Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Метод иммуноферментного анализа для диагностики лептоспироза

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

- лСц ¿ 5 ИТАХОШПИКІРА ШАРЛЬ

^ В

£ УДК 619:616.98:578.833.31

г-Ю

З

МЕТОД ІМУНОФЕРМЕВГгаОГО АНАЛІЗУ для ДІАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПІРОЗУ

16.00.03-ветеринарна мікробіологія і вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

КИЇВ-2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті ветеринарної медицини України.] академії аграрних наук.

Науковий керівник:

кандидат ветеринарних наук, Кучерявенко Олександр Олександрович, заступник ' Голови Державного Департаменту ветеринарної медицини Міністерства АП України

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук Риженко Василь Петрович,

завідувач лабораторією анаеробних інфекцій Інституту ветеринарної медицини УААН

кандидат ветеринарних наук, Павленко Микола Степанович, директор Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини Міністерства АП України

Провідна організація: Білоцерківський державний аграрний університ м. Біла Церква, кафедра епізоотології Міністерства АП України.

Захист дисертації відбудеться “ ЗО “ червня 2000 р. о 12. годі на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 в Національно аграрному університеті за адресою: 03041, Київ - 41, вул. Героїв оборони, навчальний корпус 3, ауд. 65.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Національного аграрне університету за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв оборони, навчальний корпус 10.

Автореферат розісланий “ Я9 “ 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, професор

Бортничук В./

ЗАГЛЛЬПА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми.

Здійснення систематичного моніторингу, розробка і удосконалення системи епізоотологічного нагляду та діагностики із застосуванням сучасних приладів та методів досліджень для забеспечекня надійної профілактики зооантропозоонозних хвороб, до яких відноситься лептоспіроз, є надзвичайно актуальним питанням для науки и має важливе соціальне і економічне значення. (Воліна Е.Г., Субхаш Дас Чандра, Кіктенко B.C. та інш., 1994; Шубалова Е.П., Ангонова Т.В., Алексеева Е.А., 1996; Пусговар А.Я., Кліменко С.В., ТертишникА.В., 1998).

За даними МЕБ, 2000 і об’ємною науковою інформацією, проблемі вивчення лептоспірозу приділяється значна увага у світі. Проте, лептоспіроз на сьогодні лишається розповсюдженою хворобою, як в багатьох країнах світу, так і в Україні (Баришев П.М., 1981; Деревяченко В.П. та ін., 1988; Моісєєва А.В., Шабловська Є. А., 1988; Мельницька Е.П., 1995, Бернасовська Є.П., 1996).

Для мобілізації зусиль по вивченню особливостей цієї хвороби, останнім гасом створено 10 міжнародних та регіональних референтних центрів з іептоспірозу, збільшилась кількість міжнародних конференцій і семінарів, трисвячених проблемі лептоспірозу.

За даними Всесвітної організації охорони здоров’я, лептоспіроз віднесено W п’яти хвороб, які спричиняють найбільшу небезпеку людству. Останнім іасом погіршився епізоотичний стан по лептоспірозу в Україні, реєструються іипадки захворювання тварин лептоспірозом, викликаним патогенними птамами лептосігір, які раніше в країні не виявлялись. Трапляються випадки, :оли ензоотичні спалахи лептоспірозу набувають форми епізоотій.

Тому для своєчасної і надійної діагностики лептоспірозної інфекції в /країні виникла необхідність забезпечити діагностичні лабораторії іетергагарної медицини більш чутливими засобами і обладнанням для дійснення діагностичних досліджень на сучасному рівні.

Загальноприйнятою серологічною реакцією для діагностики лептоспірозу є реакція мікроаглютинації (РМА). Але вона має ряд суттєвих недоліків (трудомісткість, ризик зараження при роботі з живою культурою лептоспір, постійна необхідність культивування лептоспір), тому виникає необхідність пошуку більш перспективних методів діагностики лептоспірозу. Альтернативним методом діагностики лептоспірозу може виступати, на наш погляд, метод імуноферментного аналізу (ІФА). В Україні цей метод діагностики лептоспірозу не розроблено, що і зумовило вибір теми наших досліджень.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконувалась згідно державного плану науково-дослідних робіт Інституту ветеринарної медицини УААН (номер державної реєстрації КН № 0197 і 12755 інв.№ 02.02) “Вивчити епізоотологію лептоспірозу, розробити моно- та полівалентні вакцини і методи діагностики” та плану “Основні заходи оздоровлення тварин від лептоспірозу в Україні на 1999-2000роки’\ який затверджено Головним Державним інспектором ветеринарної медицини і Головою Державного Департаменту ветеринарної медицини Міністерства агропромислового комплексу України наказом №2 від 18 січня 1999 року.

Мста і завдання досліджень. Мета досліджень - розробити метод імуноферментного аналізу при лептоспірозі. Завдання досліджень передбачають:

- виявиш штами лептоспір, що найбільш часто реєструються серед сільськогосподарських тварин в Україні;

- сконструювати, на підставі таких штамів, комплексний антигенний препарат, або визначити штам лептоспір, який виступає як спільний групоспецифічний антиген, та використати його при розробці ІФА для діагностики лептоспірозу;

- розробиш імуноферментний метод для виявлення протшіептосігірозних антитіл до основних штамів лептоспір, провести його діагностичну оцінку в експериментальних та практичних умовах.

Наукова новизна одержаних результатів.

- вперше в Україні методом РМА і ІФА встановлена циркуляція екзотичного штаму лептоспір L.bratislava (серогрупа Australis) серед свиней та коней;

- вперше в Україні розроблено метод імуноферментного аналізу для діагностики лептоспірозу на базі широкореактивного штаму Wijnberg (серогрупа Icterohaemorrhagiae). Метод відрізняється високою активністю, специфічністю, що дозволяє виявляти захворювання в більш ранні строки, а також проводити масові скринінгові дослідження.

з

Практичне значеним одержаних результатів. Виходячи із результатів іроведених нами досліджень, вважаємо за доцільне внести Lbratislava в ¿агностичний набір штамів лептоспір, які використовуються обласними, іайонними та міськими державними лабораторіями ветеринарної медицини, в іауково-дослідних центрах при дослідженнях на лептоспіроз. Розроблений муноферментний метод дозволяє в більш ранні терміни визначати [ротилептоспірозні антитіла проти групи штамів, що значно скорочує витрати іасу на проведення досліджень.

Конкретний особистий внесок дисертанта. Експериментальні (ослідження, аналіз одержаних даних та їх узагальнення виконані дисертантом ісобисто.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і іули схвалені:

на семінарі завідуючих відділами обласних і Центральної державної лабораторій ветеринарної медицини на базі лабораторії лептоспірозу Інсттуту ветеринарної медицини УААН, м. Київ, 1998р.; на VI Міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин”, м. Київ, 1999р.

Реалізація результатів досліджень. Проведена перевірка наборів дагностикумів для імуноферментного аналізу при лептоспірозі на базі Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини.

Публікації. По темі дисертації опубліковано 4 роботи, з них З в фахових ¡иданнях.

Структура дисертації1. Загальний обсяг роботи ¡Зн сторінок. Дисертація кладається з вступу, п'яти розділів, висновків і пропозицій виробництву, ;одатків. Робота ілюстрована 3 малюнками, містить 21 таблицю і 3 схеми, бібліографія -251 найменування, із них 144 іноземних.

ОСНОВНА ЧАСТИНА

Матеріали та методи. В роботі були використані до 20 серологічних аріантів лептоспір. Еталонні штами зберігаються в лабораторії лептоспірозу з іузеєм штамів мікроорганізмів Інституту ветеринарної медицини. Штами були тримані із Всесоюзного науково-контрольного інституту ветеринарних [репаратів (ВДИКІ) м. Москва, 1991). Культивування лептоспір здійснювали на ередовшці Кортгофа з додаванням 5-10% інактивованої (56°С, бОхв) кролячої бо овечої сироватки крові.

Антигени, що використовувались в ІФА, готували із штаму Wijnberg :ерогрупа Icterohaemorrhagiae), який надійшов із референтного ептоспірозного центру (Амстердам, Голавдія); із штаму Jez Bratislava, який

отримано із Берлінського Інституту захисту прав споживачів та ветеринари медицини; із непатогенного штаму Paíocl - ВДНКІ; а також із 8 серовар лептоспір, що найчастіше реєструються в Україні, а саме: Lpolonica, L.kabur L.pomona, Ltarassovi, Lgrippotyphosa, L.canicola, Lxopenhageni, Lbratislava.

Для виготовлення антигенів були випробувані декілька методик. : основу був прийнятий метод отримання полісахаридів, що виступають в якос антигену, за методом водно-формалінової екстракції по W.J. Terpsta з співав (1980). Імунні сироватки отримали 5 разовим введенням кролям лептоспірозш антигенів внутрівенно за методом, запропонованим S. Faine (ВООЗ, 1982 Середні тигри таких імунних сироваток складали в РМА 1:102400.

Такий метод імунізації використовували і для отримання ангисироват< до імупоглобулінів класу G великої рогатої худоби (ВРХ) та свиней, з мето подальшого приготування імунопероксидазних конь'югатів. Для імунізаі використовували готові препарати IgG великої рогатої худоби та свиней концентрацією 1-3 мг/см3 білку на 1 кг живої ваги кролів. Кількість білк визначали за методом Бредфорда і JIoypi.

Імунопероксидазні кон’югати отримували шляхом мітки ферменте пероксидаза хрону (Rz . 3,0) антиімуноглобулінів класу G ВРХ і свиней сироватки крові кролів за допомогою методу перйодатного окислення і P.Nakane і A. Kawaoi (1974).

Активність і специфічність анти-IgG і конь'югатів визначали за методо Оухгерлоні і ІФА.

Для виявлення протилептосгіірозішх антитіл методом ІФА у собак, коне: кролів використували кон'югаги з білком А фірми “Sanofi” і компанії АТЗ “Діапроф Мед”.

Відпрацювання імуноферментного методу діагностикти леїггоспіро: проводили на 96 лункових полі стиролових мікропланшетах провідні виробників в цій галузі: “Nunc” (Данія), “Dynatech” (Швейцарія), “Linbrt (США), “Coming Costar”. Облік ферментативної реакції проводили : допомогою автоматичного спектрофотометру фірми “Sanofi” і фірм “Labsystems “ при довжині хвилі 492нм.

При статистичній обробці результатів досліджень використовувал загальноприйняті методи (Мітропольский А.К., 1957; Ашмарін І.П., ВоробЧ А.А 1962; Стрельков Р.Б., 1999): визначення середньої арифметичне середнього квадратичного відхилення, середньої квадратичної похибк результатів). Визначення кореляції вирішувалось по ГПТП “АРМ-Статистик< на ПК PC/AT в Національному аграрному університеті.

Результати досліджень та йс обговорення

1. Вибір методу отримання моно- і полівалентних лепгоспірозних антигенів дляІФА.

Матеріалом для приготування лептоспірозного антигену використовували такі штами лептоспір (табл.1).

Таблиця 1 - Матеріал для приготування лептоспірозного антигену.

Вид анти гену Серогрупа Серовар Штам Джерело референт них штамів

Sejroe polonica 493 Poland “ & В Іі й|а а-|

Hebdoraadis kabura Kabura

Tarassovi tarassovi Periperitsin

>я Pomona pomorta Pomona

в а Grippotyphosa grippotyphosa Moskva V 11 1 ■'я і 1 |і Г3 8 1 §• m 2 с

о Е >. а. Сапі cola canicola Hond Utrecht IV

U Icterohaemorrha Riae copenhageni M20

Australis bratislava Yez Bratislava Берлін, Німечина1

Видо вий Semaranga patoc Patoc I ВДНКІ

Icterohaemorrha giae copenhageni Wijnberg Амстердам, Голандія2

Специфічні і концентровані лептоспірозні антигени для ІФА отримували, використовуючи декілька ефективних методик

Контроль якості антигенів, що отримували при застосуванні таких методик, визначали в ІФА по вищих показниках позитивних контролів і при найнижчих показниках негативних контролів. В якості контролів використовували позитивні і негативні сироватки крові до лептоспірозу (табл.2).

Кращі результати були отримані при використанні методу водно-формалінової теплової обробки по \\и. Тегрзй-а. При цьому культуру лептоспір, що вирощувалась на середовищі Кортгофа або на безсироваточному твін-альбуміновому середовищі (ЕМШ) на протязі 10-12 діб, при 28°С і з концентрацією 1x10* - 1x109 кп/см3, знешкоджували 0, 5 % розчином формаліну і піддавали термообробці при 100°С на протязі 30 хв. Після охолодження матеріал центрифугували 30 хв при 10 тис об/хв.

1 Берлінський інститут захисту прав споживачів і ветеринарної медицини

2 ВООЗ/ФАО референтна лабораторія лептоспірозу

В подальшій роботі використовували полісахаридну фракцію, що знаходиться в надосаді і після проведення діалізу проти 0,2М карбонатно-бікарбонатного буферу з рН 9,6 отримували антигенний препарат. Метод доволі простий та ефективний і задовольняє вимогам по якості до антигенів дляІФА.

Таблиця 2 - Вибір оптимального методу отримання лептоспірозних антигенів

дляІФА. _________________________________ (г =0,92;п=5)

№ з/п Методи Основні етапи Результати контролю методом ІФА

3 позитив ною сироват кою 3 негатив ною сироват кою

1 Ультразвукова обробка ІОразово по 1 хв при 22 Кгц 1,205±0,045 0,420±0,02:

2 Экстр акція детергентами Термообробка;тритон X 100, діаліз; центифутування, інкубація 37°С 0,554±0,029 0,355±0,02:

3 Формамідна экстр акція по Фуллеру Прогрівання з формамідом, обробка спиртом, центрифугування 2,105±0,093 0,650±0,03]

4 Водно- формалінова зкстракція Внесення формаліну, термообробка 100°С Ігод, центрифугування 1,810±0,060 0,080±0,00(

Вибір групоспецифічного лептоспірозного антигену для ІФА здійснювали за трьома напрямками:

- використовували непатогений штам РаїосІ;

- проводили змішування антигенних препаратів із лептоспір, які частіше реєструюся в лабораторній практиці;

- використовували пгтам Wijnbeгg (серогрута ІсІегоЬаетоггЬа^ае), який за літературними даними володіє спільноввдовим антигеном.

В перехресних реакціях основних лептоспірозних антигенів (табл. 3) встановлено, що саме штам \УцпЬег§ має максимальну антигенну спорідненість з основними аглютинуючими сироватками до серотипів, що частіше за інших реєструються в Україні.

В подальшій роботі визначали ступінь антигенної спорідненості штаму \УупЬег£ по сироватках основних діагностичних штамів (табл.4).

Наведені дані свідчать, що вибір штаму \Vijnberg в якості групоспецифічного антигену для ІФА виправданий тому, що з усіма досліджуваними сироватками нами отримано позитивні результати.

Таблиця 3 - Вибір групоспецифічного лептоспірозного антигену для ІФА

п=3

Антигени, серовар (серогрупа, штам) Аглютинуючі сироватки до ссрогруп

Javani ГЯ ! Bata viae Mini Sejroe Hebdo 1 madis Taras sovi fs a* Grippo typho sa Canico la Ictero haemo rragiae Austra ! lis Autum i nalis Cynop te ri Pyroge nes Bal lum

javanica + + + ±

Djati + 4- ± ±

Szwajizak + + +

Polonica + + +

Kabura + + +

Tarassovi +

Pomona + ± +

Grippotyphosa . +

Canicola + + ± ±

Copenhagenі + + ± + ±

Erinacei-europ. +

Autumnalis + ± + ±

Cynopteri ± ± + +

Pyrogenes + + +

Ballum + + + + +

ПолиАГ3 ± + + ± ± + + +

Wijnbcrg + 4* + + + ± + + + + + + + + +

Patoc ± ± і ± ± ± ± ± ± ± ± ±

3 у склад полівалентного антигену входять виділені курсивом штами і L.bratislava.

Таблиця 4 - Визначення антигенної спорідненості штаму Wijnberg по

сироватках до основних діагностичних штамів._________________________п=3

gjü Сироватки до штамів

I Розве дення сирова ток Polonica Kabura Tarasso vi Pomona Grippoty phosa Г Canicola і Ictero haemo rrhagiae Bratisla va Wijnberg

1 1:50 ++ 4+ ++ ++ -н- +++ +++ + +++ + +++ 4-

¡SfO 1:100 +4- ++ ++ ++ -н- +++ +++ + +++ +++ 4-

о g s 1:200 + - - + + ++ +++ ++ 4-H- 4-

£?© 53 і—* 1:400 - - - - - + +++ + +++ +

pU fS я <N £ 1:800 - - - - - - +4+ - +++ +

>1:800 - - - - - - V - V

Специфічність лептоспірозного антигену із штаму Wijnberg визначали при дослідженнях різних сироваток методами РМА і ІФА.

Результати таких досліджень наведені у табл.5, де показано, що з позитивними щодо лептоспірозу сироватками результати позитивні, а з сироватками до інших інфекційних захворювань - негативні.

2. Розробка методу імуноферменгного аналізу для виявлення протилепгоспірозних антитіл

Для отримання видових кон’югатів необхідно мати аіггиімуноглобуліни класу G. Активну імунізацію тварин-продуцентів проводили імуноглобулінами класу G із сироваток крові великої рогатої худоби та свиней (див. розділ “Матеріали і методи”). В роботі були використані очшцені препарати фірми ’’Sigma”. Концентрація препарату склала 1-3 мг/см3 білку на кілограм живої маси тварин (табл.6).

Виділення імуноглобулінів здійснювали за допомогою методу осадження поліетиленгліколем м.6000 з послідуючою гель-хроматографією на “Сефадексі G 200”. Контроль активності визначали по Оухтерлоні і ІФА. Контроль імунологічної чистоти препаратів здійснювали електрофоретично у поліакріламідному гелі (ПААГ). Із отриманих препаратів IgG готували кон’югати за методом перйодатного окислення (див. розділ “Матеріали і методи”). Всі отримані препарати мали високу активність і специфічність.

Нами були підібрані оптимальні параметри сенсибілізуючої дози антигену на планшетах (1:100), сорбційного буферного розчину (0,2М карбонатно-бікарбонатний буферний розчин, pH 9,6), час і температура ¿мобілізації розчину антигену на планшетах (18 год 4°С, або 2 год 37 С),

розведення сироваток, що підлягають дослідженню (1:10). Для розведешія сироваток використовували буферний розчин з 0,5%-ним вмістом БСА і

0,05% детергенту “Тритон X 100”

Таблиця 5- Визначення специфічності і активності лептоспірозного

антигену із штаму Wijnberg________________________________п=3

Досліджувані сироватки Вихідні результати Нормовані дані

титри в РМА ОЩв ІФА РМА ІФА

Кролячі сироватки до лептоспір; 1:800 0,886 0,392+0,018 1,657±0,046

1. IcterohaemorrhaRiae

2. canicola 1:400 0,600 0,196±0,010 1,128+0,044

3. Bratislava 1:800 0,710 0,392+0,018 1,335+0,045

4. Wijnberg 1:64000 >2,0 3,1365±0,09 3,761±0,132

5. Polonica 1:200 0,410 0,098±0,003 0,770+0,023

6. Kabura 1:100 0,350 0,049+0,001 0,65810,022

7. Tarassovi 1:100 0,325 0,049+0,001 0,611±0,021

8. Grippotyphosa 1:100 0,380 0,049±0,001 0,714+0,022

9. Pomona 1:200 0,410 0,098+0,003 0,770+0,023

Імунні кролячі сироватки до КЧС 0 0,090 0±0 0,1039

Позитивні сироватки крові свиней до КЧС 0 0,074 0±0 0,085±0,001

Сироватки крові ВРХ, позитивні до грипу 0 0,085 0±0 0,098±0,001

Сироватки крові, позитивні до ШАН від коней 0 0,100 0±0 0,115+0,001

Сироватки крові, позитивні доТгеропета pallidum - 0,320 - 0,369410,03

M + L 0,495±0,019 0,980±0,024

г=0,97

Із таблиці видно, що антиген із штаму Wijnberg реагує з усіма завідомо позтивними протилегггоспірозюши сироватками і не реагує з сироватками до других інфекційних захворювань, при цьому, виходячи з результатів аналізу за нормованими даними, ІФА в 2 рази перебільшує РМА по чутливості.

Концентровані препарати коя’югату зберігаються в насиченому розчині сульфату амонію, або 50%-му розчині гліцерину і робоче розведення їх складає 1:4000. Інкубація кон'югатів відбувається на протязі 40хв. Після внесення в лунки планшетів субстратно! суміші (ортофенілендіаміну у цитратному буфері, pH 5,2) проводили облік результатів за допомогою автоматичного спектрофотометра.

Облік результатів вважаємо коректним, якщо позитивний контроль має значення >0,6 оптичних одиниць при довжині хвилі 492 нм, негативний контроль не вище за 0,10 оптичних одиниць. Позитивними результатами дослідження сироваток, що підлягають тестуванню, вважаємо ті, що в два і більше разів перевищують значення оптичної щільності негативного контролю.

більше разю перевищують значення оптичної щільності негативного контролю.

Табліця 6 - Схема імунізації тварин-продуценгів по S. Faine (ВООЗ, 1982)

п=4

ife п/п Послідовність етапів імунізації Інтервали між введенням, дні

Концентрація препарату ІцЄ 1-3 мг/см3 на кг ваги продуцентів 0 7 14 21 28 48

1 І введення : Доза -1 см3 внутрівенно ШЯВш

2 П введення: Доза - 2 см3 внутрівенно шяш шшя

3 Ш введення: Доза - 4 см3 внутрівенно яшш шяш

4 IV введення: Доза - 6 см3 внутрівенно ■и ШЯВт

5 V введення: Доза - б см3 внутрівенно 8Н

6 Забір крові вмнг ЯБЯЕяв

Методом ІФА досліджували сироватки крові різних видів тварин, як із неблагополучних по лептоспірозу господарств, так і домашніх, екзотичних і лабораторних тварин. В таблиці 7 показано порівняння результатів досліджень сироваток крові методами ІФА і РМА.

Ь таблиці видно, що результати досліджень сироваток крові в ІФА і РМА співпадають. Слід відмітити, що ІФА більш чутливий метод, тому позитивних сироваток виявлено більше методом ІФА, ніж в РМА.

На основі проведених розрахунків складені регресивні порівняння зв’язку титрів в ІФА і РМА. Середня аглюпшуюча активність досліджуваних сироваток в РМА складає 1:800, середній титр цих сироваток визначенії методом ІФА складає 1:2540. Встановлено, що чутливість ІФА по виявленню антитіл на 12% вища ніж чутливість РМА. Коефіцієнт кореляції г дорівнює

0,956.

При проведенні масових досліджень на лептоспіроз, вперше в Україні, нами були виявлені антитіла проти екзотичного для країни штаму Ь.Ьгайя1ауа 8 сироватках крові свиней га коней..

Із 195 сироваток від свиней і 111 сироваток від коней антитіла проти даного штаму були визначені в 79 і 43 пробах, що складає 40,5% і 38,7% відповідно. Ні одна сироватка крові ВРХ, ДРХ, собак не була позитивною до даного штамму, що підтверджується літературними дашшми.

Таблиця 7 - Порівняльна таблиця досліджень сироваток крові методом ІФАіРМА

п=3

№ з/п Досліджувані сироватки Кількість проб РМА ІФА

позити вні % позити вних позити вні % позитиви их

1 Кролячі аглкгсинуючі сироватки 20 20 100 20 100

2 Сироватки від ВРХ 525 98 18,7 155 29,5

3 Сироватки від свиней 195 111 56,9 136 69,7

4 Сироватки від коней 111 57 51,4 71 63,9

5 Сироватки від собак 45 14 31,1 21 46,7

6 Сироватки від дельфінів 20 5 25 8 40

7 Кролячі імунні сироватки 24 24 100 24 100

Всього 940 329 35 435 46,3

L.bratislava є головною причиною масових абортів лептоспірозної ггіології у свиней і коней. Є дані про випадки захворювання у людей іептоспірозом, викликаним цим штамом.

На наш погляд актуальним є те, щоб штам Bratislava ввести до складу ¿агностичних штамів для практичних лабораторій ветеринарної медицини, а гакож при необхідності вводити такий штам в склад протилептоспірозної іакцини в тих господарствах де він реєструється і викликає захворювання на гептоспіроз.

Схема постановки непрямого методу ІФА при виявленні фотилептоспірозних антитіл представлена на рисунку 1.

Облік результатів

Внесення Stop - реагенту

Внесення субстрату

рідер (X 492 нм)

І

Внесення кон’югату

\Внесення контрольних /та дослідних сироваток

І

Сенсибілізація антигену на ТФ

К+ - > 0,6 о.о. Г-< 0,10 о.о + пр - > 0,2 о

ШКУБАДЬ

> 15-20 хв

У 40 хв. 37°

У 1год 37

18 год А 2 год 31

Етапи відмивання

Рис.1. - Схема постановки непрямого ІФА

На базі наших досліджень, розроблено технологічну схему створен» діагностичної тест-системи (ІФА-лепгоспіроз) (Рис. 2).

Рис.2. Технологічна схема створення тест-системи (ІФА-лептоспироз)

Висновки

1. Визначені штами лептоспір, які найчастіше зустрічаються серед тварин території України, а саме: L. icterohaemorrhagiae L. canicola, L. bratislava pomona, L. grippothyphosa.

2. Вперше в Україні встановлена циркуляція екзотичного штаму bratislava, яки основною причиною масових абортів у свиней і коней лептоспірозної етіоло

3. Розроблена методика приготування лептоспірозного антигену для ІФА на і пшрокореактивного групоспецифічного антигену із пггаму Wijnberg (серогр; Icterohaemorrhagiae).

4. Отримано високоактивні і специфічні антиімуноглобуліни класу G із імуш сироваток іфові тварин-продуцентів і на базі таких імуноглобулінів одерж якісні препарати антивидових імунопероксидазних кон’югатів для ІФА.

5. Вшначені основні вимоги для постановки методу ІФА при лептоспірозі саме: сенсибілізуюча доза антигену - 1:100; сорбційній буфер - 0V карбонатно-бікарбонатний буфер, pH 9,6; температура та час імобілізг антигену на планшеті- 4°С, 18 год, або 37°С, 2 год; розведення досліджуваї сироваток — 1:10, активність конь’югату -1:4000. Проведення обл результатів за допомогою автоматичного спектрофотометру вважа« коректними, якщо значення позитивного контролю не менше 0,6 о.о. негативного не більше - 0,1 о.о. Позитивними вважаються досліджув сироватки, значення оптичної щільності при Я 492 нм яких в 2 і більше рг перебільшують значення негативного контролю.

6. Метод ІФА при лептоспірозі з позитивними результатами випробуване експериментальних і виробничих умовах. Встановлено високу чутливіст специфічність методу. Чутливість методу ІФА в 2 рази перевищує чутливі методу РМА (див.Табл. № 5). При дослідженні біля 940 проб сироваток кр від тварин результати в ІФА (46,3 % позитивних) в основному співпадают результатами досліджень цих сироваток крові в РМА (35% позитивні Виявлення протилептоспірозних антитіл методом ІФА на 12% перебіли виявлення в РМА. Метод ІФА більш чутливий, тому позитивних сирова' виявлено більше, ніж в РМА.

7. Розроблено і запропоновано для впровадження у ветеринарну пракшку меі імуноферментного аналізу для діагностики лептоспірозу, який заснований визначенні специфічних до лептоспірозу антитіл в сироватках крові тварин.

Практичні пропозиції:

- запровадити метод ІФА при лептоспірозі для масових скринінгої досліджень в лабораторіях ветеринарної медицини;

- налагодити виготовлення діагностичних імуноферментних тест-систем (IŒ лептоспіроз) в Інституті ветеринарної медицини УААН;

- внести L.bratislava в діагностичний набір штамів лептоспір.

Перелік робіт, які були опубліковані за темою дисертації:

1. Нтахоншикира Шарль, Рудь О.И., Марунчин Ф.Ф. Результаты исследовал сывороток крови вакцинированных собак, собак питомника «Общее!

защиты животных» и черепах Киевского зоопарка на лептоспироз. // Сборник материалов IV Международной научно-практической Конференции. - Киев, 1998.-С.67-70.

Шарль Нтахоншикіра. Діагностика лептоспірозу методом імуноферментного аналізу // Ветеринарна медицина України.-І999. -№ 5. -С.33-34.

Нтахоншикіра Шарль. Методи очистки лептоспірозних культур // Вісник аграрної науки. -1999. -№ 8.-С. 83-84.

Шарль Нтахоншикіра. Виявлення антитіл проти Ь. ЪшЫта у сироватці крові свиней в Україні. // Вісник Білоцерківського Державного університету. -1999. -№ 8.-С.177-181.

Нтахоншпкира Шарль. Метод імуноферментного аналізу для діагностики лептоспірозу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія -ціональний аграрний університет, Київ, 2000.

Вирішення наукових та практичних завдань у ветеринарній практиці шж постійного пошуку нових, більш чутливих, специфічних і ефективних годів діагностики, терапії і профілактики захворювань різної етіології.

Дисертаційна робота присвячена розробці та застосуванню чутливого году імуноферментного аналізу для діагностики лептоспірозу - однієї з уальних антропозоонозних інфекцій, що наносить значної економічної шкоди ьському господарству та є дуже небезпечною для здоров’я людей.

В роботі викладені одержані в ході проведених досліджень результати, исані методи виділення лептоснірозного антигену і визначені оптимальні зви постановки ІФА при лептоспірозі.

Встановлено, що групоспецифічний антиген дозволяє виявляти антитіла до : серогруп, які входять до його складу, а видовий антиген із штаму Wijnberg -ішла до різних сегрогруп, що має велике практичне значення.

При проведенні ІФА були використані антивидові імунопероксидазні і’югати і пероксидазні кон’югати з білком А, в якості ферментних субстратів тасувались ортофенілендиамін (ОФД) та 5-аміносаліцшюва кислота (5-АС).

Встановлена кореляція між результатами ІФА і РМА, в той час як за 'ливістю перший метод перевищив другий на 12% . Метод виявився зручним і «стичним методом для масових скринінгових досліджень {3-4 планшети (228-\ зразки) проти 10-20 в РМА/людино-день/ }.

ючові слова: лептоспіроз, антиген, антитіла, діагностика, реакція

роаглютинації (РМА), імуноферментний аналіз (ІФА).

Нтахоншпкира Шарль. Диагностика лептоспироза методом мунофермептного анализа. - Рукопись,

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук специальности 16.00.03 — ветеринарная микробиология и вирусология. — циональный аграрный университет, Киев', 2000.

Решение научных и практических задач в ветеринарной практике треб постоянного поиска новых, более чувствительных, специфичных и эффектив! методов диагностики, терапии и профилактики заболеваний различ: этиологии.

Диссертационная работа посвящена разработке и применен чувствительного метода иммуноферментного анализа для диагност: лептосгжроза - одной из актуальных антропозоонозных инфекций, причиняю: огромный экономический ущерб сельскому хозяйству и представляни большую угрозу для здоровья людей.

В работе изложены результаты собственных исследований. Опис: методы выделения лептоспирозного антигена и определены оптимальные уело постановки ИФА при лехггспирозе.

Установлено, что приготовленный комплексный групповой анти позволяет выявлять антитела к тем серогруппам, которые входят в его сосга видовой антиген Wijnberg - антитела к разным серогруппам, что имеет болы практическое значение.

При проведении ИФА были использованы антивидо! иммунопероксидазные конъюгаты и пероксидазные конъюгаты с белком А, качестве ферментных субстратов применялись ортофенидендиамин (ОФД) * аминосалициловая кислота (5-АС).

Установлена корреляция между результатами ИФА и РМА, в то время по чувствительности первый метод превысил второй на 12% . ИФА оказа удобным практическим методом для массовых скрининговых исследований { плашки (228-304 образцов) против 10-20 в РМА/ человеко-день/ }

Ключевые слова: лептоспироз, антиген, антитела, диагностика, реак микроагглютинации (РМА), иммунофементный анализ (ИФА).

Ntahonshikira Charles. The enzyme-linked immunosorbent assay for the diagni of leptospirosis. - Manuscript.

The thesis manuscript is submitted for the degree of Doctor of philosophy in speciality 16.00.03 — veterinary microbiology and virology - National Agricuh University, Kyiv, 2000.

Leptospirosis is an infectious disease of man and animals caused by one or sev pathogenic spirochaetae Leptospira interrogans. The health hazard and the econo: losses of the disease make it a potential problem worldwide. Moreover, the eradicai of the infection is hampered by a certain number of constraints: the big amouni strains (more than 200 known serovars and 23 serogroups!), the prevalence of comr for most infectious diseases and hence the lack of pathognomic symptoms, the prese of different strains in different regions, the lack of sensitive diagnostic methods early recognition of the disease.

The aim of the present work was to improve the diagnostic techniques leptospirosis by performing a well-adapted to the country ELISA technique us locally ciculating strains (L.polonica, L. kabura, L. pomona, L. tarassovi,

grippotyphosa, L. canicola, L. copenhageni, L. bratislava4, as well as the genus scific antigens from the strain Wijnberg of the copenhageni serovar terohaemorrhagiae serogroup) and from the saprophytic strain PatocI of the maranga serogroup.

in our work formalin-water extracted antigens (method by WJ. Terpstra et al., 80, 1985), detergent extracts (R. Sting and U. Dura, 1994), formamide extracts lller* 1938), whole cell sonicated extracts (Adler et aL, 1980) were used as antigens.

The protein concentration in the antigenic preparations was determined using the wiy method. Only a pure, young 7-14 days old culture without self-agglutinated tospires with abundant growth (1 - 2 x 108 leptospires/ml) could be used as the iree of antigens.

The reactivity spectrum of the antigenic preparations was determined by ;ecting antibodies in field and immune sera (195 swine sera, 525 bovine sera, 111 line sera, 45 canine sera and 44 immune rabbit sera with known MAT titers and ovars). The antigen adsorption onto the polystirol surface of the plates was carried : at room temperature till foil evaporation of the liquid (method by WJ Terpstra et al., SO,1985), by overnight incubation of the sensitised plates at 4°C, or by a two-hour ubation at 37°C.

For antibody detection in bovine and swine sera immunoperoxidase conjugates re used, whereas for canine and rabbit sera ProteinA-peroxidase conjugates were ;d. OPD was used as a peroxidase substrate for automated reading and 5-amino-2-icylic acid for eye reading of the results.

The ELISA diagnostic kits were tested in the field and experimental conditions, e results were compared to those of the MAT and correlation was observed, wever, the ELISA was found to be more sensitive than the MAT (41,4 against 35,4% ;itive). Thus, the enzyme-linked immunosorbent assay turned to be a reliable tool for early diagnosis of leptospirosis and a good epidemiological screening test, when a number of samples had to be examined.

Key words: leptospirosis, antigen, antibodies, diagnosis, the microagglutination ! (MAT), the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

iis exotic to the fonner Soviet Union leptospiral strain was detected for the first time in 1998 in linian swine and equine sera by the author (The News of the Bilotserkivsky Agriculture University '7-181,1999).