СССР ЛЕНИНГРАДСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТШТ

На правах рукописи

СУББОТИНА Светлана Григорьевна УДК 610:616-002.5:579.873.21+610:614,48

>

МЕТОДЫ ИНДИКАЦИИ МИКШШЕРИЙ ДЛЯ САНИТАРНО-МШСРОБЙОШШВСКа ОЦШИ ОБЪЕКТОВ ЖИВОТНОВОДЧВСШ ФЕРМ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации нв соискание ученой степей» доктора .ветеринарных наук

Ленинград - 1951

Работа выполнена на кафедра эпизоотологии и микробиологии Воронежского Государственного .Аграрного университета и в производственных условиях.

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Вуткин Е.И,,

доктор ветеринарных наук, профессор Донченко A.C., .

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник Ь'оришанова Б.Ф.

Ведущее учреждение'- Всесоюзный ордена Ленина научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.

в 13 часов на заседании специализированного совета Д 120.20.02 при Ленинградском ветеринарном института по адресу: 196084, г.Ленинград, Московский проспект, П£,

G диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ленинградского ветеринарного института.

Автореферат разослан 1991 г.

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь, специализированного совета, доцент

Киндрас T.U.

j ОЩАЯ ХАРАКТ2РЮГЛКА РАБОТЫ

• r.r.t!

Актуальность томы. Высшей целью экономической политики Советского государства является рост благосостояния советского народа.

Уровень производства продуктов'животноводства играет большую роль в экономическом развитии человечества i а янвотше являются национальным богатством каждой страны (Коваленко Я.Р., 1965). В этой связ:> решающее значение придается всемерному развитию животноводства, успех которого во многом определяется благополучием стад по инфекционным заболеваниям, к числу которых относится туберкулез.

Высокая устойчивость во внешней среде и широкая миграция возбудителя туберкулеза с вовлечением большого количества видов диких, домашних, сельскохозяйственных животных,' а такяе человека, разнообразие форм проявления и причиняемый значительный экономический ущерб - все это ставит туберкулез -в особое положение среди хронических инфекционных болезней Сизове Р.В». 1983). Наибольшую опасность Зта инфекция представляет для крупного рогатого скота (Кассич Ю.Я.с

и

соавт., 1990).

В условиях промышленного 'животноводства, лрй высокой концентрации животных на'крупных фермах и комплексах, борьба с туберкулезом требует эффективных и надежных мер. Несмотря на то,' что все поголовье крупного рогатого скота охвачено профилактическими и диагностическими мероприятиями,, значительное количество хозяйств оставтся неблагополучными по этой болезни.-В 1987 г. спорадические случаи его выявляли в 64, а среднюю и частую заболеваемость скота - в 37 странах (Овдиенко Н.П., 1990) Туберкулез крупного рогатого скота до сих пор остается одним из трудиоднагностируе: т.< заболевай;:;: вследствие возмоаюго наличия в оргз.чиз!,« глзотках сеисибялкзарузиего тора, обусловленного мпкобзатзгпяш! не'тубэркулзз.чого вщгэ. "o'tzsv.^e-гай последними иеспегифгозскд;! нм:.:г;ннц?. гон уменьшает дизгг.эстич?:-

'-:скуа• ценность -разработанных аллергических и серологических гестов, .что в .свои■очорадь .сникает эффективность зетгрзгларшх мероприятий.

Течение туберкулеза "в послвдшг: тсд-«; елгелилось и клиническое - огоглроявление >встречается крайне тедкс, .¡И^лгевтно --больной туберку-глезо:.!.скот, -который -выглядит соввраангд: здпдаошм и от'которого не: посредственно заражаются 'находяздшся »с азам эдшрк-^в гзвотные, раз-■дичнышг путями выделяет возбудителя инфекции тго шнашнш среду (Ку-гзин АЛ!.. 1Э82;'Щуревский В.Е.,:Кассет Ю.Я. шлш..1ЭЭ0). Благодаря 'атому на объектах кивотиоводческшс помещений зе з ¡почве ярифермских :территориГг накапливаются микобамврии •тубдтез'-ивза. которое. в силу :своих 'биологических юсобенностей, .-длительно «вслгштся жизнеспособными дшаютешшш,

'Поэтому-усг.эх-борьбы с туберкулезом а;руднпго ^рогатого скота во млюгон ззбеспт .от травильного .и ;рациолсльши) агршвдания комплекса -овганизациошо-хозяйстаеиких к ве.хзрннЕДОй-.сашшдаых ¡иероприятий, ^-направленных на-своевременное выявление и .удаление жяочнлка инйек-. \цпи,.а, также, уничтожения ;возбуди1аля во шнзяше'й сслзда. -Однако ыоста-вить .точный даагноз. на .туберкулез то'луэдть сведения о наличии •объектов внешней среды, Кйнташишровашых .мжойактврияка на небла--гоподучныхиоздоравливаемых ..ат ^¿¡врх-улсза только

.•после; прозеденжя'пряшго ¡.бактериологического исследования.

Вместе с тем. в сравнении с-возбудителями других ж^кционных заболеваний,. обнатзукевие;.вь'да.шзи& зи зздшшШжв'цек ыакобактврнй гу. беркулеза в разлитых лагологетесквх .-шютдалах 'от зщвай и животных, остается до настоящего вр-зцгнн наиболее .трудоемок и длительны!.; (3-5 ызс.) ирэцессо::. Ползааннэ ецз иолее усугубляется .при исследовании ватергдхов с объектов звездей сроды. -Э.то определяется как бкслзгке". сгг.зго возбудителя а особенг.астдах хсследуслк ьатериалов с Егг.зг^отэгчзсг.г.х тав-с, таг, и слозгсатьп. гоеогмпзцсхвоа и,-часто,

малой эффективностью многих методов бактериологического исследования, базирующихся, как правило, на видовом свойства микооактэрий их кисло то—, спирто- и щелочеустойадвости. В тоже время ни один из предложенных в настоящее время прямых приемов и методов бактериологической диагностики туберкулеза не позволяет практическому специалисту, в короткий срок, подтвердить или исключить диагноз на туберкулез у аивогных и определить санитадао-ыикробиологическое благополучие объектов внешней среды при наличии этой инфекции на животноводческих фермах.

В связи с этим, исследования по изысканию надежных прямых якс-пресс-методов индикации, выделения в чиоюм виде и идентификации микобактерий туберкулеза, в той числе и в материалах с объектов внешней среды, и разработка научно-обоснованных методов контроля качества дезинсекции при туберкулезе, и их совершенствование на данном этапе развития, являются актуальными.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась рэз-о работка и внедрение методов индикации микобактеряй для санитарно -микробиологической оценки объектов животноводческих ферм при туберкулезе. Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Усовершенствовать и внедрить методы экспрессной индикации микобактерий туберкулеза в.различных материалах с животноводческих ферм.

2. Изучить уровень инфицированности объектов, на неблагополучных по туберкулезу фермах, микобактериями, установить их видовую принадлежность и эпизоотологическое значение. <

3. Разработать прямой метод бактериологического контроля качества дезинфекционных мероприятий при туберкулезе.

4. Изучить динамику нарастания мякобактериальной обсвмэненнос-

ти объектов животноводческих ферм от начала неблагополучия по туберкулезу до подлого оздоровления и снятия ограничений, в зависимости от эпизоотической ситуации и качества проведенных оздоровительных мероприятий.

5. Разработать и внедрить новый экспрессный метод индикации, выделения и дифференциации микобактеряЕ в патологических материалах с животноводческих ферм^

Поставленные выше задачи нашли свое разрешение в диссертационной работе и в качестве основных полокений выносятся на защиту.

Научная новизна. Установлена зависимость швду уровнем инфицированное™ объектов, их количеством и эпизоотической ситуацией по туберкулезу на неблагополучных животноводческих фермах. Изучена динамика нарастания шшобактэриальноМ обсемененностк объектов внешней среда от начала неблагополучия по туберкулезу до полного оздоровления и после снятия ограничений, с учетом эпизоотической ситуации и проведенных вегеринарна-санитарных и организационно-хозяйственных мероприятий. Определена ввдовая принадлежность микобактерий, цирку лиру иси/ среди животных и объектах внешней среды неблагополучных ферм, и их роль в эпизоотологии туберкулеза.

Разработаны рациональные приема отбора и обогащения материалов с объектов внешней среда, неблагополучных животноводческих ферм,для бактериологического исследования на туберкулез.

Разработаны методы ускоренной индикации микобактерий получением микро- и иакрокультур в жидких питательных средах на стеклах и в "осадка".

■Предложены новые технические устройства для одномоментной окраски микобактерий при массовых исследованиях. Изучена чувствительность метода лшвввеценгной микроскопе; в сочетании с микрокульти-ЕЕРОванпем для ускоренной индикации микобактерий в материалах с

объектов животноводческих ферм.

Определена диагностическая ценность известных плотных специальных питательных сред и эффективность одновременного использования нескольких из них (комплект из 2-3 сред) шм индикации и выделения микобактерий туберкулеза из материалов иивотноводческих ферм. Изучена эффективность некоторых способов очистки исследуемых материалов от банальной микрофлоры в сочетании о новыми приемами обогащения 4микобактериями и их культивированием на специальных питательных средах.

Разработаны и внедрены новые' методики бактериологического контроля качества дезинфекции животноводческих помещений при туберкулезе, установлены критерии оценки качества дезинфекционных мероприятий прямыми бактериологическими методами.

Разработан и внедрен новый метод экспрессной индикации,получения микро- и макрокультур и идентификации микобактерий туберкулеза из материалов от кивотннх и объектов внешней среды животноводческих ферм, выращиванием их на твердом парафине в жидких питательных средах.

Впервые установлено:

- феномен флотации микобактерий туберкулеза твердым парафином из суспензий различных исследуемых материалов;

- возможность одновременного обогащен?': •• г,".;п:>;.:>:аиия микобактерий на твердом парафине в жидких - "X ст-ах {типа минеральной среды, 5% мясопептонного глиц - -она«среды Сотона) и обильного накопления их бактериальной массы;

- феномен поверхностного ростз микобактерий туберкулеза в жидких питательных средах на твешом парафи-э;

- способ приготовления среды накопления (жидкая злоктпанчя питательная среда для культивирования возбудителя тубе г «ул-зэа в <••_• •

четашш с дисками из твердого парафина) для"ускоренной индикации.' "выделения и дифференциации ыикойактерий;

- раз'раЙотана новые методы экспрессной индикации, выделения шшобактерий и определения их жизнеспособности в предварительно не отацэшшх от банальной микрофлора полокителышх патологических материалов от кизотшх и из объектов внешней среды;

- предложены ноьне экспрессные приемы определения способности микобактарий к пкгментообразованшо;

--розмокность предварительной внутриродовой идентификации ыи-кобактерий по наличию и характеру их роста на парафиновых дисках в жидких питателыщх средах, в присутствии определенных концентраций -некоторых базофальных анилиновых красок.

Практическая ценность. Результата наших исследований позволили дать объективную и научно-обоснованную оценку роли объектов внешней среды в распространении туберкулеза сельскохозяйственных животных. Внесены конструктивные предложения по совершенствованию методов бактериологической диагностики туберкулеза. Разработаны и внедрены новые ыетоды экспрессной индикации, определения еизнеспособности, выделения и идентификации шшобактериЗ в материалах о объек-. тов животноводческих ферм. Предложены методики бактериологического контроля качества дезинфекции при туберкулезе, установлены критерии оценки качества дезинфекционных мероприятий прямыми бактериологическими иатодаии.

Апробация работы. Материалы диссертации долоненн: на ежегодных научных конференциях Омского ветеринарного института и Сибирского ШЕИ (1971-1976 гг.); на зональной совещании по ватершарно-сакитарныи иароприяткда и зоогигиене в кивотноводческих комплексах к на крупных 4<?рмйл Сибири а Дальнего Востока (Новосибирск , 197с; на кэиЦйг-гкгзч, пзсвнаэк'гоН 101<-латзЕэ Казанского

7 о

ордена Ленина Иэсударственного ветеринарного института Пазань , 1973); на научной конференции Целиноградского СХИ (1977); на научно-производственной конференция "О мерах по усилен юз борьба с бруцеллезом и -туберкулезом сельскохозяйственных животных в Казахской ССР" (Кустапай. 1977): иа координационном совещании по туберкулезу и бруцеллезу а КазИШИ (Алиа-Ата, 1977); на научных конференциях Воронежского сельскохозяйственного института ии.К.Д.Глинки (1979-1В91); в лаборатории диагностики туберкулеза БНИПБШ (Омск, 1987); яа пз&здре эпизоотологии, микробиология и вирусологии Донского СХ11 (Персизповка Ростовской обл.. 1989); в бора тории изучения туберкулеза УЫСЗВ (ларьков, 1983); на рзезиренном заседании сотрудников кафедры эпизоотологии, «икробпологии Воронежского СХИ им.К.Д. Глинки (15Е5, 1990); проведены секипзры с врачами бактериологами и директора;,;:! ъетернваргех лабораторий я главными вэтврачаыи районов' ЛилоцкоЗ. Вэвопзгипой и Ростов стой областей по внедрению ускоренных Изтодов индикации и гдаелеапл тгикобактернп в материалах с животноводческих фзри до п после дэздпТежцип (1990).

По темэ диссертации опубликовано 30 научных работ, одно дополнение к ластавленшз, одсбрэнпоэ 1УВ 1Ъсзгропрок СССР, получено два авторских свидетельства, 5 рационализаторских удостоверения. Материалы исполъзуптся в учебном процессе Воронежского сельскохозяйственного института нм.К.Д.Тйннкн.

Объем п стртптугл диссертации. Лиссертация изложена на 290 страницах казинописиого текста а г-клгпает: введение, обзор литературы. собстаеншэ исследования, обсуждение результатов, внводн, практические предложения, список латорагуп; и приложения. Рсбота аллпеграрована 22 гзвдвдт, 13 тагсуккааг. Список дичарягугн зк.г->-чзет 539 источников, из аж 1о2 сдо.тгрзнглх.

Внедрение исследований

1. Для индикации а выделения мякобактарий из материалов внешней среды до и после дезинфекции животноводческих ферм при туберкулезе предложена методика, которая утверждена 1УВ Босагропром СССР I сентября 1989 г., в качестве дополнения к разделу ?"Наставленщ по диагностике туберкулеза животных" (утвержденного 1УВ Госагропром СССР 25 февраля 1986 т.)

2. Для улучяения лабораторной диагностики туберкулеза предложены: .устройство для окраски микобактерий (в соавторстве с Неделиным Г.Ф.); метод индикации и выделена микобактерий. На оба предло-яения получены авторские свидетельства. На способ получения макро' культур микобактерий; Способ предварительной идентификации микобактерий и кодификацию метода окраски мазков по Циль-Нильоеву получены рационализаторские удостоверения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена за период 1973-1990 гг. на кафедре микробиологии и вирусологии Омского Государственного ветеринарного института, в Целиноградской НИВС, на кафедре эпизоотологии и микробиологии Ворокекского СХИ иы.К.Д,Глинки, а такие в производственных условиях.

Материалом для индикации микобактериц в среде обитания животных слуишш проба-соскобы с кормушек, поилок, шла стойл, стен. • столбов, кормовых и навозных проходов и других объектов внутри животноводческих пошаонкй. а таккэ из почзн выгулов, прилегащкх к ним, из II хозяйств, неблагополучных по туберкулезу крупного рэга-того скота, с различной эпизоотической ситуацией Омской, Целиноградской.. Орловской, Воронежской областей я одного благополучного по заболе^англ хозяйства Богонекской области. В зависимости о?

поставлен . . лрованяооть объектов макобантериями lydapKjf-

Лзза в этих xüj.^cvoí* изучали одно-, дву-, четырех- и пятикратно. Всего на 13 фермах, 67 животноводческих помещениях обследовано более 600 объектов. Отобрано и исследовано бактериологическими методами около 2000 проб патологических материалов от животных и с объектов внешней средн.

Взятие проб п обработку материала о объектов внешней среда проводили по разработанному нами принципу сбора средних проб-соокобов и обогащения их микобактариями сочетанием методов флотации и седк- ' ментации (Субботина С.Г., 197?).

При выяснении эпизоотической ситуации по туберкулезу сельскохозяйственных животных в хозяйствах использовали эпизоотические журналы и данные.диагностических исследован!® за ряд лет,

Эпизоотический анализ полученных данных вели с учетом методических указании М.Г.Таршиоа (1979), В.П.Урбана (1931) и И.А.Бакуло-ва с соавт. (1982).

» Ивдикацш микобактзрий, определение степени инфицированноети объектов животноводческих ферм, контроль качества механической очистки и дезинфекции на наблюдаемых неблагополучных по туберкулезу фермах крупного рогатого скота проводили методом минрокультиаи-рования на стеклах в жидкой питательной среде Сотона; методом "осадка", с культивированием в среде Сотона или 5 % ШИЗ (мясо-пеп-тоннцй глицериновый бульон), и иегодом микрокультивированая мико-бактерий на парафиновых дисках. Параллельно с этими методами в ряде случаев, выборочно, только для подтверждения природа полученных микроколоний никобактерий. использовали непосредственный посев исследуемых положительных патологических материалов, предварительно обработанных 6 % растворами серной кислоты, па элективные яичные среды. Для лабораторных исследовании использорали тахзее пробы ксло-ка от животных-неблагополучного стеда, с отрх'ла тельной рзакциз]? :íh

туберкулин и внутренние органы от положительно реагирующих на туберкулин ниео тних, убитых комиссионно о диагностической целью на Bovo-некскок и Ливенском, Орловской области, мясокомбинатах. Б некоторых случаях патологические материалы обрабатывали методами Гона (Михин H.A., 1958), Аликаевой А.П. (1982), Маккавейокой А.Н. (1955).

В качества тест кулыур использовали штаммы микобактерий: M.H37Ev, М.avium-750» il.bovis-ö, M.bovis-12, Ц.ВОО, M.fortuituo,

il.smagmatis, lí.phlei , полученные из Музея Всесоюзного Государственного контрольного института ветеринарных прэпаратов Госагропрома СССР и Центрального научно-исследовательского института туберкулеза Ш СССР.

Кроме эталонных штаммов микобактерий, в работе использовано 95 культур патогенных, атипичных и сапрофитных микобактерий, изолированных нами из материалов от кивотных и различных объектов неблагополучных по туберкулезу ферм крупного рогатого скота.

'Суспензии микобакгарий готовили на физиологическом раствора по оптическому стандарту БЩ£ или путем взвешивания их бактериальной массы на торзлонных весах (Матвеев К.П., 1964).

Культивирование микобактериЕ осуществляли, главным образом,на средах Сотона. Левенштеияа-йенсена. Потраньяни, Гельберга. В рядо случаев использовали среды: Мордовского, фшш-2, Ъ% МПГБ, агар Да-бека и простые среды: ШБ, Ша.

Для индикации, выделения в чистом виде и идентификации культур цикобактерн;. в некоторых случаях использовали среду накопления,которую приготавливали сочетая нидкую элективную питательную среду (типа Сотова. Ъ% ШГБ) с твердый парафином нанесенным на еа по -Еэраюсть в виде дисков, два и. 0,5 см. Для этих se пелей употребляла состаьлекнуо aatui. с учетом рекомендаций Soto et al, (1975),аид-uyn иинбральнур срэвд (среда А) (Субботина С.Г., 1389, 1990). Ее

использовали в качества сради накопления, во всех случаях параллельно с 5% ШПБ я средой Сотона.

Парафиновые диски на поверхности используемых жидких питательных сред го топили из твердого парафина, марки ТУ-6-09-4Ц2-75. Перед использованием парафин раскладывали до 100,0 в стеклянные стаканчики и стерилизовали в автоклаве при I атм. 20 мин.

Методом культивирования микобактерий на парафиновых дисках в еидких питательных средах наш исследовано более 250 проб положительных патологических материалов от крупного рогатого скота из 5-ти хозяйств Воронежской й Орловской областей, и более 100 проб с объектов внешней среди, отобранных до и после дезинфекции на территории ферм тех ко хозяйств.

Для идентификации шнсобактерлй» изолированнее от животных и из объективов внешней среди использовали методические указания и нас -тавлэния по проведению диагностических исследований на'туберкулез и дифференциации микобактерий» угверяданине 1УВ МСХ СССР (1971,1976) й' ГУБ Госагропрома СССР (1985), а также методические рекомендации "Бактериологическая и биохимическая идентификация шжобактерий".составленные э Ленинградском научно-исоледоватвльском институте Минздрава РСФСР кандидатом биологических наук Ильиной Т.Б. (1975,1980).

Морфологию шжобакторий изучали в мазках,окрашенных по Циль-Ннльсену, Диль-Габотта, Граму (О.Блргер,1973г Миш Н.А.,1938). При окраске по методу Цаиь-Нкльсвпа мазки обесцвечивали 3-х процентным расгсором солянокислого спирта (до кедтого оттенка), а по методу Цшль-Габетта - в течение 1-2 мин, в следующем раствора:мвтиленовой сини - 2 г, сорной кислоты - 35 ал и 1000 мл воды. Микобактерии,окрашенные этими способами, приобретали рубииов^-красный цвет, а по Граму - тзмко-фиолэтовай.

При первичном разделении гглкобактар;^ не туберкулезные и но-

туберкулезные дополнительно учитывали их основное родовое свойство-устойчивость к кислоте и спирту (Василев, В.Н., 1972).

Для отличия туберкулезных бактерий от кислотоустойчивых сопро-фцтон, непосредственно в мазках использовали методы Вейксельбауыа, Циль-Поргесса (Михаш ¡Í.A., I9S8), А.Ы.Говорова и В.И.Задара (1959). ЕЛ.Скрибшой (1955).

С целью подтверждения видовой принадлежности и определения вирулентности, у изолированных нами культур шжобактерип, ставили биологическую пробу на лабораторных животных {Методические указания до диагностике туберкулеза животных, утвержденные 1УВ МСХ СССР II февраля 1976; Наставления по диагностике туберкулеза яиеотных, утверт.-денное 25 аавраля IS66). Всего для этих целей использовано кур -142, кроликов - 190, моренах свинок - 190. Для аллоргической диагност игл туберкулеза, в период каранишировапия. у лабораторных ни-ротных (вилачая кур) применяли стандартный альттуберкулин для клз-кэгштзкцпх, cyxoli очшазннпЯ (Ш1Д - протеин пури$иед дерпвант) туберкулин для илокопптандих к сухой очищенный (ППД) туберкулин для птиц» согласно "Наставлению но применению зуберкулшюв для аллергической диагностики туберкулезе у вхеодшзаввдх и птиц", утвврздед-нону Главный управлением ветеринарии I.I0X СССР 3 февраля 1973.

Статистическую обработку полученных данных проводили' с учетам глтодпк И.А.Ойвша (1960) и Е.К.Меркуръевои (1964).

ргвульта ты lccjejiqbahl;

I. Совершенствование экспрессной, бактериологической даггпостяки туберкулеза

Учитывая оеобоввоста материалов с объектов пест обитания гдвот-1;з д,олп"л еэевзэквя плдпкац-ил в нас шг.ойактергИ

».^•iDr.o« на стеклах в аэдшЕ сита тельной среде,

гггзьлггек«: se коготке усовегсвксггои-чгл-о прхоив г» кгтоды бактерия-

¡готической диагностики ту барку деза.

1) Проведено изыскание рациональных приемов сбора материалов для бактериологического исследования на туберкулез с объектов внешней среды кивотноводческих (Тори. Дин чего в конца зишвка скота в

коровниках двух хозяйств неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота отобрала материал соскобами и смывами, параллельно с 12-ти объектов в каздаи: продольные стены I м и 0,5 и от пола . боковые стены 0,5 и от пола, навозные.кормовые а поперечные проходы. нвзесточнцв канавки, корцушки, поилка, цели пола с то 1л у передних н задних ног шгвотного. столба в по шцешщ 0,5 и от пола. С поверхности каядого объекта одновременно снимали да одной средней пробе соснобон и ш одной средней пробе сшвом,каждая с шгощадд 500 си2. .

Материалы проб обогащала вначале флотацией, а затеи флотат а полюй сбъаце центрифугировали 15-20 ьшнуг при 6000 об/шш. Мгкроку льтявированиеы на стеклах исследовала центрпфугат (Письменная С.Г., с соавт., 1Э73)-

Значвтедьннй объвм средней пробы-соскоба (до 250 г в более), розаоЕНость ее полного исследования, за счет обработки вышеуказанным сочетанием катодов обогащения. позволили повысить эффективность . индикации ышобактерий методом шжрокулыур на стеклах в материалах с объектов внесшей среда. Установлено, что соскоба имели внсонув степень кон га мин иров в н ия микобантариями, которая установлена в 7583,3 % проб от числа исследованных до обогаиения и в 91,7 'А - посла обогащения и микрокультивирования в среде Сотона на 5 и 12 сутни.В , тожэ время, в сшвах, с поверхностей тех же обследуемых объектов, наличие шшобактерли установлено, соответственно, только в 25 % и 41,6 проб, причем при незначительном их содержании - единичные клетки (до 10 ) и мелкие кучки (по 1-3) - на в кзядом пола зрения.

2) При массовых санитарно-бактерпологических исследованиях

объектов животноводческих ферм, неблагополучных по туберкулезу.требуется окраска значительного количества мазков по методу Циль-Ниль-сена. Широко используешй в лабораторной практике мостик, позволяет проводить аиш методом в основном раздельную окраску мазков, что приводит к большой затрате времени (по 10-12 мин на один мазок) и при массовых исследованиях не обеспечивает однородности окраски.Для устранения отмеченных недостатков наш (в соавт.с Колычевым Н.М., 1972) разработан с фиксатором для мазков мостик и к нему газораспределительная горелка, использование которых позволяет одновременно,в одном режиме, окрашивать до 20 мазков.

На принципе этих приспособлений было сконструировано (в ооавт. с Берд.лским Н.Ф., 19га и Неделиным Г.Ф., 1982) в двух вариантах механизированное устройство для одновременной окраски нескольких сот мазков методом Циль-Нильсена. Использование его позволяет автоматизировать все операции, обеспечивает однородность окраски ыикобакте-рий и почти в 200 раз повышает производительность труда. Принцип, по-локешшй в основу устройства, можно использовать в микробиологической практике для окраски мазков и другими методами.

На вышеуказанные приспособления получены рацюнализаторокие удостоверения. На второй вариант устройства получено авторокое свидетельство.

3) По данным литература люминесцентная микроскопия считается высокочувствительным методом для обнаружения микобактерий туберкулеза в патологических материалах (легкие, мокрота, лимфоузлы, молоко и др.). Объекты наших исследований (соскоби с пола ^тойл, стен.жгае-сточР'гх канавок и т.п.) резко отличаются по степени общей загрязненности механическими примесями и банальной микрофлорой.

Памп испытан метод люминесцентной микроскопии (по Поляковой 0,Л., 195?) в сочетании о микрэкультиварованпем на стеклах для сани-

гарно-бактериологической оценки объектов внешней сведи животноводческих ферм, неблагополучных по туберкулезу. Установлено, что метод микроцультур в сочетании с люминесцентной микроскопией молено использовать для индикации шиюбактерий туберкулеза в (.а те риалах с объектов мест содержания животных. При этом, на стеклах вырастают хорошо сформированные микрокультуры, которые при люминесцентной микроскопии выявляются в ввде светящихся золотисто-оранжевым или желто-зеленым светом скоплений. тяжей, кос.

Чувствительность метода люминесцентной микроскопии проверили на материалах с объектов искусственно обсемененных микобактернямп в смеси с фекалиями аивотных. Для опытов использовали M.aviua - штамм-780 и кислотоустойчивый сапрофит - il.phlei . Из этих штамшв готовили бактериальную взвесь в 10-ти разведениях (от I млн до I тыс.). Кая-дым разведением микобактерий обсеменяли по'3 тост-объекта (дооки, кирпич а кафельную плитку).

Установлено, что при обсеменении тест-объектов высокими разведениями до 25 тыс.. микробных тел в I мл на 100 см2 площади, оба метода (световой п люминесцентной микроскопии) позволяют четко обнаруиить микобактерии. При снижении плотности обсеменения тест-объектов чувствительность световой микроскопии тояе снижается. Лвюшесцентная микроскопия в сочетанш с микрокультивированием позволяет обнаружить ми-кобактерил в количестве 100 клеток на I см площади твет-объокга.

4) Проведено сравнительное-изучение пяти яичных питательных сред (стандартной Левенштейна-йенсена I-оЙ езрии, изготовленной Твмопсклм предприятием бактерийных препаратов, и яативных - Левенитейна-Йенсе-на, Финн-2, Петраньяни, Мордовского), с целью выявления наиболее информативной из них, для получения культур мпкобактерий туберкулеза в чистом виде методом прямого посева, лз материалов животноводческих ферм.

Исследование проводила на 100 пробах-соскобах, отобранных в коп-

■це зиыне-стойлового содержания в эдвотноводческих помещениях фермы колхоза, неблагополучного по туберкулезу крупного рогатого скота. Материал обогащали сочетанием методов флотации и седиментации о последующей очисткой от посторонней ыщрофзорц раствором серной кислоты. Отмытый физраствором осадок каждой пробы засевала да 0,2 мл на пять изучаемых яичных питательных сред,

По результатам бактериоскопии посла обогащения материалов яс-сладуешх проб в 25 из них «шшбантариа не обпаруквна (-), а 75 проб содержала различное их количество и оценены нами на: (+) - 39 проб (единичные шкобакгерш в рравараге), {++) - 16 цроб (скопление ии-кобактерий в редких полях зрения), (-ж-) - 20 проб (сковлениа ьшко-бактерий почта во всех шлях зрения).

Установлено, что все до пи тан ни о с ради 'можно использовать для та-деления (дикобактерий из материалов внешней среда неблагополучных по туберкулезу ферм. В токе время высокую днфэркатпвнооть показали три среды: стандартная Яэвештейна-йенсена, Фиш-? и Московского. Результаты одсеваемости ыикобаиторий из бактаркосцопичашш отрицательного материала на атих средах в 4 и 3 раза были выше, чем на остальных. Из бактераоскопически положительных материалов рост цккобактарий на средах: стандартной Дввенитейна-^еясена, п Моршзвского обна-

ружен на 6-9 сутки в 32 % случаях, в то время как на остальных -только в 8 % случаев. На 6-ой неделе ввеоваешоть ыпкобактерий на этих средах соответственно составдо: из проб с одфицироваияоетьт на (+) - в 64-Б2 на (++) - в 100-34 % и на (-н-+) - В 100 % случаев. Самую высокую информативность показало стандартная среда 1е-венитэйна-Иенсвна. Но выевваешети и скорости роста мякобактарий из всех образцов проб она значительно происходила все остальные. Применение одновременно двух-трех яичных питательных сред, в любых ком-' бивациях, параллельно со средей Левенштейна-^онсена существешю по-

вышает высеваемость микобактерий и надежность получения их в.чистой виде из патологических материалов с низкой степенью инфицированиес-та.

5) Проведено сравнительное изучение эффективности уничтожения банальной микрофлоры при обработка материалов'с объектов мест содержания животных, различными концентрациями серной кислоты: 18/5, 15}», 10%, Критериями оценки служили: процент выделения куль-

тур (высеваемость) микобактерий, интенсивность и скорость появления их роста, процент проростов. Исследование провели на материалах 30 проб-соскобов, отобранных нами с объектов животноводческих помещений колхоза неблагополучного по туберкулезу крупного рогатого скота, и имеющих, по результатам бактериоскопии высокую степень кон та мин провалил микобактериями. Концентрацию микобактерий в материалах проводили' сочетанием методов флотации и седиментации. После обработки цент-рифугатов каждой пробы параллельно растворами серной кислоты,в вышеуказанных концентрациях выоавали их на две яичные среды: стандартную среду ЛевенштеИна-Йенсера и нативную среду Мордовского,.

Установлено, что высокая высеваемость микобактерий (в 38,3-100$) из исследуемых материалов, на обеих использованных питательных средах, обеспечивается 20-мин.утным воздействием 6 % раствора серной кис- • лоты. При этом количество проростов после обработки материалов первыми четырьмя концентрациями серной кислоты на обеих средах не превышал 0,5 %, В то время гак во всех случаях использования 2 % раствора отмечалось развитие посторонней микройяоры.

Применение серной кислоты в 6 % концентрации обеспечивало появление первичного роста микобактерий на обоих средах.с 6-9 суток и значительную его интенсивность. Таи, на среде Левенштейна-.'юнсена высокая интенсивность роста (20 и более колона;!) установлена, в 37 .¿, на среде Мордовского - в 83,2 % случаео. Б то время как после очистки

исследуемых материалов растворами серной кислоты в более высоких концентрациях интенсивность и скорость роста микобактерил.а также вероятность выделения их из материалов резко снижались.

2. Экспрессная индикация и выделение микобактерий ' туберкулеза в материалах с объектов животноводческих

2.1. Мйкрокультизпровшше на стеклах,как метод индикации шкобактерий в материалах с животноводческих ферм до и после дезинфекции

Модифицированный наш метод получения микрокультур микобактарий . вклнчаот: отбор материалов средними пробами-соскобами (с 5 точек изучаемого объекта, площадь одной точка IOC см**) и в первую очередь с объектов внешней среды животноводческих ферм, подвергавшихся наиболее частому 11Н$вдировешш ьшкобактериями (стен на уровне 0,5 и от пола, проходов, сточных канатик, иола стойл, кормушек, поилок,почвы территории ферм с I м и' 5 м от помещения) f обогащение этих материалов сочетанием флотации а седиментации с очисткой их от банальной микрофлоры 6 % раствором серной кислоты, последующим микрокультиаи-рованием микобактариИ на предметных стеклах с кидкой питательной среде, типа среды Сотона, и окраской микобактерий в мазках методом Циль-Нильсена, с использованием для этих целей разработанными нами устройств.

В процесса культивирования в течение 5-12 суток микобактерии вырастают на стеклах в воде хорошо сформированных микрокультур,напоминающих тя'ки, кучки, скопления отделышх особей без выраженной конфигурации. Наличие ыикрок.ультур следует расценивать как доказательство аизнесвособноотл микобактерий, их росто и размножения в период инкубирования в тенкой питательной среде. Это позволяет ставить предварительным диагноз сразу после микроскопии. что является достоинством данного метода.

Проверена" пригодность метода микрокультур для индикации мико-бактерий с целью-определения наиболее часто инфицируемых объектов внешней среди и степени их обсзмененности возбудителем в период неблагополучия, в зависимости от эпизоотической ситуации и качества проведенных механической очистки и дезинфекции.

Работу провели в четырех с различной эпизоотической ситуацией, неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйствах Целиноградской области (ОПХ ВНИШХ. совхозах Заречный, Новоишшсккй им. 40-летия Казахстана).

При выборе времени исследования учли сообщение А.Н.Крошева (1955), что наиболее интенсивное бактввиовыделение происходит у больных туберкулезом животных к концу зяше-стойлового периода, при ухудшении условий питания и обострения процесса. Исходя из этого изучение уровня шкобзктериальной обсеконэяпости объектов внешней среды на всох обследуемых фермах проводили в три периода:

1. В конце зимне-стойлового содержания скота (февраль-март);

2. После вывода скота на пастбище и механической очистки (июнь-июль);

3. После дезинфекции (август-сзптябрь).

В кагшом хозяйстве выборочно обследовали по 2-3 животноводческих помещения, в основном коровники и трлятнеки, в которых, из числа содержащегося в них взрослого поголовья периодически выделяли яитотных с положительной туберкулиновой пробой.

При этом за исходную микобактогиальпую сйемун^'мость принимали количество неблагополучных объектов и стлпэнь их Ш'1ацнроЕанности . иигсобакториями в ппЪвнй период - в конка зимовки скота. Зффактивность механической очистки и двчкич-вкцаа па объектах пл-ощенш! осуществляли прзввдзидам колачесгрвнного учета в ка-глий пзр-'од исследования, в сравнении с исходной г.,ш><5ып-осй?льчой обс<гг.*ш!Рнв?сты». По норзстаии» И7и уисиьвтпто количество ясблзгопояу'птх обмктеи

я ыикобактерий на их поверхностях судили о качестве проведенных оа-нитарных мероприятиях.

Установлено, что в конце зише-стойлового содержания, на неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота фермах, вдет обильное инфицирование и значительное накопление микобактерий на поверхностях объектов в животноводческих помещениях и окружающей их территории вигулов. Степень микобактериальной обсемененности и количество объектов в животноводческих помещениях различного хозяйственного назначения и почвы выгулов вокруг них, даке в пределах территории одной и той зкз фермы (хозяйства), не одинаковы и находятся в пряшй зависимости от эпизоотической ситуации по туберкулезу.К таод ае, есл^ на ферме хотя бы в одном помещении периодически выделяются животные с положительными реакциями на туберкулин, то инфицируются шкобактериями не только объекты втого, но и других помещений, где таких тавотных нет (телятники), а такие почва выгула вокруг л их. Из общего количества обследованных в 10 помещениях 90 объектов, материалы 58 (64,4 %) содержали мико бактерии. При в том инфицированное ть объектов в коровниках составила 66-130 %, в телятниках 88,8-100 %. Во всех случаях были инфицированы стены на уровне 0,5 м от пола, щели пола стойл, поверхности проходов, кормушек, поилок, сточных канавок, почва выгула на расстоянии 1,м и 5 м от помещения. Высокую степень контамшшрования ыикобактэриями в помещениях имели навозные проходы, кмг'.асточные канавки, пол стойл. Из материалов етих объектов, только для установления истинной природы микобактерий в микроколониях на стеклах, было изолировано и идентифицировано 20 культур ыикобрктеркп. из которых 25 % отнесены к микобактериям бычьего вида, остальные - к птичьему (5 %) и атшшчккм микобактериям (70 %) (П-Ш груш по Раншиу).

Посла вывода скота на пастбище и проведенной в помещениях меха-

нической очистки» на поверхностях большинства .наблюдаемых объектов остался грязевой щит в виде сухих, плотных корочек, толщиной до 0,1 см и более. При этом, материалы с 51 объекта (56,6 %) от 90 обследуемых, содержали микабактерии. В этот период они не были обнаружены в пробах со стен. В токе время поверхности нижесточных канавок, проходов п пола стойл по-прешгеыу остались обсемененными в 100 % случаев и содержали значительное количество шжобактерий, Из материалов этих объектов было выделено в чистой виде и идентифицировано 15 культур кикобактарий, из числа которых 14 (93,3 %) определены как атипичные (П и Ш группы по Рациону) и одна (6,7 %) отнесена к сапрофитом.

После проведэяной двукратно дезинаекцш 3 % щелочным раствором формальдегида, шкобактерии не обнаружены в материалах только тех объектов, на которых после механической очистки величина остаточной загрязненности была настолько незначительной (визуально ясно : были видны цвет и структура материала, из которого изготовлен объект), что стал возможен контакт меяду деанафицвдувдиы веществом и шжобактериями и произошло их инактиаирование. На основании атого проведенная в них дезинфекция признана качественной. В остальных ке случаях ввиду наличия значительного "грязевого щита" на большей частя иг поверхностей, несмотря на проведеннуи дезинфекции, количество инфицированных объектов не снизилось.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о .пригодности предложенного юдифицированного метода микрокультур для саниг тарно-шжробиологической оценки объектов внешней среды в местах оо-дерхания неблагополучных по туберкулезу стад и объективной оценки качества проводимых механической очистки и дезинсекции.

Кроме того, он позсоляаг тбладатъ характеры у и для шкобакге-рий, если они жизнеспособны, морфологическую картину размнозащкхся

бактериальных клеток в ранниз сроки. Так. в мазках материалов среда обитания животных мшюбактериа обладала ярко выравенннм полиморфизмом. Микроскопией до мжро культивирования мы обнаруживали их в форме тонких или слегка изогнутых далочек, отдельных нитей, наподобие стрептококков или зернистых палочек, содержащих от 2 до 5 темно-красных или черных зерен. Наряду с типичными палочками, часто обнаруживались грубые, иногда расположенные попарно, наподобие диплококков или гантелей. Посла культивирования в среде Сотона, с 20 % сывороткой крови в течение 5-12 дней, в ыазках хорошо просматривались микроколошш шкобактерий в виде кучек, а также попарно расположенные клетки. В токе время, введу необходимости надежного подтвервде-ния ь ¿ироды микобактерш! в микрону ль ту pax на стеклах требуется проведение дополнительных исследований (получение чистых культур и их идентификация). ¿то усложняет и сдерживает ролученш конечных ре -зультатов при исследовании материалов методом ыикрокультивирования, и, несмотря на многие его положительнае стороны, позволяет использовать этот экспрессный прямой метод только как сигнальный для бактериологической диагностики туберкулеза.

2.2. Метод "осадка", как самостоятельный, тест для экспрессной индикации и выделения микобактерай туберкулеза из материалов животноводческих ферм

' Предлагаемый нами метод "осадка" включает: отбор материала средними пробами-соскобами, обогащение их микобактериямв сочетанием флотации и седиментации и инкубирование при 37,5-38,5 ^в течение 5-7 суток,центрмфугата, очищенного от банальной микрофлоры 6 % раствором серной кислоты. Если исследуемые материалы контаыинированы микобактериями, то к этому сроку на дне ценгри^унных пробирок накапливается бактериальная масса микобактерий. в чисток вида. По истечении 7-ми суток, пробирки центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин.

из осадка готовят пазки, окрашивают по Циль-Нильсену, делают пада-сев инкубированнах з яидкой срэде микобактерий на 2-3 яичные среды и заражают двух-трэх юрских свинок.

Сочетание эффективного приема обогащения о кратковременным выращиванием микобштерий вначале на жидкой, а затем последовательно на плотных яичных спадах (а субкультурах), в 5-6 раз сокращает срок индикации и1 на 7-9- суток выделение медленнорастущих микобактерий.

Эффективность использования метода "осадка", для индикация мико-бак торий, в материалах: из животноводческих (Герм, проверили в пределах одной, вновь, выявлзиной. неблагополучной по туберкулезу крупного рогатого скота- фарш1 колхоза "Советская Россия" Ливенского района орловской' области; Изучали, микобактариальнур обсемененность одних, и тех se 4'2-х-объектов из<всех (пяти), животноводческих по мощений, находящихся: на территории! фЬрмы. и почвы выгулов вокруг них. Наблвдеика вали В' тачанш Г,5 лет от начала неблагополучия по туберкулезу до полного.- оздоровления; В' течение этого-срока ,в кавдюм помещении по 5; раз провели; бактериологическую-оцеяку; санитарного состояния объектов внешней; орадн:- стон; на уровне' 0,5 м от пола, проходов, кормушек, ' поклон, пола- стойл,, сточных канавок, а также почвы выгулов с глуби-НН1 ТО1 см; т- расстоянии; Iï м и 5 и от помещений. с целью изучения ди~ . пвмяки. нарастания; ихс микобактериальной обсемененное m в зависимости - от' эпизоотической'1 ситуации и проводимых специальных и организационно— хозяйстаеннях:. мероприятий'.. Бйяв за - тюходну» величину степень инфи--цированностя! микобактврияки исслэдуошх объектов ■ в. конце зимна-стой-лового- содержания; ('н^напем случае период-начала неблагополучия колхоза по- туберкулезу; когда из стада выделялось более 15 реагирующих на туберкулин кивотинх) изучили уровень обсоменонтюсти мксобок-ториями этих >;;о объектов внешне'! среды после t,!0xami40CK0it очистки, после капитального-ремонта н деагаТокциа-поксяоихЛ, затеи дважды после полного оздоровления я снятия отнкчениа I» тубдп'улвзу.

Анализ результатов исследований показал, что в период начала неблагополучия отмечался высокий уровень инфицированное™ иикобак-терияш объектов внешней среды (100 % наблюдаемых объектов) во всех помещениях, находящихся на территории фермы, независимо от их хозяйственного назначения и эпизоотической ситуации в них.

Изучение видовой принадлежности II культур микобактерий, выделенных в этот период исследования, из отобранных в одни сроки патологических материалов: из срадостенных лимфоузлов от животных, реагировавших на туберкулин, из сборных проб молока, от животных фарш о отрицательной реакцией на туберкулин, и из материалов с объектов • внешней среды фарш, показал, что объектч внешней среды инфицированы теми же видами микобактерий, ко то púa мигрируют среди животных ? стада. Так, из общего количества выделанных в этот период культур микобактерий - 0 (88,8 %) определены как микобактерий оуберкулеза бычьего вида, в их числа 5 были изолированы с объектов внешней среды.

После удаления зараженных (реагирущих) животных и всего неблагополучного стада с территории фермы а проведения только грубой механической' очистки, после которой на объектах помещений величина "грязевого щита" оставалась значительной (о? 0,1 на поверхности большинства объектов и до 4,0 сы в щелях пола стойл), уровень ыико-бактернальной обсеыоненности нз только снизился* но на объектах некоторых помещений даже повысился на 11-16 При этом, видовой состав микобактерий на объектах внешней среды остался прежним и общее количество инфицированных ими объектов не отличался от исходного. Кэ снизился уровень инфицированности ыикобактериями посла обеззараживания наблюдаемых объектов 3 ^ шелогчшм раствором формальдегида. Наличие на их поверхности мощного "грязавого щита" способствовало сохранении в нем микобактвгпй. Только после тщательной механической очистки {проведенной повторно), поело которой визуально установлено,

что "грязевой щит" практически отсутствовал, отмечалось снижение общего количества инфицированных микобактериями объектов до 40-50^, а также степени их шшобактериальной обсеиененности до 50-90 % и более. Послэдувдее проведение двухкратной дезинсекции 3 % щелочным раствором формальдегида позволило получить обеззараяшзавдий эффект.

Результата исследования показали, что метод "осадка" позволяет в относительно короткие сроки установить места локализации мико-бактерий во внешней среде на неблагополучных по туберкулезу фермах и определить уровень их микобактериальной обсемененности, в зави-' симости от эпизоотической ситуации по туберкулезу п качества проведенных оздоровительных мероприятий. Использование прямого экспрессного метода индикации микобактерий в материалах с объектов внешней среды, в комплексе о обязательными организационно-хозяйственными и специальными ветеринарно-санитарными мероприятиями, позволили в течение одного года оздоровить неблагополучный по туберкулезу крупного рогатого скота колхоз "Советская Россия" Ливонского района Орловской области.

2,3. Определение видовой принадлежности изолированных микобактерий

Изучая прямыми методами ускоренной индикации шжобактерий туберкулеза уровень и динамику нарастания микобаигериальной обсаменен-ности объектов внешней среды до и после дезинфекции, на 7-ми животноводческих фермах с различной эпизоотической ситуацией, в 7-ми неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйствах Целиноградской, Орловской и Воронежской областей, памп, исключительно с целью подтверждения природы микобактерий в мпкро- и макрокультурах но жидких средах, параллельно катодом пряного посева на яичные среды было выделено 95 культур микобактерий в чистом виде, ¡¡золя-цкю ж провод2!ли выборочно, кляднй раз произвольно отбирая неболь-

шое количество некого тих полошТельнах материала в от кивотнцх или проб-соскобов с объектов внешней среда обследуемых ферм, имевшим по результатам бактериоскопии вы соку о степень контаминирования ма-кобактвриями. Идентификации культур гшсобактериД проводили по морфологическим, культуральныы, биохимическим л биологическим признакам.

Анализ видового спектра изученных наш: культур показал, что в период неблагополучия го туберкулезу, на территории ферм объекты внешней средн игфицированы •я.ооу1з, ш.аг1ит , атипичными микобак-тернями (П к Ш груш ■ ш Раниону) и сапрофитными микобактарияыл.

При этом, 88 культур микобактерий (92,6 £} выделены во всех случаях, в основном из шхериалов 5-ти объектов: проходов, кормушек, пола стойл, .сточных канавок, шчвы вырулов. Наибольшее число рулъ-тур - 77 {87,5 патогенных а непатогенных мико бактерий,, изолировано с поверхностей 2-х одноименных объектов животноводческих шма- , щений: пола стойл, сточных канавок, проходов. М}1кайак.тада туберкулеза бычьего вида были выделены такие из материалов, кормушек. и почвы территории ввгулов, Приведенные данные свидетельствуют о серьезной эпизоотической и апидеаичоскай опасности объектов, внешней- среда»

Использованный для 1даитифинацад ыжобавтврий' комплекс основ-» ных и дополнительных лабораторных тестов,, позволяет определить мико-бактерии туберкулеза и даЩаревцировать их от на туберкулезных мико-бактерий. Вместе с теьи диагностическая ценность некоторое тестов не однозначна. Данные с видовой принадлежности ышобактерий,. изолированных из материалов внеаней среды, в сочетании с результатами о ¡шли,ип и количестве контамшшрованных кикобактериями объектов,шз-водлот дать объектипную саиитарно-микробиологическую оценку объек-а а и ¡¡а неблагополучии! га туберкулезу фермах.

ках наблвдали 12 месяцев. В течение этого срока микобактерии оставались адсорбированными на дисках, и не изменяя своих шреологических и тинкториальных свойств обильно накапливали бактериальную массу. Ежемесячные контрольные пересевы микобактерий с дисков на яичную среду показали, что они в течение года оставались низнеспособ-ными. Эффективность очистки от посторонней микрофлоры бактериальной' массы микобактерий на парафиновых дисках проверили на материалах ; искусственно и естественно контаминированных микобактериями (нестерильные навески почвы, средостенша лимфоузлы от животных, с типичными для туберкулеза изменениями, и пробы-соскобы с объектов внешней среды с неблагополучных по туберкулезу ферм). Исследование провели в сравненш- на 2-х средах накоплена (Сотона и минеральной), предварительно добавляя в них параллельно следу ацие химические детергенты: I) двухпроцевтный раствор бриллиантовой зелени - 200 мл на I л среды (Розанов Н.И., 1957); 2) антибиотик карбеницшшщ -200 ад./мл (Нестеренко O.A. о соавт., 1985); 3) совместно раствор бриллиантовой зелени а карбеницшшина.в том не количестве.

Установлено, что содержание карбеницшшша и бриллиантовой зелени в средах накопления, в указанных порядке и концентрациях, не оказывали видимого влияния на скорость и характер роста, морфологические и тинкториальные свойства микобактерий. но и не сдерживали развития посторонней микрофлора.

Возможность получения чистых культур микобактерий на парафиновых дисках, из материалов от животных и объектов внешней среды проверили на более чем 50 пробах, отобранных на неблагополучных по туберкулезу трех животноводческих фермах.

Исследования проводили на средах.Сотона я минерпльной в срап-нении двумя способами:

1. Посевсчл яаве.шхю очшцониих от посторонне;! микгхп'лотн иссл-ь

дуемых материалов на среды накопления, после предварительной обработки 5 % Н^^ и 4 % МаОН. общепринятыми приеиами.

2. Очисткой дисков, после накопления на их нижних поверхностях при инкубировании значительного количества бактериальной массы микобактерий в ввде серо-келтого цвета колоний, хорошо различимых невооруженным глазом наподобие "манной крупы" или "ободка".При этом обрабатывали диски от посторонней микрофлоры 3-мя способами:

г доставали по 3-5 дисков и помещали их на 20 мин в стаканчик с 6 % раствором Н2304;

- соскабливали с нижней поверхности 7-10 дисков в центрифужную пробирку бактериальную массу микобактерий, добавляя в них по 5 мл 6 % раствора серной кислоты и 15 ищут центрифугировали при 3000 об/мин;

- в среды накопления, с посевами исследуемых материалов на I, 3 и 5 сутки инкубирования добавляли равное по объему среды количество 8 % раствора й аОН и.оставляли на 24 часа. Затем заменяли питательную среду на свекую,.полностью удалив старую со шелочыэ.

После очистки указанными способзми диски переносили в свежие жидкие среды накопления и на Левенштейна-йенсена. В результате через 24 часа на жидкой и 24-72 часа на яичной средах, во всех случаях были получены культуры микобактерий в чистом.виде.

• По результатам микроскопии, проведенной в различные сроки инкубирования (при сравнении мазков через 60 мин - 24-48-72 часа),а также при обнаружении на нижней поверхности'дисков, видимого невооруженным глазом роста микобактерий в виде жолто-иерых колоний, наподобие "манной крупы" или "ободка" - проводили индикацию микобактерий и устанавливали их жизнеспособность. В более ранние сроки жизнеспособность гх опроявляли но наличии микроколоний микобактерий, с;.ормигонаыаихся на нижней поверхности дисков после 24-96 ч

инкубирования в кадкой среде и окрашенних одним из способов: .

1. Переносили по нескольку дисков из среда накопления в стаканчик с 0,5 % водным раствором одной из анилиновых красок ((дзтилзновой сини, бриллиантовой зелени или нейтральрот) и оставляли на 30-60 мин,

2. В колбы с посевами добавляли по 0,5 ил насыщенного раствора любой вышеуказанной анилиновой краски, оставляли на 24-48 часов, затем исследовали под микроскопом.

Для чего диски ншхней стороной вверх укладывали на поверхность предметного стекла и микроскопировали без'иммерсии, используя объективы 8х и 40х. При этом на свегло-сзрон фоне неокрашенных парафиновых -дисков хорошо были видны окрашенные молодые колонии микобактерий.

Установлено такие, что присутствие гясторонней микрофлоры не влияет на индикацию и определение жизнеспособности микобактерий и но кешзет обильному накоплен™ ими бактериальной массы на парафиновых дисках.

Дополнительное центрифугирование фильтрата исследуемого материала пород его посевом в среду накопления значительно повышают концентрацию микобактерий на парафиновых дисках.

Полученные нами позитивные результаты исследований с твердым парафином позволили рекомендовать метод индикации а выделения микобактерий туберкулеза получением макро- и макрокультур на парафиновых дисках в нидкой питательной среде, отличающийся тем,что исследуемые материалы, после юс предварительного измельчения, но без всякой дополнительной традиционной обработки от посторонней микрофлорц,вносят в стеклянные колбочки, о предварительно разлитой в них .-¡сидкой питательной средой, типа среды Согона, 5 % ШГБ или мшеральной. Посла обогащения исследуемых материалов ^лотацйеЙ кз них микобактерий твердым парафином, нанесенным на поверхность питательных сред в вида Изолированных дисков, 0 около 0,5 см. проводят.их инкубирование

прямо на дисках. Бри наличии в исследуемых материалах микобактерий, они в течение 60-90 ман адсорбируются на нижней поверхности парафиновых дисков', прочно на них удерживаются и, не врастая во внутрь , активно размножаются, формируя к 24-48 часам изолированные микроко-лонкп, которые к B-5-I2 оут вырастают в виде отдельных ("манная крупа") или слившихся серо-желтого цвета макроколоний по краям дисков (?ободок").

Индикацию и определение жизнеспособности микобактерий проводят микроскопией: I) мазков-ооскобов, окрашенных по Цкль-Нильсену»приготавливаемых с нижней поверхности парафиновых дисков через 60-90 минут после.посева наследуемых.материалов в лшдкую питательную среду и 2'" -48 часов инкубирования, флотированных на дисках шшобактери]

2) мнкроколоний микобактерий, сформировавшихся на шшшй поверхности дисков, посла 48-96 часов инкубирования и окрашенных водным раствором метиленовой сини (или другого цвета анилиновой краски);

3) обнаружением видимых невооруженным глазом овро-желтого цвета (ши другого цвета у пигментных) колоний микобактерий, формирующихся в сроки до 2-х недель на нижней поверхности дисков, в виде "манной крупы" или "ободка", и пленки вокргуг них.

Выделение культур микобактерий в чистом воде проводят после обнаружения видимого роста микобактерий в виде "ободка" или при значительном их содержании в мазках-соскобах с дисков в любые сроки инкубирования, путем очистка их Б % раствором серной кислоты или 4 %

раствором едкого натрия, с последующим пересевом микобактерий апшш-

£ ' каций нианей поверхности диска на плотные элективное питательные ср

. да. Ери этом отмечается интенсивный рост микобактерий на поверхнос

ти среды через I8-S6 часов; обилгно накапливается бактериальная мае

оа в виде сплошного налета, состоящего из слившихся типичных для

микобактерий колоний. Особенно пышный рост наблюдается вокруг пара-

$иновых дисков, если после пересева микобактерий, они были оставлены на поверхности средн.

Диагностическую ценность метода индикации и выделения микобактерий туберкулеза на парафиновых дисках в пцших питательных средах проверили на 60 образцах микроскопически положительных материалов от яивотных и с объектов внешней среды неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота трех хозяйств Воронежской и Орловской об-

с

ластей. Исследование проводили параллельно методами Гона и "осадка".

При этом культивирование микобактерий на парафиновых дисках позволяет надето провести в течение 60 мляут-24 часов индикацию патогенных и негзтогенных микобактерий из различных материалов,на 3-10-12 сутки получить культуры в чистом виде и значительное количество бактериальной массы. Это на 20-25 суток раньше, чем с использованием даже экспрессного метода "осадка".

Из всех 60 исследуемых нами образцов материала на парафиновых дисках били получены чистые культуры микобактерий. Проведенная их идентификация показала, что материала от животных были контаминиро-ваны патогенными и атипичными микобактериями (П группы по Раниону). Из образцов проб с объектов внешней среда были изолированы атипичные и сапрофитные микобактерии (И-1Д-1У групп по Раниону). Ввиду обильного накопления на парафиновых дисках бактериальной массы всох видов микобактерий, изолированных из исследуемых материалов, мы исключили приемы пересева первичной генерации микобактерий с дисков на яичные среды, которые традиционно используют для накопления бактериальной массы, значительное количество которой требуется для проведения идентификации микобактерий. Это позволило провести определение видовой принадлежности изолированных на парафиновых дисках культур микобактерий в первой генерации. Такой порядок исследован ад

упрощает бактериологическую диагностику туберкулеза и сшшает затраты средств и времени.

Методом кик року ль тур на парафиновых дисках нами исследовано более 200 проб патологического материала (кусочки внутренних органов к лимфоузлы с типичными для туберкулеза изменениями и без них) от 50 голов крупного рогатого скота, трах хозяйств Воронежской области. реагировавших на ШД туберкулин и комиссионно убитых ва Воронежском мясокомбинате. Более 60 проб исследовано с объектов внешней среды, отобранных до и после дезинфекции на животноводческих фермах этих же хозяйств.

Погод используется для бактериологического исследования на туберкулез ветеринарными лабораториями Воронежской, Липецкой и Ростовской областей.

2.5. Идентификация микобактерий туберкулеза по наличию и характеру роста на парафиновых дисках в жидкой питательной среде

Изучена возможность внутрародовоц идентификации микобактерий в первой генерации по наличию и характеру цх роста на парафиновых дисках в жидкой питательной среде, в присутствии определенных концентраций некоторых анилиновых красок, и по способности к пигментообра-зованию.

Исследования проводили одновременно на двух средах накопления (5 % ШГБ и минеральной). Объектами изучения служили микробные суспензии 6-ти музейных шташов: a'H3VRv, U.*>ovia-l2, ы.всо, и. £ог-tultum, U.eviuin-780, М. amegmatis . Их вносили в'среды накопления с таким расчетом, чтобы-количество микобактерий в каждой колбе соответствовало 2 млрд микробных тел в миллилитре питательной среди После инкубирования в течение 5-7 суток, в обе среды, параллельно добавляли боднно раствори: фуксина основного, нейтральрота ,

бриллиантовой зелени, малахитовой зелени, кристаллвиолета, с таким расчетом, чтобы содержание их в средах соответствовало 0,01 % концентрации. Посевы инкубировали в термостате при 37,5 °С в течение 15 суток. При оценке результатов учитывались сроки изменения соответствующего цвета сред накопления, в сравнении с исходным цветом в колбах со стерильной средой, а также наличие и характер роста изучаемых микобактерий на дисках. Для чего, кавдне 2-3 дня готовили: I) ма&ки-соскобы с шстеВ поверхности дисков, с последующей окраской их по Циль-Нильсену; 2) мазки, изготовленные путем укладки на пред-мзтных стеклах самих дисков, нижней поверхностью вверх, на которой, с использованием объектива 20х - и окуляца 7х, изучали морфологию колоний кпкобзктеркй-

Анализ результатов исследования показал;

Добавлений в орэ.га накопления анилиновых красок: .Тукошга основного, изйтрэльрот, бриллиантовой золой и, малахитовой зелени и крис-галлвполета, клгоэя г концентраций 0,01 кг/вл, дозволили чероз 48 часов но цвету л (Тор::э полонпЛ но поверхности пэрэсМ'-чопшс дисков, а такяа лзиеиенгаэ цвета шгадолшк сред, обнаружить розницу в харэкте-рэ роста использованных craavKOB микобактерий. Наиболее наглядно "'то проявилось при нтубкроэзпкя их в 5 $ 1ЯШБ, содержащего пейтгальрот, бриллшяговуя зелзнь я мзлзхитовуп зелень. Однако, все испнтанпио краски, ввиду незпачпгэльних концентраций их (0,01 мг/мл) в средах накопления оказались нестойкими. К 96 часу инкубирования постепенно исчезала окраска питзтзль!шх сред и полностью обесцвечивались колони:: игкобакторпй на дисках, что ограничило возможность дальнейшего их изучения.

Учиплзчя рэкокендают Розанова Н.й. (195^ ка уреличялп соло;-г.знне псоттусмих анялкяошх ктасок в среде вэзодоеияя 0,3 :■•, v, *•>. 13 тозэ В17-ЗМЯ, чтоб? исключить гозмоаюв '¡облс!гоп::;'-л"Л1та -«•.ягейсть:!'--

ss

таких относительно высоких концентраций красок на рост изучаемых микобактерий, инкубировали их вначале на минеральной среде накопления. без красок в течение 5-7 суток. По истечении этого срока, заменили эту сроду на 5 % ЫПГБ, содедаащий раздельно э двух концентрациях (0,5 % ц 2 %): бриллиантовую зелень, малахитовую зелень,сафранин, ыегиленовув синь, нейгральрот и фуксин основной. Учет результатов проводили через 24-48 часов до наличию и характеру роста микобактерий на дисках. Просматривали окрашенные колонии под .малым увеличением микроскопа (окуляр 7х - объектив 8х). По описанию морфологии колоний провели идентификацию микобактерий.

Наиболее наглядно 'разница в характере роста патогенных и непатогенных микобактерий проявилась в присутствии нейтральрота, фуксина основного и метитановой сини, содеркащихся в 5 % ШГБ в 0,5 % и 2 % концентрациях. При атом расположение и форма колоний сформировавшихся'на дисках не отличались от таковых, что и при инкубировании микобактерий в присутствии анилиновых красок в концентрации 0,01 . кг/мл, и были характерны для каждого вида микобактерий. Так, при росте: K>II37Bv - вся поверхность диска обильно покрыта различной величины колониями в виде толстых, сливкообразных складчатых кучек или мощных локоноввдных жгутов, состоящих из равномерно окрашенных Параллельно расположенных нитей;

H.tovis- 12 - растет скудно, на поверхности диска встречаются редко расположенные, отдельные, различной величины, плоские, однородно окрашенные кучки с неровной поверхностью, а с более бледно окрашенными острыми или корневидными отростками различной величины, иногда в qopue ните", которые или соединяют несколько колоний,или располагаются вопрь"? них в виде тонкой сетки;

11.В03, U.icrrtuituB, u. sr.-gnatis -формируют гладкие гыЕуклке, сочные (стекловидные) крупные к мелкие неправильной форта

колонии, неравномерно окрашенные в соответствующий цвет краски.Края колонии ветвистые в виде толстых коротких локонов или отристков-ни-. тей, различной толщины и длины.

В тояе время обнаружены некоторые исключения: I) в присутствии фуксина основного - H.ayiua nil.fortultunpao-тут в виде сплошной сетки, состоящей из различной толщины .равномерно окрашенных нитей;

в присутствии нейтральрот - U.fortultua ,M.Binegna>tia формируют тонкие и короткие, местами ветвистые (на-подобие актиномице-тов) нити, окрашивающиеся в нелтый цвет;

3) нейтральрот. метиленовая синь, фуксин основной в 2% концентрации угнетают рост и.avian, li.fortuitua, H.smagna-tis . а метилено-вая синь - .

В период инкубирования в среде накопления, одновременно с выделением культур микобактерий в чистом виде на парафиновых дисках, (т,е. в первой генерации) провели их дпеитгДикацив по способности к rilir мен тоо бра зов а нию,

Для атого каждую пробу исследуемого материала вносили поровну в две колбы (емк. по 50 мл) с заранее приготовленными средами накопления (5 % Ш1Б и минеральной). Колбы закрывали стерильными пробками и на одной из них надписысяли "свет" на другой "темнота", последовательно заворачивали в темную бумагу и обе колбы ставили в термостат для инкубирования при 37,5-38,5 °С. Посевы просматривали ежедневно. Если исследуемые материалы были контаыинированы микобактериями.то на 3-5-7 или 10 сутки инкубирования, на парафиновых дисках формировались характерные для микобактерий колонии, напоминающие "манную крупу" или "ободок". Если колонии микобактерий имели орапввую окраску, независимо от действия света их считали скотохроыогеняныи. Если яе а о та с соки инкубирования обе колба содврясалп колонии микобактерий с различно/

окраской: в колбе "свет" - желтоватая культура, а в колбе - "темнота",- кремовая, то последнюю колбу без -черной бумаги ставили на солнечный свет на 2-4 часа или освещал!; искусственным светом (лагпоЗ 25 Вт) в течение 4-6 часов, после этого колбу снова обертывали бумагой и инкубировали в том яв режиме. Если цвет колоний через 2-3 суток приобретал желтую окраску, т.е. пигментация колоний на дисках появлялась после воздействия на нее света, их относили к фэтохромо-генным культурам микобактерий.

В т^кок порядке способность к пигментообразованив проверили параллельно на вышеуказанных 6-ти музейных штаммах микобактерий и,тшее нами идентифицированных^ 30 культурах мнкобактэрнй, изолированных на парафиновых дисках из различных положительных патологических материалов от животных и с объектов внешней среды четырех неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйств Воронежской и Орловской областей. Проведенные исследования подтвердила пригодность предлагаемого приема определения способности микобактерий к пигменгообра-зованию. Из числа изучаемых нами культур наличие пигмента было установлено у трех. При этом, две из них отнесены к скотохромогенным и одна - к $отохроыогенныы микобактериям, что полностью соответствовало ранее полученным нами результатам идентификации этих же культур известными общепринятыми методами,

С цельа подтверждения достоверности в получении результатов определения видовой принадлежности микобактерий, изолированных из различных «зтерпалов предлагаемыми нами способами, в каждом конкретном случае, для сравнения, исследования необходимо проводить параллельно с гспользованием в том же порядка музейных штаммов патогенных и не-ватогенных цикобакгерай.

ВЫВОДЫ

1. В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах у ¿овень инфици-рованности шкобактериями объектов внешней среды прямо пропорционален сложившейся эпизоотической ситуации по туберкулезу и качеству проведенных оздоровительных мероприятий. Видовой состав микобакте-рий, мигрирующих среди животных неблагополучной фермы, идентичен микобактериям с объектов внешней среды ее территории.

Местами локализации с высокой степенью инфицированности микобактериями в основном являются поверхности объектов животноводческих помещений: жгаэсточные канавки, пол стойл, проходы, кормушки, поилки, а также почва территории выгулов. Из материалов таких объектов около 25 % случаев выделен возбудитель тубвркуяэга бнчь^о вида и более чем в 75 % - атипичные микобактерии (II,Ш и 1У групп по Раниону).

2. Для санитарно-микробиологической оценки объектов на животноводческих фермах неблагополучных по туберкулезу, до и после проведоп-нэг' дезинфекционных мероприятии могут слуяить:

а) усовершенствованный нами метод культивирования микобактерий на стеклах в кцдких питательных средах типа среды Сотона в сочетании с обычной или люминесцентной микроскопией. При наличии на неблагополучных фермах источника инфекции или при неудовлетворительно проведенных дезинфекционных мероприятиях за 5-12 суток на стеклах вырастают хорошо сформированные микрокультуры микобактерий в виде тякзй, кос, скоплений*

б) разработанный нами метод "осадка" - порядок исследования культивированием микобактерии в осадке в жидких питательных средах типа среды Сотона в сочетании с обычной микроскопией, поэволшцей.г, течение 5-7 суток на дна центрифушшх пробирок накапливать бнктздаль-пую массу микобактерии в чистом виде;

в) разработанный наш лошл метод культивирования микобактерий на парафиновых дисках в ищкой питательной среде (типа минеральной среда или среда Сотона), в сочетании с обычной микроскопией, из предварительно неочищенных от банальной шшрофяорн патологических материалов. При наличии в исслздуемнх материалах микобактерий, они в течение 60-SQ мин адсорбирй'ются на нижней поверхности парафиновых дисков, прочно на них удеряивавтся и. не врастая во внутрь, активно размножается, дорыируя к 24-48 часам изолированные микроколонип ш:::о-бактерий. которое на 5-7-12 сутки вырастает в вида отдельных ("мзнна.ь

л

крупа") ели слшешхся серо-желтого цвета макроколоний млкобактериЛ по краяы дисков ("ободок").

. 3. ¡^пользование предлагаемых экспрессных методов индикации микобактерий, с цельа быстрого и полного выявления источников и резервуаров возбудителя, а такие бактериологического контроля качества де-зин5екцшн1шх мероприятий, способствует уничтожению очагов ш$екции и позволяет сократить сроки оздоровления неблагополучных по туберкулезу хозяйств.

4. 1Дехаяпческую очистку можно считать удовлетворительной если после ее проведения откзчается снижение степгвихдйлцпрованностп ып-Еобактераями объектов животноводческих фвци я общего их количества, и при визуальном контроле, наблюдается отсутствие на них "грязевого сдта". когда ясно видга цвет к структура материала, из которого изготовлен объект.

Проведенная дзззшхекщш признается удовлетворительной, если Еизнеспособнле шллбактер^и нэ обнаружены при текуцей дезинфекпил но иенее, чем в.SO > проб, и при профилактической и заключительной де-зззлегцпи отсутствует во всех пробах.

5. ~лд пзгь-пеЕИр вероятности обнаружения ¡/лжобактерий на объектах Езб^гзг.злучБкх до г'Сэгкулэзу сербах, отозр материалов для

I '

бактериологического исследования необходимо проводите. с лдоареиенно, с охватом всех животноводческих помещений и не менее как с 5-ти объектов в каждом, а такие почвн шгулов вокруг них на расстоянии

о

I м и б м, увеличив общую площадь взятия игоб соскобами до 500см с объекта,

' Эффективность индикации микобактерий туберкулеза в материалах

о

проб-соскобов, составленных из 5 точек (общей площадью 500 см ) поверхности каждого изучаемого объекта на шгооиюводч.юкой ферме, выше в 4 раза, чем в пробах-смывах с такой же площади объектов, и в три раза - чем в пробах-соскобах, отобранных из одной точки (с пло-

р

щади 100 см ). Процесс отбора материалов - соскобами (скальпелем) , их упаковка, транспортировка и хранение нвтрудаешш и более удооны, в сравнении со-ошвами.

Значительный объем средней пробы-соскоба (до 250 г и более),воз-мояность ее полного исследования, за счет компактно уменьшенного объема пробы, в результате обогащения ее микобактериями, предлагаемыми Приемами флотацией твердым парафином или сочетанием известных способов флотации и седиментации, и последующим культивированном в жидкой среде типа Сотона, позволяет в 2-3 раза повысить концентрацию микобактерий в единице объема исследуемых образцов проб, в сравнении с обработкой этих материалов только флотацией или седиментацией.

6. Для получения макрокультур микобактерий туберкулеза рекомендуется способ, включающий инкубирование микобактерий, флотированных на нижней поверхности парафиновых дисков в жидкой среде накопления, из предварительно неочищенных от банальной микрофлоры материалов с объектов животноводческих ферм, с последующим пересевом шжобактер.:;: на плотные или жидкие элективные питательные ".рван, оулачодаи'оя \ что с целью сокращения сроков получения иакрохульл.пч пт юг,л ^-у/V ояяется после появления ш'дишгэ роста кигибак-.ем^ г •.■-'■•.> ■> -иг ;п:;;!'."]".с и последушэн очпсглоГ; о? ьзьт^^спи-'-. мл-:. <'• ■' •

вором серной кислоты или 4 % На ОН. Сроки получения культур микобак-терий туберкулеза в чистом виде сокращаются в 2-3 раза во сравнению с прямым посевом на яичные среды. Инкубирование чистых культур мико-бактерий на парафиновых дисках в периодически обновляемой элективной жидкой питательной среде, позволяет накопить значительное количество бактериальной массы.

?. Комплекс основных и дополнительных лабораторных тестов,использованный для идентификации микобактарий, позволяет определить возбудителей .туберкулеза и дифференцировать их от нетуберкулезных микобак-> ~ *

терий. В то же время многие методы являются весьма трудоемкими, требуют дополнительного времени, высокой квалификации, а некоторые из них -. детализации и усовершенствования.

8. Предложены способы проведения предварительной внутриродовой идентификации шкобактерий в первой генерации:

- по способности к пигменгообр': ованию. путем инкубирования ыикобактерий на парафиновых дисках параллельно на свету и в темноте;

. - по наличию и особенностям характера роста микро- и ма к ро колоний микобактерий, формирующихся через 5-7 суток на ниених поверхностях парафиновых дисков в минеральной среде накопления .-¡гем окрашенных в течение 24-48 час инкубирования в 5 % ШГБ, содержащего параллельно 0,5 % и 2 % концентрации нейтральрот, метшюшвой сини, фуксина основного. При этом располоаение, йорма, поверхность и цвет колоний характерны для каждого вида микобактеруД; и отличаются от других.

Индикация на парафиновых дисках к "чй иг .обактврии, окрашенгых растворами базофгльных красок, позволяв проводить диагностику в.,разные сроки инкубирования, что представляет возможность динамического . наблюдения за развешай еивых культур.

9. &по.л>зоЕа11ие стандартной питательной средч Левенптейна-Йен-сенз иозроляе1! изтодк-лу бактериологического обследова-

иия патологических материалов с объектов животноводческих с|<зрм, с различной степень» контаминировияия их микобактериями туберкулеза, и получать высокий диагностический эффект (высеваеиость 84,6-100 %, окорость роста на 4-8 % выше, чем на друг;1х яичных средах).

Применониэ одновременно 2-3 яичных питательных сред (типа среды Мордовского, Гельберга, Петраньяни) параллельно со средой Левен-штейна-Йенсена повышает высеваемость микобактерий туберкулеза и надежность получения их в чистом вида из патологических материалов с объектов внешней среда.

10. Воздействие 6 % раствором серной кислоты при 20-минутной экспозиции, сдерживает развитие сопутствующей микрофлоры в патологических материалах с объектов внешней среды. Последующий посев центри-фугатов этих материалов в квдкую и на 2-3 яичные питательные среды , позволяют достичь высокой (до 98,3-100 %) внсеваешсти и на 6-9 суток сокращает'сроки получения культур шкобактерий туберкулеза в чистом виде, в сравнении с результатами использования для этих целей 15-18 % растворов серной' кислоты при том же режиме.

11. Предложенные устройства для одномоментной окраски микобактерий, способы обогащения, получения и идентификации микро- и га кто -культур микобактерий и другие приемы позволяют унифицировать лабораторную диагностику туберкулеза, делают ее более безопасной, экономичной,, и в 20 раз и более повышают производительность труда.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В результате проведенных исследована1! для внедрения в производство рекомендуется:

- Методы индикации микобактернй в материалах внешней среды с целью санитарно-микробиологнчсской оценки объектов пшот-човодческих ферм при туберкулезе до и после дезинсекции:

I) микрокультивирование микобактег:'Л тубэг кулезл на п-^д -чтгч*

' стеклах в жидких питательных средах в сочетании с обычной или лам: несцеятной микроскопией;

2) выращивание микобактерий в "осадке";

3) получение микро-' и макрокультур микобактерий на твердом пе рафине в жидких питательных средах накопления из предварительно не очищенных от банальной микрофлоры исследуемых материалов.

Оценку качества специальных ветеринарно-санитарных мероприятк в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах проводить по динамике нарастания общего количества инфицированных объектов внешней среды и результатам установления жизнеспособности на них микобактерий.

- Дяя повышения вероятности обнаружения микобактерий на объек . Tax неблагополучных по туберкулезу ферм и выяснения правильности в

бора объектов для обеззараживания, отбор материалов для бактериоло: ческого исследования следует проводить одновременно, с охватом на i территории всех животноводческих помещений, не менее как с 5 объектов 'в каздом, и с почвы выгулов вокруг них на расстоянии I м и 5 м; увеличив площадь взятия проб-соскобамй до 500 смЗзобъекта.

- При оценке эпизоотического состояния животноводческих ферм учитывать роль циркулирующих на их территориях видов микобактерий, для чего проводить бактериологическое исследование патологических f. териалов параллельно от животных и с объектов внешней среды с после дуицзй идентификацией выделенных культур.

- Новые способы обогащения шкобактериями материалов срэды обк •танин кпвотных сочетанием флотации жидкими углеводородами с последу щей седиментацией или только флотацией твердым парафином.

- Новый экспрессный метод индикации, получения микро- и макрокультур и идентификации микобактерий из материалов кивотноводческих фары, выращиванием их на дисках из твердого парафина в элективных явшж питательных средах. '

- Экспрессную индикацию микобактерий я определение их ясизноспо-собности до и после дезинфекции в исслодуемих материалах с животноводческих ферм, проводить, без предварительной очистки их от банальной микрофлоры, по результатам микроскопии мазков-соскобов с парафиновых дисков, изготовленных через 60-90 минут после посева исследуемых материалов и флотации из них микобактерий на нгашей поверхности дисков (первичная микроскопия);. в том ео порядке после 24-48 часов инкубирования (вторичная микроскопия), а такзг.е обнаружение колоний .

■ микобактерий предварительно окрашэниих водным раствором метиленовой сини (или базофильной анилиновой краской другого цвета), сформировавшихся на нкяней поверхности парафиновых дисков после 24-48 часов или в другие более поздние сроки инкубирования.

- Еизнеспособность микобактерий в исследуемых образцах проб определять по динамике нарастания их количества на дисках, сопоставляя рэзультзты первичной и вторичной микроскопии мазков-соскобов, а тяк;::о после обнаружения колоний микобактерий. искусственно окрашенных базо-

«фильными анилиновыми красками в ранние сроки инкубирования 24-^8 час. или бактерий типичного серо-пелтого цвета (или другого ттвета у пигментных) колоний микобактерий сформировавшихся в более поздние сроки в виде "манной крупы" или "ободка" и хорошо различимых невооруженным глазом на фоне неокрашенного парафинового диска.

Новые приемы выделения микобактерий в чистом виде.пз предварительно неочищенных от посторонне;! микрофлоры материалов животноводческих ферм, путем предварительного инкубирования микобактерий на парафиновых дисках в минеральной среде накопления до появления видимого роста колони!! микобактерий в виде "ободка" на поверхности пэрг^зю-вых дисков, с последующей очисткой их от посторонне;: миктхЯ.воздействием растворами некотошх химических детергентов и -;•;■:••■. г/-. стерильные элективные гглк::е и плогк"? сред;;.

- Новый гатод накопления бактериальной массы микробактерий чя парафиновых дисках, очищенных от посторонней микрофлоры, путем инкубирования их в периодически обновляемой элективной жидкой питательной среде.

- Методика предварительной идентификации микобактериЧ в первой генерации, по наличию и характеру их роста на парафиновых дисках в жидких питательных средах (типа 5 % МПГБ), в присутствии 0,5 % и 2 % концентрации некоторьрс базофильных анилиновых краспк (Фуксина основного, нейтральрот, кетиленовая синь), а также параллельно на свету

■ й в темноте.

.- Для улучшения лабораторной диагностики туберкулеза и повыше-' ния производительности труда использовать устройства для окраски уи-кобактерий.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Бактериологический контроль текущей и заключительной дезинфекции в скотпмх дворах при туберкулезе // Материалы зонального совещания по вет.-сан. мероприятиям и аоогигиене в животноводческих комплексах и на крупных фермах Сибири и Дальнего Востока.- Новосибирск, 1973.- С.53-54. (В соавторстве).

2. Методика контроля качества дезинфекции животноводческих поме щений при туберкулезе // Сб.науч.тр. / Омский Госуд.вет.ин-т. -Омск, 1973.- Т.23, вып.З.- С.5-7. (В соавторстве).-

3. Сравнительная оценка способов накопления микобактерий туберкулеза при индикации в объектах внесшей среды // Сб.науч.тр. / ови,-01,-ск, 1973.- Т.23,вып.З.- С.8-12. (В соавторстве).

4. Определение состояния и степени инфицированности микобакте-рияки туберкулеза животноводческих помещений й контроль качества дезинфекции // Материалы науч.конф. ,посвящ.ЮО-летип Казанского оодена Ленина-Гос.вет.ин-та.-Казань, 1974,- ТЛ (В соавторстве).

5. Выживаемость возбудителя туберкулеза птиц в глубокой нес»'еня-екой подстилке и псчвс птичника И Бути увеличения продуктов животнов 'БОдства в Западной Сибири,- Новосибирск, 19%.- С.142-147. (В соавторстве^. г

6. Хаг;?терисг.п;а культур уикобактерий, выделенных из среды оби-

такия животных // Сб.науч.тр./ ОБИ.- Омск, 1976.- Т.32,вып.2.- С.122-128.

7. Приспособление для одномоментной окраски большого количества мазков методом Циль-Нильсена // Сб.науч.тр. / Сиб.НИВИ.- Омск, 1976.-вып.26.- С.56-59. (В соавторстве!.

8. Применение аппарата Ш-Г при стерилизации среди Петраньяни// C6.imv4.Tp./ Сиб.НИВИ.- Омск,1976.- Вып.26.- С.60-63 (В соавторстве).

9. К методике контроля качества дезинфекции при туберкулезе //Материалы науч.-произв.конф. по улучшению борьбы с бруцеллезом и туберкулезом с.-х. животных в Казахстане.- Кустанай, 1977.- СЛ28-131.

Ю. Рекомендации по бактериологическому контролю. Бактериологический контроль качества дезинфекции животноводческих помещений при туберкулезе с.-х. животных. - Целиноград: НТО, 1977.- 12с.

11. Внешняя среда как фактор передачи туберкулеза и особенности дезинфекции при нем.- Целиноград: НТО, 1977.- 14с.

12. 0 чувствительности ломенесцентной микроскопии при исследовании на туберкулез '/ Сб.науч.тр. / ОВИ,- Омск, 1978.- Т.35, вып. 3.-С.42-46 (В соавторстве).

13. Методика индикации и выделения микобактерий из материалов внешней среды '/Бил. ВЙЭВ.- М.,1979, вып.34.- С.31-33.

14. Микобактерии внешней среды и их патогенность //Сб.науч.тр./ ВСХИ.- Воронеж,1982.- Т.114.- С.15-2Г (В соавторстве).

15. Туберкулез крупного рогатого скота и современные методы борьбы с ним.-Орел,1981.- 42с. (В соавторстве).

16. Методика бактериологического контроля качества дезинфекции животноводческих помещений при туберкулезе животных.- Орел: НТО,1982.-Юс. |

17. Рекомендации по проведению дезинфекции при туберкулезе с.-х. животных.- Орел: НТО.1981.- 16 с. (В соавторстве).

18. Устройство для окраски-микобактерий // Авторское свидетель^ ство Г' 940067 от 23.02,1932. (В соавторстве).

19. Изыскание способов уничтожения банальней микрофлоры в материалах с объектов мест содержания животных при исследовании на туберкулез // Сб.науч.тр./ВСХИ,- Воронеж,1986.- С.37-42. (В соавторстве).

20. Сравнение эффективности некоторых яичных сред для выделения микобактерий из материалов животноводческих ферм // Сб.науч.тр. / ВСХИ.-Воронетс, 1956.- С.43-47. (В соавторстве).

21. Способ выделения микобактернй туберкулеза //Авторское сви-

детельство Р 1557166 от 15.12.1989.

22. Рекомендации по индикации и выделению микобактерий в раали пых материалах.- Персиановка: ДСХИ, 1990.- 6с. (В соавторстве).

23. Бактериологическая оценка уровня микобактериалыгай обсеме-ненкости объектов животноводческих ферм при туберкулезе // Сб.науч. тр./БСХИ.- Воронеж,1990.- С.31-35.

24. Идентификация микобактерий по характеру роста на парафиновых дисках и жидкой питательной среде //Сб.науч.тр./ ВСХИ.- Воронеж 1990.- С.35-38.

25. Метод индикации микобактерий туберкулеза из объектов животноводческих ферм //Тез.докл.науч. и учебно-методич.конф. по итогам исследований га ХП пятилетку/ВГАУ.-Воронеж,1991.- С.67-68.

26. Контроль благополучия объектов внешней среда на оздоравли-ваеких от туберкулеза животноводческих фермах Дез. докл. Ш Всесоюзно конференции по эпизоотологии, Новосибирск, 24-26 сентября 1991.-

С.147-149.

¡ СиС .

г\

Подписано в печать 28.10.91 сормат бумаги 60x90 1/16. Бумага писчая. Усл.печ.т.й. Тнрал 1С0. Затаз ОХ" Бест'чтнп

Воргг.с^с-у.П техпэг.етт.чееккй институт 394017, Вороне-*;, гш.Революции , 19 учзсток гт:ег<»т«в!:ой полиграф;'./..