Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Конструирование пробиотиков на основе генетически модифицированных штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis

На правах рукописи

КАШПЕРОВА ТАМАРА АРТУРОВНА

КОНСТРУИРОВАНИЕ ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ШТАММОВ BACILLUS SUBTILIS И BACILLUS LICHENIFORMIS

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2005

Работа выполнена в научно-исследовательском конструкторско-технологическом институте биологически активных веществ ФГУП государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор»

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Белявская Валентина Александровна

доктор химических наук, профессор

Малыгин Эрнст Георгиевич

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Юшков Юрий Георгиевич

ФГОУ ВПО Новосибирский государственный аграрный университет

Защита состоится « ^¿¿Ы?. 2005 г. в •/с&ч. на заседании

диссертационного совета Д.006.045.01 при ГНУ Институт экспериментальной, ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН по адресу: 630501, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, п. Краснообск, СО РАСХН, ИЭВСиДВ

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Широкое распространение резистентных форм микроорганизмов и снижение эффективности ряда антибиотиков нередко приводит к развитию дисбактериозов, частота которых растет /Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1997, 2000; Митрохин С.Д., 2004/. В промышленном птицеводстве желудочно-кишечные заболевания занимают второе место после вирусных и являются основной причиной гибели молодняка птицы /Панин А.Н., 2001/. Известно, что Европейский Союз запретил использование ряда антибиотиков в качестве стимуляторов роста и ограничил их применение с лечебно-профилактической целью для птицеводства /Башкиров О.Г., 2001/. В последние годы появились новые подходы к лечению дисбактериозов, связанные с восстановлением естественной экологии организма и основанные на использовании активных биологических продуктов. Одним из аспектов такого подхода является нормализация измененного микробного пейзажа организма при помощи бактерийных препаратов /Мирошник О.А., 1997; Бондаренко В.М. и др., 1998; Ouwerhand et al., 2002; Янковский Д.С. и др., 2004/.

Пробиотики составляют большой класс биопрепаратов, используемых для коррекции дисбактериоза и лечения диарейных заболеваний. В отличие от антибиотиков, они не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, безвредны, экологически чисты и не имеют противопоказаний для применения. Некоторые полезные свойства пробиотических штаммов бацилл делают их важным арсеналом совершенствования биопрепаратов. Прежде всего, это высокая ферментативная активность, позволяющая им регулировать и стимулировать пищеварение, способность оказывать противоаллергенное, антитоксическое действие и повышать неспецифическую резистентность макроорганизма /Сорокулова И.Б., 1997; Малик Н.И., Панин А.Н., 2001; Isolauri E. et al., 2002/. Антагонизм в отношении широкого круга патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, самостоятельная элиминация из желудочно-кишечного тракта, делает конструирование лечебно-

профилактических препаратов из пробиотических бацилл особенно перспективным. Среди существующих в настоящее время пробиотиков нет высокоэффективных средств, характеризующихся выраженной антивирусной активностью. В то же время известно, что заболевания вирусной и вирусно-бактериальной этиологии составляют значительную часть инфекционной патологии человека и животных. Вирусные инфекции, как правило, осложняются бактериальными и наоборот. Поэтому представляется весьма актуальной проблема разработки средств, характеризующихся одновременно антибактериальными и антивирусными свойствами. Для ее решения пробиотики используют в сочетании с различными иммуностимуляторами, антивирусными веществами и цитокинами, среди которых наиболее широко представлены препараты интерферона. Однако этот подход усложняет технологию производства и повышает цену, что часто делает такие комплексные препараты нерентабельными, поэтому в реальной практике они имеют ограниченное применение.

Альтернативой такому подходу является одно из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов -непосредственная модификация пробиотических штаммов путем клонирования генов антивирусных белков. Это направление в течение ряда лет широко разрабатывается в ГНЦ ВБ «Вектор», где были созданы штаммы микроорганизмов, продуцирующие цитокины, в частности В.тЫШя 2335/pBMB 105, продуцирующий альфа 2 -интерферон /Белявская В.А., 2002/. Созданный на его основе пробиотик Субалин, наряду с высокой антибактериальной активностью обладает антивирусными свойствами /Чудновская Н.В. и др., 1995; Белявская В.А. и др., 2002/. Следует отметить, что штамм В.тЫШя, составляющий основу препарата субалин, является строгим аэробом. А как известно, внутренние полости организма значительно различаются по уровню аэрации и имеют протяженные анаэробные участки. Эту проблему можно решить путем составления микробного консорциума из штаммов, дополняющих свойства друг друга. Поэтому разработка препаратов на основе генетически модифицированных микроорганизмов, способных осуществлять доставку в организм терапевтических

белков при оральном введении является весьма перспективной и актуальной задачей.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis, продуцирующего альфа 2 - интерферон для потенциальной его доставки в организм при оральном введении и создание консорциума из рекомбинантных штаммов Bacillus для нового пробиотического препарата. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- Сконструировать генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis, продуцирующий ИФН-а2 и изучить возможность его использования в качестве вектора доставки целевого белка в организм.

- Сконструировать на его основе микробный консорциум, включив дополнительно ранее созданный штамм B.subtilis для разработки пробиотического препарата с улучшенными свойствами.

- Разработать технологию изготовления препарата и получить опытные партии для проведения испытаний.

- Провести испытания эффективности опытных партий препарата в птицеводстве.

Научная новизна Впервые сконструирован и подробно исследован генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis 2336/рВМВ105, кодирующий ген интерферона человека типа альфа 2. Исследован консорциум рекомбинантных штаммов Bacillus и показана перспективность его использования для разработки нового пробиотического препарата с улучшенными свойствами. Разработан пробиотик субалин-форте и исследована его эффективность для повышения хозяйственно-экономических показателей при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Сибиряк».

По результатам проведенных исследований получены патенты РФ: «Штамм бактерий Bacillus licheniformis, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью» (№2172343, 1998) и «Пробиотический препарат комплексного действия» (№2159625, 1999).

Практическая значимость Предложен новый пробиотик субалин-форте для повышения хозяйственно-экономических показателей птицеводства. Сконструирован генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis 2336/pBMB105, продуцирующий интерферон, который может быть использован для разработки новых пробиотических препаратов. На основе материалов диссертации разработаны технические условия получения препарата субалин-форте.

Основные положения, выносимые на защиту

- рекомбинантный штамм Bacillus licheniformis 2336/pBMB 105, способный к стабильному поддержанию плазмиды, обеспечивающей экспрессию целевого белка с антивирусными свойствами (рекомбинантного интерферона) в условиях in vitro и in vivo;

- генетическая модификация - трансформация плазмидой рВМВ 105 с клонированным геном альфа 2 -интерферона не изменяет полезных свойств реципиентного штамма: антагонистичекой активности против широкого круга патогенных микроорганизмов и безвредности для теплокровных;

- разработана технология поверхностного культивирования рекомбинантных штаммов Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis, которая обеспечивает получение опытных партий препарата субалин-форте со стабильными характеристиками;

- применение препарата субалин-форте повышает хозяйственно-экономические показатели птицеводства.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: VIII международной конференции «Новые направления биотехнологии» (Москва, апрель 1998 г.); VIII международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии (Гурзуф, 2000); международной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» (Оболенск, май 2000 г.); I международной конференции "Актуальные проблемы производства и переработки продуктов животноводства и птицеводства" (Уфа, 2000); международной научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и

перспективы» (Киров, 2001); международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Качество» (Краснообск, февраль 2001 г.); 2-м московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г.).

Публикация результатов исследований По теме диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, 1 статья в международном сборнике, 11 работ- в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 135 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 196 источников, в том числе 120 иностранной литературы.

2 . МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты и методы исследований. В исследованиях использовали следующие культуры микроорганизмов: пробиотические штаммы Bacillus subtilis BD170, В. subtilis 2335 ВКПМ 4579, В. licheniformis ВКПМ В 2336; тест-культуры Salmonella typhimurium 174, Shigella sonnei, Candida albicans, Staphylococcus aureus 209 из музея ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г. Москва). А также генетически модифицированные штаммы, из музея ИККМ ГНЦ ВБ «Вектор» (пгт.Кольцово): В. licheniformis 2336/рВМВ105 (В-677); В. subtilis 2335/рВМВ105 (ВКПМ-4579 В-315); В. subtilis BD170/pBMB105 (B-319).

При создании модельных инфекций были использованы вирусы: герпеса П-го типа, штамм MS (Государственная коллекция вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г. Москва).

Всего в работе использовали 20 морских свинок, 40 мышей и 31984 цыплят-бройлеров кросса «Сибиряк». Все манипуляции с животными проводили с применением седативных средств в

соответствии с ветеринарным законодательством.

Эксперименты по молекулярному клонированию в бациллах проводили согласно /Гловер Д., 1988/ с собственными модификациями. Изменения были внесены в параметры (время, температура) инкубации с лизирующими агентами, связанные с особенностями клеточной стенки пробиотических штаммов.

Определение уровня синтеза интерферона клетками трансформированных бацилл проводили двумя методами: по ингибированию цитопатического действия вируса энцефаломиокардита (ЕМК) с использованием культуры клеток диплоидных фибробластов человека (ДФЧ-ДК-58) и иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием коммерческих наборов «ProCon IF2 plus», (г. Санкт-Петербург).

Стабильность плазмид в клетках бацилл изучали в экспериментах in vitro (при пассировании на культуральных средах) и оценивали по доле клеток, сохранивших исходную плазмиду. После пассажей проводили рассев культуры для получения изолированных клонов на агаризованной среде без антибиотиков. У 100-200 случайно отобранных клонов определяли сохранность фенотипа, детерминируемого наличием плазмиды (Kmr, INF+). Сохранность встройки гена интерферона (структурную стабильность) определяли рестрикционным (по появлению рестрикционного PstI - EcoRI фрагмента длиной 700 н.п.), гибридизационным и ПЦР анализами. Стабильность рекомбинантных плазмид в трансформированных штаммах оценивали при пассировании на жидкой питательной среде LB /Маниатис Т. и др., 1984/ без антибиотика. Для этого 5 мкл ночной культуры исследуемых штаммов вносили в 5 мл свежей питательной среды и оставляли при 37°С в термостате до утра. Одно суточное выращивание (пассаж) соответствует примерно 1214 клеточным генерациям /Denich К. et al., 1993/. Операцию повторяли десятикратно. Через I, 3, 5, 10 пассажей проводили высевы культуры на твердую питательную среду и определяли процентное количество бактерий, сохранивших плазмиду.

Изучение антогонистических свойств у рекомбинантного штамма проводили методами отстроченного антогонизма -

радиальных и перпендикулярных штрихов, и агаровых блочков /Егоров Н.С., 1979/. Для культивирования штамма-антагониста были использованы следующие среды: среда Гаузе2, сусло-агар, и картофельный агар.

Патогенность, вирулентность и токсичность сконструированного штамма В.ИсИеш/огтгз 2336/pBMB105 изучали по методу Биргер М.О. (1982) на белых мышах при внутрибрюшинном, подкожном и пероральном введении 24 часовой культуры, выращенной на МПА или агаризованной среде Гаузе 2 с канамицином (10-20 мкг/мл). По истечении срока наблюдения животных умерщвляли, вскрывали и органы подвергали макроскопическому исследованию. Исследования проводили совместно с ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г. Москва).

Антивирусную активность рекомбинантного штамма изучали совместно с лабораторией Игнатьева Г.М. (ГНЦ ВБ «Вектор», пгт. Кольцово) на модельных инфекциях лабораторных животных (морские свинки). Исследуемые штаммы В.ИсИеш/огтгз (рекомбинантный, ИФН+ и реципиентный, ИФН-) в дозе 109 кл/мл вводили перорально, за сутки до заражения. Контрольным животным вводили 0,85%-ый раствор ^О.

Исследование эффективности субалина-форте в птицеводстве исследовали на цыплятах-бройлерах кросса «Сибиряк». Выращивание цыплят с суточного до 42-дневного возраста осуществлялось в клеточных батареях типа БКМ-3Б. Технологические параметры выращивания бройлеров по плотности посадки, фронту кормления и поения, температурному и световому режимам соответствовали нормам, принятым в хозяйстве. В схему кормления были включены антибиотики. Пробиотики давали с водой. Предварительно готовили препарат: 5 г сухого концентрата, содержащего (8,5± 1,5) х 1011 к.о.с/г растворяли в 500 мл питьевой воды, тщательно перемешивая. Полученную гомогенную суспензию выливали в специальный бак, емкостью 80 л. Таким образом, на каждого цыпленка в среднем приходилось 0,02 дозы препарата (1 доза составляет 5,0 х 109 к.о.е.). Клетки батареи БКМ-ЗМ оборудованы ниппельными поилками. На время выпаивания пробиотиков бак подключали к системе поилок. Цыплята выпивали

воду в течение 2-3 часов, после чего поилки подключали к системе водоснабжения. Препараты давали двумя курсами по 5 дней: первый курс проводили в первую неделю жизни, второй - с 28-30 дня жизни цыплят.

Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента/Лакин Г.Ф., 1980/.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis 2336/рВМВ105 для разработки нового пробиотического препарата

В работе использовали плазмиду рВМВ105, сконструированную в ГНЦ ВБ «Вектор» /Красных В.Н. и др., 1984; Щелкунов С. Н., 1986/, структура которой представлена на рисунке 1. Плазмида содержит химико-синтетический аналог гена интерферона человека типа альфа 2 /Колосов В.Н. и др., 1984/.

Рисунок 1. Рестрикционная и генетическая карта плазмиды рВМВ 105

Примечание: Ра - промотор гена альфа-амилазы; область Шайна-Дальгарно (Shine-Dalgarno); HuIFa2 ~ ген ИФЖх 2 человека; КшЯ - ген устойчивости к канамицину.

В качестве бактериального вектора доставки интерферона в организм был выбран пробиотический штамм Bacillus licheniformis 2336. Этот штамм широко применяется в медицине и ветеринарии в составе препаратов биоспорин и бактерин-SL, является хорошо изученным и безвредным для человека, теплокровных животных и окружающей среды /Смирнов В.В., 1993; Сорокулова И.Б., 1997/.

Нами была проведена трансформация компетентных клеток штамма Bacillus licheniformis 2336 плазмидой рВМВ 105 /Клонирование ДНК. Методы, 1988/. Сравнительная эффективность трансформации различных штаммов бацилл представлена в таблице 1.

Таблица 1 - Сравнительная эффективность трансформации

компетентных клеток штаммов Bacillus плазмидой рВМВ 105

Штамм Эффективность трансформации, (на 1 мкг ДНК)

Bacillus subtilis BD 170 (6,7±0,5)х104

Bacillus subtilis 2335 (4,0±0,8)х102

Bacillus licheniformis 2336 (2,0±0,1)х102*

* Примечание: использовали 10 мкг плазмидной ДНК

Эффективность трансформации штамма В. НсИет/огт1з 2336 была на два порядка ниже, по сравнению с лабораторным штаммом В. тЫШя ВБ170, что возможно, связано с эндонуклеазной активностью и/или с особенностью репликации плазмиды рВМВ105 на молекулярном уровне в клетках В.ИсИеш/огтгз. Анализ трансформантов показал, что в исследуемых клетках пробиотических штаммов (для анализа брали не менее 10 клонов от каждого из них) присутствовала плазмидная ДНК, которая не отличалась по молекулярной массе и данным рестрикционного анализа от плазмиды рВМВ 105.

Синтез интерферона пробиотическими штаммами бацилл анализировали в образцах супернатантов культуральной жидкости, так как именно появление внеклеточного интерферона создает предпосылки для его биологических эффектов в организме при введении в составе реплицирующегося вектора. В таблице 2 приведены данные по уровню экспрессии клонированных генов в трансформированных штаммах бацилл.

Таблица 2 - Сравнительная характеристика трансформантов пробиотических штаммов по уровню экспрессии клонированных генов_

Штаммы Экспрессия клонированных генов

интерферон, МЕ/мл к.ж. Канамицин-трансфераза (по МИКкт), мкг/мл

По цитологическому действию По ИФА

В.хиЬиШ ВВ170/рВМВ105 (1,3±0,9)х104 (3,1±1,3)х104 520±10

В.Нскет/огт1з 233б/рВМВ105 (3,4±1,8)х102 не определяли 50±2

ВМскет/огт15 2336 (контроль) отсутствует отсутствует <0,5

В.зиЫШя 2335/рВМВ105 (5,(Ш,6)х1(У (2,3±0,4)х104 1050±20

Представленные в таблице 2 результаты свидетельствуют о том, что все трансформированные штаммы были способны осуществлять синтез внеклеточного интерферона на уровне 102-104 МЕ/мл, и уровень синтеза зависел от штамма реципиента. Это, вероятно связано с репликационными, экспрессионными, а также физиологическими особенностями штаммов. Значения уровня синтеза интерферона у B.licheniformis 2336/pBMB105 были ниже, чем у лабораторного штамма Б.зиЫШэ BD170/pBMB105 и Б.зиЫШэ 2335/рВМВ105. Следует отметить, что наблюдалась корреляция между уровнем синтеза целевого белка и значением минимальной ингибирующей концентрации канамицина (МИКкm).

При исследовании стабильности плазмиды, экспрессии гена интерферона и жизнеспособности клеток в штамме В.lichehiformis 2336/рВМВ105 была обнаружена значительная гетерогенность популяции по этим признакам, свидетельствовавшая о необходимости стабилизации клеточного состава

трансформированного штамма для создания на его основе лечебно-профилактического препарата.

Для стабилизации штамма B.licheniformis 2336/pBMB105 использовали комплекс факторов: пассирование клеток при повышенной температуре 39°С с последующим посевом на твердую агаризованную среду, содержащую предельную концентрацию канамицина (50 мкг/мл) и лиофильную сублимацию культуры для отсева ослабленных клеток и спор. Таким образом был получен селекционный вариант трансформированного штамма, в котором произошла стабилизация популяции по полезным признакам.

Одним из основных требований, предъявляемых к штаммам для пробиотических препаратов, является антагонистическая активность по отношению к патогенным и условнопатогенным микроорганизмам, обусловленная способностью продуцировать антибиотические и другие биологически активные вещества антимикробного действия /Бондаренко В.М., Горская Е.М., 1992; Nemcova R., 1997/. Поэтому после трансформации плазмидой рВМВ105 реципиентного штамма B.licheniformis 2336 необходимо было проверить сохранность антагонистических свойств у рекомбинантного штамма.

В экспериментах in vitro было показано, что штамм B.licheniformis 2336/pBMB105 обладает выраженной специфической активностью в отношении ряда тест-культур патогенных и условнопатогенных штаммов (таблица 3).

Таблица 3 - Сравнительная антагонистическая активность пробиотических штаммов бацилл_

Штамм-антагонист антагонистическая активность по отношению к стандартным тест-культурам, по зоне подавления роста, мм

Shigella sonnei Salmonella typhimurium 174 Staphylococcus aureus 209 Candida albicans

B.subtilis 2335 18-23 15-18 24-26 21-23

B.licheniformis 2336 6-9 6-9 7-9 11-12

B.licheniformis 2336/рВМВ105 6-10 6-9 5-8 10-12

Из данных таблицы 3 видно, что рекомбинантный штамм B.licheniformis 2336/pBMB105 сохранил антагонистические свойства реципиентного штамма по отношению к патогенным и условнопатогенным культурам, но они менее выражены, чем у штамма B.subtilis 2335, составляющего основу препарата субалин.

Антивирусные свойства рекомбинантного штамма B.licheniformis 2336/рВМВ105 исследовали на модельной инфекции герпеса II типа морских свинок. Выбор инфекции был обусловлен прежде всего, ее высокой чувствительностью к лечению и профилактике препаратами интерферона /Чудновская Н.В. и др., 1995; Adams О. et al., 2004/, а также известными данными о том, что герпес часто является причиной развития вторичных бактериальных инфекций /Whitley RJ. et al., 2001/. Было показано, что защитное противовирусное действие у трансформированного штамма (per os + аппликация) в 2 раза выше по сравнению с реципиентным. Эти данные подтверждают, что B.licheniformis 2336/рВМВ105 способен продуцировать ИФН в условиях in vivo, создавая потенциальные возможности проявления его антивирусной активности.

3.2. Создание консорциума генетически модифицированных штаммов Bacillus для препарата субалин-форте

При составлении консорциума из генетически модифицированных микроорганизмов рода Bacillus, продуцирующих ИФН-а, для повышения эффективности доставки целевого белка к различным участкам слизистых поверхностей ЖКТ использовали принцип комплементарности.

Известно, что отделы ЖКТ различаются по уровню аэрации. Штамм В. licheniformis 2336 является факультативным анаэробом в отличие от строго аэробного штамма В. subtilis 2335. Особенности физиологии роста трансформантов данных штаммов изучали в условиях периодического культивирования с использованием среды Спицайзена. Уровень концентрации растворенного кислорода задавали путем изменения оборотов качалки (п=50; 150 об/мин). В условиях недостатка кислорода (n=50) у В. licheniformis

2336/рВМВ 105 наблюдали равномерный глубинный рост со значительным для таких условий выходом по влажной биомассе -(3,5±0,3) г/л. Для В. subtilis 2335/pBMB 105 в этих условиях отметили лишь слабый рост со значительным автолизом клеток, выход по биомассе составил лишь (2,0±0,3) г/л. При энергичном массообмене кислорода (n=150 об/мин) у обоих штаммов наблюдали интенсивный глубинный рост с максимальным выходом по влажной биомассе, но урожайность В. subtilis 2335/pBMB 105 была выше и составила (7,5±0,8) г/л, для В. licheniformis 2336/рВМВ105 - (5,8±0,7) г/л. Изучение синтеза целевого белка трансформированными штаммами в условиях различной аэрации продемонстрировало, что при недостатке кислорода продуктивность факультативного анаэроба В. licheniformis 2336/рВМВ 105 была выше, чем аэробного штамма В. subtilis 2335/рВМВ105. Это свидетельствовало о способности обоих штаммов дополнять друг друга в микробном консорциуме, осуществляя синтез ИФН в различных биотопах ЖКТ, что создает предпосылки пролонгированного действия ИФН и, как следствие, повышения его специфической активности.

Жизнеспособность клеток бацилл как спорообразующих бактерий в значительной степени зависит от эффективности прорастания спор /Nicholson WL, 2002/. Время периода «скрытого прорастания» варьирует в зависимости от вида бактерий и температуры среды. Впоследствии прорастающая спора становится чувствительной и к другим факторам, таким как уровень аэрации, неоптимальные значения которой приводят к замедлению роста и автолизу /Амбулос Н., 1992/. Исследование эффективности прорастания спор при различных уровнях аэрации показало, что в условиях недостатка кислорода (n=50) прорастающие споры В. subtilis подвергаются автолизу, в то время как споры ß.licheniformis 2336 активно образуют вегетативные клетки, увеличивая численность популяции.

Для оценки антагонистической активности консорциума из двух штаммов Bacillus мы провели эксперимент по «смешанному» культивированию штаммов-антагонистов с тест-культурой Salmonella typhimurium 174 в условиях различной аэрации на среде,

оптимальной для роста обеих культур (рисунок 2). На рисунке 2 видно, что антагонистическая активность такого строгого аэроба, каким является B.subtilis 2335, была максимальной в оптимальных для роста условиях (рисунок 2С). При уменьшении аэрации антагонистическая активность уменьшается, а при n=0 как и следовало ожидать, отсутствует. В то же время, в этих условиях B.licheniformis 2336 подавляет рост клеток тест-культуры, благодаря способности осуществлять свою жизнедеятельность и антагонистическую активность в условиях с пониженным содержанием кислорода.

3.3. Технология получения препарата субалин-форте

С целью оценки эффективности консорциума двух генетически модифицированных штаммов Bacillus как основы нового пробиотического препарата необходимо было разработать технологию его получения. С учетом опыта получения препарата субалин методом поверхностного культивирования, было наработано пять опытных серий препарата субалин-форте, характеристики которых отражены в таблице 4.

Рисунок 2. Влияние уровня аэрации на антагонистическую активность бацилл при «смешанном» культивировании с тест-культурой Salmonella typhimurium 174. А — п=0; В — п=50; С—п=150, где п—число оборотов качалки

На основе анализа полученных данных был разработан проект технических условий получения пробиотика субалин-форте ТУ 9383-021-00479979-01.

Таблица 4 - Характеристика опытных серий препарата субалин-форте _ _ _

Наименование показателя Серия 011098 Серия 021198 Серия 030299

Внешний вид препарата Пористая масса молочно-белого цвета Пористая масса кремоватого цвета Пористая масса молочно-белого цвета

Специфическая (антагонистическая) активность по зоне подавления роста, мм Sh. sonnei -7-8; S.typhimurium -8-9; St. aureus -7-8; C.albicans -1112 Sh. sonnei -8-9; S.typhimurium -7-8; St. aureus -6-7; C.albicans -1012 Sh. sonnei -7-9; .typhimurium -6-8; St. aureus -7-8; C.albicans -12

Растворимость Хорошо растворим в воде и физиологическом растворе

рН водного раствора 7,0 ±0,1 7,1 ±0,1 7,1 ± 0,2

Количество микробных клеток в одной дозе: В.Искет/огтя 2336/рВМВ105 В.яиЫШ$ 2335/рВМВ105 (1,2±0,3)х109 (4,9±0,7)х109 (0,9±0,2)xl09 (4,8±0,8)xl09 (l,0±0,4)xl09 (5,2±0,6)xl09

Подлинность Содержит культуры: B.subtilis 2335/рВМВ 105 и B.licheniformis 2336/рВМВ 105

Массовая доля влаги, % 3,7 ±0,7 | 3,1 ±0,3 | 3,6 ±0,6

Контаминация посторонней микрофлорой Не содержит посторонней микрофлоры

Данный метод отличается простотой, позволяет получать препарат со стабильными характеристиками и высокой степенью сохранности плазмидной ДНК, что особенно важно при

культивировании трансформированных штаммов. Вместе с тем он не поддается автоматизации и является достаточно трудоемким, что, в конечном итоге, сказывается на себестоимости препарата. Использование метода глубинного культивирования позволит избежать указанных недостатков и повысить рентабельность производства. В связи с этим было проведено исследование параметров роста и сохранности плазмиды рекомбинантного штамма при периодическом культивировании в селективных (в присутствии антибиотика в среде культивирования) и неселективных условиях. Было показано, что рекомбинантный штамм имеет более низкие параметры роста в сравнении с реципиентным во всех условиях культивирования. В то же время сохранность плазмиды была максимально высокой - (94,8±5,5)% при выращивании в неселективных условиях в сравнении с селективными - (77,6±2,4)% при содержании канамицина в среде 20 мкг/мл. Следует отметить, что для разработки технологии получения препарата методом глубинного культивирования необходимы дополнительные эксперименты по масштабированию процесса.

3.4 Эффективность пробиотика субалин-форте в птицеводстве

Исследование эффективности нового пробиотического препарата субалин-форте, сконструированного на основе рекомбинантных штаммов Bacillus, проводили на цыплятах-бройлерах кросса «Сибиряк» в условиях промышленного выращивания. С этой целью были сформированы опытная и контрольная группы. Препарат субалин-форте давали с водой из расчета 0,02 дозы на голову, что соответствует 5,0 х 107 к.о.е., двумя курсами, продолжительностью пять дней каждый. Первый курс проводили в первую неделю жизни, второй - с 26-28 суточного возраста, так как известно, что в эти периоды жизни молодняка закономерно снижается естественная резистентность и иммунная реактивность /Панин А.Н. и др., 1998/. Учет прироста живой массы проводили еженедельно, сохранность поголовья определяли по окончании эксперимента. Было показано, что

применение субалина-форте повышает сохранность поголовья до 3%, увеличивает прирост живой массы на 9,6%. Прибыль и уровень рентабельности производства мяса цыплят-бройлеров возросли на 45,8% и 19,5% соответственно (таблица 5).

Таблица 5 - Экономические показатели применения субалина-

форте

N п/п Показатели Контрольная группа Опытная группа

1 Продолжительность опыта, дни 42 42

2 Поголовье на начало опыта, голов 6000 6000

3 . Сохранность поголовья, % голов 93,7 5622 96,7 5802

4 Среднесуточный прирост массы, г 38,8 43,3

5 Убойная масса, кг 5670,35 6582,95

6 Реализационная цена мяса, руб. 34 34

7 Выручка от реализации, тыс. руб. 1927 2238

8 Прибыль, тыс. руб. 723,7 991,8

9 Уровень рентабельности, % 60,1 79,5

В дальнейшем было проведено сравнение эффективности двух пробиотических препаратов на основе рекомбинантных штаммов Bacillus - субалина и субалина-форте. Препарат субалин в этом случае служил положительным контролем, так как его эффективность в птицеводстве была показана ранее /Белявская В.А., 2002/. Были сформированы две опытных и одна контрольная

группы цыплят по 8640 голов каждая. Условия эксперимента соответствовали описанным выше. Полученные результаты показали, что сохранность цыплят и среднесуточные привесы в опытных группах были выше, чем в контрольной группе. Для препарата субалин среднесуточные привесы увеличились на 5,5% по сравнению с контрольной группой, для субалина-форте - на 14,7%. Сохранность цыплят в обеих контрольных группах превышала таковую в контрольной группе. Рентабельность производства и прибыль у препарата субалин-форте были выше, чем у препарата субалин и составили 19,5% и 45,8% против 7,9% и 21,3% соответственно. Таким образом, субалин-форте оказался более эффективным по сравнению с препаратом субалин.

ВЫВОДЫ

1. Сконструирован пробиотический штамм B.licheniformis 2336/рВМВ 105, способный продуцировать интерферон альфа 2 человека.

2. Показано, что полученный трансформированный штамм стабильно сохраняет плазмиду, обеспечивая экспрессию целевого белка в условиях in vitro и in vivo.

3. Экспериментально показано, что генетическая модификация - наличие плазмиды рВМВ 105, кодирующей синтез интерферона альфа 2 человека, не изменила полезных антагонистических свойств реципиентного штамма и обеспечила рекомбинантному штамму способность к синтезу интерферона, что создает предпосылки для проявления антивирусной активности.

4. Экспериментально показано, что пробиотический штамм B.licheniformis 2336 является перспективным для составления микробного консорциума со штаммом B.subtilis 2335, так как дополняет свойства последнего. Сконструированный на его основе рекомбинантный Bacillus licheniformis 2336/рВМВ 105 способен к росту и продукции целевого белка в условиях недостатка кислорода. Это обеспечивает эффективность действия препарата субалин-форте в отделах жкт с различной степенью аэрации.

5. Разработана технология и проект технических условий получения пробиотического препарата субалин-форте методом поверхностного культивирования с последующим лиофильным высушиванием.

6. Экспериментально показана эффективность применения препарата субалин-форте при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Сибиряк». Субалин-форте повышает сохранность птицы до 3%, прирост живой массы - до 9,6%, прибыль и уровень рентабельности - на 48,5% и 19,5% соответственно.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние интродукции генетически модифицированных микроорганизмов (ГММО) на микроэкологию желудочно-кишечного тракта теплокровных / Соавт.: В.А. Белявская, Н.Г. Ромашова, Л.К. Федосова, И.Б. Сорокулова // Новые направления биотехнологии: Тез.докл. 8-й конф. - М., 1998. - С. 103.

2. Интродукция популяций плазмидного и бесплазмидного штаммов Bac.subtillis в лабораторные водные микрокосмы с различной длиной трофической цепи / Т.Ю. Крылова, Л.Ю. Попова,

A.А. Шитц, В.А. Белявская // Новые направления биотехнологии: Тез.докл. 8-й конф., - М., 1998. - С. 108.

3. Экспериментальный подход к оценке плазмидного профиля аборигенной микрофлоры модельных и природных экосистем / Соавт.: Т.Н. Лобова, Е.Е. Максимова, Л.Ю. Попова, В.А. Белявская // Новые направления биотехнологии: Тез.докл. 8-й конф. -М, 1998. -С. 109.

4. Патент РФ № 2172343 Штамм бактерий Bacillus licheniformis, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью. -1998 / Белявская В.А., Кашперова Т.А., Сорокулова И.Б., Смирнов

B.В., Ильичев А.А., Панин А.Н., Малик Н.И., Сандахчиев Л.С.

5. Патент РФ № 2159625 Пробиотический препарат комплексного действия. - 1999 / Белявская В.А., Сорокулова И.Б., Ромашова Н.Г., Кашперова Т.А., Масычева В.И., Ильичев А.А., Щелкунов С.Н., Данилюк Н.К., Нестеров А.Е., Сандахчиев Л.С, Смирнов В.В., Петренко В.А., Красных В.Н. / БИ N 33 от 27.11.00.

6. Изучение гетерогенности в популяциях плазмидсодержащего и бесплазмидного штаммов Bacillus subtilis в разных условиях существования / Соавт.: Т.Ю. Крылова, Л.Ю. Попова, Н.С. Печуркин, В.А. Белявская // Микробиология.- 2 000. - Т.69, № 2. -

C.270-273.

7. Многоуровневое исследование экологической безопасности генно-инженерно-модифицированных Bacillus subtilis с использованием модельных экосистем / Соавт.: В.А. Белявская, Л.Ю. Попова, И.Б. Сорокулова, Н.И. Малик // Новые информационные технологии в медицине и экологии: 8-я

междунар.конф.и дискус. Науч.клуб, Гурзуф - Запорожье, 2000. -С.103, J.13.

8. Применение субалина в промышленном птицеводстве бройлерного направления / Соавт.: В.А. Белявская, Н.С. Хрусталева, К.Я. Мотовилов // Актуальные проблемы производства и переработки продуктов животноводства и птицеводства: Сб. научных трудов по материалам Первой Междунар. конф. (Уфа, 1718 окт. 2000 г.). - Уфа, 2000. - С.150-153.

9. Экспериментальная оценка биобезопасности генно-инженерно-модифицированных Bacillus subtilis с использованием модельных экосистем /Соавт.: В.А. Белявская, Л.Ю. Попова, И.Б. Сорокулова, Н.И. Малик // Проблемы биологической и экологической безопасности: Междунар. конф., Тез.докл.: - Оболенск, 2000. -С.357-358.

10. Экспериментальная оценка биобезопасности генно-инженерных бактерий на модели штамма Bacillus subtilis, продуцирующего интерферон альфа 2 человека / Соавт.: В.А. Белявская, В.М. Бондаренко, А.А. Ильичев и др. // Журн. Микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001. - №2. - С. 16-20.

11. Опыт применения нового пробиотика субалина-форте на основе Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis в промышленном птицеводстве /Соавт.: В.А. Белявская, Н.С. Хрусталева, К.Я. Мотовилов //Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы: Материалы научно-практической конф. (Киров, 22-23 мая 2001 г.). - Киров, 2001. - С. 31-32.

12. Опыт применения препарата субалин в профилактике диарей и стресса в промышленном птицеводстве / Соавт.: В.А. Белявская, Н.С. Хрусталева, К.Я. Мотовилов // Пища. Экология. Качество: Сб. материалов междунар. научно-практической конф. (Краснообск, 26-27 февраля 2001 г.). - Новосибирск, 2001. - С. 87-88.

13. Испытание нового пробиотика субалина-форте в промышленном птицеводстве / Соавт.: В.А. Белявская, Н.С. Хрусталева, К.Я. Мотовилов // Пища. Экология. Качество: Сб. материалов междунар. научно-практической конф. (Краснообск, 26-27 февраля 2001 г.). - Новосибирск, 2001. - С.89.

14. Применение пробиотических препаратов в промышленном птицеводстве /Соавт.: Н.С. Хрусталева, О.М. Незнамова //Труды НГАУ, Новосибирск, 2003. - С.277-281.

15. Биотехнологические аспекты конструирования генетически модифицированных микроорганизмов для создания лечебно-профилактических препаратов / Соавт.: В А Белявская, В.И. Масычева // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы 2-го московского междунар. конгресса, (Тез.докл.): В 2-х ч.-М., 2003.- Ч.1. -С.96.

16. Конструирование генетически модифицированных микроорганизмов для разработки нового поколения иммунобиологических и вакцинных препаратов / Соавт.: Н.Г. Ромашова, А.В. Нестеров, Л.Р. Лебедев, ВА Белявская // Биотехнология. - 2004. - № 5. - С.39-48.

17. Biotechnological aspects of designing genetically modified microorganisms / Co-auth.: VA. Belyavskaya, L.R. Lebedev, V.I. Masycheva // Biotechnology and Medicine editor G.E. Zaikov et al.-Nova Science Publishers, Inc., New York.- 2004.- P.107-119.

07 МАЙ 2005 718

Актуальность темы Основной проблемой последних лет является увеличение числа резистентных к антибиотикам инфекций и снижение эффективности ряда антибиотиков. Распространение бактерий, устойчивых к антибиотикам, влечет за собой массовую аллергизацию больных и развитие дисбактериозов, частота которых быстро растет /Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1997, 2000; Митрохин С.Д., 2004/.

В последние годы появились новые подходы к лечению дисбактериозов, связанные с восстановлением естественной экологии организма и основанные на использовании активных биологических продуктов. Одним из аспектов такого подхода является нормализация измененного микробного пейзажа организма при помощи бактерийных препаратов /Мирошник О.А., 1997; Бондаренко В.М. и др., 1998; Янковский Д.С. и др., 2004/.

В настоящее время в клинической практике в качестве средств лечения и профилактики острых кишечных инфекций, дисбактериозов различной этиологии и стресса широко используются биопрепараты из живых микробных культур - пробиотики. В отличие от антибиотиков, они не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору, безвредны, экологически чисты и не имеют противопоказаний для применения. Основой пробиотиков являются либо микроорганизмы, представляющие нормальную микрофлору, либо не характерные для нормофлоры сапрофиты, способные вытеснять патогенные микроорганизмы из просвета кишечника. Пробиотические штаммы бацилл являются неадгезивными транзисторными представителями микрофлоры кишечника. Некоторые полезные свойства делают их важным арсеналом совершенствования биопрепаратов. Прежде всего, это высокая ферментативная активность, позволяющая им существенно регулировать и стимулировать' пищеварение, а также способность оказывать противоаллергенное, антитоксическое действие и повышать неспецифическую резистентность макроорганизма /Сорокулова И.Б., 1998;

Oggioni M.R. et al., 2003; Ouwehand AC. et al., 2003/. Антагонизм в отношении широкого круга патогенных и условнопатогенных микроорганизмов и самостоятельная элиминация из желудочно-кишечного тракта, делает конструирование лечебно-профилактических препаратов из пробиотических бацилл особенно перспективным.

Среди существующих в настоящее время пробиотиков нет высокоэффективных средств, характеризующихся выраженной антивирусной активностью. В то же время известно, что заболевания вирусной и вирусно-бактериальной этиологии составляют значительную часть инфекционной патологии человека и животных. Вирусные инфекции, как правило, осложняются бактериальными и наоборот. Поэтому представляется весьма актуальной проблема разработки средств, характеризующихся одновременно антибактериальными и антивирусными свойствами. Для ее решения пробиотики используют в сочетании с различными иммуностимуляторами, антивирусными веществами и цитокинами, среди которых наиболее широко представлены препараты интерферона. Однако этот подход усложняет технологию производства и повышает цену, что часто делает такие комплексные препараты нерентабельными, поэтому в реальной практике они имеют ограниченное применение.

Альтернативой такому подходу является одно из перспективных направлений разработки новых биопрепаратов - непосредственная модификация пробиотических штаммов путем клонирования генов антивирусных белков. Это направление в течение ряда лет широко разрабатывается в ГНЦ ВБ «Вектор», где были созданы штаммы микроорганизмов, продуцирующие цитокины, в частности Bacillus subtilis 2335/рВМВ 105, продуцирующий альфа 2 -интерферон /Патент РФ № 1839459/. Созданный на его основе пробиотик Субалин, наряду с высокой антибактериальной активностью обладает антивирусными свойствами /Чудновская Н.В. и др., 1995; Белявская В.А. и др., 2002/. Следует отметить, что штамм В.subtilis,составляющий основу препарата субалин, является строгим аэробом. А как известно, внутренние полости организма значительно различаются по уровню аэрации и имеют протяженные анаэробные участки. Эту проблему можно решить путем составления микробного консорциума из штаммов, дополняющих свойства друг друга. Поэтому разработка препаратов на основе генетически модифицированных микроорганизмов, способных осуществлять доставку в организм терапевтических белков при оральном введении является весьма перспективной и актуальной задачей.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы явилось конструирование генетически модифицированного штамма Bacillus licheniformis, продуцирующего альфа 2 - интерферон для потенциальной его доставки в организм при оральном введении и создание консорциума из рекомбинантных штаммов Bacillus для нового пробиотического препарата. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

Сконструировать генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis, продуцирующий ИФН-а2 и изучить возможность его использования в качестве вектора доставки целевого белка в организм.

- Сконструировать на его основе микробный консорциум, включив дополнительно ранее созданный штамм B.subtilis для разработки пробиотического препарата с улучшенными свойствами.

- Разработать технологию изготовления препарата и получить опытные партии для проведения испытаний.

- Провести испытания эффективности опытных партий препарата в птицеводстве.

Научная новизна Впервые сконструирован и подробно исследован генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis 2336/рВМВ105, кодирующий ген интерферона. Исследован консорциум рекомбинантных штаммов Bacillus и показана перспективность его использования для разработки нового пробиотического препарата с улучшенными свойствами.

Разработан пробиотик субалин-форте и исследована его эффективность для повышения хозяйственно-экономических показателей при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Сибиряк».

По результатам проведенных исследований получены патенты РФ: «Штамм бактерий Bacillus licheniformis, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью» (№2172343, 1998) и «Пробиотический препарат комплексного действия» (№2159625, 1999).

Практическая значимость Предложен новый пробиотик субалин-форте для повышения хозяйственно-экономических показателей птицеводства. Сконструирован генетически модифицированный штамм Bacillus licheniformis 2336/рВМВ105, продуцирующий интерферон, который может быть использован для разработки новых пробиотических препаратов. На основе материалов диссертации разработаны технические условия получения препарата субалин-форте.

Основные положения, выносимые на защиту

- рекомбинантный штамм Bacillus licheniformis 2336/рВМВ 105, способный к стабильному поддержанию плазмиды, обеспечивающей экспрессию целевого белка с антивирусными свойствами (рекомбинантного интерферона) в условиях in vitro и in vivo;

- генетическая модификация - трансформация плазмидой рВМВ 105 с клонированным геном альфа 2 -интерферона не изменяет полезных свойств реципиентного штамма: антагонистичекой активности против широкого круга патогенных микроорганизмов и безвредности для теплокровных;

- разработана технология поверхностного культивирования рекомбинантных штаммов Bacillus licheniformis и Bacillus subtilis, которая обеспечивает получение опытных партий препарата субалин-форте со стабильными характеристиками; применение препарата субалин-форте повышает хозяйственно-экономические показатели птицеводства.

Апробация работы Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях: VIII международной конференции «Новые направления биотехнологии» (Москва, апрель 1998 г.); VIII международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии (Гурзуф, 2000); международной конференции «Проблемы биологической и экологической безопасности» (Оболенск, май 2000 г.); I международной конференции "Актуальные проблемы производства и переработки продуктов животноводства и птицеводства" (г.Уфа, 2000); международной научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001); международной научно-практической конференции «Пища. Экология. Качество» (Краснообск, февраль 2001 г.); 2-м московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003 г.).

Публикация результатов исследований По теме диссертации опубликовано 3 статьи в научных журналах, 1 статья в международном сборнике, 11 работ в материалах российских и международных конференций.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 141 странице. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложений. Иллюстрирована 16 таблицами и 10 рисунками. Список литературы включает 205 источников, в том числе 128 иностранной литературы.

ВЫВОДЫ t

1. Сконструирован пробиотический штамм В.licheniformis 2336/рВМВ 105, способный продуцировать рекомбинантный интерферон человека типа альфа 2.

2. Показано, что полученный рекомбинантный штамм стабильно сохраняет плазмиду, обеспечивая экспрессию целевого белка в условиях in vitro и in vivo.

3. Экспериментально показано, что генетическая модификация - наличие плазмиды рВМВ 105, кодирующей синтез интерферона альфа 2 человека, не изменила полезных антагонистических свойств реципиентного штамма и обеспечила рекомбинантному штамму способность к синтезу интерферона, что создает предпосылки для проявления антивирусной активности.

4. Экспериментально показано, что пробиотический штамм В.licheniformis 2336 является перспективным для составления микробного консорциума со штаммом B.subtilis 2335, так как дополняет свойства последнего. Сконструированный на его основе рекомбинантный Bacillus licheniformis

Ф 2336/рВМВ 105 способен к росту и продукции целевого белка в условиях недостатка кислорода. Это обеспечивает эффективность действия препарата субалин-форте в отделах ЖКТ с различным уровнем аэрации.

5. Разработаны технология и проект технических условий получения пробиотического препарата субалин-форте методом поверхностного культивирования с последующим лиофильным высушиванием.

6. Экспериментально показана эффективность применения препарата Ш субалин-форте при выращивании цыплят-бройлеров кросса «Сибиряк». Субалинфорте повышает сохранность птицы до 3%, прирост живой массы - до 9,6%, прибыль и уровень рентабельности - на 48,5% и 19,5% соответственно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итоги анализа литературных данных, следует подчеркнуть, что пробиотики, в том числе и на основе Bacillus spp., становятся важной и неотъемлемой частью профилактики и терапии многих заболеваний. Применение пробиотиков в аграрной области - это естественная альтернатива антибиотикам, гормонам или каким-либо другим небезопасным стимуляторам роста и новый шаг в технологии современного сельского хозяйства. Пробиотические культуры содержат микроорганизмы, которые стабилизируют кишечный микробный баланс, уничтожают болезнетворные бактерии и секретируют различные ферменты, позволяющие животному лучше усваивать важные питательные вещества. В этой связи обоснованными и крайне актуальными являются усилия, направленные на расширение арсенала пробиотических штаммов и улучшение их свойств. Однако активно используемые для этой цели методы селекции и приемы создания микробных консорциумов не могут обеспечить появление принципиально новых необходимых свойств, таких как антивирусные. Огромные возможности для реализации этой цели открываются благодаря достижениям молекулярной генетики и биологии. Методы генной инженерии позволяют клонировать ген любой биологически активной молекулы в любом бактериальном хозяине. Следовательно, введение генов целевых белков в пробиотические штаммы бактерий может обеспечить появление у последних заданных полезных свойств. Итак, создание пробиотиков и их широкое применение являются сегодня стратегическим направлением в борьбе со многими инфекционными, а также некоторыми неинфекционными заболеваниями.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты и методы исследований. В исследованиях использовали следующие культуры микроорганизмов: пробиотические штаммы Bacillus subtilis BD170, В. subtilis 2335 ВКПМ 4579, В. licheniformis ВКПМ В 2336; тест-культуры Salmonella typhimurium 174, Shigella sonnei, Candida albicans, Staphylococcus aureus 209 из музея ГИСК им. Л.А. Тарасевича (г.Москва). А также генетически модифицированные штаммы, из музея ИККМ ГНЦ ВБ «Вектор» (пгт. Кольцово): В. licheniformis 2336/рВМВ105 (В-677); В. subtilis 2335/рВМВ105 (ВКПМ-4579 В-315); В. subtilis BD170/pBMB105 (В-319).

При создании модельных инфекций были использованы вирусы: герпеса 2-го типа (ВПГ2, гениталий), штамм MS (Государственная коллекция вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, г.Москва).

Всего в работе использовали 25 морских свинок, 40 мышей и 31984 цыплят-бройлеров кросса «Сибиряк». Все манипуляции с животными проводили с применением седативных средств в соответствии с ветеринарным законодательством.

Определение чувствительности к антибиотикам штаммов бацилл проводили диско-диффузным методом и оценивали по зоне подавления роста /Биргер М.О., 1982/.

Эксперименты по молекулярному клонированию в бациллах проводили согласно /Гловер Д., 1988/. Выделение плазмид из пробиотических штаммов бацилл проводили, используя стандартный метод щелочного лизиса /Гловер Д., 1988/ с собственными модификациями. Изменения были внесены в параметры (время, температура) инкубации с лизирующими агентами, связанные со структурными особенностями клеточной стенки пробиотических штаммов. На основании проведенных экспериментов была предложена следующая методика выделения плазмид из пробиотических штаммов бацилл:

- выращивали культуру в 5 мл L-бульона в течение 18-20 ч., центрифугировали для осаждения клеток при 5000 об/мин в течение 10 мин;

- осадок замораживали (при - 20°С) и оттаивали при комнатной температуре не менее трех раз, после чего ресуспендировали в 300 мкл буфера 1 (50 мМ глюкозы, 10 мМ ЭДТА, 25 мМ трис НС1, рН=8,0), содержащего 10 мкг/мл лизоцима и выдерживали во льду до появления вязкости 30-90 мин при периодическом плавном перемешивании;

- при появлении вязкости к раствору добавляли 600 мкл буфера 2 (0,2 М NaOH, 1% SDS) и оставляли при комнатной температуре на 5-10 мин;

- добавляли 450 мкл буфера 3 (3 М ацетат натрия, рН=4,8) и помещали на 10-20 мин в лед;

- после центрифугирования при 12000 об/мин в течение 5 мин супернатант переносили в чистые пробирки и прибавляли этанол в объемном соотношении 1 : 2,5 или равное количество изопропанола, выдерживали при - 20°С не менее 30 мин для формирования осадка;

- центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин, осадок растворяли в 50-100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис НС1,1 мМ ЭДТА, рН=8,0);

- добавляли равный объем 5 М хлористого лития, выдерживали 10 мин во льду;

- центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин;

- супернатант переносили в чистые пробирки, добавляли 0,1 объема 3 М ацетата натрия (рН=4,8) и предварительно охлажденный этанол в объемном соотношении 1 : 2,5 и оставляли не менее, чем на 30 мин (или на ночь) при температуре -20°С;

- центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин, осадок подсушивали, промывали 70% этанолом, повторно центрифугировали, промывали 96% этанолом, центрифугировали, подсушивали и растворяли в ТЕ-буфере;

- анализировали с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле.

Определение уровня синтеза интерферона клетками трансформированных бацилл проводили двумя методами: по ингибированию цитопатического действия вируса энцефаломиокардита (ЕМК) с использованием культуры клеток диплоидных фибробластов человека (ДФЧ-ДК-58) и иммуноферментным анализом (ИФА) с использованием коммерческих наборов «РгоСоп IF2 plus», (г.Санкт-Петербург). Образцы лизатов культуральной жидкости для определения внеклеточного интерферона готовили по схемам, разработанным с учетом известных методик по изучению продукции интерферона и других рекомбинантных белков клетками бацилл /Palva I. et al, 1983/. Определение антивирусной активности интерферона по ингибированию цитопатического действия вируса проводили на монослое клеточной культуры. Суспензию клеточной культуры доводили до концентрации 2x10 кл/мл ростовой средой. В каждую лунку вносили по 100 мкл суспензии клеток и инкубировали в СОг - термостате до формирования монослоя клеток. Затем ростовую среду удаляли и в первую лунку вносили 20 мкл титруемого образца и 180 мкл поддерживающей среды. После осторожного перемешивания 100 мкл из первой лунки переносили во вторую, смешивали со 100 мкл поддерживающей среды и т.д. Клетки выдерживали при 37°С в течение 24 ч. В каждую лунку с обработанным монослоем вносили 100 ТЦПД (тканевых цитопатических доз, вызывающих поражение в половине проб вируса) и выдерживали при 37°С в течение 24-48 ч. Через 24 ч. Проводили первый учет результатов, через 48 ч. -второй. Расчет титра интерферона производили с поправкой на результаты стандартного препарата - реаферона.

Стабильность плазмид в клетках бацилл изучали в экспериментах in vitro (при пассировании на культуральных средах) и in vivo (путем пассирования через организм мышей) и оценивали по доле клеток, сохранивших исходную плазмиду. После пассажей проводили рассев культуры для получения изолированных клонов на агаризованной среде без антибиотиков. У 100-200 случайно отобранных клонов определяли сохранность фенотипа, детерминируемого наличием плазмиды (Kmr, INF+), для чего с помощью стерильной микробиологической иглы их переносили на агаризованную питательную среду с добавлением антибиотика. После культивирования в течение 24 ч определяли соотношение клонов, сохранивших и утративших устойчивость к антибиотику. Сохранность встройки гена интерферона (структурную стабильность) определяли рестрикционным (по появлению рестрикционного PstI -EcoRI фрагмента длиной 700 н.п.), гибридизационным и ПЦР анализами. Для определения структурной стабильности плазмиды после культивирования, пассирования в условиях in vitro и in vivo проводили гибридизационный анализ на сохранность гена интерферона. В качестве гибридизируемого меченного фрагмента был взят Slal - Hindlll фрагмент ДНК плазмиды рВМВ105, содержащий часть гена интерферона. Вся процедура гибридизации была стандартной /Маниатис Т. и др., 1984/. Стабильность рекомбинантных плазмид в трансформированных штаммах оценивали при пассировании на жидкой питательной среде LB без антибиотика. Для этого 5 мкл ночной культуры исследуемых штаммов вносили в 5 мл свежей питательной среды и оставляли при 37°С в термостате до утра. Одно суточное выращивание (пассаж) соответствует примерно 12-14 клеточным генерациям /Denich К. et al., 1993/. Операцию повторяли десятикратно. Через I, 3, 5, 10 пассажей проводили высевы культуры на твердую питательную среду и определяли процентное количество бактерий, сохранивших плазмиду.

Изучение антагонистических свойств у рекомбинантного штамма проводили методами отстроченного антогонизма - радиальных и перпендикулярных штрихов, и агаровых блочков /Егоров Н.С., 1979/. Для культивирования штамма-антагониста были использованы следующие среды: среда Громыко, сусло-агар и картофельный агар.

Патогенность, вирулентность и токсичность сконструированного штамма B.subtilis 2336/рВМВ105 изучали по методу Биргер М.О. (1982) на белых мышах при внутрибрюшинном, подкожном и пероральном введении 24 часовой культуры, выращенной на МПА или агаризованной среде Гаузе 2 с канамицином (10-20 мкг/мл). Токсичность (безвредность, согласно ТУ 9383-021-00479979-01) препарата субалин-форте определяли на самцах беспородных белых мышей, массой 18-20 г. Сформировали опытную и контрольную группы по 5 животных в каждой, содержащихся на стандартном рационе в условиях вивария. Опытная группа дополнительно к основному рациону получала препарат из расчета 1 доза на мышь в течение 10 дней. Ежедневно проводили взвешивание животных и по соотношению прироста живой массы в опытной и контрольной группах судили о безвредности препарата.

Антивирусную активность ре ком б инаитного штамма изучали совместно с лабораторией Игнатьева Г.М. (ГНЦ ВБ «Вектор», пгт. Кольцово) на модельной инфекции герпеса 2-го типа. Были использованы самцы морских свинок, массой 200-220 г. Животные были получены из питомника ГНЦ ВБ «Вектор» и содержались в стандартных условиях вивария на сбалансированной диете. Заражение вирусным материалом проводили согласно описанной ранее методике /Маренникова С.С. и др., 1986/. Были сформированы две опытных (по 10 животных) и одна контрольная (5 животных) группы. Первая опытная группа получала суспензию живых клеток рекомбинантного штамма В.licheniformis 2336/рВМВ105 в количестве по (1,0±0,5)х109 кое/мл с дополнительными аппликациями на пораженные участки в той же дозе. Вторая группа получала только аппликации. Третья группа не получала никакого лечения. Внутри каждой из опытных групп половина (5 животных) морских свинок получала суспензию рекомбинантного штамма, другая половина - культуру штамма-реципиента. Лечебный эффект оценивался по разности баллов с результатами третьей (контрольной) группы /Даниленко Е.Д. и др., 1998/.

Исследование эффективности субалина-форте в птицеводстве исследовали на цыплятах-бройлерах кросса «Сибиряк». Выращивание цыплят с суточного до 42-дневного возраста осуществлялось в клеточных батареях типа БКМ-ЗБ. Технологические параметры выращивания бройлеров по плотности посадки, фронту кормления и поения, температурному и световому режимам соответствовали нормам, принятым в хозяйстве. В схему кормления были включены антибиотики. Пробиотики давали с водой. Предварительно готовили препарат: 5 г сухого концентрата, содержащего (8,5±1,5) х 1011 к.о.е./г растворяли в 500 мл питьевой воды, тщательно перемешивая. Полученную гомогенную суспензию выливали в специальный бак, емкостью 80 л. Таким образом, на каждого цыпленка в среднем приходилось 0,02 дозы препарата (1 доза составляет 5,0 х 109 к.о.е.), что соответствует 5 х 107 к.о.е. на голову. При проведении второго курса подачи препарата дозу увеличивали в два раза. Клетки батареи БКМ-ЗМ оборудованы ниппельными поилками. На время выпаивания пробиотиков бак подключали к системе поилок. Цыплята выпивали воду в течение 2-3 часов, после чего поилки подключали к системе водоснабжения. Препараты давали двумя курсами по 5 дней: первый курс проводили в первую неделю жизни, второй - с 28-30 дня жизни цыплят.

Статистическую обработку результатов проводили методами вариационной статистики с использованием стандартного пакета компьютерных программ Microsoft Excel 97.