Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Лактококкофаги и санитарное состояние в кисломолочном производстве творога

ГОУ ВПО «МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ»

0034Ь

ЛАКТОКОККОФАГИ И САНИТАРНОЕ СОСТОЯНИЕ В КИСЛОМОЛОЧНОМ ПРОИЗВОДСТВЕ ТВОРОГА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

На правах рукописи

Ментюков Григорий Александрович

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук

и и- ^

МОСКВА 2008

003451730

Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии ветеринарно-санитарного факультета ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии»

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор

Степаненко Пётр Петрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор (МГУПБ) Валихов Алексей Фёдорович

доктор ветеринарных наук,

профессор (ВИЭВ) Субботин Владимир Викторович

Ведущая организация:

ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии»

Защита диссертации состоится «<?/» /гоЛс&Х 2008г. в/5" ^-часов на заседании диссертационного совета Д 212.149.03 при ФАО ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (МГУПБ), по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина,

Д.ЗЗ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУПБ. Автореферат разослан « » сит&е^Х 2008г.

Учёный секретарь диссертационного совета, к. в. н., проф.

Серёгин И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важнейшим требованием современного рынка молочной продукции является её стабильное качество и микробиологическая безопасность. Одним из факторов их обеспечения при производстве кисломолочных продуктов является интенсивность и направленность процесса сквашивания.

Главными причинами снижения интенсивности кислотообразования при сквашивании являются: использование молока, содержащего ингибирующие вещества и молока с недостаточным количеством сухих веществ, несоблюдение технологических режимов и, наконец, несоответствие качества сырья и условий производства санитарно-гигиеническим требованиям, а также использование молока, пораженного бактериофагами полезной микрофлоры (В.И. Ганина, В.Ф. Семенихина МГУПБ, 1999). Как показывает повседневная производственная практика, проблема бактериофагии на молокоперерабатывающих предприятиях в настоящее время стоит достаточно остро, что обусловливает необходимость проведение фагового мониторинга с целью снижения рисков экономических потерь, связанных с фаговой инфекцией.

Теоретические и практические основы в изучении явления бактериофагии в молочной промышленности заложены в трудах В.З. Ахвердяна, JI.A. Банниковой, В.И. Ганиной, A.B. Гудкова, И.Р. Волковой, Н.С. Королевой, Н.Ф. Кувалдиной, Л.Г. Мытник, Г.Д. Перфильева, В.Ф. Семенихиной, П.П. Степаненко, Д.А. Яковлева, Н. Ackermann, V. Braun, A. Coffey, С. Hill, A. Jarvis, T.R. Klaenhammer, P. Laux, S. Moineau, H. Neve, В. Terzaghi, M. Teuber и др.

Изучением явления бактериофагии учёные занимаются несколько десятилетий, тем не менее, существует ряд нерешённых проблем, определивших цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы и задачи исследований. Целью настоящей диссертационной работы явилось определение источников и интенсивности контаминации объектов кисломолочного производства творога лактококкофагами, санитарно-показательными и другими микроорганизмами, характеризующими санитарное состояние производства и предложение практических рекомендаций по его улучшению.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

• изучить микрофлору и оценить санитарное состояние заготовляемого сырого и сухого обезжиренного молока;

• определить источники и интенсивность контаминации лактококкофагами основных объектов кисломолочного производства творога;

• определить наиболее эффективный метод выявления лактококкофагов в объектах кисломолочного производства творога;

• подобрать наиболее приемлемую заквасочную культуру для обнаружения лактококкофагов;

• проанализировать динамику микрофлоры на различных этапах производства творога;

• определить оптимальный метод выявления микроорганизмов в воздухе;

• для снижения контаминации объектов производства предложить усовершенствованный метод дезинфекции производственных цехов и молочного оборудования.

Научная новизна. Впервые выявлена достоверная зависимость между общей бактериальной обсеменённостью, концентрацией молочнокислых бактерий и титром лактококкофагов в объектах производства творога, определены основные источники и интенсивность контаминации лактококкофагами объектов кисломолочного производства творога, что позволит объективно оценивать фаговую ситуацию на молокоперерабатывающих предприятиях.

Предложен новый научно - обоснованный эффективный метод выявления лактококкофагов в различных объектах кисломолочного производства, позволяющий точно определять источники и интенсивность контаминации производимой продукции лактококкофагами: в частности, подобрана тест-культура, использование которой обеспечивает высокую эффективность метода определения лактококкофагов.

Изучена динамика микрофлоры на различных этапах производства творога, что позволяет оценивать микробиологическую ситуацию и осуществлять профилактику развития возбудителей порчи и условно-патогенных микроорганизмов.

Практическая значимость работы. Разработана рабочая инструкция методов обнаружения бактериофагов, что даёт возможность быстро и эффективно проводить анализ и оценивать фаговую ситуацию на различных этапах кисломолочного производства творога.

В условиях молокоперерабатывающего предприятия определено санитарное состояние сырья, других объектов производства творога и даны практические рекомендации по его улучшению.

Предложен эффективный метод определения микроорганизмов в воздухе, позволивший значительно повысить выявляемость различных групп микроорганизмов.

Внедрён в производственную практику усовершенствованный метод дезинфекции производственных цехов и молочного оборудования, в результате чего уменьшается общая микробиальная обсеменённость и количество лактококкофагов в указанных объектах производства.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на Международных научно-практических конференциях: «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции», (М., МГУПБ,

2004); «Живые системы и биологическая безопасность населения», (М., МГУПБ, 2006).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на

_ страницах машинописного текста и включает введение, обзор

литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Диссертация содержит 22 рисунка, 17 таблиц. Список литературы включает 155 источников, в том числе 52 иностранных.

Положения, выносимые на защиту. Изучена микрофлора и оценено санитарное состояние заготовляемого сырого и сухого обезжиренного молока. При этом статистически доказано, что лактококкофаги и колифаги могут служить показателем санитарного состояния перерабатываемого молока.

Определены основные источники обсеменения и интенсивность контаминации лактококкофагами других объектов кисломолочного производства творога: молочное сырье, не подвергавшееся тепловой обработке.

Определен эффективный метод выявления лактококкофагов в различных объектах кисломолочного производства: метод агаровых слоев с использованием в качестве тест-культуры штамма Lactococcus Iactis.

Изучена динамика изменения микрофлоры на различных этапах производства творога: инактивация фагов сырого молока в процессе пастеризации с последующим возрастанием их титров в процессе сквашивания.

Определён оптимальный метод выявления микроорганизмов в воздухе производственных помещений: аспирационный отбор проб с использованием прибора MAS-lOOEco.

Предложен и внедрен усовершенствованный метод дезинфекции молочного оборудован™ и цехов производства средством «Неосептал ПЕ - 15» в концентрации рабочего раствора 0,12% с экспозицией 10 минут.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования проводили в микробиологической лаборатории ОАО «Вимм-Билль-Данн» г. Москвы и на кафедре микробиологии ГОУ «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» в период 2003 - 2007гг.

Материалом и объектами исследований служили образцы сырого молока (в количестве 370 проб, п=370); сливок (п=200); бактофугированного молока (п=160); пастеризованного молока (п=260); сухого обезжиренного молока (п=506); творога (п=450); творожной сыворотки (п=200); закваски (п=200); сахарного песка (п=100); джемов (п=100); смывов с оборудования (п=5Ю); воздуха (п=1060), а также два штамма Ecsherichia coli (К-12,

полученный из ВКПМ, ФГУП «ГосНИИ генетика», и выделенный из объектов производства); чистая культура Lactococcus lactis, выделенная из закваски CHOOZIT 230 производства фирмы «Danisco» (Германия); бактериофаги в количестве 11 штаммов, выделенные из исследуемых образцов.

Санитарно-микробиологическое состояние молочных продуктов и объектов производства оценивали по следующим микробиологическим показателям: общей бактериальной обсеменённости, наличию санитарно-показательных микроорганизмов (бактерий группы кишечных палочек (БГКП), эшерихий (Е. coli), кишечных бактериофагов), а также концентрации молочнокислых бактерий, лактококкофагов, дрожжей и плесеней. Отбор и подготовку проб пищевых продуктов проводили по ГОСТ 26668, 26669; определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов - согласно ГОСТ 9225-84 и 10444.15-94; определение количества дрожжей и плесневых грибов - согласно ГОСТ 10444.12.88; молочнокислых микроорганизмов по ГОСТ 10444.11-89; наличие бактерий группы кишечных палочек (БГКП) согласно ГОСТ 9225-84; а количество бактерий вида Е. coli - согласно ГОСТ 30726-2001 и ГОСТ 30518-97/ГОСТ Р 50474-93.

Выявление бактериофагов проводили методом агаровых слоев, однослойным методом, тестом на сквашивание.

Метод агаровых слоев позволяет установить количество фаговых частиц, способных образовывать негативные колонии.

Однослойный метод даёт возможность на одной чашки Петри с нанесённым газоном культуры исследовать несколько фильтратов продукта, смывов и количественно определить концентрацию бактериофагов.

Тест на сквашивание используется в тех случаях, когда в состав закваски входят несколько видов культур. Данный тест является результатом кислотного сквашивания молока под действием молочной кислоты, продуцируемой микроорганизмами. Он служит для непрямого (качественного) обнаружения бактериофага.

Результаты исследований статистически обработаны с помощью ППП «Statistica 6.0 for Windows».

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Микрофлора заготовляемого сырого молока

Целью исследования микрофлоры сырого молока являлась оценка санитарно-микробиологических показателей заготовляемого молока, полученного от 150 поставщиков. Определяли общую бактериальную обсеменённость, количество лактобактерий, бактерии группы кишечных палочек (БГКП) и E.coli, количество спор аэробных бацилл, количество солетолерантных стафилококков, а также титры лактококкофагов и колифагов.

Установили, что 57,3% хозяйств поставляли несортовое молоко неудовлетворительного санитарного качества с общей микробной обсеменённостью свыше 4 млн. микробных тел в 1 см3. Заготовляемое молоко 41,3% поставщиков было отнесено ко второму сорту, и только 1,3% хозяйств поставляли молоко первого сорта (табл. 1). Кроме того, в исследованном молоке выявлены также высокие (на уровне 105 КОЕ/см3) концентрации солетолерантных кокков и спор мезофильных аэробных микроорганизмов (порядка 104—105 спор/см3 при норме не более 102 для выпуска стерилизованного молока).

Таблица 1

Качество молока различных поставщиков

Бактериальная обсемененность (клеток в 1 см3) Требования ГОСТ Качество молока Сорт Количество хозяйств

Абсолютное количество %

До 300 тыс. и от 300-500 тыс. Очень хорошее, хорошее Высший Первый 2 (],3±0,24%)

До 4 млн. Удовлетворительное Второй 62 (41,3±7,9%)*

Свыше 4 млн. Неудовлетворительное Несортовое 80 (53,3±8,1%)*

Свыше 20 млн. Очень плохое Несортовое 6 (4±1,5%)

*- различия статистически достоверны, р<0,05.

Количество молочнокислых бактерий в заготовляемом молоке различных поставщиков составляло от 2,0 до 25 млн. клеток в 1 см3. Наиболее типичными для исследуемой выборки оказались уровни обсемененности сырого молока лактококками в пределах 2-2,5 и 6-9 млн. КОЕ/см ; остальные категории обсеменности молока бактериями данной группы встречались с примерно одинаковой, достоверно не различающейся, частотой (табл. 2). Корреляционный анализ выявил достоверную положительную связь между титром лактококкофагов и концентрацией молочнокислых бактерий (г=0,69; р=0,000016), таким образом, по титрам лактококкофагов можно косвенно судить о содержании молочнокислых бактерий, и, следовательно, рассматривать лактококкофаги как показатель санитарного состояния сырого молока.

Таблица 2

Уровень обсеменения сырого молока лактобактериямн и лактококкофагами

Количество молочнокислых бактерий (КОЕ/см3) Количество хозяйств Титр лактококкофагов

Тест на сквашивание Метод агаровых слоёв

Абсолютное количество %

2-2,5 млн. 41 (27,3±7,1%)* 10" 10"

2,5-6 млн. 24 (16,0± 5,9 %) 10" 10"

6-9 млн. 46 (30,7±7,4 %)* 10"- 10' 106- 10'

9-13 млн. 17 (11,3± 5,1%) 10' 10v

13 -25 млн. 22 (14,7± 5,6%) 10'- ю8 10'- ю8

*- различия статистически достоверны, р<0,05.

Бактерии группы кишечных палочек были обнаружены во всех исследованных пробах в концентрации от 2,0х104 КОЕ/см3 до 1,7х107 КОЕ/см3. Распределение образцов по трем градациям обсемененности представлено в таблице 3. Стоит отметить, что от 19 до 57% от общего количества выделенных штаммов составляли лактазаотрицательные кишечные палочки.

Таблица 3

Распределение хозяйств в зависимости от уровня микробного обсеменения сырого молока БГКП

Количество БГКП, КОЕ/см* Количество хозяйств

Абсолютное количество %

От 20,2-22,7 тыс. 33 (22,0±6,7%)

От 124-203 тыс. 91 (60,6±7,9 %)*

От 16-17 млн. 26 (17,3±6,1%)

*- различия статистически достоверны, р<0,05.

Е. coli обнаружены в молоке всех исследованных проб. Их концентрация составляла от 1,5х103 до 2,3x105 КОЕ/см3; распределение образцов по градациям обсемененности данными бактериями приведено в таблице 4. Колифаги были обнаружены в молоке 124 хозяйств, т.е. в 82,6% исследованных проб, что подтверждает санитарно-показательное значение кишечных бактериофагов, (корреляция между количеством Е. coli и титром колифагов на уровне г=0,68; р=0,00031).

Таблица 4

Распределение хозяйств по уровню присутствия в сыром молоке Е. coli и колифагов

Количество E.coli, КОЕ/см3 Количество хозяйств Титр колифагов

Абсолютное количество % выявления

От 1,5 -10 тыс. 26 (17,3±6,1%) -

От 11 -92 тыс. 96 (64,0±7,7%)* 104-105

От 104 - 230 тыс. 28 (18,6±6,3%) юМо"

различия статистически достоверны, р<0,05.

Микрофлора бактофугированного и пастеризованного молока

Для изучения влияния бактофугирования и пастеризации на микробную обсеменённость молока определяли общую бактериальную обсеменённость и количество спор аэробных бацилл. Данные исследования 240 проб молока (3 бактофуги) показывают, что в процессе бактофугирования сырого молока происходит закономерное снижение количества бактерий на 99,5% и бактериальных спор на 40%, а после пастеризации - на 99,87% и 87,5% соответственно, что обеспечивает длительное сохранение хорошего качества питьевого молока.

Таблица 5

Микробная обсеменённость сырого молока в процессе переработки**

Исследуемые Общая микробная Количество спор

образцы обсеменённость аэробных бацилл

(п=80) KOE/cmj % остаточной КОЕ/см' % остаточной

микрофлоры микрофлоры

Молоко до бактофугирования 2,2 х Ю' 100 1,5 х 10' 100

Молоко после бактофугирования 1,1 х 103' 0,5 9,0 х 10'" 60

Молоко до пастеризации 3,5 х Ю5 100 8,0 х Ю' 100

Молоко после пастеризации 4,6 х Ю-1' 0,13 1,0 х Ю1' 12,5

* - различия статистически достоверны (р<0,05).

**- на примере наиболее эффективной бакгофугационной установки №1.

Микрофлора сухого обезжиренного молока

С целью изучения общей микробной обсеменённости, выявления лактококкофагов, присутствия бактерий группы кишечных палочек были проведены исследования 506 проб сухого обезжиренного молока, полученного от разных поставщиков.

Как следует из таблицы 6, преобладающее число проб сухого обезжиренного молока содержало микроорганизмы в концентрации менее 10 КОЕ/г, что соответствует требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01 предъявляемым к сухому обезжиренному молоку для промышленной переработки.

Титр лактококкофагов коррелировал с уровнем общей обсемененности данного сырья, а БГКП были обнаружены только в одном образце (0,19%) с максимальным уровнем обсемененности.

Таблица 6

Результаты микробиологического исследования сухого обезжиренного молока

Общее микробное обсеменение сухого обезжиренного молока Лактококкофаш БГКП

КОЕ/г Количе- % выявле- Количе- Титр % выявле- Количе- % выявле-

ство проб ния ство проб ния ство проб ния

1,0x10' 1 0,19 - - - -

1,0x10' 5 0,89 - - - -

1,0x10' 141 25,1 18 10' 3,55 - -

1,0x10' 339 60,5 42 юМо4 8,3 - -

1,0x105 20 3,57 4 ю3 0,79 1 0,19

Эффективность методов выявления лактококкофагов с использованием различных заквасочных культур

Целью данного исследования была оценка подверженности заквасочных культур, используемых на производстве, воздействию лактококкофагов и определение наиболее чувствительного метода выявления последних.

Таблица 7

Результаты исследования эффективности методов выявления лактококкофагов

Заквасочная тест-культура Методы исследования

Тест на сквашивание | Однослойный метод | Метод агаровых слоев

Частота выявления лакгофага ( %)

Творог Смывы Творог Смывы Творог Смывы

Choozit 230 46,7 43,3 36,7 36,7 73,3* 70,0*

Choozit 240 40,0 43,3 43,3 33,3 76,7* 70,0*

Lactina (LATCW) 40,0 333 36,7 30,0 66,7* 60,0*

R-604 46,7 33,3 40,0 33,3 76,7* 70,0*

L. lactis 46,7 50,0 50,0 50,0 76,7* 83,3*

*- различия статистически достоверны, р<0,05.

По результатам исследования 60 проб (30 фильтратов творога и 30 смывов) с использованием в качестве тест-культур различных заквасок промышленного производства, а также чистой культуры Lac. lactis, обнаружено, что метод агаровых слоев достоверно чувствительнее (83,3%), чем тест на сквашивание и однослойный метод (р<0,05), между которыми достоверных различий не выявлено (см. табл. 7). Наибольшую чувствительность анализу обеспечило использование в качестве тест-культуры штамма Lac. lactis и, в меньшей степени, заквасок Choozit 240 и R-604. Наиболее устойчивой к воздействию лактококкофагов (и, соответственно,

наименее пригодной в качестве тест-объекта) оказалась закваска Lactina (LAT CW).

Таким образом, наиболее эффективным методом выявления лактококкофагов является метод агаровых слоев с использованием в качестве тест-культуры штамма Lac. lactis.

Сравнительный анализ методов выявления лактококкофагов при производстве творога

Далее, используя отобранную тест-культуру, провели сравнительный анализ трех методов выявления лактококкофагов: теста на сквашивание, однослойного метода и метода агаровых слоев. С их помощью проанализировали по 100 проб каждого наименования (см. табл. 8). Обнаружили, что наименьшее количество случаев выявления лактофагов наблюдалось при проведении анализа однослойным методом, а наибольшее -методом агаровых слоев, однако достоверных различий в чувствительности методов не выявлено.

Таблица 8

Выявляемость лактококкофагов различными методами

Исследуемые образцы Количество положительных проб

Тест на сквашивание Однослойный метод Метод агаровых слоев

Абсолютные числа % Абсолютные числа % Абсолютные числа %

Сырое молоко 77 77± 8,2 73 73±8,7 79 79±7,9

Сырые сливки 73 73± 8,7 68 68±9,1 75 75 ±8,5

Закваска 7 7 ±1,8 7 7±1,8 7 7±1,8

Пастеризованное молоко 62 62± 9,5 57 57± 9,7 65 65±9,3

Заквашенная смесь 67 67± 9,2 60 60±9,6 69 69±9,1

Творог (колье) 69 69±9,1 65 65±9,3 72 72±8,8

Творог (сепарированный) 70 70± 8,9 66 66±9,3 73 73±8,7

Творожная сыворотка 51 51±9,8 48 48±9,7 55 55±9,7

Смывы с оборудования 27 27± 8,7 24 24±8,4 28 28±8,8

Воздух н.д. 18 18±7,5 18 18±7,5

н.д. - нет данных.

Кроме того, установили, что частота обнаружения бактериофага в закваске достоверно меньше, чем в других исследуемых объектах (р<0,05). Далее по возрастанию процента выявляемости лактококкофагов следуют смывы с оборудования и пробы воздуха. В сыром молоке, сырых сливках, пастеризованном молоке, заквашенной смеси, колье, твороге (сепарированном) и творожной сыворотке бактериофаги были обнаружены в половине и более от общего числа исследуемых проб, а частота выявления положительных проб

достоверно не различалась. Распределение лактококкофагов в объектах кисломолочного производства (с учетом данных исследований сырого и бактофутированного молока) показано на рисунке 1.

99,9%

1 2 3 4567 89 10 11

■ I Сырое ми. Ю к О □ 2 Бакто фугировав но е молоко 0 3 Сырые сливки Н 4 Творог

НЕ 5 Заквашен пав смесь § 6 Пастеризованвое молоко 5 7 Творожная сыворотка 3 8 Смывы с оборудования В 9 Возцул

¡2 ] 0 Сухое обезжиренное молоки 0 1] Закваска

Рис. 1. Выявлисмость лактококкофагов при производстве творога

Микрофлора воздуха цехов производства кисломолочных продуктов

Проведено исследование количества и частоты выявления различных групп микроорганизмов в воздухе транспортного коридора, участка производства кефира, ряженки и простокваши («диетцеха»), участка производства йогурта и творога. В каждом цехе исследовали по 240 проб воздуха. Посевы производили седиментационным методом (в течение 5 минут), а также аспирационным методом при помощи приборов ПУ-1Б и МА5-ЮОЕсо {каждым методом исследовали по 80 проб воздуха). В последних случаях воздух прокачивался на плотные питательные среды в течение 1 минуты, при этом количество пропускаемого через прибор воздуха составляло 100л. При анализе результатов исследования производили перерасчёт содержания общего количества микроорганизмов в 1 м5 воздуха.

Наиболее эффективным методом выявления микроорганизмов в воздухе производственных цехов являлся аспирационный метод исследования при

помощи прибора MAS 100 Eco. Аспирационный метод с использованием прибора ПУ-1Б по эффективности обнаружения микроорганизмов в воздухе занимал промежуточное положение между седиментационным и аспирационным методом с использованием аппарата MAS 100 Eco.

Таблица 9

Микрофлора воздуха производственных цехов

Микробиологические показатели Количество микроорганизмов

Транспортный ■ коридор Участок пр-ва кефира, ряженки, простокваши Участок пр-ва йогурта Участок пр-ва творога

1 | 2 | 3 | 1 12 | 3 1 |2 |3 1 12 I 3

КМАФАнМ

Число положительных проб 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80

% выявления 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

KOE/Mj 4600 5300 5900 1578 2110 2220 1000 1162 1178 567 620 644

д рожжи

Число положительных проб 38 55 60 19 26 31 13 18 23 10 14 16

% выявления 48* 69 75 24** 33 39 16 23 29 13 18 20

КОЕ/м' 200 260 300 110 170 200 67 SS 100 45 66 72

Плесени

Число положительных проб 74 80 80 20 25 29 16 22 •27 17 23 27

% выявления 93* 100 100 25 31 36 20 28 34 21 29 34

КОЕ/м-1 650 710 750 400 467 493 480 540 576 367 413 427

Лактококкофаги

Число положительных проб 36 44 47 18 24 28 23 27 30 28 34 37

% выявления 45 55 59 23 30 35 29 34 38 35 43 46

БОНУм" 200 260 280 164 203 213 78 111 117 68 100 108

КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

БОЕ - бляшкообразующие единицы.

* - различия достоверны по сравнению с двумя другими методами, р<0,05. ** - различи достоверны по сравнению с прибором MAS 100 Eco, р<0,05.

1-седиментационный метод;

2-асгшрациошшй метод прибор ПУ-1Б;

3- аспирационный метод прибор MAS 100 Eco.

При сравнении микрофлоры воздуха различных производственных помещений за основу брали показатели, полученные при использовании аппарата MAS 100 Eco. Наибольшая общая микробная обсеменённость воздуха была характерна для транспортного коридора; далее этот показатель снижался в ряду диетцех - участок производства йогурта - участок производства творога (5266,7±375,б, 1969,3±198,2, 1113,3±56,9 и 610,3±22,7 КОЕ/м3 соответственно, указанные различия достоверны для р=0,000245-Ю,0012).

По уровню обсемененности воздуха дрожжами, плесенями и лактококкофагами обследованные помещения образовывали аналогичный ряд: транспортный коридор - диетцех - участок производства йогурта - участок производства творога (содержание дрожжей: 253,3±29,1, 160,0±26,5, 85,0±9,6 и 61,0±8,2 КОЕ/м3 соответственно; содержание плесеней: 703,3±29,1,453,3±27,7, 532,0±28,0 и 402,3±18,1 КОЕ/м3 соответственно; содержание лактококкофагов: 246,7±24,0, 193,3±14,9, 102,0±12,1 и 92,0±12,2 БОЕ/м3 соответственно), однако достоверность различий между участками по этим показателям варьировала.

Микрофлора и эффективность дезинфекции производственного оборудования

Целью данного исследования являлось определение эффективности дезинфекции производственного оборудования дезинфицирующим средством «Неосептал ПЕ -15» (Германия). Данный препарат является водным раствором стабилизированной смеси перекиси водорода и надуксусной кислоты (НУК).

Объектами дезинфекции служили внешняя поверхность резервуаров молочных цистерн. В процессе исследования устанавливали наличие БГКП, Е. coli, дрожжей, плесеней, лактофагов, колифагов до и после проведения дезинфекции (по 80 смывов).

Для проведения эксперимента готовили рабочие растворы средства с концентрацией 0,09%; 0,12%; 0,15% по препарату и 0,015%; 0,020%; 0,025% по надуксусной кислоте (НУК) соответственно.

Для удаления белково-жировых загрязнений с поверхностей оборудования проводили механическую мойку тёплой водой (50-55°С) в течение 5 минут. Затем осуществлялась обработка щелочным средством «Деомол - А» (Воскресенский завод химических реагентов) с температурой 70°С в течение 5 минут, ручная механическая обработка поверхностей щётками, ополаскивание чистой водой с температурой 22-25°С от щелочного средства в течение 5 минут. Далее на поверхности оборудования наносили

растворы «НеоселTai ПЕ 15» с температурой 15-45°С. Расход рабочих растворов составлял 0,3 дм3 на 1м, а ЭКСПОЗИЦИЯ - I Омин. Удаление дезинфицирующих растворов производили путём ополаскивания чистой водой с температурой 22-25üC в течение 10-15 минут.

Как видно из рисунка 2, обработка 0,09%-м раствором «Неосептал ПЕ -15» обеспечивала полную инактивацию БГКП, Е. coli и бактериофагов, и снижала частоту обнаружения дрожжей и плесеней в 14 и 4 раза соответственно. Использование растворов в концентрациях 0,12% и 0,15% приводило к полной дезинфекции поверхностей. Таким образом, наиболее эффективной и экономически обоснованной являлась дезинфекция с использованием средства в концентрации рабочего раствора 0,12% (0,020% надуксусной кислоты) с экспозицией 10 минут.

□ до дезинфекции Я после дезинфекции

Рнс. 2. Результаты изучения эффективности применения «Неосептал ПЕ -15» в концентрациях 0,09%, 0,12%, 0,15% ДЛЯ дезинфекции молочного оборудования

выводы

1. При исследовании микрофлоры заготовляемого сырого молока выявлено, что достоверно большее число хозяйств поставляли несортовое молоко и молоко второго сорта (53,3% и 41,3% соответственно).

Преобладающее число проб сухого обезжиренного молока, напротив, соответствовало требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01.

2. Установлено, что основными источниками лактококкофагов в объектах кисломолочного производства творога являлись: сырое молоко 99,9%, бактофугированное молоко 84%, сырые сливки 75%. В твороге, заквашенной смеси, пастеризованном молоке, творожной сыворотке частота выявления лактококкофагов составила 73%, 69%, 65%, 55% соответственно. В смывах с оборудования, воздухе, сухом обезжиренном молоке, закваске частота обнаружении составила 28%, 18%, 12,6%, 7% соответственно. Титры лактококкофагов и колифагов в заготовляемом сыром и сухом обезжиренном молоке достоверно коррелировали с концентрацией соответствующих им бактерий и могут служить показателем санитарного состояния молока.

3. Определено, что наиболее эффективным методом выявления лактококкофагов являлся метод агаровых слоёв. Частота выявления лактококкофагов этим методом составила от 60,0% - 83,3%.

4. Наибольшую чувствительность методам обнаружения лактококкофагов обеспечивало использование в качестве тест-объекта чистой культуры Lactococcus lactis.

5. Выявлено достоверное снижение общей бактериальной обсеменённости после бактофугирования в среднем в 91 раз (97,8%), после пастеризации - в 822 раза (99,8%); уменьшение количества бактериальных спор после бактофугирования в среднем в 1,6 раза (38,2%), после пастеризации - в 3,9 раза (58,9%). Таким образом, пастеризация в сравнении с бактофугированием обеспечивает более эффективное снижение общей микробной обсемененности сырья, но статистически достоверное снижение содержания жизнеспособных спор наблюдали только в одной установке.

6. Установлено, что наиболее эффективным методом выявления микроорганизмов в воздухе являлся аспирационный метод исследования при помощи прибора MAS-100 Eco. Выявлено, что наиболее обсемененным являлся воздух транспортного коридора молокоперерабатывающего предприятия, далее по микробной обсеменённости и выявленных частиц лактококкофагов следовали диетцех, участок производства йогурта и участок производства творога.

7. Наиболее эффективной и экономически обоснованной являлась дезинфекция с использованием средства «Неосептал ПЕ-15» в концентрации рабочего раствора 0,12% с экспозицией 10 минут.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. С целью осуществления систематического мониторинга фаговой ситуации на молокоперерабатывающих предприятиях компании «Вимм-Билль-Данн» разработана и утверждена рабочая инструкция методов обнаружения бактериофагов, что позволяет своевременно выявлять бактериофаги, оценивать фаговую ситуацию и осуществлять профилактику экономических потерь, связанных с нарушением кисломолочного процесса при производстве продукции.

2. Предложен эффективный метод выявления микроорганизмов в воздухе производственных помещений при помощи прибора MAS-100 Eco, что позволяет быстро и качественно провести оценку санитарного состояния воздушной среды производственных цехов и вспомогательных помещений.

3. Внедрён в производственную практику усовершенствованный метод дезинфекции производственных цехов и молочного оборудования при помощи дезинфицирующего средства «Неосептал ПЕ-15».

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ментюков Г.А. Лакто- и колифаги как показатели санитарно-гигиенического качества сырого молока / Г.А. Ментюков, П.П. Степаненко // Материалы 5-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции». -М., 2004. - С. 77-78.

2. Ментюков Г.А. Санитарно-микробиологическое качество сырого молока, поступающего на переработку / Г.А. Ментюков, П.П. Степаненко // Материалы 5-ой Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции». -М.,2004.-С.32-33.

3. Ментюков Г.А. Санитарное качество заготовляемого молока / Г.А. Ментюков, П.П. Степаненко // Научно-практический информационный журнал Практик. - СПб, 2005. - С. 32-34.

4. Ментюков Г.А. Сравнительная микробиологическая характеристика сухого обезжиренного молока / Г.А. Ментюков, С.С. Шихов // Материалы 5-ой Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М., 2006. - С. 276-277.

5. Ментюков Г.А. Сравнительная микробиологическая характеристика сырого молока разных регионов / Г.А. Ментюков, С.С. Шихов // Материалы 5-ой Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения». - М., 2006. -С. 277-278.

6. Ментюков Г.А. Оценка санитарно-микробиологических показателей заготовляемого и бактофугированного молока / Г.А. Ментюков, С.С. Шихов И Гигиена и санитария. - 2007.- №6.- С. 62-64.

7. Ментюков Г.А. Эффективный метод выявления лактофага в смывах с молочного оборудования (танков) и в твороге / Г.А. Ментюков, П.П. Степаненко, С.С. Шихов // Ветеринария сельскохозяйственных животных. -2007.-№6.-С. 63-66.

1В

Подписано в печать 01.10.2008 г.

Печать трафаретная

Заказ № 886 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Современным важнейшим требованием рынка молочной продукции является её стабильное качество и микробиологическая безопасность, что в первую очередь относится к кисломолочным продуктам. При получении высококачественных молочных продуктов важную роль играет интенсивность кисломолочного процесса в период их производства. Анализ состояния технологического производства кисломолочных продуктов (в первую очередь творога и сметаны) свидетельствует о довольно частом снижении интенсивности развития заквасочных микроорганизмов и изменении направленности микробиологических процессов, что отрицательно отражается на санитарном качестве получаемой продукции.

Снижение интенсивности кислотообразования обусловливается несколькими причинами, главными из которых являются: использование молока, пораженного бактериофагами полезной микрофлоры; молока, содержащего ингибирующие вещества и молока с недостаточным количеством сухих веществ, а также нарушение технологических процессов и несоблюдение санитарно-гигиенических условий производства [23, 24, 26].

Лактофаги вызывают гибель всех или части заквасочных микроорганизмов, при этом нарушаются бродильные процессы, что приводит к замедлению производства продукции, резкому ухудшению её качества [1,2, 66, 67, 102].

Бактериофаг может являться также одной из причин быстрого вырождения или ослабления бактериальных культур, используемых в производственных заквасках [1, 2].

Нарушение кисломолочного процесса при получении кисломолочных продуктов приводит не только к снижению качества продукции и потерям сырья, но и возникновению пищевых отравлений, что обусловлено менее выраженным ингибирующим воздействием заквасочной микрофлоры на находящиеся в молоке условно-патогенные, иногда патогенные и другие микроорганизмы [16, 84, 93].

Для успешной борьбы с лактококкофагами и предотвращения распространения фаговой инфекции в производственных условиях необходимо знать источники и интенсивность обсеменения фагами различных объектов кисломолочного производства [16].

Исследования по выявлению лактококкофагов позволяют не только следить за фаговой ситуацией, но и использовать выделенные штаммы бактериофагов для получения фагорезистентных заквасочных культур и проведения других мероприятий, направленных на разработку методов защиты производства от бактериофагов [16, 47]. Изучением явления бактериофагии учёные занимаются несколько десятилетий, тем не менее, существует ряд нерешённых проблем, определивших цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы и задачи исследований. Целью настоящей диссертационной работы явилось определение источников и интенсивности контаминации объектов кисломолочного производства творога лактококкофагами, санитарно-показательными и другими микроорганизмами, характеризующими санитарное состояние производства и предложение практических рекомендаций по его улучшению.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

• изучить микрофлору и оценить санитарное состояние заготовляемого сырого и сухого обезжиренного молока;

• определить источники и интенсивность контаминации лактококкофагами основных объектов кисломолочного производства творога;

• определить наиболее эффективный метод выявления лактококкофагов в объектах кисломолочного производства творога;

• подобрать наиболее приемлемую заквасочную культуру для обнаружения лактококкофагов;

• проанализировать динамику микрофлоры на различных этапах производства творога;

• определить оптимальный метод выявления микроорганизмов в воздухе;

• для снижения контаминации объектов производства предложить усовершенствованный метод дезинфекции производственных цехов и молочного оборудования.

Научная новизна. Впервые выявлена достоверная зависимость между общей бактериальной обсеменённостью, концентрацией молочнокислых бактерий и титром лактококкофагов в объектах производства творога, определены основные источники и интенсивность контаминации л актококко фагами объектов кисломолочного производства творога, что позволит объективно оценивать фаговую ситуацию на молокоперерабатывающих предприятиях.

Предложен новый научно - обоснованный эффективный метод выявления лактококкофагов в различных объектах кисломолочного производства, позволяющий точно определять источники и интенсивность контаминации производимой продукции лактококкофагами: в частности, подобрана тест-культура, использование которой обеспечивает высокую эффективность метода определения лактококкофагов.

Изучена динамика микрофлоры на различных этапах производства творога, что позволяет оценивать микробиологическую ситуацию и осуществлять профилактику развития возбудителей порчи и условно-патогенных микроорганизмов.

Практическая значимость работы. Разработана рабочая инструкция методов обнаружения бактериофагов, что даёт возможность быстро и эффективно проводить анализ и оценивать фаговую ситуацию на различных этапах кисломолочного производства творога.

В условиях молокоперерабатывающего предприятия определено санитарное состояние сырья, других объектов производства творога и даны практические рекомендации по его улучшению.

Предложен эффективный метод определения микроорганизмов в воздухе, позволивший значительно повысить выявляемость различных групп микроорганизмов.

Внедрён в производственную практику усовершенствованный метод дезинфекции производственных цехов и молочного оборудования, в результате чего уменьшается общая микробиальная обсеменённость и количество лактококкофагов в указанных объектах производства.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены и обсуждены на Международных научно-практических конференциях: «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, ветеринарно-санитарного контроля и биологической безопасности сельскохозяйственной продукции», (М., МГУПБ, 2004); «Живые системы и биологическая безопасность населения», (М., МГУПБ, 2006).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, выводы, практические предложения, список литературы, приложения. Диссертация содержит 22 рисунка, 17 таблиц. Список литературы включает 155 источников, в том числе 52 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. При исследовании микрофлоры заготовляемого сырого молока выявлено, что достоверно большее число хозяйств поставляли несортовое молоко и молоко второго сорта (53,3% и 41,3% соответственно).

Преобладающее число проб сухого обезжиренного молока, напротив, соответствовало требованиям СанПиН 2.3.2.1078-01.

2. Установлено, что основными источниками лактококкофагов в объектах кисломолочного производства творога являлись: сырое молоко 99,9%, бактофугированное молоко 84%, сырые сливки 75%. В твороге, заквашенной смеси, пастеризованном молоке, творожной сыворотке частота выявления лактококкофагов составила 73%, 69%, 65%, 55% соответственно. В смывах с оборудования, воздухе, сухом обезжиренном молоке, закваске частота обнаружении составила 28%, 18%, 12,6%, 7% соответственно. Титры лактококкофагов и колифагов в заготовляемом сыром и сухом обезжиренном молоке достоверно коррелировали с концентрацией соответствующих им бактерий и могут служить показателем санитарного состояния молока.

3. Определено, что наиболее эффективным методом выявления лактококкофагов являлся метод агаровых слоев. Частота выявления лактококкофагов этим методом составила от 60,0% - 83,3%.

4. Наибольшую чувствительность методам обнаружения лактококкофагов обеспечивало использование в качестве тест-объекта чистой культуры ЬасШсоссш 1асЙ8.

5. Выявлено достоверное снижение общей бактериальной обсеменённости после бактофугирования в среднем в 91 раз (97,8%), после пастеризации - в 822 раза (99,8%); уменьшение количества бактериальных спор после бактофугирования в среднем в 1,6 раза (38,2%), после пастеризации - в 3,9 раза (58,9%). Таким образом, пастеризация в сравнении с бактофугированием обеспечивает более эффективное снижение общей микробной обсемененности сырья, но статистически достоверное снижение содержания жизнеспособных спор наблюдали только в одной установке.

6. Установлено, что наиболее эффективным методом выявления микроорганизмов в воздухе являлся аспирационный метод исследования при помощи прибора MAS-100 Eco. Выявлено, что наиболее обсемененным являлся воздух транспортного коридора молокоперерабатывающего предприятия, далее по микробной обсеменённости и выявленных частиц лактококкофагов следовали диетцех, участок производства йогурта и участок производства творога.

7. Наиболее эффективной и экономически обоснованной являлась дезинфекция с использованием средства «Неосептал ПЕ-15» в концентрации рабочего раствора 0,12% с экспозицией 10 минут.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. С целью осуществления систематического мониторинга фаговой ситуации на молокоперерабатывающих предприятиях компании «Вимм-Билль-Данн» разработана и утверждена рабочая инструкция методов обнаружения бактериофагов, что позволяет своевременно выявлять бактериофаги, оценивать фаговую ситуацию и осуществлять профилактику экономических потерь, связанных с нарушением кисломолочного процесса при производстве продукции.

2. Предложен эффективный метод выявления микроорганизмов в воздухе производственных помещений при помощи прибора MAS-100 Eco, что позволяет быстро и качественно провести оценку санитарного состояния воздушной среды производственных цехов и вспомогательных помещений.

3. Внедрён в производственную практику усовершенствованный метод дезинфекции производственных цехов и молочного оборудования при помощи дезинфицирующего средства «Неосептал ПЕ-15».