Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Кинетические и вирусологические аспекты лимфолейкоза крупного рогатого скота

санкт-петербургски;'} ветеринарный институт

На правах рукописи

Г У Л Ю К И Н Михаил Иванович

КИНЕТИЧЕСКИЕ И ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЛИМФОЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук в форме научного доклада

Санкт-Петербург - 1993 г.

Работа выполнена в комплексной лаборатории по изучению лейкозов и злокачественных опухолей сельскохозяйственных животных Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.

Научный консультант - Заслуженный деятель науки РСФСР,

доктор ветеринарных наук, профессор БУРБА Л.Г.

Официальные оппоненты:

- член-корреспондент РАСХН, доктор биологических наук, профессор КОРОВИН Р.Н.

- доктор ветеринарных наук СУХАРЕВ О.И.

- доктор ветеринарных наук ЛЕМЕШ В.М.

Ведущее учреждение - Институт экспериментальной ветеринарии

Сибири и Дальнего Востока

Защита диссертации состоится 10 февраля 1993 г. в 13 часов на заседании специализированного совета Д 120.20.02 Санкт-Петербургского ветеринарного института. Адрес института: 196084, Санкт-Петербург, Московский пр., 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского ветеринарного института.

Диссертация разослана 10 января 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

ШУСТРОВА М.В.

Общая характеристика работы

Настоящая диссертационная работа, представленная в форме научного доклада, выполнена согласно Государственной научно-технической программе 0.69.05 "Разработать и внедрить систему государственных мероприятий по эффективной профилактике, лечению и снижению заболеваемости депрессиями кроветворения и лейкозами человека, сельскохозяйственных животных и птиц" и является итогом пятнадцатилетних исследований по изучению морфофунквдональных особенностей клеток лимфоидного ряда и путей передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Актуальность проблемы. Инфекционные болезни - одна из основных форм патологии и причин смертности среди сельскохозяйственных животных. Лейкоз крупного рогатого скота - хроническая инфекционная болезнь, вызываемая вирусом (ВЛКРС), протекающая вначале бессимптомно, а затем проявляющаяся лимфоцитозом или образованием опухолей в кроветворных и других органах и тканях.

Несмотря на достигнутые за последние десятилетия успехи в изучении патогенеза, диагностике и профилактике гемобластозов крупного рогатого скота, это заболевание продолжает оставаться одним из наиболее распространенных в миро. Как новая нозологическая форма вирус лейкоза крупного рогатого скота был описан в 1968 году в США и СССР.

Открытие возбудителя заболевания дало мощный толчок многочисленным исследованиям этого вида инфекционного неопластического заболевания.

Вирус лейкоза крупного рогатого скота известен как один из наиболее выраженных этиологических факторов, вызывающих поражение лимфоидной системы, и поэтому проблемы, связанные с изучением кинетики лимфоидной популяции, действие вируса на эти клетки, определение антигенных структур вируса и совершенствование средств диагностики вызываемого этим вирусом заболевания, остаются по-прежнему актуальными.

Лимфолейкоз крупного рогатого скота в основном проявляется как хроническое лимфопролиферативное заболевание 3-лимфоцитов. Важным моментом в патогенезе лимфолейкоза крупного рогатого скота является способность лимфоцитов находиться длительное время в кровеносном русле, а также появление в крови в определенные периода болезни клона клеток с выраженными пролиферативными свой-

ствами.

Изучение особенностей пролиферативного процесса и его регуляция в лимфоидных клетках при лимфолейкозе крупного рогатого скота представляет не только теоретический, но и большой практический интерес.

В настоящее время как в нашей стране так и за рубежом широко проводятся исследования, направленные на выяснение механизма патогенеза гемобластозов, зависимости кинетики клеток от морфологического цикла лейкемических клеток, роли различных блоков в жизненном цикле той или иной клеточной популяции.

К кругу вопросов, изучаемых клеточной кинетикой, относятся определение жизненного цикла лейкозных клеток, особенностей размножения и распространения клеток лейкозного клона в организме больного лимфолейкозом животного, клеточных взаимоотношений внутри лейкозного пула, а также лейкозных клеток с нормальными кроветворными элементами.

Имеющиеся в литературе сведения о пролиферативной активности лимфоцитов крови здорового и больного гемобластозами крупного рогатого скота немногочисленны и противоречивы, так как эти данные получены с помощью различных методов исследования на контингенте больных животных, различающихся по стадиям и формам болезни, а также и возрастному составу.

Несмотря на исключительно важное значение, которое имеет изучение пролиферативных процессов в клетках лимфоидной популяции в норме и при лейкозной патологии, многие вопросы этой проблемы еще остаются далеки от своего разрешения.

В этом плане особое значение приобретают исследования по выяснению закономерностей синтеза ДНК, РНК и белка на протяжении митотического цикла для определения их роли в регуляции деления клеток.

Цель и задачи исследования. Работа посвящена выяснению путей и факторов передачи вируса лейкоза от животного к животному, а также изучению морфофункциональных особенностей клеток лимфоидно-го ряда в норме, при спонтанном и экспериментальном лимфолейкозе крупного рогатого скота.

Для этого были поставлены следующие задачи.

I. Изучить морфологию пролиферирующих клеток лимфоидного ряда с помощью меченого предшественника ДНК - 3Н-тимидана и метода

авторадиографии.

2. Разработать эмульсию для проведения экспресс-авторадиографии и провести сравнительные исследования эмульсий, выпускаемых

в нашей стране и за рубежом.

3. Определить количественные показатели пролиферирующих клеток лиЩоплпого ряда в крови животных, инфицированных ВЖРС, а также больных лимфолейкозом, с использованием радиоизотопных методов (авторадиография,сцснтнлляционный подсчет).

4. Изучить механизм (пути и факторы) передачи ВЖРС при различных условиях содержания и физиологического состояния животных.

5. Разработать модель экспериментального воспроизведения лим-фолейкоза на телятах и овцах.

6. Проследить в динамике за морфофункциональными и серологическими изменениями, происходящими в лимфоцитах крови телят, родившихся от матерей, болы-шх лимфолейкозом.

Научная новизна. Данная работа является новым научным направлением в решении вопроса патогенеза лейкоза крупного рогатого скота.

Впервые изучены лимфоидные элементы крови, обладающие проли-феративными свойствами у здорового крупного рогатого скота, инфицированного БЛКРС, больного лимфолейкозом, а также в крови лошадей, овец и секрета молочных желез коров. Даны морфологические описания этих клеток. Показан прогностический характер в определении уровня клеток, обладающих пролиферативнши свойствами у инфицированных ВЛКРС.и в развитии за этим самого лейкозного процесса.

В стаде, отселекционированном на лейкоз, с одновременным использованием авторадиографического, серологического и гематологического методов впервые у 16-25$ потомков больных лейкозом коров-матерей установлено внутриутробное инфицирование ВЛКРС. При совместном содержании телят, инфицированных внутриутробно, о сероно-гативными потомками от коров, больных лейкозом, через 12-16 месяцев наблюдения вся группа животных (100$) становится зараженной вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

На основании экспериментального изучения путей и факторов передачи ВЖРС с использованием различных вариантов заражения животных ВЖРС наиболее полно раскрыт механизм передачи вируса от

источника возбудителя инфекции к восприимчивым животным.

Впервые установлена возможность передачи ВЖРС от лактирующе! коровы с пораженной маститом долей вымени кроликам.

Впервые экспериментально доказано, что при ручной случке се-ронегативных телок с быком, больным лимфолейкозом и инфицированным ВЛКРС, происходит перезаражение животных.

В серии экспериментов с применением радиоизотопных, серологических и гематологических методов установлено, что клиняко-гема-тологическому проявлению болезни, а также развитию онкорнавирус-ной инфекции предшествует появление в крови клона клеток с повыше ными пролиферативными потенциями.

Разработана модель экспериментального воспроизведения лимфо-лейкоза на телятах и овцах, позволяющая в течение 3-6 месяцев нас людать клиническое проявление болезни.

Практическая ценность. Впервые в стране проведены исследоваш морфофункциональной активности лимфоцитов крови в норме, при спор танном и экспериментальном лимфолейкозе крупного рогатого скота, а также цри экспериментальной ВЛКРС-инфекции. Разработаны методические рекомендации по выявлению животных повышенного риска заболевания (с использованием радиометрического метода). Разработана, апробирована и широко используется в биологических исследованиях эмульсия УК. Эмульсия УК позволяет получать качественный автограс] практически в течение нескольких часов, что особенно важно в медицинских исследованиях, например, при оценке действия различных цитостатических препаратов и последующей тактике лечения больных лейкозами и при прогнозировании процесса.

Материалы экспериментальных исследований использованы при подготовке следующих документов и рекомендаций:

- Инструкции о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота. Утверждена ГУВ Госагропрома СССР 9 августа 1989 г.

- Технических условий ТУ 6-17-1251-83 Эмульсия-гель УК для тонкослойной экспресс-авторадиографии, 1983 г.

- Стандарта СЭВ СИ СЭВ 2702-80 - Крупный рогатый скот. Методы лабораторной диагностики. Утвержден постоянной комиссией по сотрудничеству в области стандартизации, Берлин, декабрь, 1980.

- Государственного стандарта СССР-ГОСТ 25382-82 - Крупный рогатый скот. Методы лабораторной диагностики лейкозов. Утвержден Государственным комитетом СССР по стандартам II января 1982 г.,

постановление & 3153.

- Инструкции о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота. Утверждена ГУВ МСХ СССР 27 июня 1984 г.

- Методических рекомендаций по выявлению некоторых цитохимических показателей клеток крови, находящихся в фазе синтеза ДНК. Одобрены секцией "Биология, общая и сравнительная патология животных" Отделения ветеринарии ВАСШ1Л 22 апреля 1980 г.

- Методических рекомендаций по обнаружению с помощью меченого предшественника ДНК (3Н-тимидина) пролиферирущих клеток в периферической крови крупного рогатого скота. Одобрены секцией "Биология, общая и сравнительная патология животных" Отделения ветеринарии ВАСХНИЛ 22 апреля 1980 г.

- Методических рекомендаций "Проведение биохимических, имму-нохимических и радиохимических исследований иммунокомпетентных клеток, клеточных структур и их компонентов". Рекомендации рассмотрены и одобрены на заседании секции "Биология, общая и сравнительная патология животных"Отделения ветеринарии ВАСХНИЛ.1983 г.

- Методических рекомендаций "Выделение кейлонов из органов крупного рогатого скота". Одобрены секцией "Лейкозы, сравнительная и экспериментальная онкология" Отделения ветеринарии ВАСХНШ1 13 апреля 1984 г.

- Методических рекомендаций "Оценка иммунологического статуса крупного рогатого скота, больного гемобластоззг.ш". Одобрены Отделением ветеринарии ВАСХНШ 13 апреля 1084 г.

- Методических указаний по диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Утверждены ГУВ МСХ СССР 27 июня 1985 г.

- Методических указами по диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Утверждены комиссией по продовольствию и закупкам при Совете Министров СССР, 1989 г.

- Методических рекомендаций по выявлению животных повышенного риска заболевания (с использованием радиометрического метода). Одобрены комиссией ОЖВвт "Лейкозы, сравнительная и экспериментальная онкология животных" при ВЛС-ШШ 9 июня 1909 I'.

На защиту выносится:

I. Использование разработанных в данном исследовании кинетических параметров лейкозного клона клеток крови в качестве объективных тестов, характеризующих степень развития лейкозного процесса и особенностей развития инфекции ВЛКРС.

2. Пути и факторы передачи BJIKPC и их значение в эпизоотическом процессе лейкоза крупного рогатого скота.

3. Материалы по сравнительному изучению эмульсий для авторадиографии, в том числе разработанную нами и рекомендованную к использованию в различных лабораториях биологического профиля.

4. Сравнительное изучение морфофункциональных особенностей лимфоцитов крови при спонтанном и экспериментальном лимфолейкозе крупного рогатого скота.

5. Выяснить возможности экспериментального воспроизведения лимфолейкоза крупного рогатого скота с помощью введения различных вируссодержащих материалов (лейкоконцентрат, плазма крови и над-осадочная жидкость краткосрочной культуры лимфоцитов крови животного, больного лимфолейкозом).

Публикации. Основные научные положения, выводы и рекомендации изложены в коллективных монографиях: "Лейкозы и злокачественные опухоли животных" (ГЛ., Агропромиздат, 1988, под редакцией В.П.Шишкова и Л.Г.Бурбы), "Лейкозы сельскохозяйственных животных" (Кн.: Урожай, 1988, под редакцией В.А.Бусола), 65 научных статьях, опубликованных в периодических изданиях.

Апробация работы. Результаты исследований обсуждены и одобрены на Всесоюзных симпозиумах, конференциях и координационных совещаниях по решению научно-технической проблемы 0.69.05 (лейкозы человека, животных и птиц), Москва, 1978-1985; Белая Церковь, 1982; Гродно, 1982; Тарту, 1983; Казань, 1983; Самарканд, 1984; 2-й Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов, Львов, 1986; Юрмала, 1987; Рига, 1988; Кишонев, 1989; Киев, 1990; Новосибирск, 1991.

Материалы, методы и результата исследований

Работу проводили в течение 1978-1992 гг. в Центральном отделе лейкозов, сравнительной и экспериментальной онкологии ВИЭВ, на опытной базе института о.Лисий, в хозяйствах Московской, Тверской и Калужской областей.

Объектом исследования в работе служил крупный рогатый скот в возрасте от I дня до 12 лет, лошади, овцы, кролики. Подопытные животные были объединены в следующие группы:

- клинически здоровые (контрольные) животные, отрицательные в РИД - 64;

- клинические здоровые, положительные в РИД (спонтанна иодированные ВЛКРС) - 96;

- животные, больные лимфолейкозом и инфицированные ЗЛКГ^ -

76;

- телята - потомки больных лейкозом родителей - 202;

- животные, экспериментально инфицированное ВЛКРС - 20;

- облученные различными дозами общего гамма-излучения (50150-200 Р) животные и акоцорш^нтпльно инфицированные ВЛКРС -5 гол.;

- лошади - 5 гол.;

- овцы - 165;

- кролики - 68;

- эмульсии для авторадиографии, выпускаемые различными фирмами.

Материалом исследования служили лимфоциты и сыворотки крови этих животных.

Гематологические исследования проводили по общепринятому в гематологии методу. Общее количество лейкоцитов определяли при подсчете их в камере Горяева. Морфологический анализ лейкоцитов проводили в мазках крови, окрашенных по Роглановскому-Гимза или Паппсигейму. Результаты гематологических исследований оценивали по "лейкозному ключу", принятому стандартом СЭВ-2702 (1980).

Серологические исследования проводили методом реакции иммуно-диффузии (РИД) согласно "Методическим рекомендациям по серологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота", утвержденным ГУВ Госагропрома СССР 30 ноября 1988 г.

Латологоанатомические и гистологические исследования проводили совместно с профессором Д.Г.Бурбон и научным сотрудником A.B. Васиным.

Авторадиографичоские исследования проводили по методико, разработанной Годкорс (197.':) с некоторыми измонониями (В.А.Горбатов, М.Н.Гулижин, Т980),

Синтез нуклеиновых кислот в лимфоцитах крови определили с помощью меченых предшественников да-PIK - 3Ц-тимидина и 311-уридина, а учет результатов проводили радиометрическим методом с использованием сцинтш&ционного счетчика типа 1219 RAckbeta ( lkb,wallac, Швеция).

Кровь у животных брали из яремной вены в пробирки с гепарином (10-15 ед/мл). Для получения лейкоконцентрата кровь центрифугиро-

- при ГоиО об/мин в течение 10 мин. Слой лейкоцитов переносили в ишшциллиновые флаконы с питательной средой (5 мл среды 199)

С

из расчета I - 1,5 х 10 клеток на I мл среды. Взвесь лейкоцитов инкубировали I ч при +38°С с 3Н-тимидином в концентрации х мк К../мл (удельная активность 21,6 к/мо.:а), зато..! центрифугировали 5 мин при 1000 об/мин. Осадок дважды ресуспендировали средой 199, чтобы отдать неусвоенный меченый предшественник. Из полученного осадка клеток готовили мазки, которые фиксировали 4-5 мин метиловым спиртом, покрывали эмульсией типа "М" и экспонировали 7-14 суток или эмульсией "УК" и экспонировали 6-10 час при +4°С.

Радиоавтографы держали I мин в проявителе Д-19 (его основной раствор разбавляли дистиллированной водой в соотношении 1:10), прошвали водопроводной водой (30 с) и фиксировали 30$-ным раствором гипосульфита натрия, после чего опять промывали водопроводной водой и окрашивали краской Романовского. Подсчет числа зерен восстановленного серебра над ядрами клеток позволил оценивать интенсивность синтеза ДНК. Процентное содержание меченых клеток (индекс метки) характеризовало их пролиферативную активность. В каждом препарате подсчитывали не менее 1000 клеток лимфоидного ряда. Для кариометрии использовали окулярный винтовой микрометр ГЛОВ - I х 1,5х. Морфологический анализ клеток крови, определение количества ДНК-синтезирующих лимфоцитов, кариометрию и фотографирование проводили на микроскопе НУ-2, окуляр й 12,5, объектив 100.

В качество вируссодержащего материала для экспериментального воспроизведения лейкоза на телятах использовали лейкокопцентрат от больной и инфицированной ВЛКРС коровы, содержащий 8 х 10® клеток, культуральную жидкость от краткосрочных культур лимфоцитов (2 мл внутривенно), а также плазгду крови (15 мл).

Статистичоскую обработку исследований проводили методами вариационной статистики (Лакин Г.Ф., 1990).

Морфология ДНК-синтезирующих клеток крови сельскохозяйственных

_животных и птиц_

При изучении морфологической структуры ДПК-синтезирующих клеток крови сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, лошади, овцы, свиньи) обращали внимание на величину, форму ядра и степень окраски цитоплазмы, так как эти свойства более отчетливо характеризуют меченые клеточные элементы.

ДПК-синтезирующие клетки крови разнообразны по форме. В основном ото круглые и овальные клетки. Ядра этих клеток обычно крупные и занимают большую их часть. В структуре ядра обнаруживали небольшие глыбки хроматина с просветлением между ними. Форма ядра различная: круглая, овальная, лопастная, бобовидная, неправильная.

По степей! окрашенности цитоплазмы нами определены 3 типа клеток: с интенсивной, средней и слабой базофилией цитоплазмы.

В крови клинически здоровых животных в основном ДНК-синтези-рующие клетки крови имели интенсивную и только 24$-среднюю а &%-слабую базофилию цитоплазмы.

Диаметр меченых клеток колебался от II до 30 мкм, но наибольшее количество их обнаружено от 16 до 23 мкм (рис.1). *■

В периферической крови здорового крупного рогатого скота разных возрастных групп постоянно циркулирует 0,55 + 0,04$ ДНК-син-тезирующих клеток.

В крови лошадей и овец этот показатель колебался от 0,8 до 1,2% на 1000 клеток данного ряда.

Таким образом, необходимо отметить, что в крови сельскохозяйственных животных постоянно обнаруживали клетки с выраженными пролиферирующими свойствами.

Нам не удалось выявить характерных морфологических отличий среди ДЦК-синтозирующих клеток крови здоровых и инфицированных ВЛКРС. По нашему мнению, популяцию меченых клеток крови здорового и инфицированного ВЖРС можно отнести к макролимфоблаотам, небольшой процент которых постоянно циркулирует в кровеносном русле.

При исследовании крови животных, больных лимфолейкозом, установлено, что в зависимости от стадии болезни меняется и количество ДПК-синтозирующих клеток. В крови коров, больных лпм.]оле,;ко-зом, количество ДЦК-синтозирующих клеток варьировало ит 0,4 до 12,7%.

Морфологической изучение клеток лейкозной популяции показало, что метку включают, как правило, крупные (Т8-2С глкм), средние (14-18 мкм) и реже малые (ХО-СЗ мкм) бластные элементы крови. Активно пролиферирующие клетки - бласты большого и среднох'Ч) диаметра.

В начальной стадии болезни (гематологические показатели достигали до 20,0 тыс. лейкоцитов в I мкм) обнаруживали в основном ДНК-синтезирующие клетки со всеми морфологическими признаками здоровых животных, но в значительно большем количестве. Ядра крупные, располагались эксцентрично, хроматин в некоторых из них имел 35 - см. стр. 53

вид нежных глыбок, выявлялись единичные ядрышки. Цитоплазма с выраженной базофилией.

В развернутой стадии болезни диаметр ДНК-синтезирукмцих клеток уменьшался до 14-16 мкм. Цитоплазма их характеризовалась слабой базофилией и имела вид узкого ободка вокруг ядра.

В терминальной стадии болезни, когда количество лейкоцитов в I мкл составляло 100-400,0 тыс, диаметр меченых клеток заметно уменьшился (до 12-14 мкм), цитоплазма в виде небольшого ободка окружала ядро. По всем морфологическим признакам эти клетки отнесены к микролимфобластам. В динамике лейкозного процесса наблюдали как бы замену популяции макролимфобластов на микролимфоблас-тов. С появлением в циркулирующей крови большого количества меченых макролимфобластов отмечали затем и повышение общего уровня лейкоцитов.

По интенсивности включения меченого нуклеозида ДНК-синтезирую-щие мононуклеарные клетки были распределены на 4 группы: первая -клетки, в ядрах которых насчитывали 5-10 зерен восстановленного серебра; вторая - 11-25; третья - 26-50; четвертая - более 50 зерен. Метку у интенсивно меченых клеток обнаруживали по всей площади ядра, а в клетках,над ядром которых насчитывали несколько зерен восстановленного серебра, она не имела постоянной зоны.

Интенсивность включения 3Н-тимидина зависит от диаметра ядра и нахождения клетки в определенной стадии митотического цикла. Если в момент добавления меченого предшественника клетка заканчивает синтез ДНК, то усвоение 3П-тимидина будет незначительное. При авторадиографичоском исследовании таких клоток, как правило, обнаруживали 5-20 зерен восстановленного серебра. Не исключено, что клетки могут усваивать и незначительное количество моченого предшественника, который используется на исправление повреждений ДДК (репарацию), а не на ее репликацию. Интенсивность включения 3Н-тимидина зависит также от продолжительности фазы синтеза ДНК (Э ). Фаза синтеза ДНК леикемических клеток намного длиннее по сравнению с фазой клеток здоровых животных. Следовательно, удвоение количества ДНК (переход из диплоидного количества в тетра-плоидное 2с-4с) у лейкомических клеток происходит значительно медленнее.

Таким образом, чем длиннее фаза синтеза ДНК, тем больше клеток находится в ней и тем выше индекс метки. Так, в терминальной

стадии болезни постоянно отмечали большое количество меченых клеток (8,0-12,7$), над которым насчитывали от 5 до 25 зерен восстановленного серебра.

ййнетические аспекты лимфолейкоза крупного _рогатого скота_

Проблема исследования лимфопоэтическоП системы в последнее время приобрела важное значение в связи с изучением болезней системы крови - гемобластозов. Поскольку лимфолейкоз крупного рогатого скота протекает по лимфоидному типу, то самые ранние изменения должны происходить в лимфотической ткани.

В настоящем разделе обобщены результаты многолетних исследований (1978-1992 гг.) пролиферативной активности лимфоцитов крови в норме и при лимфолеикозе крупного рогатого скота.

Комплексному исследованию были подвергнуты 76 животных, больных лимфолейкозом,разных возрастных групп и пород. В качестве контроля исследовали клинически здоровых животных аналогичного возраста.

В табл.Г представлены результаты гематологических и авторадпо-графичоских исследований животных, больных лимфолейкозом.

Порвио исследования были выполнены на животных, больных лим-фолепкозо..!, в возрасте от II месяцев до 10 лет черно-пестрой, холмогорское п бурой латвийской пород в динамике.

Гематологические, серологические и автораднографичоскио исследования проводили ежеквартально. По окончанию опыта все животные были убиты,и гистологическими исследованиями был подтвержден лимфолейкоз .

1! начальной стадии и при обострении болезни постоянно отмечали в периферической крови резкое увеличении числа клеток, обладающих пролиферативными свойствам!. Особенно четко ото проявлялось в дшшмшео нрогроосирущого патологического процесса у одного и того же больного животного.

фи НОрЪОМ ИССЛ0Д0Ш1ШШ К|)01Ц] коровы * ОСлЦОи количостьо

лейкоцитов составило 10 тыс. в I икл, а индекс глотки - 1%. Через ■1 месяца общее количество лейкоцитов снизилось до 30,0 тыс, а число моченых клеток увеличилось болое чем в 2 раза. Однако в определенные периоды болезни отмечалось снижение как этого показа-толя (до 18 тыс.), так и числа меченых клеток (до 0,7$).

Причина смерти при лимфолейкозе - обычно развитие бластного

криза. Как показали результаты проведенных исследовании, перед (ЗласТ1шгл кризом наблюдали усиленную пролиферацию элементов, выражающуюся повышением числа ДНК-синтезирующих клеток, меченых по 3Н-тимидину. Так, за 15 дней до гибели у коровы И 934 при лейкоцитозе 27,8 тыс.в I мкл отмечали резкое увеличение числа меченых клеток до 12,7$. Наряду с бурной пролиферацией лямфоидных элементов отмечали резкое увеличение общего количества лейкоцитов, которое за этот короткий срок достигло 64 тыс.в I мкл. Среди меченых клеток основную массу составляли малые бласты диаметром от II до 13 мкм. На вскрытии обнаруживали увеличение селезенки, лимфоузлов, печеш!, почек. Гистологическими исследованиями установлен лимфолейкоз.

Гематологические показатели животных Ш 0928, 0945, 0398, 4447 характеризовались стабилизацией общего количества лейкоцитов на уровне 15-30 тыс.в I мкл, отражая тем самым хроническое течение лейкозного процесса. В глазках крови обнаруживали в незначительном проценте пролимфоциты, лимфобласты и недифференцированше клетки.

3 течение нескольких лет в крови животных Ш 4450, 4451 и 4457 обнаруживали большое количество меченых клеток и в последующем отмечали повышение общего количества лейкоцитов до лейкеми-ческого уровня. В мазках крови обнаруживали фигуры митоза, бласт-нне и недифференцированные формы клеток. При лейкоцитозо 91254,8 тыс.в I шел крови у этих животных отмечали увеличение числа малых и средних лимфобластов.

Животные Ш 0033, 0051, 0052 и 0932 находились под наблюдением с П-мссячного возраста и были потомками больных лейкозом ко-ррв. У коров, от которых произошли животные № 0052 и 0932, гис-тологпчоскими исследованиями была установлена ретикулосаркома, однако морфологическая картина крови у животного 0932 оказалась характерной для лимфолейкоза. Отот диагноз подтвордился при гистологическом исследовании селезенки, лимфоузлов, печени, почек и т.д. У животного Je 0052 отмечали типические проявления болезни, характеризующиеся исхуданием, \ чонием лимфатических узлов (надколенной складки, межреберк:. ■■редлопаточных, голодной ямки, заглоточных, надвыменных). 3 крови выявлялось от 1,4 до 2,9/J меченых клеток и увеличение общего количества лейкоцитов до 30 тыс. в I мкл. Кивотное 0033 - потомок коровы ¡Ь 4447, а J2 0051 - потомок коровы Ун 5064, которые были больны лимфолейкозом.

Гематологические показатели и количество меченых клеток у жи-

вотных jä 0033 п ü 0932 на протяжении длительного срока сохранялись в пределах нормы, установленной для здоровых животных, тогда как у животных Jt 0051 и 0052 отмечалось увеличение количества ЛДК-синтезирующих клеток уже при первых исследованиях (табл.2).

Количество ДНК-синтезирующих лимфоцитов в крови животного Ji 0G5I возросло за ? ыес. до 2%. За этот период более чем в 2 раза увеличилось количество лейкоцитов и процент лимфоцитов в лейко-формуле. В последующем отмечали снижение числа меченых клеток до 0,6$ и через 2 мес. уменьшение количества лейкоцитов до 16,4 тыс. Снижение процента меченых клеток в определенный период болезни отмечали и у животного Je 0052, но затем вместе с его увеличением до 2,5$ - повышение количества лейкоцитов до 44,6 тыс.в I мкл.

При наступлении ремиссии отмечалось, как правило, снижение общего количества лейкоцитов, но вместе с тем,число пролиферирую-щих клеток увеличивалось в 2-3 раза. Эти клетки имели диаметр 1620 мкм. Ядра меченых клеток занимали большую их площадь и располагались эксцентрично. Интенсивность метки, выражающая пролифе-ративные свойства клеток, была ярко выражена.

Как видно из табл.1,в определенные периода болозш. наблюдали снижение числа пролиферирующих клеток в крови животных, больных лиифолейкозом. Эта общая для всех исследованных животных закономерность позволяет высказать предположение о том, что лейкозная популяция клеток обладает различными пролиферативными свойствами на разных этапах болезни. Поэтому все морфологически дцотифицн-руемые клетки лиыфои дного ряда делят на две группы: пролифериру-ющие и утратившие способность к пролиферации.

Таким образом, морфологические и пвторадиогрзфические исследования клоток крови при лимфолопкозе крупного рогатого скота позволили выявить следующие особенности: увеличение общего количества лейкоцитов при лимфолейкозе крупного рогатого скота связано о изыоношюм процессов деления лимфоидных элементов крови в определенные периоды болезни и накоплением шюрт '■; бластов в стадии покоя; выходом большого количества клеток из стадии покоя вновь в митотическин цикл,и только затем отмечали увеличение общего количества лейкоцитов в крови. Морфология клоток, находящихся в фазе синтеза ДНК (пролиферирующих), изменяется в зависимости от стадии болезни, что подтверждает существование связи между делящейся и неделящейся лейкемическими субпопуляциями в течение лейкозного процесса.

Таблица I

Данные гематологических и авторадаограйшческих исследований лимфоцитов крови коров,больных лимфолейкозов, в динамике

Номера животных 1 т ¡исследование ! 2 ¡исследование ! 3 ¡исследование ! 4 ¡исследование ! 5 ¡исследование ! 6 ! ¡исследование ! ! 7 [исследование

! I : ! 2 ! 3 ! I : [ 2 ! 3 ! I ! ! 2 ! 3 ¡1 ¡2 ! 3 ! I ! 2 ! 3 ! I ! 2 ! 3 ! 1

4450 33,8 89 1,6 48,0 86 1,8 61,2 95 2,6 62,0 94 3,4 189,2 98 6,4 254,8 99 6,9 лимфолейкоз

4451 13,6 80 1,4 20,6 88 1,6 23,4 84 1,1 54,6 90 2,8 183,0 97 7,4 лимфолейкоз

4457 19,8 84 1,7 38,С 90 0,9 26,6 82 0,8 25,8 94 2,0 36,4 84 3,0 лимфолейкоз

5064 23,0 90 1,2 27,4 от ± 1 - 34,0 82 1,2 27,4 77 2,6 35,8 91 2,4 37,6 91 2,5 лимфолейкоз

5092 27,6 82 0,4 33,С 90 3,4 29,6 84 2,4 24,6 84 1,8 30,0 88 2,6 лимфолейкоз

4447 22,5 81 0,3 16,6 87 0,5 20,0 76 0,8 16,8 91 2,0 лимфолейкоз

0928 15,4 78 0,9 18,0 97 0,8 21,4 85 0,7 18,4 85 1,6 лимф-олейкоз

0934 40,0 86 1,С 30,6 91 О ъ <,, о 29,2 87 1,7 27,8 96 12,7 лимфолейкоз

0945 13,8 81 0,2 18,8 89 0,5 26,0 79 1,4 лимфолейкоз

0395 16,4 85 1,4 21,4 87 -- О — » ~ 36,0 90 0,8 20,0 85 1,8 лимфолейкоз

0398 18,0 80 1.6 21,С 83 1,3 18,4 84 1,6 23,4 80 2,4 лимфолейкоз

0051 13,2 81 1,7 28, С 83 0,6 26,8 90 1,4 27,6 91 2,3 30,2 84 1,3 39,4 95 1,8 лимфолейкоз

0052 14,6 78 2,С 20,0 88 2,5 40.6 95 2,9 24,8 88 1,6 28,0 85 1,4 21,4 86 2,0 лимфолейкоз

0033 9,4 74 0,8 11,0 77 1,1 13,4 83 1,0 12,2 79 0,9 12,8 81 1,6 11,0 70 0,5 лимфолейкоз

0932 12,8 64 0,8 10,6 67 0,8 9,8 86 0,6 12,8 77 1,6 лимфолейкоз

контроль п = 119; I = 6,86 + 0,49; 2 = 59; 3 = 0,55 + 0,04

1 - лейкоциты (тыс.) в I мкл крови,

2 - процент лимфоцитов,

3 - индекс метки.

Результаты серологических и морфофункционалышх исследований крови телят, родившихся от больных _лимсЬолейкозом матерей _

Современные научные данные свидетельствуя? о высокой частоте заболевания молодняка крупного рогатого скота в неблагополучных по гомобластозам хозяйствах.

Вместе с тем, несмотря на наличие большого числа работ, указывающих на взаимосвязь вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЖРС) и лимфолейкоза, до сих пор остаются недостаточно выясненными молекулярные механизмы возникновения этой патологии. В этом плане хорошей моделью для изучения патогенеза лимфолейкоза п степени инфицирования телят ВЖРС являются потомки больных лейкозом животных.

Для выявления пренатальной передачи ВЖРС от матери потомству был проведен ряд опытов на крупном рогатого скоте лейкозного изолятора, стадо которсгосостоит из семейств животных, генетически предрасположенных к лейкозу и в течение 20 лет разводящихся в себе.

1) первом опыте били 21 корова и 3-летшш бик-цроизводитель, во втором - Г6 коров и бык-лроизводитель. Все животные были инфицированы иЛиРС.и у них методом биопробы па овцах подтверждали наличие вируса.

Животные каждого опита по гематологическим показателям были разделены на три группы: с нормальным колпчиствш лейкоцитов в крови; гематологически подозрительные на лейкоз и с характершил для лейкоза лнмфоцитозом.

Все коровы были осеменены методом вольной случки. Родившихся телпт содержали шесте с матерями, используя подсосный метод выращивания. Телята содержались совместно с матерями до 7-8-мосяч-ного возраста, затем-на привязи в одном помещении со взрослыми животными. У толят до приема молозива или первые 4-6 часов жизни брали кровь и подсчитывали количество лейкоцитов л определяли наличие антител к ВЖРС и ГПД с гллкопротопдшш антигеном.

Одновременно, с целью выявления вируса, кровь телят интрапе-ритонеально вводили здоровым овцам 8-12-месячного возраста, свободным от ВЖРС. Овец содержали в отдельном от коров помещении.

Комплексные исследования, выполненные на телятах первого опыта (1980),свидетельствовали о том, что только 3 (14,2$) из 21 теленка инфицировались внутриутробно. Эти 3 теленка происходили от

коров с клишшо-гематологическими проявлениями лейкоза, тогда как телята, родившиеся от 5-ти гематологически положительных, 6-ти гематологически подозрительных и 6-ти коров с нормальными гематологическими показателями, были свободными от ВЛКРС. У всех телят, родившихся свободными от ВЛКРС, в сыворотке крови после приема молозива появились антитела, которые элиминировались из организма к 6-месячному возрасту. Таким образом, в течение 6-месячного периода подсосного выращивания телят под инфицированными ВЛКРС коровами ни одно животное не заразилось. При первых гематологических и авторадтографических исследованиях 3 телят, инфицированных внутриутробно,отмечали незначительное увеличение общего количества лейкоцитов, а также ДНК-синтезирующих клеток. В дальнейшем гематологические показатели у этих телят характеризовались как снижением общего количества лейкоцитов, так и увеличением.

В наших опытах, проводимых в условиях лейкозного изолятора, в среднем 20,<3% телят, родившихся от коров, инфицированных ВЛКРС и больных лимфолейкозом с выраженными гематологическими изменениями, оказались инфицированными в пренаталышй период онтогенеза, но в отдельные годы этот показатель колебался от 12,5 до 33,3$ (табл.2).

Таблица 2

Частота иренатальной передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота

Год ! исследования! Количество ! телят ! Из них инициировано

количество 1 процент

1980 21 3 14,2

1931 16 4 25,0

1982 18 6 33,3

1983 17 3 17,6

Г 984 15 4 26,6

1985 17 3 17,6

1986 15 3 20,0

1937 13 О 15,4

1938 14 4 28,6

1989 12 2 16,6

1990 8 I 12,5

1991 6 I 16,6

Всего 172 36 20.93

Необходимо отметить, что в сыворотке крови телят, инфицированных пренатально, антитела к ВЛКРС обнаруживали на протяжении всего срока наблюдения. За такой длительный период ни разу РИД не была отрицательной, что свидетельствует о довольно высоком уровне антител в крови исследуемых животных. Аналогичные результаты были получены и при многолетних исследованиях коров, больных лимфолеикозом, в сыворотке крови которых, независимо от сезона года, физиологического состояния (глубокая стельность, послеродовой период), постоянно в РИД выявляли антитела к ВЛКРС.

Во-второй серии опытов из 16 телят, родившихся от коров, больных лимфолойкозом, 4 были инфицированы внутриутробно. Из II коров с гематологическими проявлениями лейкоза только у 4-х была транспланцентарная передача вируса, подтвержденная биопробой на овцах.

После приема молозива антитела к ВЛКРС в сыворотке крови обнаруживали у всех телят кроме одного.

К 6-месячному возрасту у II телят колостральные антитела элиминировались (табл.3), гематологические показатели в среднем по группе составляли I;3,21 ^ 4,47 тыс.лейкоцитов в I мкл крови. Телят, инфицированных внутриутробно, содержали вместе с остальными телятами, получившими с молозивом матерей колостральные антитела. Ни одного случая инфицирования животных нам обнаружить не удалось.

Через 4 месяца после исчезновения колостральных антител были инфицированы три теленка, а через 8 месяцев - еще три. Через 14 месяцев только 4 теленка не содержали в сыворотке крови антител.

С учетом этих данных через 14 мес. животные были распределены на 4 группы. К первой группе отнесли 4 телят, инфицированных внутриутробно; ко второй - 3 телят, инфицированных в 10-мссячном возрасте; к третьей - инфицированных в 14-месячном возрасте; к четвертой - 4 телят, у которых спустя 14 мес.антитела отсутствовали. Два теленка после 6-месячного наблюдения были выведены из опыта.

Па рис.;: представлены результаты гематологических и серологических исследований телят, инфицированных в различные сроки. Так, у телят первой группы имел место незначительный устойчивый лейкоцитоз, выше был уровень клеток лимфоидного ряда и ДНК-синтезирую-щих клеток. Затем отмечали снижение этих показателей, а лейкоцитоз в среднем по группе не превышал 18,60 + 1,30 тыс. в I мкл крови.

Таблица 3

Результаты определения содержания лейкоцитов и серологических исследований телят в динамике

Время исследования ¡Число ¡Количество лейкоци-¡Результаты РИД ¡животных!тов (тыс.в I мкл) ! + ! -

До приема шлоэива 16 7,80 ± 1,96 4 12

I мес. 16 8,37 ± 2,18 15 I

2 мес. 16 12,78 + 3,25 15 I

4 мес. 16 13,91 + 4,19 15 I

6 ¡лес - 16 15,21 + 4,47 4 12

8 мес. 14 12,20 + 0,82 4 12

10 мес. 14 13,38 + 1,43 7 7

12 мес. 14 14,80 + 1,84 7 7

14 мес. 14 15,50 + 2,13 10 4

16 мес. 14 18,83 ± 2,75 10 4

[8 мес. 13 20,20 ± 3,56 9 4

20 мес. 13 от % 4. , + 3,83 9 4

25 мес. 12 25,20 + 4,00 II I

28 мес. 12 24,64 ± 5,53 II I

32 мес. 9 23,35 ± 4,60 9 -

40 мес. 9 23,73 ± 5,24 9 -

Гематологические изменения не имели резко выраженных проявлении и длительный период колебались в указанных выше пределах. Дальнейшие исследования показали, что такая тенденция прослеживается у всех животных, инфицированных пренаталыю.

Результаты, полученные при исследовании телят второй группы, инфицировавшихся в 10-месячном возрасте, также свидетельствуют о хроническом течении болезни. Так, через 2 мес. после рождения, отмечали незначительное увеличение общего количества лейкоцитов и лимфоцитов. В 4-месячном возрасте общее количество лейкоцитов составляло в среднем по группе12,50 х 1,27 тыс.в I мкл крови, и к 6-1.Юсячному возрасту, когда элиминировались колостральные антитела - 15,30 2,47 тыс.в I мкл. В дальнейшем, когда в сыворотке крови этих телят антитела не выявлялись, гематологические показатели стабилизировались примерно на одном уровне и составляли на протяжении 10 мое. 13,40 ± 1,32 - 11,60 х 2,10, и только после 20-мос.срока наблюдения отмечали увеличение общего количества

лейкоцитов от 15,27 ± 2,61 тыс,в I мкл крови и выше.

У телят третьей группы параллельно с морфофункционалышми изменениями было отмечено, что болезнь протекала агрессивнее, чем у животных остальных исследованных групп. У этих животных длительный период (8 мес.) в крови не обнаруживали антител к ВЛКРС, но гематологические показатели были выше, чем в других группах. В лейкоформуле отмечали увеличение процента клеток лим-фоидного ряда (88-94$). ДНК-синтезирущие клетки составляли от 2,6 до 4,8$. Они были больших размеров (18-26 мкм), ядра располагались эксцентрично и занимали большую часть клетки. Характерной особенностью для телят этой группы было то, что при отсутствии в организме ВЛКРС, отмечали характерные для лейкоза изменения в крови.

После приема молозива в сыворотке крови этих телят были обнаружены антитела к вирусу лейкоза, которые персистировали до 56-месячного возраста. Как видно из рис.2*в период с 6- до 14-месячного возраста в сыворотке крови телят этой группы не обнаруживали антител к вирусу лейкоза.

Результаты гематологических и серологических исследовании телят третьей группы 0062, 0066, 0067) представлены на рис.3. Как видно из представленных результатов, характерной особенностью для телят этой группы было то, что при отсутствии в организме ВЛКРС и наличии антител к нему, полученных с молозивом матеря, у них уже отмечали гематологические изменения, характерные для начальной стадии лимфолейкоза. Спустя 2 мес. после инфицирования вирусом лейкоцитоз уже составлял 25,0 ^ 9,07 тыс/шел, в последующем достигал 40,00 ^ 4,73 тыс/икл (рис.3). Й

У телят четвертой группы после элиминации колостральних антител к 6-ыосячному возрасту на протяжении последующих ТО мое. антитела к ВЛКРС в сыворотке крови отсутствовали. В 25-месячном возрасте у 3 телях из 4 они были обнаружены. Количество лейкоцитов в среднем по группе составляло 10,05 £ 0,54 тыс.в I мкл, ДНК-синтезирующих клеток - от 1,6 до 2,4$.

Через 3 месяца поело заражения вирусом лейкоза, общее количество лейкоцитов увеличилось до 16,65 + 3,48 тыс., а в 32-месячном возрасте уже достигало 22,40 ± 6,43 тыс.в I мкл крови. 13 возрасте 32 мес. все животные (100$) были инфицированы ВЛКРС,

Анализ приведенных данных свидетельствует о том, что более объективные сведения, особенно в отношении инфицирования телят

ВЛКРС и проявления у них морфофункциональных изменений в клетках х-,■-см.стр. 53

крови и кроветворных органах, могут быть получены только при изучении этих изменений в динамике.

Внутриутробная передача ВЛКРС имела место у коров-матерей как с высоким лейкоцитозом, так и с умеренным. В отдельных семействах, находившихся под наблюдением на протяжении нескольких лот, отмечали довольно высокий процент случаев внутриутробного инфицирования .

В одном из семейств II потомков из 43 были инфицированы внутриутробно. Несмотря на значительное число случаев внутриутробного инфицирования телят ВЛКРС,в данном семействе горизонтальный путь передачи все-таки превалировал над вертикальным (внутриутробным) .

О путях и частоте передачи вируса от больных животных здоровым среди исследователей нет единого мнения. Общепризнано, что перенос вируса лейкоза путем гамето-хромосомной трансмиссии не происходит. В последнее время исследователи стали обращать внимание на трансплацентарныйцуть передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота, интегрированного с ДНК лимфоцитов, матери-плоду.

В связи с этим,разработка надежного способа определения проникновения через плацентарный барьер материнских лимфоцитов, содержащих геном ВЛКРС,в плод является актуальной проблемой расшифровки механизма прохождения вируса через плаценту и обнаружения его в организме плода в более ранние сроки,, когда специфические антигены к нему серологическим методом не выявляются.

Разработанный нами способ диагностики инфицированноети плодов овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота позволил убедительно доказать на большом экспериментальном материале о повышении проницаемости плацентарного барьера.

Поставленная цель достигалась благодаря тому, что из крови суягных овец, экспериментально инфицированных ВЛКРС, получали лейкоконцентрат, который трижды отмывали средой Игла от остатков эритроцитов и ресуспендировали средой Игла.

К взвеси клеток (I х 1(Р - I х Ю9 кл/мл взвеси) добавляли флуоресцин изотиоционат (ФИТЦ) из расчета 0,08 - 0,1 мг/мл взвеси лейкоцитов и инкубировали в термостате при 37,0 - 38,0°С в течение 15 мин. Лейкоконцентрат ресуспендировали средой Игла до концентрации Ю^ - Ю13 меченых клеток в I мл среды и вводили внутривенно овцам. Каждой овце вводили лейкоциты крови, выделенные из ее крови. С целью повышения проницаемости плацентарного

барьера двум из трех овец внутривенно предварительно вводили пи-рогенал в дозе 0,024 - 0,026 мг/кг массы животного. Через 3-12 ч животных убивали и от овец и их плодов брали кровь.

В сыворотке крови плодов антител к ВЛКРС обнаружено не было. Для подтверждения диагноза на инфицированноеть плодов Ш\РС кровь от исследуемых плодов вводили внутрибршинно ягнятам, свободным от ВЛКРС (ставили биопробу). Во всех случаях биопроба от плодов овец, которым вводили пирогенал, была положительной.

Таким образом, предложенный способ позволяет выявлять в эксперименте проникновение в плод материнских лимфоцитов, содержащих ВЛКРС и тем самым, задолго до выработки организмом плода антител к ВЛКРС, судить об инфицированное™ ег° вирусом.

Результаты наших исследований показали, что заражение животных ВЛКРС может произойти в различные периоды онтогенеза. Поэтому отмеченное нами отсутствие синхронности в инфицировании животных ВЛКРС, а также в течении лейкозного процесса обусловлено, по-видимому, ролью иммунной системы, обеспечивающей защиту организма от инфекции.

Обнаружение антител к ВЛКРС свидетельствует об инфицировании животных данным вирусом, но гематологические показатели длительное время могут находиться в границах физиологической нормы для данной возрастной группы. С другой стороны, при отсутствии вируса (установлено на основании биопробы) и, следовательно, антител к нему, гематологические измонония свидетельствуют о начальной стадии лимфолейкоза. Эти случаи напоминают спорадический лимфо-лейкоз телят. В условиях лейкозного изолятора частота их проявления была повышена но сравнению с имеющимися статистическими данными.

Исследования, проведенные с использованием серолох'ических, гематологических и авторадиографических методов позволили выявить определенные закономерности в развитии болезни и онкорнавирусной инфекции, выделить стадии болезни с учетом инфицирования животных ВЛКРС и имыунопролифоративных нарушений иотыетить своеобразие их проявления.

Так, у телят первой, второй и четвертой групп болезнь развивалась по трем последовательно сменяемым стадия»«!: инфицирование животных вирусом; функционально-иммунологические изменения; кли-нико-гематологические изменения.

Проявление болезни у телят третьей группы, на наш взгляд,

свидетельствует о наследственной ее передаче. При постановке биопробы на овцах были получены отрицательные результаты, а болезнь уже прогрессировала. Отсутствие вируса у этих телят свидетельствует о развитии болезни ( в ее начальной стадии), не связанном с инфицированием вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

В этой связи проявлению болезни у телят третьей группы свойственны свои стадии: функционально-иммуногенетические изменения; клинико-гематологические изменения; инфицирование животных вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Для каждой стадии лимфолейкоза характерны свои функционально-морфологические, генетические и иммунологические изменения, обнаруживаемые с помощью соответствующих методик. Это позволяет контролировать переход болезни из одной стадии в другую и выявлять при этом изменения, происходящие как на клеточном, так и на субклеточном уровне.

Экспериментальное воспроизведение лимфолейкоза _на телятах_

Вопрос об экспериментальном воспроизведении лейкоза у животных постоянно находится в поле зрения исследователей, занимающихся изучением злокачественного роста в органах и тканях сельскохозяйственных животных. При изучении возможности воспроизведения лимфолейкоза на телятах различными вируссодерхсащими материалами задачей наших исследований было проследить в динамике за иммуно-морфологическими изменениями в клетках крови до проявления гематологических и патоморфологических изменений.

В первой сории опытов для экспериментального воспроизведения болезни были подобраны три группы телят в возрасте 6-8 мес. по четыре в каждой, которых содержали в одинаковых условиях.

Животным первой группы ввели внутривенно по 2 мл культураль-ной жидкости культуры лимфоцитов, полученных от животного, больного лимфолейкозом; второй группы - по 15 мл плазмы крови этого же животного; третьей - по 20 мл лейкоконцентрата, полученного от животного, используемого в I и 2 группах, в котором содержалось 12 х 10 клеток. Четырем контрольным телятам ввели лейкокон-центрат (12 х 10®), полученный из крови здоровой коровы, в сыво- ■ ротке крови которой отсутствовали антитела к ВЛКРС.

Через 3 дня после введения вируссодеркащего материала у некоторых телят отмечали увеличение количества лимфоцитов. В мазках

крови обнаруживали молодые клетки. Лимфоциты характеризовались ба-зофильной цитоплазмой. В основном популяция относилась к средним и большим лимфоцитам.

Через 5 дней отмечали увеличение процента молодых клеток (бластов) в лейкоформулах телят, которым вводили лейкоконцентрат.

Через 20 дней из 12 телят, сыворотки которых исследовали в РИД, у 2-х обнаруживали антитела к ВЛКРС. Через 2 месяца сыворотки крови всех телят положительно реагировали в РИД с антигеном гп-51 (табл.4).

С диагностической целью через 3 месяца убили одного теленка С'р 0059) из третьей группы. Гистологическими исследованиями был установлен лимфолейкоз. Через 7 месяцев убили всех подопытных животных, лимфолейкоз был подтвержден еще у двух телят третьей группы.

У телят, которым вводили плазму и культуральную жидкость культуры лимфоцитов, за такой срок наблюдения не удалось установить гистологических признаков, характерных для лимфолейкоза.

В последующих сериях опытов 6-месячным телятам вводили только лейкоконцентрат (внутривенно). Исследования проводили через 7, 14, 21, 28 и 35 дней и затем ежемесячно (табл.5).

Как видно из табл.5,у большинства телят спустя 28 дней после начала опыта отмечали увеличение общего количества лейкоцитов, а у 7 из 10 животных в сыворотке крови были выявлены антитела к ВЛКРС. Через 35 дней они присутствовали в сыворотке крови всех исследуемых телят.

Через 3 месяца четырех телят убили и у двух из них гистологическими исследованиями установили лимфолейкоз. Через 6 мес. убили еще двух телят,и у одного был установлен лимфолейкоз, у другого -недифференцированный лейкоз.

Остальные животные находились под наблюдением до 28 месяцев. У двух гистологическими исследованиями установили лимфолейкоз, у двух других изменений, свойственных лимфолейкозу. установить не удалось. У шести телят из 10 гистологическими исследованиями были установлены изменения.характерные для лимфолейкоза. Гематологические отклонения отмечали у всох животных, однако у некоторых они колебались в значительных пределах, что свидетельствует о начальном проявлении болезни.

Необходимо отметить, что через 20-35 дней после введения ви-руссодержащего материала в 100$ случаев были обнаружены антитела, подтверждающие наличие инфекции.

Таблица 4

Результата гематологических и серологических исследований подоштных телят

в динамике

Группа и номер! животного Г

3 дня

1

5 дней

10 днеЛ

15 дней

Первая

Вторая

Третья

1082

1083

1084

1085

0075

0083

0084 0087

0053

0054 0053 0069

Первая

Вторая

1082

1083

1084

1085

0075

0083

0084 0087

6,4 8,6 5,8 8,4

11,8 7,4 7,0 9,6

II .2 5,6 9,8

13,4

6,0 6,8 8,0 7,6

16,8 11,8 6,0 5,2

62 _ 7,0 58 _ 5,8 60 _ 7,4 56 _

56 _ 6,8 67 — ?;4 59 - 6,0 48 -

48 — 8,0 62 — 9,0 62 - 7,8 60 -

64 - 7|2 48 - 6,8 54 - 9,0 58 -

63 _ 8,6 63 12,0 66 _ 14,0 51 _

75 _ 7 0 73 - 9,2 74 - 11,2 77 -

53 _ 6,2 75 - 4,4 66 - 5,2 71 -

71 - 8,6 63 - 6,0 68 — 5,4 §9 -

64 _ 6,2 67 6,8 70 17,6 74

74 - 8,2 73 - 8,6 83 - 10,4 61 _

84 - 14,8 90 - 21,8 81 - 16,4 86 _

61 2 12,0 69 - 11,0 75 - 10,0 82 -

дней 25 дней 30 дней 2 мес.

53 __ 8,2 62 7,6 58 _ 10,8 62 +

50 - 7,0 53 _ 8,2 61 + 7,6 50 +

61 - 5,6 49 2 6,4 54 + 8,0 46 +

54 - <8 60 - 5,8 58 —

60 13,4 74 19,6 71 17,4 64 +

62 - 12,8 58 - 15,0 65 - 14,4 64 +

64 - 6,4 81 — 5,6 68 — 14,6 81 +

68 - 6,4 81 - 5,6 68 - 14,6 81 +

Группа и номер! 20 дней ! 25 дней

животного ! I ! 2 ! 3 ! I ! 2

Третья

0053 20,0 72 - 11,6 8С

0054 11,0 70 _ 17,0 83

0059 13,4 89 _ 17,8 83

0069 9,4 71 - 11,2 74

3 мое. 4 мес.

Первая

1082 7,5 48 + 10,6 44

1083 10,4 56 7,2 60

1084 10,0 60 + 4,8 56

Вторая00?5 17,0 53 13,4 59

0083 II 2 65 11,4 73

0084 17,6 81 17,6 91

0087 12,6 67 + 18,6 55

Третья

0053 20,0 73 + 12,2 83

0054 20,8 84 23,0 92

0059 18,6 86 лимфе )лейкоз

0069 12,0 70 + 12,8 61

1

2 3

- количество лейкоцитов, тыс.в I

- процент лимфоцитов,

- результаты РИД.

_!_30 дней_!_2 мес._

!3!1!2!3!1!2!3

15,6 86 - 22,8 73 +

16,0 82 - 26,0 77 +

+ 17,0 81 + 17,0 84 +

+ 13,8 66 + 11,8 67 +

6 мес. 7 мес.

+ + + 9,6 9,0 7,0 60 52 48 + + + 8,4 9,0 6,4 58 + 60 + 52 +

+ + + + 7,8 10,4 15,2 54 77 90 + + -г 11,4 10,0 11,0 51 + м 67 + 01 88 +

+ + Лейкоз 25,8 не установлен 92 + 22,4 79 лимфолейкоз

+ 12,2 63 + 11,8 63 лимфолейкоз

мкл крови,

/

Таблица 5

Результаты гематологических и серологических исследований телят в динамике после введения им лейкоконцентрата

Номер ! 7 дней_! 14 дней_! 28 дней_! 35 дней_! 60 дней

животного! ! I Г 2 ! 3 Г I ! 2 ! 3 ! I ! ! 2 ! 3 Г I Г 2 ! 3 Г I ! ! 2 ! 3

0828 7,8 87 7,8 76 - 11,0 74 - 13,0 85 + 14,4 80 +

0829 12,6 84 11,0 67 - 26,0 80 + 16,0 91 + 11,2 82 +

0830 7,8 74 10,4 71 - 16,4 70 + 12,4 77 + 19,2 84 +

0831 7,4 70 9,0 70 - 9,0 69 + 14,4 1& + 15,6 80 +

0832 8,0 77 8,0 83 - 16,8 84 - 10,6 75 + 9,2 47 +

0833 6,0 73 9,8 76 - 8,8 68 - 18,8 70 + 18,6 76 +

0834 9,2 79 14,0 61 - 19,6 76 + 18,6 80 + 17,4 87 +

0835 8,2 80 10,0 81 - 10,8 80 + 16,0 83 + 20,4 85 +

0837 7,4 80 10,0 60 - 18,0 75 + 16,2 85 + 17,6 70 +

0840 10,2 79 11,2 78 - 12,0 83 + 14,0 90 + 14,4 89 +

90 дней 6 мес. 14 мес.

0828 Лейкоз не установлен

0829 18,4 85 + 19,6 85 + 25,0 84

0830 18,4 80 + Недифференцированный лейкоз

0831 Лимфолейкоз

0832 10,6 52 + 10,0 71 + 9,6 66

0833 Лейкоз не установлен

19 мес. 18,0 76

28 мес.

+ 11,1 84 + Лейкоз не установлен

7,4 68 + 12,8 66 + Лейкоз не установлен

Продолжение таблицы .Ш 5

Номер ! животного! 90 дней ! 6 мес. ! 14 мес. ) 19 мес. 1 28 мес

I ! 2 ! 3 ! I ! о ! 3 ! I ! 2 ! 3 ! I ! 2 ! 3 ! I ! 2 ! 3

0834 23,0 82 + 23,0 80 + 24,2 86 + 21,4 85 + 11,0 80 +

Лимфолейкоз

0835 Лимфолейкоз

0837 33,6 76 + 26,4 86 + 25,4 84 + 21,8 88 + +5,5 87 +

0840 Лимфолейкоз

32,2 91 + Лимфолепкоз

1 - количество лейкоцитов, тыс.в I мкл крови,

2 - процент лимфоцитов,

3 - результаты РИД.

Ташш образом, мы разделяем точку зрения ряда авторов, свидетельствующую о том, что инфекцию удается воспроизвести в 100$ случаев. Однако, у телят, которым вводили плазму и культуральную жидкость, в течение семи месяцев ни гематологическими, ни гистологическими методами изменении, свойственных лимфолейкозу, обнаружить не удалось.

Для экспериментального воспроизведения лимфолейкоза наиболее эффективным материалом оказался лейкоконцентрат от животного, больного лимфолейкозом и инфицированного ВЛКРС.

В третьей серии опытов в качестве экспериментальных животных использовали телят черно-пестрой породы в возрасте 5-16 мес., которым внутривенно вводили лимфоциты крови коровы, больной лимфолейкозом, в количестве 8 х 10 клеток. Телята были разделены на 3 группы: 1-я группа - 5 голов в возрасте 5-6 мес.; 2-я группа - 3 гол. в возрасте 18 мес. и 3-я группа - 5 гол. в возрасте 6-8 мес., ранее облученных различными дозами гамма-излучения (50-150200 р).

Контролем служили 5 телят, происходящих из благополучного по лейкозу хозяйства, которым ввели лейкоконцентрат от клинически здоровой и свободной от ВЖРС коровы в такой же дозе.

До введения вируссодержащего материала ни у одного из животных 1-й группы не было выявлено отклонений ни гематологических показателей, ни в уровне синтеза ДНК и PIIK.

Однако, через 3 суток после инфицирования показатели синтоза MUÍ и РНК в насколько раз были выше контрольных. Так, уровень синтоза ДНК составил IIЛ3 ¿ 1161,4 расп/мин, а в контрольной группе 600 i 31,2 расп/мин для РНК; 4304 ± 316,4 расп/мин - в опытной и в контрольной 1275 ± <12,9 расп/мин.

Последующие радиометрические исследования свидетельствовали о высоко;! активности синтеза ДИК и РНК в лимфоцитах крови опытных животных.

'Гак, через 7 и 10 суток поело инфицирования телят ВЛКРС достоверных отличий в содержании количества лейкоцитов не установлено. В то же время, уровень синтеза ДНК и РНК,постепенно повышаясь, достигает пика через 10 суток поело заражения животных,и только на 14 сутки были установлены гематологические изменения. Количество лейкоцитов в среднем по группе превышало исходное значение в 2 раза и составило 19,2 i. 1,14 тыс/мкл с колебаниями у отдельных животных от 15,8 до 21,8 тыс/мкл, а антитела к ВЛКРС

были обнаружены только у 3 животных из 5.

На 21 сутки после введения вируссодержащего материала отмечали снижение общего количества лейкоцитов (14,2 + 1,88 тыс/мкл) и лимфоцитов (11,8 + 2,04 тыс/мкл) по сравнению с предыдущим исследованием, но вместе с тем наблюдали повышенный уровень синтеза ДНК и РНК, а титры антител к антигену гп51 ВЛКРС колебались от 1:2 до 1:16.

Через 60 суток титры антител к гп51 антигену ВЖРС у трех животных равнялись 1:32, у одного 1:64 и у другого 1:16. В этот же период исследования у 4 телят из 5 были выявлены антитела к р24 антигену ВЖРС. Гематологические показатели (18,5 + 2,94 тыс/мкл) свидетельствуют о начальной стадии лимфолейкоза.

По истечении 3-месячного срока наблюдений у всех 5 телят были обнаружены антитела к антигену р24 ВЛКРС, а титры антител к антигену гп51 у двух телят составили 1:16, у одного 1:32 и двух других 1:64. Через 18 мес. после инфицирования провели комплексное обследование животных с последующим диагностическим убоем.

Гематологические показатели свидетельствовали о различном проявлении начальной стадии лимфолейкоза. Так, у двух животных отмечали снижение общего количества лейкоцитов до уровня контрольных показателей, тогда как у оставшихся трех эти показатели колебались от 24,4 до 45,8 тыс/мкл, и содержание лимфоцитов в лей-коформуле составило 93$.

При диагностическом убое экспериментально инфицированных ВЛКРС животных были обнаружены характерные для лимфолейкоза пато-логоанатоыические изменения. Патоморфологическими и гистологическими исследованиями у всех телят опытной группы был подтвержден диагноз - лимфоидный лейкоз.

Во-вторуы группу (экспериментальную) были включены три животных в возрасте 18 мес. При анализе гематологических показателей, а также результатов радиометрических и серологических исследований были выявлены значительные различия между первой и второй опытными группами. Так, у животных второй опытной группы только на 21 сутки после введения вируссодержащего материала были выявлены антитела к антигену гп51 у одного теленка,и лишь на 35 сутки отмечали появление антител у вссх животных, а титры антител к антигену гп51 составляли 1:4, 1:8 и 1:16 соответственно.

Только через 140 суток после заражения у животных 2-й группы наблюдали гематологические изменения, характерные для начальной

стадии лиыфолойкоза. По ходу эксперимента через 4, 9 и 12 мес. эти животные также были убиты,и у них гистологическими исследованиями был установлен диагноз - лимфолейкоз.

Третья экспериментальная группа состояла из 6 животных. Все они были подвергнуты воздействию ионизирующего излучения на установке ГУй-24 (источник излучения ^Ъг ) в дозах 50 Р (мощность дозы 50 Р/час), 150 И 200 Р (можность дозы 100 Р/час).

' Воздействие ионизирующеи радиации через 2 суток характеризовалось снижением общего количество лейкоцитов и числа лимфоцитов, а также вызывало снижение уровня синтеза Д!1К и РНК.

Через месяц после облучения животных содержание лейкоцитов в крови достигло в группе облученных в дозе 50 Р 6,3 ± 4,67 тыс/мкл, а через 2 мес. нормализовались показатели крови и в группах, облученных в дозах 150 и 200 Р, и только через 150 суток уровень синтеза ДНК и РНК соответствовал уровню контрольных показателей. Показатели, полученные через 150 суток после облучения,составили (±юн дая инфицирования животных вируссодержащим материалом. Доза леикоконцентрата и сроки исследования после его введения соответствовали предыдущим сериям опыта.

При заражении В1ЖРС облученных животных наблюдали изменения, • аналогичные таковым при заражении здоровых животных (I группа).

Однако проявление инфекции BJÍKPC было намного раньше (через 7 суток) по сравнению с I и 2 серий опытов. Так, через 7 суток титры антител к антигену гпЫ составляли от 1:2 до 1:16,а через три недели были уже от 1.3 до 1:64.

Гематологические изменения, характерные для начальной стадии ллм]/олепкоза, раньше были выявлены у животных, облученных в дозе 200 Р. Через 120 суток после заражения вирусом лейкоза количество леикоцитов в среднем по группе составило 19,2 + 8,3U тыс/мкл, и процент лимфоцитов 89,7 + 3,93.

Одно животное на 24 сутки, второе через 3 мес., а остальные через 4 мес. были убиты. На вскрытии л патомор^ологическом исследовании у телят обнаруживали однотипные изменения, которые но своему морфологическому проявлению отличались лишь по вовлечению в процесс различных органов и тканей. и степени выраженности изменений в них.

При гистологическом исследовании органов и тканеи от подопытных животных мы наблюдали в большинстве случаев лимфоидаый лейкоз (лиъцюцитарныи и лищюбластнын варианты) и недифференцирован-

ный лейкоз ( в двух случаях).

Экспериментальное воспроизведение лимьолеикоза на овцах_

Интерес к изучению гемобластозов у овец значительно возрос в связи с использованием их в качестве экспериментальной модели для воспроизведения данной болезни материалом, содержащим вирус лейкоза крупного рогатого скота.

По данным большинства исследователей, у овец, инфицированных ВЖРС, клинико-гематологические и патоморфологические изменения, характерные для гемобластозов, развиваются в более короткий срок, чем у крупного рогатого скота, однако, проявляются они не ранее чем через 1,5-5 лет после заражения.

Воспроизвести гемобластозы у овец в первый год после введения им различных материалов, содержащих ВЛКРС, удалось немногим ученым ( С.01аоп et.al.1972; А.П.Арак, 1973; А.Т.Левашов с со-авт., 1985; M.Gatex е1:.а1. 1989).

Цель нашей работы - проследить динамику развития экспериментальной инфекции у овец, зараженных вируссодержащим материалом (лейкоконцентрат), полученным от длительное время инфицированное и больной лейкозом коровы из замкнутого стада.

В опыте использовали 13 овец 10-1Ь-месячного возраста. До начала эксперимента все животные имели показатели крови в пределах уеизиологическои нормы и были свободны от ВЛКРС. Десять инфицированных и трех контрольных овец содеркали в соседних помещениях в одинаковых условиях.

Донорами крови служили больная лимролейкозом и инфицированная ВЛКГС корова-черно-пестрой породы из замкнутого стада и сво-оодная от влКРС корова из олагополучного по гемобластозам хозяйства, показатели крови которой находились в пределах физиологической нормы.

Кровь у животных брали из яремнол вены, в качестве антикоагулянта применяли гепарин (10-15 ЕД на I мл крови).

Лейкоциты, выделенные из крови этих двух коров, культивировали 24 ч в питательной среде (90$ среды 199, 10% детальной телячеи сыворотки и по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина) с добавлением ФГА (I мкг/мл). Лейкоконцентрат вводили животным внутривенно в дозе 10 мл (4 • Ю^ клеток):десяти овцам (опытная группа) -от больной лимфолейкозом и инфицированной ВЛКРС коровы, трем -

(контрольная группа) - от здоровой и свободной от ВЖРС коровы.

Спустя V, 14, 21 и 28 дней после введения лейкоконцентрата, а затем ежемесячно до момента убоя всех животных, проводили гематологические исследования крови по общепринятым методикам и определяли наличие антител к ВЖРС в реакции тшунодиффузии (РИД) с гликопротеидным антигеном вируса.

Антитела к гликопротеидному антигену (гп51) ВЖРС на 14-и день после введения лейкоконцентрата выявили только у двух животных опытной группы, а спустя 4 недели и до конца опыта -у всех подопытных овец. Через 2 недели после начала эксперимента у этих животных отмечали увеличение числа лимфоцитов, однако общее количество лейкоцитов при этом возрастало но у всех овец. Лейкоцитоз с лимфоцитозом наблюдали у инфицированных животных в течение 2-3 недель, затем показатели крови приходили к физиологической норме,и только у отдельных особей периодически регистрировали относительный лимфоцитоз. Показатели крови овец контрольной группы были в пределах физиологической нормы, антител к гп51 антигену в сыворотке крови этих животных не обнаружили.

Спустя 4,5 мес. после начала опыта одно подопытное животное пало, остальных убили через 12 месяцев.

При вскрытии павшей овцы отмечали истощение, подкожная клетчатка остальных животных хорошо выражена, иногда желтого цвета. У шести овец опытной группы наблюдали незначительное увеличение околоушных, предлопаточных, подвздошных, коленной складки и над-выменных лимфатических узлов (плотные, бледно-серого цвета), а также средостенных, бронхиальных и портальных (капсула несколько утолщена, блестящая, граница коркового и мозгового слоев сглажена, ткань пульпы серо-белого цвета).

Увеличение селезенки при вскрытии обнаружили у 4 животных. На разрезе она красно-коричневого цвета с хорошо выраженными ц.олликулаш. Видимых изменении, характерных дая гемоолиотозов, в других органах и тканях не регистрировали. При гистологическом исследовании у 6 овец опытной группы диагностировали лткоидныи лейкоз. Диффузную пролиферацию лимфоидных клеток отмечали в корковом слое лимфоузлов, в результате очертания фолликулов становились нечеткими, граница между корковым и мозговым слоями сглажена, .а в некоторых случаях совсем не заметна. Расширенные синусы мозгового слоя были переполнены новообразованиями из клеток лим-фовдного ряда различной степени зрелости.

В селезенке наблюдай увеличение размеров Сеолликулов за счет обогащения перифолликулярных зон лимфоидными клетками. В красной пульпе последние располагались ди&фузно, поэтому границы отдельных фолликулов не просматривались.

У двух овец обнаружили скопление лимфоцитов в виде цепочек и небольших тяжей в сердце по ходу мышечных волокон, при этом во всех полях зрения они теряли поперечную исчерченность.

В нашей работе у 60$ инфицированных ВЖРС овец через 12 мес. после заражения развился лимфоидный лейкоз. Это можно объяснить тем, что кровь для введения брали от коровы из замкнутого стада, в котором в течение 20 лет обновление поголовья проводили за счет молодняка собственной репродукции, то есть происходил гене-тическии отбор предрасположенных к развитию гемобластозов животных.

В стаде персистировал один и тот же штамм вируса, вирулентность и онкогенность которого возрастали.

Пути передачи вируса лейкоза крупного рогатого _скота_

Среди болезнен сельскохозяйственных животных опухолевой природа лейкоз крупного рогатого скота наносит народному хозяйству наибольший экономический ущерб.

В неблагополучном по лейкозу стаде снижается продуктивность животных, сокращаются сроки использования высокоценных быков-производителей и коров, затрудняется селекционно-племенная работа, осуществляются дополнительные 'затраты на проведение оздоровительных мероприятий.

Основной путь заражения животных происходит обычно горизонтально, т.е. после ввода здоровых животных в стадо, инфицированное ВЖРС, и в здоровых стадах - путем ввода в них животных, зараженных вирусом лейкоза.

Для успешного осуществления противоле1ишзных мероприятии необходимо хорошо знать источник ивдекции, пути и и.акторы передачи В-ЖРС, а также на основании современных диагностических тестов (РИД, ИфА и т.д.) своевременно и надежно проводить диагностику дашюго заболевания.

В связи с практической важностью этого вопроса и на основании собственных многолетних наблюдений, нашей задачей было обобщить имеющиеся результаты и дать предложения о путях снижения или

охране стад от инфекции BJIKPC.

При лейкозах крупного рогатого скота рассматривают в основном два варианта передачи вируса: пренаталыши (внутриутробный)-от матери плоду и постнатальный (горизонтальный) - от животного животному. Вместе с тем важное значение имеет выяснение контактного, энтерального (алиментарного) и парентерального (через кровь) путей передачи возбудителя болезни.

В связи с этим возникает необходимость тщательного рассмотрения ряда ij.акторов (молозиво, молоко, сперма, кровососущие насекомые, пересадка эмбрионов КРС, нанесение татуировок, массовое обезроживание и др.) в передаче BJIKPC от одного животного к другому.

а) Кровь как ¿актор передачи ВЛКРС

Среди (¿акторов, обуславливающих передачу вируса лейкоза, наибольшее значение имеют кровь, биологические препараты, получаемые из нее и манипуляции при обработках животных.

Так, ПО данным ряда авторов (Van Der Maaten М.Т.,et.al, IS8I; I.D.Miller et.al, 1985; J.F.Evermarm et.al, 1986) установлено, что для заражения животного достаточно ввести внутрикокно 2500 лимфоцитов крови.

В наших исследованиях, выполненных на шести телятах 4-месячного возраста, было установлено, что нанесение на кровоточащие раны, получаемые при установлении ушных бирок, 20 мкл крови от коровы, больной лим^олейкозом в 1005? случаев через 4-6 недель удалось установить передачу ВЛКРС.

Как отмечалось ранее, при введении 2 мл плазмы крови и леако-концонтрата от коровы, больной лим^олеикозом, также удалось инфицировать опытных телят. Следовательно, кровь и ее компоненты могут служить источником поредйчи ВЛ1СРС.

б) Голь спермы и метод осеменения животных в распространении ВЛКРС _

¿ели принимать во внимание возможность передачи возбудителя лейкоза от животного к животному, то нельзя исключить из этой цепи и передачу ВЛКРС через сперму.

При выяснении передачи ВЛКРС через сперму биков-нроизводитолоЕ нами были отобраны 15 быков, в том числе 10 положительных в РИД. На искусственную вагину брали сперму и от каждого быка в объеме 2-5 мл вводили ее внутрибрюшинно овцам. Из крови каждого быка вы-

делялп лейкоциты после лизировашш эритроцитов гипотоническим шоком л таксе вводили внутрибршинно овцам. Серологические и гематологические исследования овец проводили через 30, 43, 12 дней п 29 месяцев после зареяеешш. У 18 овод, которым ввели лейкоциты крови 10 быков-носителей антител к гликопротекду ВЛКРС, через 48 дно il после заражения развилась хроническая инфекция, при которой отмечали персистенцгао вирусспецпфпческпх антител в T04GHIÎG 29 мес. (срок наблюдения). Из 9 овец, которым ввели лейкоциты крови 5 быков с отрицательной РИД,и из 4 контрольных овец, содержащихся совместно с зараженными, ни у одной не установили ьпрусспецифических антител. Отрицательные результаты биопробы были получены и при серологическом исследовании 18 овец, иноку-лированных спермой 9 быков, инфицированных ВЛКРС, а также 10 овец, шокулированннх спермой 5 серологически отрицательных в РИД быков. Трехкратные отрицательные результаты серологических исследований овец, которым внутрибрюшинно вводили сперму инфицированных ВЛКРС быков-производителеи, дает основание считать об отсутствии вируса лейкоза в сперме.

ii связи с практической важностью вопроса о роли быков-производителей в передаче вируса лейкоза крупного рогатого скота нами был поставлен опыт на экспериментальной базе института. Для этого из благополучного по лейкозу хозяйства были завезены 60 телочек 8-месячного возраста черно-пестрой породе. На протякешш году ежеквартально проводили гематологические и серологические исследования откх животных. Результаты исследований были отрицательными. случки этих толок был отобран бык, больной лимфо-лейкозом и инфицированный ВЛКРС, гематологические показатели которого л;.юлн следующие гренпщ.: количество лейкоцитов в I мкл кров:, - 32,0 тыс, УОЙ лимфоцитов.

В реакции иычунодиффузии (РИД) и пммунофермонтном анализе с антигоном ВЛКРС сыворотка крови на протяжении более года была положительной.

Чориз СО дней ¡¡Осло случкк у 1 жпвотш;;: в сгвороткс крот; била обнаружены антитела к ВЛКРС. При достижении 5-цссячного развития плода 30 животных били убиты. В эту группу вошли и 3 нотеля, пинцированные ВЛКРС. При исследовании крови у одного плода,мать которого была инфицирована, обнаружены антитела к ВЛКРС. При культивировании клеток крови этого плода с последующей постановкой биопробы на овце (которая через 25 дней стала инфицированной

ВЛ1СГС) подтвердилось предположение о ннфицпрованности вирусом лейкоза как штери, так и плода.

Во второй части опыта была поставлена задача - выяснить передачу ВЛКРС здоровому быку, введенному в стадо, состоящее из 30 коров, больных геыобластозами и инфицированных ВЛКРС. Через 70 суток совместного содержания в загоне с больными животными в сыворотке крови этого быка в РИД были выявлены антитола к ВЛКРС.

Таким образом, при проведении ручной случки здоровых животных с быком, больным лимфолейкозом и инфицировавши ВЛКРС, можно распространить инфекцию в хозяйстве, и наоборот, когда здоровый бык используется в неблагополучном хозяйстве, он может инфицироваться вирусом лейкоза и стать распространителем данной инфекции.

в) Роль молозива и молока в передаче ВЛКРС

В настоящее время известно, что выделение ВЛКРС из организма больного животного потенциально возможно с любым секретом, который выводится во внешнюю среду и содержит в себе лимфоциты крови. Поэтому среди физиологически обусловленных путей и факторов переноса ВЛКРС восприимчивому животному может быть заражение через молоко.

Разноречивость литературных данных о роли молозива и молока больных коров в передаче ВЛКРС, по-видимому, обусловлена неидентичностью методических подходов при изучении данного вопроса.

Вместе с тем в литературе обсуждаются данные, свидетельствующие о том, что ВЛКРС может передаваться с молоком и должен рассматриваться как возможная причина множественного склероза и других неврологических синдромов человека.

Для изучения возможности породами ВЛКРС с молоком больных лейкозом коров, нами были поставлены опыты на кроликах калифорнийской породы. 1-я группа состояла из 7 кроликов, которым спаивали молоко от коровы, больной лимполейкозом, но со здоровыми долями вымени (исследовали с помощью мастицина).

2-я группа состояла из 7 кроликов, которым спаивали молоко от ыороиы, больной лимфолейкозом, с добавлением 5 мл крови от этой же коровы.

В 3-ю группу были включены 4 кролика, которым спаивали молоко от коровы, больной лимфолейкозом, но предварительно прогретой 5 шш при температуре 70°С.

4-я группа состояла из В кроликов, которым спаивали молоко от коровы, больной лимфолейкозом, полученное из доли вымени,

пораненной маститом (мастит был воспроизведен экспериментально путем введения культуры стрептококков-).

В 5-ю группу били включены 7 кроликов, которым спаивали сборной молоко, полученное из всех долен вшлеш; от коровы, больной лшфолеикозом и с пораженной маститом одно!; долей вымени.

6-я группа состояла из <1 кроликов, которым спаивали сборное молоко от коровы с пораженной долей вымени, но прогретое 5 мин при 70°С.

7-я группа состояла из 5 кроликов (контроль), которым спаивали молоко от клинически здоровой коровы.

Кролики калифорнийской породи содержались в одинаковых условиях. Молоко спаивали в течение месяца по 50 мл каждому утром и вечером.

У коров-доноров ja* 6770 и 6794 регулярными серологическими исследованиями обнаруживали в РИД антитела к антигенам гп51 и р24 ВЖРС.

Гематологические показатели у коров-доноров на начало опита характеризовались увеличением общего количества лейкоцитов и процента лимфоцитов. Так, у коровы 6770 количество лейкоцитов составило 20,0 тыс/мкл и 905» лимфоцитов, а у донора .'* 6794 - 16,3 тыс/мкл и 86$.

Количество соматических клеток в I ш молока составляло в среднем: у коровы .'.V 6770 - 65,72 ± 3,76 тыс., у донора .'." 6794 -7G,68 ± 4,26 тыс., у здоровой коровы 10,6 i 3,24 тыс/мл.

Морфология клеток в мазках, приготовленных из осадка молока, была различно,'! и наряду с соматическими клетками молока обнаруживали форменные элементы крови.

Наиболее резко отличались препарат!:, приготовленные из доли f

вымонп пораженной маститом. Так, у коровы, больной маститом, количество соматических клеток составляло от 400,0 до 600,0 тыс/мл. Мы установили, что из всого многообразия клеток, содержащихся в секрете молочной железы коров, наибольший интерес предсташишт кубический эпителий (эпителий 4-го тип;] - классиГ икшцш К.И.Иовд-рахшюй, 1975). 3 зависимости от физиологического (лактация, сухостойный период) и патологического (маститы, лейкозы) состояния вымени наряду с количественными (увеличение) происходят и существенные морфологические (увеличение размера ядра и цитоплазмы, вакуолизация, клазматоз, многоядерность) изменения клеток этого вида. Пролиферативную активность клеток секрета вымени коров ис-

следовали методом авторадиографии по результатам включения 3Н-тимидина. Мечеными были в основном клетки эпителия 4-го типа. Индекс метки - процентное соотношение числа меченых клеток к общему количеству подсчитанных у животных, больных лейкозом,составлял от 0,18 + 0,06 до 6,17 + 2,3; больных маститами 0,12 + 0,04 и у здоровых лактирующих животных 0,05 + 0,001.

Морфология меченых клеток кубического эпителия разнообразная. Мечеными были мелкие, средние и крупные клетки; с компактным и рыхлым, овальным, круглым и лопастным ядром; с узким ободком цитоплазмы и широкоплазменные. Обнаруживали также клетки в состоянии митоза. Метка располагалась равномерно над ядром. Встречали« клетки со слабой, средней и интенсивной меткой.

Полученные данные свидетельствуют о том, что эпителиальные клетки секрета вымени после отторжения от базальной мембраны сохраняют способность к митотическому делению.

Для биопробы использовали 7 ягнят 3-5-месячного возраста. Молоко, спаиваемое кроликам,служило предметом исследования в биопробах. Испытуемый материал в дозе 10 мл вводили овцам внутрибрю-шинно. Животные, которым инокулировали молоко от больных лейкозог* коров (опыты I, П, 1У, У, У1),через 30-45 дней были положительны в РИД, что свидетельствует о наличии ВЛКРС в исследуемом материале. Животные, которым инокулировали прогретое молоко и молоко от здоровой коровы (контроль),в период всех исследований оставались серонегативными, что свидетельствовало об отсутствии вируса лейкоза.

Комплексными исследованиями, проведенными в динамике опыта показано, что через 60 суток после прекращения спаивания молока у 2-х кроликов 4-й группы были обнаружены в РИД антитела к ВЛКРС. Поставленная биопроба на овцах (5 1.1л крови кроликов ввели внутри-брюшинно овцам) подтвердила развитие онкорнавирусной инфекции у 2-х кроликов. По истечении 90 суток в 4-й группе положительные результаты были выявлены еще у одного кролика. В этот же период исследования в I группе был выявлен один, во 2-й группе - два, в 5-й группе - один кролик, сыворотки крови которых реагировали положительно с антигеном гп51 ВЛКРС.

В последующем,через 4, 6 и 12 месяцев результаты серологических исследований были постоянными и характеризовались следующими показателями. Так, в I группе животных на протяжении всех исследований был выявлен один кролик, сыворотка крови которого реаги-

ровала положительно в РИД с гп51 антигеном ВЖРС,. во 2 группе из 7 кроликов у 3 выявлены антитела в РИД, в 4-й группе из 8 кроликов у 3, в 5-й группе из 7 кроликов у 2, а в группах 3, 6 и 7 все особи были серонегативными на протяжении всего опыта.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о воспроизведении инфекции вируса лейкоза в эксперименте на кроликах при спаивании им молока от коров, больных лимфолейкозом и инфицированных ВЖРС.

Отсутствие развития онкорнавирусной инфекции у кроликов 3 и 6 групп, которым опаивали молоко, предварительно обработанное при 70°С на протяжении 5 мин, а также в контроле, свидетельствует об отсутствии в молоке вируса лейкоза.

Особый интерес вызывает вопрос о профилактике новорожденных телят от заражения вирусом лейкоза крупного рогатого скота. В настоящее время разрабатывается ряд биологических препаратов, направленных для решения данной проблемы. Так, в работах Р.А.Ку-кайн с соавт.(1991), А.Д.Альтштейна и А.Ф.Валихова (1991) рассматривается предложение по разработке эффективных средств профилактики от заражения вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

В наших исследованиях предпринята попытка разработать способ профилактики полученных от неинфицированных коров новорожденных телят от заражения вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Для этой цели телятам, полученным от неинфицированных коров, скармливали молозиво коров, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота, которое содержит колостральные антитела к вирусу лейкоза. Молозиво, содержащее антитела против ВЖРС,скармливали телятам дважды, первую выпойку молозива теленку проводили не позднее 2 часов после рождения в количестве 1,5 - 2 л и второй раз - при третьем кормлении в том же количестве. Во второе, четвертое и последующие кормления теленку выпаивали молозиво и молоко здоровой коровы.

В первом опыте 16 новорожденным телятам скармливали дважды молозиво, содержащее колостралыша антитела. Первую выпойку молозива проводили через 1,5-2 часа после рождения в количестве 1,5 л, а вторую - при третьем кормлении теленка в количестве 2 л. Пассивные колостральные антитела были обнаружены в сыворотке крови всех телят через I сутки и сохранялись у 8 телят до 5 мес. и у 4-х до 4 мес.,и к 6-месячному возрасту у всех телят антитела в крови не обнаруживались.

В табл.6 представлены материалы по проверке напряженности иммунитета у телят при прямом заражении их ВЛКРС. В опытах находились 3 группы животных. Телятам первой и третьей групп через I - 1,5 ч после рождения скармливали молозиво, содержащее антитела против вируса лейкоза. Вторая группа телят была свободна от колостральных антител к ВЛКРС. В возрасте 1,5 мес. телятам первой и второй групп была введена подкожно кровь коровы, инфицированной ВЛКРС. Через 30 дней биопробой на овцах ВЛКРС был обнаружен у всех телят второй группы (контроль на заражение) и у двух телят из 5-ти первой группы. Животные третьей группы в течение всего срока наблюдения оставались свободными от вируса лейкоза.

Таблица 6

Напряженность колострального иммунитета у телят в 1,5-месячном возрасте

Группа животных

Номер ! РИД животных!до прие-!после

!ма моло-!приема ______------

_!зива ¡молозива!30 дней)!45 дней !60

! После заражения_

¡биопроба!Рад у овец после !(через ^¡постановки биопробы

дней

I (опытная)

0862

0863

0864

0865 0868

2 (контроль- 0807 ное зараже- ддл

0813 0816

ние

3 (интактный 0861 контроль) оддц

0869 0874 0876

+ + + + +

Биопроба на овцах

^ + + + +

+ + +

+ +

+ +

( +

+

I +

Таким образом, телят, полученных от неинХицированных коров можно сохранить от заражения ВЛКРС и содержать совместно с телятами, инфицированными внутриутробно, с помощью скармливания им молозива от инфицированных вирусом лейкоза коров.

Разработка метода экслресс-авторадиограйии

Практически нет разделов биологии, биохимии и медицины, в которых в том или ином виде не нашел бы применение метод авторадиографии.

Длительное время экспонирования - основной существенный недостаток метода тонкослойной авторадиографии с малоактивными источниками излучения как 3Н, который особенно широко применяют в цитологических исследованиях для определения клеточной пролиферации.

К лучшим отечественным промышленно выпускаемым эмульсиям для тонкослойной авторадиографии следует отнести эмульсии типа М и Р.

За рубежом наибольшее распространение получили эмульсии G-5, К-6 И 1-4 фирмы Ilford; NTB, ИТВ2, НТВЗ фирмы Kodak И др., различающиеся между собой прежде всего размером микрокристаллов (МК) галогенида серебра.

Высокочувствительная фотоэмульсия-гель "УК" для регистрации ■¿-излучения предназначена для применения в биологии, медицине, минералогии и металлургии, где широко используется метод авторадиографии. Чувствительность, измеряемая временем экспозиции образца с толщиной покрытия фотоэмульсий-гелем "УК" 1,0 мкм для получения плотности 0,10 при облучении суммарным потоком jZ -излучения от эталонного источника 3Н-тимидина с удельной активностью 20 кюри на моль, составляет не более 12 часов.

Основное достоинство фотоэмульсии "УК" - сокращение времени экспонирования исследуемого объекта от двух-трох недель до нескольких часов, что впервые достигнуто в мировой практике. Сокращение времени экспонирования имеет особенно важное значение при проведении обследования онкологически больных людей, где от быстроты получения результатов зависит правильная постановка диагноза и своевременность лечения.

Широкая доступность реактивов и простота обработки фотоэмульсии геля "УК" делает метод экспресс-авторадиографии простым и естественным для небольших медицинских учреждений и исследовательских лабораторий широкого профиля.

Цель данного исследования заключается в разработке и проведении оценки уровня чувствительности кfl -излучению эмульсии-гель "УК" по сравнению с лучшими образцами эмульсий, изготовлен-

ними в нашей стране и за рубежом, на примере изучения процессов клеточной пролиферации в цитологических исследованиях.

Работа проводилась на мазках крови здоровых и больных лим-фолейкозом животных. Клетки крови инкубировали с 3Н-тимидином (I мкки на I мл клеточной взвеси, удельная активность 21,6 ки/ моль) в течение I часа при 38°С. Из клеточной суспензии готовили мазки и фиксировали их метиловым спиртом в течение 5-7 мин.

Эмульсии "УК, "М" и "Р" расплавляли при температуре 50°С в течение 30-45 мин. В расплавленные эмульсии, в зависимости от образца, вносили добавки (смачиватель, дубитель) в равных количествах. Эмульсии разбавляли в соотношении 1:1 в растворе бромида кальция (3 мл 10$-ного раствора на I л воды) и наносили на образцы.

Для нанесения эмульсий на мазок пользовались методом вертикального погружения с последующим удалением эмульсии с нерабочей части стекла марлевым тампоном. Мазки сушили в горизонтальном положении 30-40 мин, затем помещали в светонепроницаемые коробки для экспозиции. В зависимости от поставленных целей и объекта излучения, время экспозиции подбирали путем проявления контрольных мазков. Одновременно готовили образцы эмульсий G-з, ь-4, к-5 фирмы iiford и птв, NTB2, птвз фирмы Kodak согласно инструкции.

Препараты экспонировали при 4°С в течение 3,6,10,12,24 час, 1,3,4,7,10,14 и 30 суток. Поело экспозиции препараты также, как и обычные фотоматериалы фиксировали, промывали, сушили и окрашивали.

Оптимальное время и условия проявления зависят от требований эксперимента и определяются в процессе отработки методики в лаборатории. При проведении данной работы использовали проявитель Д-19 и фиксировали препараты в 30-35$-ном растворе гипосульфита натрия в точение 10 мин.

Хорошее качество авторадиографии достигается при условии, если температура всех растворов, используемых при их обработке, поддерживается примерно одинаковой - 18-20°С. Важно помнить,что ядерные эмульсии содержат более высокий процент бромистого серебра, чем фотоэмульсии, что скорость фиксирования резко падает с накоплением в растворе продуктов фиксирования. Неэкспонированное бромистое серебро, оставшееся в слое после процесса проявления, растворяется при фиксировании и удаляется из эмульсионного слоя

проточной водой. Во время промывания проточной водой желатин эмульсионного слоя, как правило, обычно набухает и требуются особые меры предосторожности, чтобы не повредить или не переместить эмульсию.

13 процессе выполнения данной работы были отобраны наиболее приемлемые условия при использовании эмульсии-гель "УК". Наилучшее качество автографов было достигнуто при проявлении в течении I мин в проявителе Д-19, разбавленном 1:10 дистиллированной водой и окрашивании краской Романовского-Гимза (1:15) в точение 20 мин.Зсе остальные типы эмульсий, которые использовали для сравнения с эмульсией-гель "УК", проявляли 6-8 мин в проявителе Д-19 и также фиксировали и окрашивали как препараты с нанесенной эмульсией-гель "УК". Чувствительность эмульсий оценивали по величине индекса метки (ИМ), который подсчитывали среди меченых 3Н-тимидином клеток.

Первые радиоавтографы на образцах эмульсии "УК" появились уже при 3-часовой экспозиции и увеличивались в количестве числа зорен восстановленного серебра над ядром клетки до 6-часовой экспозиции,« затем с увеличением времени экспозиции величина индекса метки (ИМ) менялась незначительно ( в пределах ошибки измерения).

Это свидетельствует о том, что экспозиция в течение 6 часов позволяет выявить максимальное количество меченых клеток. При работе с эмульсией типа "Ы" время экспозиции составляло 14 суток, а для эмульсии типа "Р" - хи суток. Аналогичные результаты для эмульсии и-5 достигались при экспонировании в течение I суток, а для эмульсий и ь-4 - 7 и 14 суток соответственно.

Таким образом, высокую чувствительность, стабильность фотографических свойств и хорошую сохраняемость имеет новая эмульсия "УК", разработанная в астроспектрографической лаборатории Гос. НИИ химфотопроекта, совместно с НИИ гематологии и пероливания крови и ВНИИ экспериментальной ветеринарии (г.Москва).

Совместно с вышеуказанными учреждениями разработаны технические условия на промышленное изготовление эмульсии "УК" и приоритет данной разработки подтвержден авторскими свидетельствами.

ВЫВОДЫ

1. Исследования, проведенные с использованием серологического, гематологического, авторадиографического и радиометрического методов, позволили выявить стадии болезни с учетом инфицирования животных ВЛКРС и иммунопролиферативных нарушении. Основываясь

на полученных данных комплексного исследования выявлено, что болезнь развивается по трем последовательно сменяемым стадиям: инфицирование животных вирусом; функционально-иммунологические изменения; клинико-гематологические изменения. Вместе с тем у небольшой части животных наблюдали проявление болезни со свойственными только для них стадиями: функционально-иммуногенетических изменений; клинико-гематологических изменений и инфицирование животных вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

2. Установлено, что уровень лейкоцитоза периферической крови находится в прямой связи с количеством ДНК-синтезирующих клеток в лимфоидной популяции. Повышение содержания активно пролифери-рующих лейкозных клеток является предвестником увеличения общего количества лейкоцитов, и, напротив, снижение показателей проли-феративной активности свидетельствует о стабилизации лойкозного процесса или наступлении ремиссии. Выявленная закономерность позволяет сделать заключение, что популяция лейкозных клеток обладает различными пролиферативными свойствами на разных этапах болезни.

Для экспериментального воспроизведения лимфолейкоза наиболее эффективным материалом является лейкоконцентрат от живот-нох'о, больного этой формой лейкоза, и вводоние подопытным животным плазмы крови и культуральной жидкости вызывало незначительные гематологические изменения, которые носили временный характер и на протяжении семи месяцев наблюдений ни гематологическим, ни гистологическим методами изменений, свойственных лимфолейкозу, обнаружить не удалось.

4. Экспериментальное заражоние телят, облученных различными дозами гамма-излучения (50, 150 и 200 Р), вирусом лейкоза крупного рогатого скота показало, что серологические, клинико-гематологические и патоморфологические изменения, характерные для

лимфолейкоза, проявляются интенсивнее и в более ра1- ■ . ^ики но сравнению с необлученными животными.

5. Определение с помощью радиометрического метода л~

лей синтеза ДНК и РНК в лимфоцитах крови животш,1х, " 1 ....витально зараженных вирусом лейкоза, позволяет чер.^ о суток после введения вируссодержащего матеп'яла обнаруживать повышенны»; уровень синтеза ДНК и РНК, чти .шляется прогностическим тестом и наиболее ранним симптомом проявления болезни.

6. Результаты наблюден.- дровами, больны;,ш лимфолеико-зом, показали, что в 20,,',.; <.о колебаниями от 12,5 до 33,3%) рождаются телята, инфицированные внутриутробно, и эти особи представляют собой источник инфекции для других животных при совместном их содержании.

7. Молозиво от инфицированных вирусом лейкоза коров предохраняет от заражения телят, полученных от неинфицированных матерей, на протяжении 5-7 месяцев совместного их содержания с инфицированными внутриутробно телятами.

8. При проведении ручной случки здоровых животных с быком, больным лимфолейкозом, удалось наблюдать перезаражение животных.

У. При выпаивании кроликам молока от коров, больных лимфолейкозом, в эксперименте установлена передача ВЖРС через молоко. Большую опасность представляет молоко от больных маститом коров. Молоко, предварительно прогретое с течение 5 мин при 70°С, но обладало инфекционными свойствами.

10. Авторадиографичоскими и радиометрическими исследованиями лимфоцитов крови здорового крупного рогатого скота разных возрастных групп установлено постоянное циркулирование клеток, активно синтезирующих ДЦК и РНК. Так, по данным авторадиографических исследований, эти показатели в сродном по группа составили 0,55 ± 0,04% и 1,2 ± 0,4$ , а по данным радиометрических исследовании 746 х 32,7 и 11)66 х У0,0 расп/мин соответственно.

11. В крови сельскохозяйственных животшх (лошади, крушил; рогатый скот, овцы, свиньи) постоянно обнаруживали пролиферирую-щие клетки лимфоидного ряда. Морфологическое изучение клеток крови крупного рогатого скота свидетельствует о том, что метку включают крупные (18-26 мкм), средние (14-18 мкм) и реже малые (10-13 мкм) бластные элементы крови, активно пролиферирующие

^часты большого и среднего диаметра.

.нальные клетки секрета вымени коров после отторжения от ной мембраны сохраняют способность к митотическому

~нию. Мь. ¡шми были мелкие, средние и крупные клетки. Метка располагалась равномерно над ядром.

13. Разделение животных на серопозитивную и серонегативную группы с размещением их на обособленных скотных дворах позволило на протяжении более 24 месяцев наблюдения сохранить животных от заражения BJIKPC.

14. Разработана эмульсия-гель "УК" для экспресс авторадиографии, обладающая высокой чувствительностью, стабильностью фотографических свойств, хорошей сохраняемостью, позволяющая через 6 часов экспозиции препаратов крови анализировать изучаемый материал.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЯОШШ

lia основании результатов исследований разработаны рекомендации и предложения, отраженные в следующих документах.

1. Инструкция о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота. Утверждена ГУВ МСХ СССР 29 декабря 1984 г.

2. Инструкция о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота. Утверждена ГУВ Госагропрома СССР 9 августа 1990 г

3. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Утверждены комиссией по продовольствию и закупкам при Совете Министров СССР, 1989 г.

4. Методические рекомендации по выявлению животных повышенного риска заболевания (с использованием радиометрического метода). Одобрены комиссией ОНКвет "Лейкозы, сравнительная и экспериментальная онкология животных" при ВАСХНШ 9 июня 1909 г.

5. Технические условия ТУ 6-17-1251-83 эмульсия-гель "УК" для тонкослойной экспресс-авторадиографии.

6. Авторское свидетельство (A.c.) Л I0I05I6 (СССР) "Способ получения галогенсеребряной фотографической эмульсии" (Уварова II.В., Гулюкин М.И., Касаткина В.В., Сундукова B.II., Романовская

K.M., Горбатов Б.А., Шпольский М-Р., Козинец Г.И.)- не подлежит публикации в открытой печати, 1983.

7. A.c. jv I045743 (СССР) "Способ изготовления галогенеереб-ряной фотографической эмульсии для авторадиографии" (Уварова Н.Б., Козинец Г.И., Гулюкин Ы.И., Волков Е.А., Сундукова В.Н., Горбатов В.А;, Шпольский ГЛ.Р.) - не подлежит публикации в открытой печати, 1983.

8. A.c. У» 2II3460 (СССР) "Способ профилактики полученных от нотифицированных коров новорожденных телят от заражения вирусом лейкоза крупного рогатого скота" (Бурба Л.Г., Валихов А.Ф., Ыурватуллоев С.А., Гулюкин М.И.), 1985.

9. A.c. Jà 248148 (СССР) "Способ получения эмульсии" (Уварова Н.В., Слабковская М.А., Гулюкин М.И., Сашин А.Г., Бахмутов Ю.Л., Чехова Г.П., Шпольский М.Р., Залесов В.А., Чистова Г.И.)-не подлежит публикации в открытой печати, 1987г.

10. A.c. л; I703I20 (СССР) "Способ диагностики инфицирован-ностп плодов овец вирусом лейкоза крупного рогатого скота" (Бурба Л.Г., Гулюкин М.И., Иванова Л.А., Колина C.B., Васин A.B., Кудрявцева Л.А.), £991.

11. " Штамм перевиваемых клеток легкого эмбриона крупного рогатого скота - продуцент вируса лейкоза крупного рогатого скота" (положительное решение Госкомизобретения от 5 июня IÖ9I г.) (Гулюкин ГЛ.И., Замараева II.В., Дьяконов Л.П., Добунцова Д.В., Васин A.B., Иванова Л.А., Шишков В.П., Бурба Л.Г.).

12. Свидетельство участника ВДНХ СССР J.' 57 за 1987 г. "Повоо в профилактике и ликвидации лейкоза сельскохозяйственных животных" .

13. Удостоверение на серебряную медаль ВДНХ СССР за достигнутые успехи в развитии народного хозяйства СССР - 1990 г. "Современные меры борьбы и профилактики лейкоза крупного рогатого скота".

СПИСОК

основных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Горбатов Б.А., Гулюкин Ы.И. Пролиферативная активность лимфоцитов крови телят-потомков от больных лейкозами коров // 'Груда ВИЭВ, М., 1978, с.51-57.

2. Горбатов В.Д., Кудрявцева Л.А., Гулюкин М.И. Метод одновременного использования цитохимической реакции и авторадиографии на мазке при исследовании крови крупного рогатого скота // Бюлл.ВИЭВ, М., 34, с.9-10.

3. Горбатов В.А., Дун Е.А., Гулюкин М.И. Радиоавтографичес-коо и патогенетическое изучение клеток крови и костного мозга потомков больных лейкозом коров // Бюлл. ВИЭВ, 1979, 36,с.47-50.

4. Кондрахина К.Н., М.И.Гулюкин. Включение 3Н-тимидина в клетки секрета вымени коров. //Бюлл.ВИЭВ, 37, с.74-75, 1979.

5. Горбатов В.А., Гулюкин М.И. Ыорфофункционалыше особенности клеток крови при лейкозах крупного рогатого скота //Проблемы экспериментальной онкологии и лейкозов человека и животных. М., "Колос", 1979, с.341-343.

6. Гулюкин М.И., Горбатов В.А. Пролиферативная активность лимфоцитов крови коров при некоторых болезнях // Бюлл.ВИЭВ, М., 36, с.57-59, 197У.

7. Гулюкин М.И., Горбатов В.А., Кондрахина К.Н. Определение жизнеспособности клеток секрета вымени коров // Труды ВИЭВ, 50, 1979, с.63-65.

8. Гулюкин М.И., Валихов А.Ф., Симонян Г.А., Горбатов В.А., Бурба Л.Г., Кудрявцева Т.П., Воробьева В.С. Изучение лейкоза у телят-близнецов //Ветеринария, М., 1979, 8, с.28-29.

9. Шишков В.П., Бурба Л.Г., Валихов А.Ф., Гулюкин М.И., Вражин Е.^., Симонян Г.А., Кожин П.Д. Выявление онкорнавируса в сперме быков-производителей // Сб.статей Донского СХИ, Персиа-новка, 1989, 15, 44, с.6-9.

10. Горбатов В.А., Кудрявцева Л.А., Гулюкин L1.1I. цитокиноти-ческие и цитохимические характеристики гемопоэтичеекпх клеток при лейкозах крупного рогатого скота //Труды ВИЭВ, М., 1981, 54, с.38-49.

11. Галеев Г.Ф., Валпхов А.Ф., Гулюкин М.И., Мурватуллоев С.А. Вирусологическое исследование телят, рожденных от коров, инфицированных онкорнавкруооп //Доклада ВАСХНИЛ, %]., liXH, 1Ü,

с .44-40.

12. Гулюкин М.И. Лейкоз толят //Бголл.ВПЭВ, J.I., 1080, 47, с.42-44.

13. йодорченко А.Н., Гулюкин ¡'.1.II. Сравнительная гематологическая и иммуносорологическая диагностика лейкозов крупного рогатого скота. Распознавание и мери борьбы с лейкозами человека и животных // Тез.докл.Всесогозн.копф. 22-24.09.82 г., Белая Церковь, М., 1982, с.86.

14. Дун Е.А., Гулюкин М.И., Головченко A.Ii. Патогенез гегло-бластоза крупного рогатого скота //Ветеринария, М., 1982, 3,

с.35-37.

15. Горбатов В.А., Гулюкин М.И. ДНК-синтезирующие лимфоциты крови коров, больных лимфолейкозом. Распознавание и меры борьбы

с лейкозами человека и животных // Тез.докл.Всесоюзп.конф. 22-24 09.82 г., Белая Церковь, М., 1982, с.54-¡35.

16. Дун Е.А., Гулюкин М.11. Прогностическое значение изменений хромосом и пролиферативной активности лимфоидных клеток при гемо-бластозах крупного рогатого скота //Современные проблемы профилактики и лечения зоонозных заболеваний и лейкозов (Гродно, 3-0.09.82 г.) /Доз.докл.роспубл.научи.-ироиз.кон]., Минск,1982, с.218-219.

17. НяХмансон В.М., Дун Е.А., Гулюкин М.И., Карликов Д.В., чедорчонко А.Н., Бусол В.А. Меры профилактики и борьбы с лейкозами крупного рогатого скота путем создания стад из генетически устойчивых линий и семейств // Труды ВИЭВ, 1983, 59, с.82-86.

18. Коромыслов Г.Ф., Газдаров А.К., Гулюкин М.LI., Чушрина П.В. Состояние метилирования ДИК лимфоцитов крови при спонтанном и экспериментальном лейкозе крупного рогатого скота // Тоорот.п практич.вопросы ветеринарии, т.З Лейкозы, Тарту, 1983, с.43-47.

19. Гулюкин М.П., Кудрявцева Т.П., Горбатов В.А., Бурба Л.Г. Уварова Н.В. Авторадиографические исследования при лимфолейкозе крупного рогатого скота //Ветеринария, М., 1983, 2, с. 29-32.

20. Ыурватуллоев С,А., Гулюкин М.И., Иванова Л.А. Пренаталь-ное и постнатальное инфицирование телят вирусом лейкоза крупного рогатого скота //Теоретические и практические вопросы ветеринарии. (матер.республ.конф."Ветеринарные проблемы индустриального животноводства"), Тарту, 1983, 3, с.240-244.

21. Гулюкин Ы.И. Иммунобиологический ответ телят на введение суспензии клеток крови лейкозного животного // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных, Тезисы докл.Всесоюзн. конф., Ташкент, 1984, с.45.

22. Иванова Л.А., Гулюкин М.И. Антителообразование на ранних стадиях развития ретровирусной инфекции //Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных. Тезисы докл. Всесоюзн. конф., Ташкент, 1984, о.52-53.

23. Гулюкин М.И., Коропов И.В. Иммуногематологическая характеристика крови телят, экспериментально инфицированных вирусом лейкоза //2-й Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов. Тезисы докл. 15-18.10.85 г., Львов, с.334-335.

24. Гулюкин М.И. Авторадиографическое исследование клеток крови крупного рогатого скота //2-й Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов. Тезисы докл. 15-18.10.85 г., Львов, с.330.

25. Гулюкин Ы.И., Бурба Л.Г., Иванова Л.А. Результаты серологических и морфофункциональных исследований крови телят от инфицированных вирусом лейкоза и больных лимфолейкозом матерой //Ветеринария, [Д., 1985, II, с.32-38.

26. Гулюкин М.И., Горбатов В.А., Уварова II.В. Морфология ДНК-синтезирующих клеток крови при лимфолейкозе крупного рогатого скота //Вестник сельхоз.науки, 1985, 4, с.126-132.

27. Уварова И.В., Гулюкин М.И., Касаткина В.В., Козинец Г.И. Оцульсия-гель "УК" для экспресс-авторадиографии /Дурнал научной и прикладной фотографии и кинематографии, М., 1986, 5, с.376-379.

28. Газдаров А.К., Гулюкин М.И., Чупырина И.В. Oa/Mg-зави-сиыая эндонуклеаза ядер лимфоцитов крови как показатель инфици-рованности телят ВЛВ //Этиология, диагностика, профилактика ге-мобластозов, проблемы диспансеризации и реабилитации гематологических больных. Тезисы докл.симпозиума, Рига, 1987, с.25.

29. Гулюкин М.И., Бурба Л.Г., Иванова Л.А., Васин A.B.,

Кузнецова Е.В. Экспериментальное воспроизведение лимфолейкоза на телятах //Ветеринария, М., 1987, 2, с.22-28.

ЗУ. Гулюкин М.И., Монаенко В.Г., Меретов Д., Бобкова Т.Е., Мамаева Л.И., Зоякина Т.Н. Меры борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в среднеазиатском регионе СССР // Бгал. ВМЭВ, М., 1988, с.75-76.

31. Гулюкин М.И., Васин А.В., Панова Л.А., Замараева Н.В. Экспериментальное воспроизведение лейкоза на телятах //Бюлл. ВИ5В, 1988, 1.1., с.13-16.

32. Горбатов В.А., Гулюкин М.И. Морфологическая характеристика клеток системы крови при лейкозах // В кн.: "Лейкозы и злокачественные опухоли животных" под род. Шишкова В.П. и Бурбы Л.Г., М., Агропромиздат, 1988, с.204-211.

33. Бусол В.А., Гулюкин М.И. Патогенез лейкоза крупного рогатого скота // В кн.: "Лейкоз сельскохозяйственных животных" под ред. БусолаВ.А., Киев, "Урожай", 1988, с.174-203.

34. Гулюкин М.И. Кинетические аспекты лимфолейкоза крупного рогатого скота //Ветеринария, М., 1989, II, с.29-34.

35. Гулюкин М.И., Замараева Н.В. Синтоз ДНК в лимфоцитах крови животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота // Биохимия сельхоз.животных и продовольственная программа. Всесоюзный симпозиум 26-28.09.89 г., Киев, с.33.

36. Газдаров А.К., Чупырина И.В., Гулюкин М.И., Коромнслов Г.Ф. Са/Мс -зависимая эндонуклеаза ядер лимфоцитов крови как показатель инфяцированности телят ВЛКРС //Ретровирусы и их роль

в патологии человека и животных. Рига, "Зинатне", 1989, с.56-61.

37. Гулюкин М.И., Замараева Н.В., Востряков А.П., Карташов II.А., Овдиенко Н.П., Касич В.Ю. Синтез нуклеиновых кислот в лимфоцитах крови облученных телят //Актуальные проблемы ветеринарной и зоотехнической науки в интенсификации животноводства, !.!., 1990, с.162-163.

38. Снежков И.И., Гулюкин М.И., Снежкова В.Н. Физико-химическое показатели и микробиологическая характеристика молока лейкоз-ных коров //Тезисы докл. ХШ научно-практич.конф."Развитие АПК: проблемы, поиски, решения", Калинин, 1990, с.148-149.

39. Гулюкин M.И., Замараева Н.В., Уварова Н.В. Применение метода авторадиографии в биологических исследованиях //Теорет. и практич.вопросы ветеринарии, Тарту, 1990, с.84-93.

40. Гулюкин М.К. Некоторые аспекты патогенеза экспериментального лейкоза крупного рогатого скота //Проблема оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота. Тезисы докл.Все-союзн.научно-производ. конф., Новосибирск, 1990, с.57-58.

41. Гулюкин М.И., Колина C.B., Васин A.B., Иванова I.A., Бурба Л.Г., Кудрявцева Л.А. Внутриутробная передача ВЛКРС при экспериментальном нарушении плацентарного барьера //Теорет. и практич, вопросы ветеринарии, Тарту, 1990, с.44-47.

42. Гулюкин М.И., Васин A.B., Замараева Н.В. Пути передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота //Ветеринария, П., 1990,

I, с.27-31.

43. Снекков 11.И., Гулюкин ¿Л.И., Бурба Л.Г., Васин A.B. Биологические свойства молока и его роль в распространении возбудителя лейкоза крупного рогатого скота //Ветеринария, Ы., 1991,

II, с.30-34.

44. Васин A.B., Гулюкин Ы.И., Бурба Л.Г., Кунаков A.A. Экспериментальная ДЯКРС-инфекция и лимфолейкоз овец //Ветеринария, М., 199I, 6, с.20-21.

Отпечатано во ВНИИметмаше

Объем 2 печ.листа тир.150 экз. зак. 2040

Рис.1. Кариомстрия ДНК-синтезирующих клеток крови животных,больных^лимфолелкозом.

Рис. Результаты исследовании телят, инфицированных в разные сроки.

Рис. 3. Результаты исследований телят третьей группы в динамике.