Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Экспериментальное исследование липосомальных форм фенотерола

р

а Ь

На правах рукописи

Архипенко Инга Викторовна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ ФЕНОТЕРОЛА

14. 00.23. - Гистология. 14. 00.43. - Пульмонология.

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских

наук

ВЛАДИВОСТОК 1996

Работа выполнена во Владивостокском государственном медицинском университете

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор П.А. Мотавкин. доктор медицинских наук, профессор Б.И. Гельцер. Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Б.Я. Рыжавский доктор медицинских наук, профессор М.А. Рычкова

Ведущая организация: Московская медицинская академия

Защита состоится "_"_1996 в_часов на заседании

Докторского совета Д 084.24.01 при Владивостокском государственном медицинском университете по адресу: 690600, г. Владивосток, пр. Острякова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского университета (г.Владивосток, пр. Острякова, 2).

Автореферат разослан "_"_1996 г.

Учёный секретарь Специализированного диссертационного совета кандидат медицинских наук, профессор Г.М. Холоденко.

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время для лечения обструктивных заболеваний легких традиционно применяют кортикостероиды, группу кромогликата натрия, бета-2-агонисты (в2а), метилксантины, антихолинергические препараты. Преимущества и недостатки их хорошо известны. В то же время продолжается поиск новых лекарственных средств, способных воздействовать на процессы воспаления в дыхательных путях и гиперреактивность бронхов. Включение лекарственных средств в липосомы, возможно, окажется одним из таких перспективных методов лечения обструктивных заболеваний легких. Селективность действия лекарств является важной предпосылкой их успешного применения для лечения или предотвращения заболеваний.

Однако, вследствие значительного сходства (например, в структуре и функции мембран, характеристиках метаболизма и т.п.) нормальных клеток и патологически измененных (больных) , специфическое действие лекарств является скорее исключением, чем правилом. В следствие этого, возникают побочные эффекты, которые затрудняют или даже препятствуют лечению обширного круга болезней. Универсальность свойств липосомального носителя (состав, размер, поверхностные свойства и другие характеристики) гарантирует широкие возможности его применения для улучшения селективности и эффективности действия лекарств [I. Bakker-Woundenberg, Е. van Etten, 1995; M.G. Bergeron, A. Desormeaux, 1995].

В ряде фундаментальных исследований показана возможность использования липосом, как носителей лекарственных препаратов [Г. Грегориадис, А. Аллисон, 1983; Л.Б. Марголис, Л.Д. Бергельсон , 1986; R. Lippens, 1995; J. Plitman et al., 1992]. Однако, работы по применению

бронхолитических средств в липосомальной форме встречаются очень редко. По литературным данным в опытах in vitro и in vivo , были изучены в липосомальной форме беклометазон [М. Vidgren et al., 1995], будезонид, флунизонид, дексаметазон [J.C. Waldrep et al., 1994], кромогликат натрия [С.Ю. Ландышев, 1993], тербуталин, альбутерол [Т. A. McCalden, 1991], метапротеренол сульфат [Т.А. McCalden et al., 1989].

К настоящему времени опубликовано большое число работ, в которых в качестве носителей использовали липосомы, приготовленные из яичного или соевого лецитина [М. Vidgren et al., 1995; Т.А. McCalden, R. Radhacrischnan, 1991]. Однако, литературные данные свидетельстэуют о том, что для взаимодействия липосом с клеточной поверхностью большое значение имеет состав фосфолипидов, из которого они синтезированы. Если фосфолипиды выделены из каких-либо определенных клеток, то способность липосом соединятся именно с этими клетками значительно возрастает [Т.С. Саатов и др., 1990].

В связи с этим, в настоящей работе предлагается использовать в качестве носителей лекарственных средств аутологичные липосомы из суммарных фосфолипидов легких теплокровных.

Цель работы: Выяснить эффективность и селективность бронхолитического препарата - фенотерола в липосомальной форме.

Задачи исследования:

1. Выяснить преимущества липосомальной формы фенотерола перед неинкапсулированным препаратом.

2. Провести сравнительный анализ терапевтической эффективности липосом различного фосфолипидного состава: из яичного лецитина, суммарных фосфолипидов легких свиньи и человека.

3. Провести сравнительный анализ эффективности фенотерола инкапсулированного в липосомы из яичного лецитина, суммарных

фосфолипидов легких свиньи и человека на бронхи мелкого калибра (диаметром до 1 мм).

4. Изучить влияние липосомальной формы фенотерола на функциональную активность тучных клеток дыхательных путей.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Исследованы новые липосомы различного фосфолипидного состава, приготовленные в лаборатории неинфекционного иммунитета ТИБОХа /TRO РАН, лекарственных средств на примере фенотерола. В экспериментах in vitro на органной культуре медиастинальной плевры и in vivo на животных с моделью бронхиальной астмы (БА) изучено влияние липосомальной формы фенотерола на функциональную активность тучных клеток дыхательных путей и бронхиального дерева при БА.

Применение фармакологических препаратов, заключенных в аутологичные фосфолипидные везикулы может разрешить проблему направленного транспорта лекарственных веществ к клеткам-мишеням. Использование фенотерола, инкапсулированного в липосомы из суммарных фосфолипидов теплокровных, позволит разработать новые высокоэффективные способы лечения больных БА.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингаляционная липосомальная форма фенотерола эффективнее свободной.

2. Липосомы из суммарных фосфолипидов легких теплокровных при ингаляционном введении оказывают более выраженное мембраностабилизирующее и противовоспалительное действие.

3. Липосомы синтезированные из суммарных фосфолипидов легких свиньи и человека являются наиболее эффективным носителем лекарственных средств для лечения обструктивных заболеваний легких.

4. Фенотерол, инкапсулированный в липосомы, оказывает более выраженное мембраностабилизирующее и противовоспалительное действие.

Аппробацня диссертации: Диссертация выполнена в соответствии с планом научных исследований Владивостокского государственного медицинского университета.

Основные положения диссертации доложены на 36-й , 37-й научно-практических конференциях (ВГМУ, Владивосток, 1995, • 1996); Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию медицинской службы Дальневосточного бассейна, (ДЦКББ, Владивосток, 1996); 3-ем Российском Национальном Конгрессе " Человек и лекарство" (Москва, 1996); 6-ом Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (Новосибирск, 1996); 15 Всемирном конгрессе по астмологии (Монтпель, Франция, 1996)

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами и 24 рисунками. Диссертация состоит из введения, 5 глав, обсуждения, выводов, 'списка литературы, включающего 83 отечественных источников и 154 иностранных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Для того, чтобы показать эффективность действия липосомальной формы фенотерола была выбрана модель БА. Модель БА в эксперименте получали на 90 белых нелинейных половозрелых крысах-самцах, массой 180-250 г по методу А. Андерсона и 55 кроликах, массой 3-4 кг, по методу В. Трофимова.

В работе использовали лёгкие и медиастинальную плевру интактных животных и с моделью БА.

Липосомальную форму фенотерола синтезировали в лаборатории неинфекционного иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук по методу В. Владимирова из суммарных фосфолипидов лёгких свиньи (ЬРЬ) и Хуанга из яичного лецитина (ЕРС), суммарных фосфолипидов лёгких человека (НРЬ).

Исследование острой токсичности липосомального фенотерола

Изучение острой токсичности липосомальной формы фенотерола проводили на белых лабораторных мышах-самцах одного возраста, массой 18-20г. Подопытным животным, разделенным на группы (по 6 мышей в каждой) внутрибрюшинно вводили фенотерол в липосомах из ЕРС, полученных по методу Хуанга (1976). Первой группе грызунов вводили ЗОмг/кг массы тела препарата, второй - 45мг/кг, третьей - 60, четвертой -120, пятой 240, шестой - 300, седьмой - 450, восьмой - 600 мг/кг массы тела фенотерол, инкапсулированный в липосомы. Девятой, десятой, одиннадцатой и двенадцатой группам животных, использованным в качестве контроля, инъецировали неинкапсулированный фенотерол по 5, 15, 30 и 45 мг/кг массы тела, соответственно.

Чтобы исключить из эксперимента животных, смерть которых могла наступить не из-за воздействия фармакологического агента, обязательно проводили вскрытие каждой погибшей мыши.

Ингаляционное введение препаратов животным с моделью бронхиальной астмы Введение препаратов кроликам

Для сравнения эффективности действия липосомальной формы фенотерола кролики с моделью БА были разделены на 7 групп (по 5 животных в каждой). Препараты вводились в дыхательные пути кроликов ультразвуковым ингалятором "ТЬотех Ь2" в течение 10 минут 2 раза в сутки по 0,02 мг фенотерола, на одну ингаляцию, в 10 мл физиологического раствора натрия хлорида. Курс лечения составил 7 дней. Первая группа животных получила неинкапсулированный препарат, вторая - фенотерол в липосомах из ЕРС, третья - в липосомах из ЬРЬ, четвертая - в липосомах из НРЬ, пятая, шестая и седьмая группы ингалировали пустые липосомы из ЕРС, ЬРЬ, НРЬ, соответственно. Восьмая группа кроликов получила 10 мл из физиологического раствора натрия хлорида, девятой (интактной) не давали никаких препаратов. На восьмые сутки кроликов забивали для морфологических исследований их легких и плевры.

Введение препаратов крысам

Препараты вводили в дыхательные пути грызунов с помощью ультразвукового ингалятора "ТЬотех Ь2, который подсоединяли к специальной герметичной камере с крысами. Лекарственные средства ингалировали по 30 минут в день, дозировка фенотерола составила 0,06 мкг, липида (для липосомальной формы) - 0,6 мкг на одну ингаляцию. Все препараты давали в 10 мл физиологического раствора натрия хлорида. Курс лечения составил 5 дней. Первая группа крыс получала неинкапсулированный фенотерол, вторая, третья и четвертая -

липосомапьную форму препарата в липосомах из ЕРС, ЬРЬ, НРЬ, соответственно. Пятой, шестой и седьмой группам вводили пустые липосомы из ЕРС, ЬРЬ, НРЬ, соответственно. Восьмая группа грызунов получала 10 мл физиологического раствора натрия хлорида, девятой, служившей в качестве контроля, не вводили лекарств.

На шестые сутки крыс декапитировали для морфологических исследований их легких и плевры.

Эксперименты на органной культуре медиастинальной плевры крыс с моделью бронхиальной астмы

У 10 половозрелых, нелинейных крыс с моделью БА после декапитации тотчас извлекали медиастинальную плевру, помещали на предметное стекло и обрабатывали одним из следующих препаратов: фенотеролом в свободной форме, липосомальной из ЕРС, ЬРЬ, НРЬ, (по 0,003, мкг препарата и 0,03 мкг липина), пустыми липосомами из ЕРС, ЬРЬ, НРЬ (по 0,03 мкг липида). После чего, плевру инкубировали в термостате при температуре 37 С в течение двух часов. Затем, остатки лекарств смывали 70% этиловым спиртом, а плевру окрашивали толуидиновым синим для идентификации тучных клеток.

Сканирующая электронная микроскопия

Методом сканирующей электронной микроскопии была изучена поверхность тучных клеток медиастинальной плевры крыс с моделью БА после аппликации фенотерола в свободной форме и инкапсулированного в липосомы, синтезированные из ЕРС, ЬРЬ, НРЬ, а также после инкубации с пустыми липосомами такого же фосфолипидного состава.

Для ультраструктурных исследований образцы плевры крыс с моделью БА фиксировали 2,5% раствором глютарового альдегида на фосфатном буфере (pH 7,3) в течение 2-3 часов. Затем образцы промывали фосфатным буфером и подвергали дополнительной фиксации 1% раствором четырех окиси осмия, приготовленным на 0,15 М фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. После тщательной промывки в фосфатном буфере образцы обезвоживали в спиртах и ацетонах возрастающих концентраций. Следующим этапом кусочки тканей дегидрировали в глубоком вакууме. Напыление образцов золотом проводили в аппарате Jeol JEE (при 4 С). Препараты изучали в сканирующем микроскопе JSM-25 S 11 при ускоряющем напряжении 75 кв и увеличении 700 до 7000 раз.

Морфометрические исследования

При исследовании тучных клеток измеряли их величину, с помощью винтового оккуляр-микрометра MOB 1-16, количество индифферентных и дегранулирующих форм на 1 мм препарата. Вычисляли коэффициент дегрануляции (КД), определяемый как отношение числа дегранулирующих клеток к их общему числу на 1 мм. Кроме того, подсчитывали величину профильного поля (произведение большего и меньшего диаметров) тучных клеток на 1 мм поверхности препарата и определяли оптическую плотность гранул в цитоплазме тучных клеток на денситометре фирмы "Vickers" при увеличении 400 и длине 550.

При исследовании бронхов измеряли их внутренний и наружный диаметры, с помощью винтового оккуляр-микрометра MOB 1-16, вычисляли коэффициент релаксации бронхов, который определяется как отношение диаметра просвета бронха к диаметру бронха.

Количественные методы исследования

Значение каждого показателя вычисляли не менее чем в 6 полях зрения. Количественные данные обрабатывали методом вариационной статистики с определением средней арифметической (Sx), критерия существенности различий (t) и уровня значимости отличий (Р). Разницу между средними арифметическими считали достоверной при Р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Используя экспериментальнй метод исследования острой токсичности липосомальной формы фенотерола удалось установить, что фенотерол, инкапсулированный в липосомы, приблизительно в 15 раз менее токсичен по сравнению со свободной его формой. В группе мышей, которым ввели 450 мг/кг массы тела препарат инкапсулированный в липосомы, через сутки из б животных в живых осталось 4. В то время как, в группе мышей, которым ввели 30 мг/кг массы тела неинкапсулированный фенотерол, из 6 животных осталось только 3.

Идентичные результаты наблюдались при испытании острой токсичности липосомалыюго доксорубицина [J. Balazsovits et al., 1989]. Было установлено, что "dosis letalis 50" доксорубицина, инкапсулированного в липосомы 40 мг/кг, что на 53% выше, чем LD 50 свободного препарата (26 мг/кг).

Таким образом, инкапсулированный в липосомы фенотерол менее токсичен по сравнению со свободной его формой, по-видимому, За счет более медленного освобождения лекарства из фосфолипидных везикул.

В опытах, проведенных на кроликах с моделью БА, после введения свободного фенотерола через 10 мин. от начала ингаляции отмечалось

уменьшение частоты дыхания в среднем на 15 в 1 мин. , уменьшалось количество хрипов. Бронхолитический эффект продолжался втечение 4 час. Отмечено учащение частоты сердечных сокращений в среднем на 47 ударов в 1 мин.

Липосомальная форма фенотерола обеспечивает выраженный бронходилататорный эффект также уже через 10 мин. после ингаляционного введения препарата. Однако, длительность его действия больше по сравнению с неинкапсулированной формой . При этом, отсутствовали побочные эффекты со стороны сердечно-сосудистой системы.

При длительном лечении фенотеролом уменьшение количества хрипов отмечалось на 5е сутки, одышки на 4 день с момента лечения. К 7 суткам в легких выслушиваются лишь единичные хрипы .

При лечении липосомальным фенотеролом одышка уменьшилась уже на 2е сутки, а хрипы на Зй день. К бым суткам с момента лечения, и одышка, и хрипы отсутствуют.

Американские ученые [R.F. Fielding, В. Abra, 1993] описали, что введение липосомального Н-З-тербуталина позволило не только получить более выраженную бронходилатацию у морских свинок с экспериментальной моделью бронхообструктивного синдрома,' но и добиться точного контроля над продолжительностью действия инкапсулированного бронходилататора. В работе [Т.А. McCalden, R. Radhakrishnan, 1991] ученые показали, что ингаляции очень высоких доз липосомально инкапсулированного метапротеренол сульфата производили меньше системных эффектов с более продолжительной бронходилатацией, относительно свободной формы препарата.

Т.А. McCalden и соавт. [Т.А. McCalden et al., 1989] в опытах на морских свинках показали, что типичная тахикардия, встречающаяся при

использовании в2а, значительно снижается при введении липосомальной формы метапротеренол сульфата.

Итак, использование липосомальной формы в2а увеличивает их преимущество, как по продолжительности бронходилатации, так и по предупреждению кардиоваскулярных эффектов.

У животных,- сенсибилизированных нами овальбумином, наличие десквамированного эпителия в просвете бронхов, гиперплазия гладких мышц бронхов и желез , развтие бронхоспазма позволо говорить о наличии экспериментальной модели БА.

Сравнительный анализ функционального состояния тучных клеток после аппликации фенотерола in vitro на плевру (табл.1), а также после ингаляционного введения препарата грызунами свидетельствуют о том, что фенотерол выступает в роли стабилтзатора тучных клеток. Стабилизируя мембрану мастоцитов, фенотерол приводит к подавлению выделения из них медиаторов воспаления, таких как гистамин, серотонин, эозинофильный и нейтрофильный хемотаксические факторы, простагландины, тромбоксаны и другие. И, таким образом, он оказывает противовоспалительное действие.

При введении липосом из суммарных фосфолипидов легких свиньи и человека, яичного лецитина, полученные данные демонстрируют способность липосом достоверно уменьшать число дегранулирующих тучных клеток, стабилизировать плазматическую мембрану. Такое действие липосом, видимо, объясняется способностью фосфолипидных везикул при взаимодействии с клеточной мембраной обмениваться с ней фосфатидилхолином или включаться в плазмолему.

Наилучшие результаты, полученные после введения липосом из суммарных фосфолипидов легких можно объяснить их высоким сродством к клеткам бронхов, в связи со сходством клеточной

поверхности с мембраной липосом. Кроме того, температура фазового перехода мембраны липосом, приготовленных из суммарных

Таблица 1

Функциональное состояние тучных клеток медиастинальной плевры крыс с моделью БА в экспериментах ¡п vitro.

№ п.п Группы животных Коэффициент дегрануляции Единицы оптической плотности гранул Среднее содержание тучных клеток в 1мм

1 Интактные крысы 0,18±0,01 17,52±1,70 114120

II Крысы с моделью БА 0. 7510,02, Р0<0,0001 13,2513,54 Р0<0,0001 201146 Р0<0,0001

III Физ. раствор 0,86±0,04, Р1 <0,05 11,8211,72 Р1<0,05 212125 Р1>0,1

IV Фенотерол 0,56±0,05, Р<0,0005 17,9913,27 Р1<0,0001 Р2>0,5 171136 Р1<0,05

V Фенотерол в липосомах из ЕРС 0,31±0,03, Р1 <0,0001. Р2<0,0001 18,1010,87 Р1 <0,0001 Р2>0,5 134118 Р1<0,0001 Р2<0,0001

VI Липосомы из ЕРС 0,62±0,04, Р1 <0,005, Р2<0,1 14,9811,62 Р1<0,01 Р2<0,0001 168114 Р1 <0,005 Р2>0,5

VII Фенотерол в липосомах из LPL 0,21±0,06. Р0>0,5, Р1<0,0001, Р2<0,0001, Р3>0,1 18,5611,92 Р0<0,05 Р1<0,0001 Р2>0,5 Р3>0,1 144122 Р0<0,0001 Р1<0,0001 Р2<0,005 Р3>0,1

VIII Липосомы из LPL 0,6210,06, Р1<0,05,Р2>0. 5Р4=0,001 16,4513,15 Р1=0,0001 Р2>0,05 Р4<0,05 136113 РК0.0001 Р2<0,0001 Р4<0,0001

IX Фенотерол в липосомах из HPL 0,16±0,01, Р0<0,05, Р1<0,0001,Р2< 0,0001, Р3<0,0001, Р5>0,5 18,7511,60 Р0<0,005 Р1 <0,0001 Р2>0,1 Р3<0,05 Р5>0,5 134112 Р0<0.001 Р1<0,0001 Р2<0,001 Р3=0 Р5>0,05

X Липосомы из HPL 0,5710,03, Р1<0,0001, Р2>0,2, Р4>0,5, Р6>0,6, Р7<0,0001 15,6011,89 РК0.001 Р2<0,001 Р7<0,0001 Р4>0,1 Р6>0,1 129115 Р0<0.005 Р1<0,0001 Р2<0,001 Р4<0,0001 Р6>0,1 Р7>0,1

Примечание РО - в сравнении с интактными крысами; PI в сравнении с больными животными; Р2 после инкубации с фенотеролом; РЗ в сравнении с данными после апликации фенотерола в липосомах из EPC; Р4 после апликации липосом из EPC; Р5 после инкубации с фенотеролом в липосомах из LPL; Р6 после апликации липосом из LPL; Р7 в сравнении с данными после инкубации с фенотеролом в липосомах из HPL.

фосфолипидов легких, практически одинакова с температурой тела животных. И фосфолипидные везикулы, синтезированные из легких теплокровных, несут больший отрицательный заряд, поэтому удерживаются органом более длительный период времени и захватываются эффективнее их клетками. Более выраженный эффект, полученный после воздействия липосом из суммарных фосфолипидов легких человека по сравнению с липосомами из фосфолипидов легких свиньи, по-видимому, связан с тем, что фосфолипидный состав липосом из суммарных фосфолипидов легких человека в большей степени соответствует фосфолипидному составу мембран клеток дыхательных путей крыс. Согласно данным литературы, большое значение для взаимодействия липосом с клеточной поверхностью имеет состав фосфолипидов, из которого они сделаны. Если фосфолипиды выделены из .каких-либо определенных клеток, то способность липосом соединяться именно с этими клетками значительно возрастает [Т.С. Саатов и др., 1990]. Повышенное сродство аутологичных липосом к органам-мишеням объясняется тем, что на поверхности клеток существуют рецепторы для нескольких лигандов: галактозы, фукозы, фаннозы, Ы-ацетилгалактозамина и, возможно, других углеводов.

Сравнивая данные применения липосомалыюй формы фенотерола с результатами введения неинкапсулированной его формы и пустых липосом, можно отметить, что фенотерол, инкапсулированный в липосомы, обладает более выраженным бронхолитическим и противовоспалительным эффектом. После инкубации медиастинальной плевры с фенотеролом в липосомах из ЕРС число дегранулирующих форм снизилось в 2,5 раза и составило 31%, что достоверно отличается от количества дегранулирующих клеток после воздействия неинкапсулированного препарата (56%) и пустых липосом из ЕРС (62%).

А после аппликации на медиастинальную плевру крыс с моделью БА фенотерола в липосомах из LPL и HPL число дегранулирующих элементов составило 21 и 16%, соответственно, что практически не

отличается от здоровых животных (табл. 1). |

i i

В экспериментах in vivo после ингаляционного применения фенотерола в липосомах из ЕРС количество дегранулирующих форм_ в медиастиналыюй плевре уменьшилось в 2,3 раза (32%), а в легком в 1,9 раз (39%). Однако, после ингаляций фенотерола в липосомах из LPL и HPL количество дегранулирующих клеток в медиастинальной плевре составило 26 и 23%, соответственно и 24, 23% - в легком, что достоверно не отличается от здоровых животных (табл. 2, табл. 3).

Более выраженный эффект липосомальной формы фенотерола, по-видимому, связан с взаимоусиливающим патогенетическим действием фенотерола и фосфатидилхолина, составляющего основу липосом.

Наилучшие результаты, полученные после введения фенотерола в липосомах из суммарных фосфолипидов легких можно объяснить более целенаправленной доставкой лекарства к клеткам, так как суммарные фосфолипиды органов-мишеней обладают повышенным сродством к клеточной поверхности этих органов.

Точкой приложения медиаторов воспаления являются бронхи. Для того, чтобы показать действие различных препаратов на бронхи при ингаляционном введении, мы разделили их на несколько классов в зависимости от степени обтурации: 1- в просвете бронхов увеличение секрета; 2- в просвете бронхов слизь, эозинофилы и слущенные клётки эпителия; 3- в прсвете бронхов сли$ь, десквамированный эпителий, в слизистой оболочке отслойка поверхностных эпителиальных клеток на некоторых участках; 4- отсутствие прсвета в бронхах, полная отслойка эпителия.

Таблица 2

Функциональное состояние тучных клеток медиастинальной плевры крыс с моделью БЛ в экспериментах ¡n vivo.

№ п.п Группы животных Коэффициент дегрануляции Единицы оптической плотности гранул Среднее содержание тучных клеток в 1мм

1 Интакгные крысы 0,1810,01 17,5211,70 114120

II Крысы с моделью БА 0, 7510,02, Р0<0,0001 13,2513,54 Р0<0,0001 201146 Р0<0,0001

III Физ. раствор 0,7910,05, Р1>0,1' 11,0611,50 Р1<0,0005 217 28 Р1>0,1

IV Фенотерол 0,3510,03, Р<0,0001 7,9513,04 Р1<0,0001 146145 Р1<0,0005

V Фенотерол в липосомах из ЕРС 0,3210,04, Р1<0,0001, Р2>0,5 14,1012,60 Р1>0,1 Р2<0,0001 129116 Р1<0,0001 Р2>0,1

VI Липосомы из ЕРС 0,5210,03. Р1<0,0001, Р2<0,0001 12,7511,98 Р1>0,5 Р2<0,0001 173131 Р1<0,05 Р2<0,05

VII Фенотерол в липосомах из LPL 0,2610,03, Р0>0,01. Р1<0,0001, Р2>0,1,РЗ>0,1 17,0412,65 Р0>0,1 Р1<0,0001 Р2<0,0001 Р3<0,0001 144127 Р0<0,0005 РК0.0001 Р2>0,5 Р3<0,05

VIII 1 Липосомы из LPL 0,5310.05. Р1 <0,0001, . Р2<0,0001, Р4>0,5 12,9712,25 Р1>0,5, Р2<0,0001 Р4>0,5 143112 Р1<0,0001 Р2>0,5 Р4<0,0005

IX Фенотерол в липосомах из HPL 0,2310,03, Р0<0,01. Р1 <0,0001, Р2<0,05. Р4>0,5, Р6=0, Р7<0,0005 18,6611,82 Р0<0,01 РК0.0001 Р2<0,0001 Р3<0,0001 Р5<0,0005 146138 Р0<0,0005 Р1<0,0005 Р2=0. Р3>0,05 Р5>0,5

X Липосомы из HPL 0,5310,07, Р1 <0,0005, Р2<0,05, Р4>0,5, Р6=0, Р7<0,0005 12,9412,14 Р1>0,5 Р2<0,0001 Р7<0,0001 Р4>0,5 Р6>0,5 120121 Р1<0,0001 . Р2<0,01 Р4<0,0001 Р6<0,0001 Р7<0,0001

Примечание РО - в сравнении с интактными крысами; Р1 в сравнении с больными животными; Р2 после инкубации с фенотеролом; РЗ в сравнении с данными после апликации фенотерола в липосомах из ЕРС; Р4 после апликации липосом из ЕРС; Р5 после инкубации с фенотеролом в липосомах из 1РЦ Р6 после апликации липосом из 1_Р1_; Р7 в сравнении с данными после инкубации с фенотеролом в липосомах из НР1_.

Таблица 3

Функциональное состояние бронхиального дерева и тучных клеток крыс с экспериментальной моделью БА в зависимости от фосфолипидного состава липосом.

№ п/п Группы животных Степень обструкции бронхов % КР кд

1 II III IV бронхов тучных клеток

1 Интактные крысы - - - - 0.63±0,0 2 0,18+0,01

II Крысы с моделью БА 21,0 24,0 29,0 14,0 0,36±0,0 1 0,75±0,02

II! Крысы с моделью БА (физ. Р-Р) 21,0 24,0 29,0 14,0 0.36±0,0 1 0,79±0,01

IV Крысы с моделью БА (Р) 61,0 18,4 6,4 5 0,46±0,0 1 0,43±0,05

V Крысы с моделью БА (Р+ЦЕРС) 62,0 9,0 6,0 - 0,53±0,0 1 0,39±0,03

VI Крысы с моделью БА (ЦЕРС) 56,0 23,0 7,0 Г 0,45±0,0 1 0,49±0,03

VII Крысы с моделью БА (F-KI.PL) 62,0 3.0 - - 0,57±0,0 1 0,2410,03

VIII Крысы с моделью БА (Ц 1_Р1_) 56,0 32,0 4,0 - 0,45±0,0 1 0,43±0,02

IX Крысы с моделью БА (Р+(ШР1_) 52,0 3,0 - - 0,60±0,0 1 0,23±0,04

X Крысы с моделью БА (1(НР1_) 70,0 8,0 4,0 0,51 ±0,0 2 0,40+0,02

Примечание: КР-коэффициент релаксации; КД- коэффициент дегрануляции; Р-фенотерол; Р+ЦЕРС)- фенотерол в липосомах из яичного лецитина; ЦЕРС)- липосомы из яичного лецитина; Р+Ц1_Р1_)- фенотерол в липосомах из суммарных фосфолипидов лёгких свиньи; Ц1-Р1.)-лилосомы из суммарных фосфолипидов лёгких свиньи; Я+ЦИРЦ- фенотерол в липосомах из суммарных фосфолипидов лёгких человека; 1_(НР1_)-липосомы из суммарных фосфолипидов лёгких человека. ,

У животных с моделью БА свободнопроходимые бронхи, без признаков воспаления составляют 4 и 12% (табл. 3,4), бронхи с 1 степенью обструкции 21 и 23%, со 2- 24 и 31%; с 3- 29% и 35%; и с 4- 14 и 7%. Коэффициент мышечной релаксации бронхов равен 0,36 у кроликов и 0,32 у крыс.

После ингаляций фенотерола крысам с моделью БА признаки воспаления сохранились в виде отека слизистой оболочки,, умеренной лейкоцитарной инфильтрации подслизистого слоя. В просвете бронхиол отмечается скопление слизи, встречаются эпителиальные клетки. В 3 раза увеличивается количество бронхов с 1 степенью 'обструкции,

приблизительно в 3 раза уменьшилось число бронхов с 3 и 4 степенью обструкции. Ив 1,5 раза увеличился коэффициент релаксации бронхов.

Таблица 4

Функциональное состояние бронхиального дерева кроликов с экспериментальной моделью бронхиальной астмы после ингаляционного введения препаратов

№ | Группы животных | Степень обструкции бронхов | КР бронхов

1 II III IV бронхов

I Интактные кролики - - - - 0,66±0,06

11 Кролики с с моделью БА 23,0 31,0 35,0 7,0 0,38±0,09

111 Кролики с моделью БА (физ. р.-р.) 23,0 31,0 35,0 7,0 0,38±0,09

IV Кролики с моделью БАР 57,0 29,0 3,0 0 0,49±0,07

V Кролики с моделью БА Р+ЦЕРС) 60,0 7,0 1,0 0 0,55±0,08

VI Кролики с моделью БА ЦЕРС) 61,0 32,0 0 0 0,48±0,05

VII Кролики с моделыЬ БА Р+ЦЬРЬ) 30,0 1,0 0 0 0,62±0,07

VIII Кролики с моделью БА ЦЬРЬ) 64,0 21,0 1,0 0 0,50±0,06

Примечание: КР- коэффициент релаксации; КД- коэффициент дегрануляции; Р- фенотерол; Р*1.(Е\РС)-фенотерол в липосомах из яичного лецитина; ЦЕРС)- липосомы из яичного лецитина; Р+ЦЬРЬ)-фенотерол в липосомах из суммарных фосфолипидов лёгких свиньи; Ц1.РЬ)- липосомы из суммарных фосфолипидов лёгких свиньи; Я+ЦНРЬ)- фенотерол в липосомах из суммарных фосфолипидов лёгких человека; Ь(НРЬ)-липосомы из суммарных фосфолипидов лёгких человека.

После ингаляций фенотерола кроликам с моделью БА. Количество бронхов с 1 степенью обструкции увеличилось в 2,5 раза и в 12 раз уменьшилось число бронхов с 3 степенью обструкции. Коэффициент релаксации бронхов как и у крыс возрос в 1,3 раза (табл. 4).

Если после введения липосом из ЕРС у животных с моделью БА наблюдается только тенденция к уменьшению признаков воспаления в бронхах (табл. 3), то после ингаляций липосом из ЬРЬ и НРЬ отмечается значительное снижение количества бронхов с выраженными обструктивными изменениями, причем полностью непроходимые бронхи отсутствуют. Коэффициент релаксации бронхов у крыс равен 0,45, у

кроликов - 0,50 после введения липосом из ЬРЬ (табл. 3,4) и 0,45; 0,48 при ингаляции липосом из ЕРС у крыс и кроликов, соответственно.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о бронхолитическом и противовоспалительном действии липосом. .

После проведенного курса лечения фенотеролом, инкапсулированным в липосомы из личного лецитина, отмечается увеличение количества бронхов без признаков воспаления в 2 раза по сравнению с контрольными больными грызунами и в 8 раз по сравнению с контрольными кроликами с экспериментальной моделью БА. Приблизительно в 3 раза увеличилось число бронхов с 1 степенью обструкции (табл. 3,4), а содержание бронхов с выраженными признаками обструкции снизилось до 6% у крыс и 1 % у кроликов. Бронхов с полностью закрытым просветом отсутствуют. Коэффициент релаксации бронхов после введения фенотерола в липосомах их ЕРС увеличился в 1,5 раза.

После ингаляций фенотерола в липосомах из ЬРЬ следует отметить значительное снижение бронхообструктивных признаков. В 1,5 раза увеличивается количество бронхов без воспалительных, явлений по сравнению с группой крыс, получавших фенотерол в липосомах из ЕРС и в 17 раз по сравнению с группой кроликов, получавших фенотерол в липосомах из ЕРС . Бронхи с 3-4 степенью обструкции после лечения фенотеролом в липосомах из ЬРЬ не обнаружены. Коэффициент релаксации бронхов после введения препарата крадсам не изменился по сравнению с показателями, полученными в группе животных, получавших фенотерол в липосомах из ЕРС (табл. 3,4). Коэффициент релаксации бронхов после введения фенотерола в липосомах из ЬРЬ кроликам с моделью БА увеличился в 1,1 раза по сравнению с группой животных, получавших фенотерол в липосомах из ЕРС .

После лечения < животных фенотеролом в липосомах из НРЬ бронхиальная проходимость стала лучше, {1ем в группах животных, получавших фенотерол • в липосомах из ЕРС и ЬРЬ. Количество неизмененных, свободно проходимых бронхов возросло в 2 раза по сравнению с животными, ингалировавшими фенотерол в липосомах из ЕРС ив 1,3 раза по сравнению с грызунами, которым давали препарат в липосомах из ЪРЬ. Снизилось число бронхов, в просвете которых видна слизь в 1,2 раза. Достоверно улучшилось показатели релаксации бронхов.

Наилучшие результаты, полученные после ингаляционного введения фенотерола в липосомах из суммарных фосфолипидов легких можно объяснить более целенаправленной доставкой лекарства к клеткам.

Таким образом, фенотерол, инкапсулированный в липосомы из суммарных фосфолипидов легких теплокровных может, вероятно, решить некоторые из проблем, которые встречаются при использовании ингаляционных в-2-агонистов. Он позволит эффективно поддерживать бронходилатацию в течение суток и особенно ночью, когда у большего числа пациентов наблюдается наиболее выраженное снижение легочных функций. ЛипосомаЛьный фенотерол оказывает выраженное мембраностабилизирующее и противовоспалительное действие и не вызыват системных побочных эффектов, поэтому фенотерол, инкапсулированный в липосомы из фосфолипидов легких теплокровных можно будет применять даже больным БА с сопутствующей ишемической болезнью сердца.

ВЫВОДЫ

1. На экспериментальной модели бронхиальной астмы исследовали новые липосомапьные формы фенотерола, приготовленные из суммарных

фосфолипидов лёгких свиньи и человека в сравнении с липосомами из яичного лецитина. I

2. Модель бронхиальной астмы получена на кроликах и крысах и подтверждена:

- клиническими наблюдениями: наличие кашля и свистящих хрипов на выдохе, увеличение частоты дыхания;

- макроскопическими данными: растянутые и неспадающиеся до нормальных размеров легкие с очаговыми мелкими ателектазами и множественными сероватыми пробками в просветах бронхов;

- микроскопическими исследованиями: гипертрофия и гиперплазия железистого аппарата бронхов, очаговая десквамация эпителия, умеренный отёк слизистой и подслизистой оболочек, наличие лимфоцитарно-гистиоцитарных пролифератов, эозинофилия, увеличенное число дегранулирующих тучных клеток, снижен коэффициент релаксации бронхов.

3. Фенотерол, инкапсулированный в липосомы, является высокоэффективным ингаляционным препаратом, который, как показывают эксперименты, пролонгирует время бронходилатации и снижает побочные эффекты. Установлено, что липосомальная форма фенотерола в 15- раз менее токсична по сравнению со свободным препаратом.

4. Липосомы из суммарных фосфолипидов лёгких теплокровных при ингаляционном введении обладают' лучшим противовоспалительным эффектом, по сравнению с липосомами, синтезированными из яичного лецитина; они снижают гиперсекрецию желез, уменьшают воспалительные процессы в бронхах, улучшают их релаксацию.

5. Липосомы из суммарных фосфолипидов лёгких теплокровных оказывают более выраженное мембраностабилизирующее действие на

тканевые базофилы органов дыхания, по сравнению с липосомами из яичного лецитина.

6. Фенотерола в липосомальной форме обладает наиболее выраженным мембраностабилизирующим и противовоспалительным действием. Он эффективнее стабилизирет структуру и функцию тучных клеток, заметнее снижает гиперплазию и гиперсекрецию железистого аппрарата, уменьшает воспалительные процессы в бронхах, улучшает их релаксацию, по сравнению со свободной формой препарата.

7. Фенотерол, инкапсулированный в липосомы из суммарных фосфолипидов лёгких теплокровных при ингаляционном введении оказывает более выраженнре мембраностабилизирующее и прртивовоспалительное действие.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

[.Применение фармакологических препаратов, заключенных в аутологичные фосфолипидные везикулы, может разрешить проблему направленного транспорта лекарственных веществ к клеткам-мишеням. 2. Использование фенотерола, инкапсулированного в липосомы из суммарных фосфолипидов теплокровных, позволит разработать новые высокоэффективные способы лечения больных БА.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ по ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Обратимые и необратимые реакции тучных клеток и их коррекция липосомальным фенотеролом // Клиническая морфология в Приморье. Сборник трудов, посвященный 35-летию кафедры патологической

анатомии ВГМУ. Владивосток, 1995. С. 73-77. (Соавт. М.В. Зуга, Т.Ю. Гарцман, В.Л. Невзорова).

2. Регуляция функции тучных клеток органов дыхания препаратами холинергического действия // там же. С. 69-72. (Соавт. М.В. Зуга, Т.Ю. Гарцман, В. А. Невзорова).

3. Сравнительный анализ терапевтической эффективности фенотерола, инкапсулированного в липосомы различного происхождения // Материалы юбилейной научно-практической конференции 29 марта 1996 года.Владивосток, Дальневосточная центральная клиническая бассейновая больница, с. 74-76. (Соавт.Б.И. Гельцер, А.Г. Подгорбунская, П.А. Лукьянов, B.C. Каредина, В.А. Невзорова, М.В. Зуга).

4. Сравнение терапевтической эффективности свободной и липосомальной форм фенотерола // там же, с. 76-77. (Соавт. Б.И. Гельцер, А.Г. Подгорбунская, П.А. Лукьянов).

5. Лечение пневмонии липосомами // Материалы научно-практической конференции 17 апреля 1996 года. Владивосток, с. 51. (Соавт. А.Г. Корякова). !

6. Регуляция функции тучных клеток фармакологическими препаратами // Морфология, 1996. №2, с.23. (Соавт. Е.В. Елисеева, В.А. Невзорова).

7. Аутологичные липосомы - наиболее эффективный носитель лекарственных средств // 3-ий национальный конгресс "Человек и лекарство" Москва, 16-20 апреля 1996. Сб. резюме, 1996, с. 16. (Соавт. Б.И. Гельцер, В.А. Невзорова). , , 1

8. Влияние липосомальной (¡юрмы фенотерола на функциональную активность тучных клеток // там же, с. 7. (Соавт. Б.И. Гельцер, А.Г. Корякова, П.А. Лукьянов).

9. Реакция тучных клеток на введение фенотерола в свободной и инкапсулированной в липосомы формах // 6 национальный конгресс по болезням органов дыхания. (Новосибирск, 1 - 4 июля 1996): Сб. резюме., 1996. № 1374. С. 361 (Соавт. Б.И. Гельцер, А.Г. Подгорбунская, В.А. Невзорова).

10.Коррекция тучных клеток липосомальным фенотеролом // там же. С. 8. (Соавт. Б.И. Гельцер)

11 .Регуляция функции тучных клеток органов дыхания липосомальным фенотеролом // там же. С. 8. (Соавт. Б.И. Гельцер, А.Г. Подгорбунская).

12.Determination of acute toxicity of the liposomal form of fenoterol II The third International symposium of the Japen-Russia Medical Exchange Foundation and the, Japan-Russia Medical Collaborative organization .on the methods and processes of Japan-Russia medical exchange. Abstracts of only participants who didn't attend the meeting. 1995. June 22-23. Osaca, Japan. P. 27. (Соавт. A. Podgorbunskaya, B. Geltser, P. Lukyanov).

13. Reaction of mast cell of bronchial tree in^rabbits with bronchial asthma model after berotec therapy // там же. P. 14. (Соавт. M. Protopopova, M. Zuga, V. Karedina, V. Nevsorova, B. Geltser).

14.The effects of liposomal form of fehoterol in rats with bronchoconstriction II XV-th word congress of astmology, Montpellier - France, April 24-27, ,1996. №90.(Соавт. В. Geltser, P. Motavcin, M. Zuga, P. Lukyanov, V. Nevzorova).

15. The effects of liplosomal form of fehoterol on the state of mast cells at bronchial asthma // XV-th word congress of astmology, Montpellier - France, April 24-27, 1996. №91. (Соавт. В. Geltser, P. Motavcin, A. Podgorbunskay, P. Lukyanov).