Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изучение вирусной геморрагической септицемии радужной форели в хозяйствах Украины (эпизоотология, диагностика, методы борьбы)

!;,л' МІНІСТЕРСТВО СІЛЬСЬКОГО ГОСПОДАРСТВА

1 ПРОДОВОЛЬСТВА УКРАЇНИ Український дср^апн'лй аграрний укі версетс?

На правах руновагу

КіСГйггЛКО Володкмкр Сеизиовяч:'

.вйзчешя' віг/саої ггхрмчяші сепгшеиН

?ЛД2У2ЮІ ЮРЕДІ З ГОСПОДАРСТВАХ УКРАЇНІ! /епізоотологія,діагностіжа,заходи боротьби /

16,00.03 - Ветеринарна мікробі одогтя, вірусологія, епізоотологія, мікологія та імунологія

А з •? о ? е ф з р і V. ■

Кйсертацг ї яа здобуття’науязрого сіупекя каидада::» ветеріизригос' кзук ' ■ -

кий і9?з

Робота виконана в Українсько«}' науково - дослідному інституті аявакультурк іригаційних гідросистем -

. Науковий керівник - , доктор біологічних вауг

. ■ БучецькиЯ Леонід Петрович

Офіційні опоненти - доктор ветеринарних наук

. Старчеус Анатолій Павлович

. % • ¡Ш£2ВД2? ветеринарних наук,

. ’ _ професор '

. Мйкятісх Петро Васильоейч .

Провідна установа -і , Західний філіал Українського

, інституту,експериментальної і

- - ’ • кяііпякої ветеринарної медицини

2a.Tv.CT дисертації відбудеться * Ъо ". Оеї 1993 р.

о і Ч год, ва засіданні спеціалізованої ради Д» 120. 71. 03.

при Українському дерхазноцу аграрному університеті в 412 аудиторії 12 учбового корпусу. ■

Прохання взятї участь в обговоренні дисертації яри її захисті або наді слати Ваз відгук на автореферат у двох примірниках, зазїренкх печаткою на адресу : 252041, Київ - 41, вуя, , Героїв Оборони, 15. Сектор захисту дисертацій.

З дмсергаціеі) мсжиа. ознайомитись в бібліотеці університету.

Автореферат розісланяй * 2$ * о' 1933 року.

Вчений секретар , /7

спецісяізо&аноі ради - >ч У' -—-- .

доктор ветеринарних кауж В‘А'ВоРткічук

загальна' характеристика роботи

Актуальність теми . Успіх розпитку рибництва з значній мірі

залежить від того , наскільки послідовно і цілеспрямовано буда__________

здійскпратись боротьба », понаднормативнж'изтратами риба їід хвороб. Серед них.вірусна геморагічна септицемія. / ЗГС / форе -лі займаз особлизе місце» у зв’язку з наявністВ трьох серотетів збудника і різноманітні сто кліничних форм перебігу хвороби. Міжнародним епізоотичним бюро БГС віднесена до надбільш небезпечних хвороб риб.- Захворввайкя пошйргнв в усіх країнах катерксо-вої частини Європи, урахуз товарну форель та риб інзих видів , завпавчй значнігс ехономічкох збитків; В Україні ВГС вперше . «ареястрована нами у 1961 році / Наконечна И.Г., Нестеренко B.C. 1^9 /. Для недопущення подальшого попкрення хвороби по Україні, необхідно було узагальнити досвід боротьби з ВГС, розробити віт -чнзкяиі методи діагностики та заходи профілактики, що і обумовмо актуальність проведених досліджень. . .

Мета і завдання дослі джень . Основна мета робота подйгада у вивченні пйтаїа епізоотологіїі діагностики, заходів боротьба з ЗГС для.здійснення оздоровлення господарств від ці®ї хвороби.

Дія досягнення вказаної мети необхідно було вкрізитя наступні Завдання : .

- визначити епізоотичний стан, особливості перебігу епізоотичного процесу ВГС з промислових форелевих господарствах України ;

- провести тлпізаців та дослідити властивості зиділеїпіх ізоляті з збуднжеа хвороби ;

- визначити споссбя отримання антигені з та інукних сироваток для діагностики ВГС ;

- впровадити у виробництво ефективні заходи боротьба з ВГС .

новизна і практична цінність гоботи полягав з tost/ , Gfl впзріе в Україні було завчено епізоотологію ЗГС у форелевих господарствах, визначено .падхд та д»ереяа поанренкл цівї небезпечної інфекції. Показана можливість озцоревліжа від ВГС повносис -теиних господарств комплексний иетодом, без ліквідації цінних катодних стад-риб. Визначені умов;?, чо забезпечуоть иаі£с;:маяьн9 нчііспкчєкнд антигенів вірусу ВГС в культурах хлітзн, схеин очк -ценяя антигенів та г-іунізації тварин. Встановлена діагностична Цінність охрекдх серологічних реакція» Використати методів

діагност юси «а профілактики ВГС дозволило визначити небдагопо -лучні щодо ВГС форелеві господарства, здійснити в них цілеспрямовані протиепізоотичні захода, зменшити економічні збитки від захворювання та оздоровити наявні в Україні небдагоподучнї по ВГС господарства .

Апробація роботи . Основні положення, висновки і рекомендації дисертаційної роботи доповідалиеі та обговорювались на :

- виробничих vi«лабораторних нарадах Українського науково -дослідного інституту рибного господарства, Всесоюзного науково?* дослідного інституту рибного господарства, Державного науково г дослідного інституту оаерного і річкового господарства '

/ Київ , 1967 ; Москва , 1968 ; Ленінград , 1969 ./ ;

- засіданнях секції * Іхтіояатології, водної токсикології та , охорони гідробіонтів * відділений ветеринарії ВАСГНІД , кетодичної ради Подольського відділу Всесоюзного інституту експериментальної .ветеринарії: / Москва, 1966, і Подольск, 1989/;

«• ІУ Всєсошиій нараді по рибогосподарському використані аз > г реплих водойм У Курчатов , 1090 / ; : . . ■•••.-

- ЗХ Всесоюзній, нараді по йаразитам і хворобам рйб

, / Петрозаводск , 1991 / ; . , . , . ■ -

- . розширетк засіданнях віддігу екологічні« осноа боротьбй з паразятозака гідробіонтів Інституту зоології ім. І.І.Щмальгаузева АН України, лабораторії екології і токсикології їа кафедри вірусології Київського державного університету ім. Т.Г.Шевченка

/ Київ , 1991, 1933 : / і -.-т

- вчені» раді Українського науково - дослідного інституту ахвакультури іригаційних гідросистем / Київ , . 1993 / .

Публікації . Матеріали дисертації викладені s II друковайи* роботах. ' . •. - • .- \ '

Обсяг та структура яисертапії '. Дисертація складається із вступу, шести розділів, висновків, пропозицій для практичного примінення. Вона викладена на 141. сторінках мавикопису, містить 24 таблиці, 19 рисунків та фотографій. Список Цілованої літа «• ратури складається з ІбІ найменування, в тону числі 136 ва іноземних мовах. .■ . . . .• .. • . ■

, . Катеріад та'методика досліджень ♦ Епізоотологію ВГС вивчали в українських форелевих господарствах капротязі I960 - 1992 років. Всього проведено 42 «емісійні епізоотологічні обстеження. .

Для з'ясування причин поширення ЗГС було проаналізовано дані статистичних форм звітності 3 - Вет , 3 - РХ рибокомбінатів та

областей, що касть форелеві господарства.

Пятничными, паразитологічними, патологаанатомічними, мікологіч - _

НИМИ ,..бДКТ€рІ'ОЛОГІЧНЯМІІ -rfc • ві русояогі ЧЯЖЯІ'»«О дйми"¿осяід-їєко

1005 екз. райлугних форелей, американсько! палії, форелі, камдоопс, форелі Дональдсона : 129. екз. плідників, 2І екз. дзояітоя, 49’ екз. річняка, 791 екз. цьоголіток, 15 екз. калькіз та личинок.

З них вірусологічна дослідженням піддано 36 комісійна-відібра -них проб внутрішній органів / печінка, нирки:, селезінка / від 145 ехз. лососевих, 26 проб статевих продуктів / ікра, колок и / від. 119 плідників-,, а тзхох-2 проб* води'з ставів форелевих господарств. Для-здійснення • біологічні« досзідаекь використано 950,-екз. ійолоаї райдужної форелі , дсстазленях з кебяагоподучкі чодо ВГС господарства “Шипот*, '"Дддаяго", ’Пуца - Водиця" а такозз акваріальну Інституту рибного господарства з івано - 'Зранхівського рибокомбінату та рибкодгоспу "Пролетарська правда.я. Прн сцін -ці бі спроб вірусологічно'дослідеєно 14 проб знугрісніх органів зід 46;екз. 'форелей. . . - • • •. . , ’

Об’зктзуи досліджень були тахоз: культури клітщі R20-2 з гонад райдужної’форелі, AS3;...-,.'3: епітелію лосося, 5на s тзостоаого' гтебла пікефала, SP0 - з пкірх коропа, 33 - з плавця коричневого соииха оде?ру.ані з ІРН та Его „і лазі ї, з. такої; вітчизняні куль -тури ЛХС - з епітелій ¡5ур& ?а СЗЗі ~ з икрок аоросятх. Референтний пгг!!.ч вірусу ВГС / 2s*Ted Tiras ? - : / наданий

Bt-30 г.о рибництву, ізоляти еірусіз від цьоголіток, річняка, дзо -лгток форелі з господарств України та'Грузії, отам Rhabdovirua carpió зід дволіток коропа з колекції лабораторії іхтіопа -тодогії Інституту рибного господарства. . .

Лабораторні. твйркнк :' ¿сроді- / 25 екз./, аорські свете’/ 70 ви,/, біяімзур«*- /24ехз.;/. ' " ’

Тип nt русу визначали реякціво неЯтралізпці ї з сироватках;! прстй зіруошх- захвороракь лососеві«: ркб í. Інфекційного некрозу підазун-пової ЗПЛОЗЯ / ІКІ і , інфекційного некрозу гемопоеткчноі Т”а -ййни / інз, /. вірусної геморагічної. септиаекії / тйЗ / , одеряан^и’ »ід докторів з.ніїї / Велихобрпганія /, X.toIí/СЯУ/. Культур« клітин порі «асоє-ади міх собсо зал ех» зід чутливості, до вірусу ВГС'.-.а"стагйЗД!п: та динамічних / ролерн*,« / умозах вирову -вання. Інфекційний тктр вірусу зазначала методом титрувяяия. з . культурах клітин з тгакян риб. ‘

1-Д07Р» -З

Основні властивості вірусу вивчали з використанням методик, що застосовуються в ветеринарній .вірусології / Сюрін, 1966 /.

Отупінь патогенності ізолятів збудника ВГС визначали на коропах, буффало, райдужних форелях методами біологічних досліджень в акварі альних умовах. Рівень антитіл у імунизованих тварин визначали в реакціях нейтралізації, преципітації / Оухтерлоні, 1948 / , непрямої гемаглютинації. Паразитологічні, бактеріологічні та мікологічні дослідження лососевих риб, а також епізоотологічні обсте -ження форелевих господарств, здійснювали за загальноприйнятими в іхтіопатології методами та правилами / Маркевич, 1951 ; Догель, 1962 ; Биховська - Павловська, IS69 ; Антонов, 1974 ; Осетров ,

І97Б / . Вірусологічні дослідження проводили згідно з розроблени ми нами " Методичними вказівками по ідентифікації вірусів та лабораторній діагностиці вірусних хвороб риб " / М. 1987 / . Статистичну обробку результатів дослідів здійснвваяи згідно з методами прийнятими у біометрії / Топчій, Корншенко , 1967 ; Садовский , 1975 / .

- РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Епізоотичний стан, особливості перебігу ВГС в промислових

форелевих господарствах України . .

Визначено епізоотичний стан щодо вірусних хвороб лососевих риб 23 рибоводних господарств України : форелевих' риборозплідни -ків " Пуща - Водиця " , "Оконськ " , " Золотий ключ " - Київсь -кої. Волинської, Запорізької областей ; форелевих рибзаводів Ричансысого та Перєчинського лісокомбінатів , " Лопушко " -Закарпатської, Чернівецької областей ; форелевих повносистемних господарств " Ждимир ", "Шжіот ", "Лози " , "Нітріус " , "Огебник"

- Закарпатської, Тернопільської, Донецької та Чернівецької облас -тей ; форелевих товарних ставкових господарств " Святе ", "Тульчин” "Бар" , "Самарське " , "Кодра " - Рівненської, Вінницької , Д-ііпропетрівської та Київської областей ; форелевих товарних сад кових господарств на водоймах - охолоджувачах Миронівської , Бурлтинської ГРЕС ; товарних басейнових господарств при Київській ТЕЗД - 5 , Запоріжській ГРЕС ; форелевих садкових господарств Придніпровської, Трипільської ГРЕС, /^іпроГЕС.

За тривалий період спостережень / IS80 - 1992 pp./ встановлено, що характер захворювань і тяжкість перебігу хвороб у лососевих риб

залежить від виду, віку риб та технології їх вирощування.

Найбільш неблагополучними.щодо хвороб були риборозплідники, що вирощують молодь райдужної форелі, форелі Доиальдеона : "Пуща -

Зодиця ", "Сконськ ", "Золотий ключ " , "Кодри " та__"_Лози -.—'-------

В_них_зареестровано-ІОО'$'втаадаів-закіорювань, що спричинялись жгутиконосцями / іхтіободоз / , 50_ % - різновійчастими інфуза -ріями / іктіофтиріоз /, 62,5 % - ' флексібактеріями / міксобакте-ріоз / , 64,7 % - мікозних захворювань ікри / сапролегніоз /,

100 % - функціональних незаразних захворювань личинок і плїдни -ків / білоплямова хвороба , дегенерація печінки /.

В садкових господарствах по підрощуванню цьоголіток форелі , .розташованих на річках Дніпро , Дністер, найбільші збитки завяа -вали іхтіофтирїоз - 50 % зареєстрованих випадків, міксобакте -ріоз 'зябгр - 37,5 % випадків , в товарних форелевих басейнових і садкових господарствах на водоймах-охолоджувачах - парази -тарні хвороби, спричинені метацеркаріями дигенетичних смоктуяів / діплостоматоз / або плероцеркоїд&чи гельмінтів / трієнофороз / -100 % зареєстрованих за період 1960 - 1992 рр. випадків. • Вірусна геморагічна септицемія форелі була діагностована наїли в п’яти господарствах. - . . . ■ . .

’ ’ ‘ - •

Таблиця І. Показники форелевих господарств України, в яких зареєстровано епізоотії ВГС

Показник

(Повносистемне господар^

гепродукщин-

господарство

Шип от

іПуща -'Водиця

| !

ІПеречин ! Ричанськ

виробнича потужність :

ікринок,тис. шт. цьоголіток, тис.шт. товарної форелі, цят.

>агальна площа ставків, Ькерело водопостачання

іата реєстрації ВГС '

2000 ' 450 ’

500 га 2,2

5000

500

500

2,4

р.Яато - р.Уж риця

1981 І981

7700 . 500 ■

ЗО

0,87

Свердло-

вина

1983 .

500 . 300

6

0,02

500

300

5

. 0,07

р.Даториця р.Ук 198І І961

1*-1078в

Гостра форма перебігу ВГС в господарстві " Пуща - Водиця" серед стаяькоголового лосося реєструвалась у жовтні 1963 року при зни -женні температури води до 10 0 С , в господарствах Закарпаття , серед райдужної форелі - в листопаді 1981 року при зниженні тем -ператури води до 12 0 С на рибдільниці "Ідимир ” та до 6 0 С на рибдільниці " Шипот Хворіла , в основному молодь / від цього -діток до дволіток /, в період її активного росту. Загибель риб ’ значно перевищувала рибоводяі технологічні нормативи і становила в Закарпатті серед річняка 70 % , дволіток форелі - .36 % / Рис.І/, серед цьоголіток стальноголового лосося рибгоспу "Пуща - Водиця "

- 74 %. \ . ' -

Загибель риб

Рис. І. Динаміка перебігу епізоотії ВГС серед річняка

/■»*»«/ та ДВОЛІТОК /=*=/ райдужної форелі в Закарпатті. _ . ; . . '

Дяя гострого перебігу хвороби були характерними швидкий розвиток симптомів геморагічної септицемії / табл. 2 / та висока смертність риб у перш 1,5 року неблагополуччя господарств.

\ Форма хвороби----------------------

Симптом____-----------------------—--------:---------!------------------

-------- і гостра і хронічна

Смертність - + + +

Коливальні рухи + +■

Почорніння тіла + ' + X' 4- 4- -г

Екзофтальмія з хрозовчливамн т + •*“

Зміни консистенції нирок + +

Спленомегалія 4- “Г -#-•

Гіперемія печі ют а г -

Крововиливи на :

зябрах + + -

грудних плавцях ■

плавальному міхуру . + + +

м’язах ■ • ■ + + +

перівісцеральній тканині +• •+■ + ' , +■

мозку + ' - ■ -

сорді + 4*

~ - ЗсГГіНОЕ. ::-ЗпО у І - 33, 2

+ + - у. 33,3 - 56* 5 '

4- т + — у 66,6 - оа 9 % дослідами*

Дяфєренційка діагностика ВГС базувалась на наявності симптомів характерних для даного захворювання в сприятливій для розвитку хво -роби зоні температурного оптимуму / 5 - 15 0 С / , при відсугносїі таких ознак як пошкодження' луски, катаракти , вкскакувакнр. з водя / ектопаразитарнх хвороби /, відкритій ріт / асзкодження- зябер /, зміна харчових рефлексів / бактеріальні захворювання / , язви на шкірі / мікозні хвороби / , інвагінації / пухлин;^

Основним джерелом поширення інфекції 8 українська господарствах, та похазади здійснені епізоотологічні обстеження, була хонтемінозана ікра від плідників носіїв вірусу ВГС. . - -

Виділення віиусів та вивчення Ух культурально - морфологічних влас -тизостеЗ . Дзслідаено 76 комісійно відібраних-проб від лососевих риб з 12 форелевих господарств та 2 проби води.

2-1079в 7

Ізоляти вірусу ВГС виділені в 22 випадках, в тому числі з проб внутрішніх органів -9 , статевих продукті в - 12, води - І. . Цитопатична дія-вірусу ВГС в 48-годинних культурах ASE, FHM.EPC мала цитоцидний / літичний /.характер і проявлялась 'в заокругленні, уражених клітин,- потоншенні- їх зовнішньої мембрани, грануляції . - " . хроматину ядер, порушенні цілостності моношару культур клітин. - .. .. На культурах ASE, FHM, ЕРС,. що знаходились-під агаровим покриттям, цитопатичний процес характеризувався утворенням негативних колоній / бляшок /, внаслідок поступового проникнення вірусу в сусідні КЛІ-Г тини. Бляшки. збудникаВГС являли-собою округлі і з чіткими контурами прозорі негативні колонії на поверхні забарвленого моношару клітин." Уражені клітини в порожнині колоній, гинулиі втрачаючи вітальне забарвлення, гранули хроматину із зруйнованих клітин розподілялись на поверхні - площини рівномірно. 'Ізоляти вірусу ВГС,- що спричиняли . епізоотії хвороби в 1977, І98Х, 1983 pp. серед дволіток райдуя -ної форелі / 4$ - 43 б /. річняка американської палії / ЗФ -г 126 б/, цьоголіток стальноголового лосося / ПВ -,.144 / були’ вивчені більш . .. детально. Індекси нейтралізації / ÎH / ЧФ ~. 43 б, ПВ - 144, 3$ -126 б анти - ІРН сироваткою становили відповідно 0,Б2 lg ; 0,73 lg ; 0,56 lg ; анти - ІШ сироваткою - 0,72 lg : ; 0,89 lg; 0,83 lg ; анти таЗ серотипу F. - І • -3,77 íg; 3,73 lg; 4,10 lg' .

ІН референтного штаму ВГС / Egtved -virus . / кролячими імунними сироватками проти ізсілятів ПВ - 144 , ЗФ - 126 б v-.ЧФ - 43 б становили 3f75 .ig; 4,01 lg ; 4,50 lg . Отже епізоотії ВГС серед різних видів лососевих риб на Україні були спричинені ізолятами,, котрі належать до широко розповсюдженого й Європі серотипу F -, І.

На інфекційність збудника. ВГС впливали ефір, хлороформ та середо -виде з pH 3,0 / -Табл. 3./. Температура + 60 0 С на протязі 15 і хвилин спричиняла повну втрату.віріонами інфекційності. ■

Для визначення ступені антигенної спорідненості ізолятів вірусу.

ВГС було проведено 28 реакцій нейтралізації на культурах клітин. Статистично достовірної ризниці мік досліджуваними ізолятами в , перехресних реакіггрх-не;,встановлено, що вказує на,можливість вико ~. ристання для виготовлення діагностичних препаратів одного, найбільш імуногенного ізоляту. ■ - . , /. : ■ ' ' ' ; -.■/

Вивчення біологічних властиво^й вірусу ВГС . Для визначення груп’ риб, що найбільш;легко піддаються зараженню ВГС , 'проведено в..аква-ріальних умовах дев'ять біологічних проб з використанням 320 екз. риб / Табл. 4 . /.

»вшг.

Ізолят. • вірусу ■; : 1 ■ • ^ : ! . ! . ■ . у. Первісна tІнфекційніст£ Індекс І Інфекцій - інфекцій - ІВІРУ,СУ післяі інактивації ність вірусу ність ' !обробки ! хлорофор -і після оброб • nipvcv [хлороформом j MOM j ки'ефіром ■ ■ ’І ’ * V.V ! ! '■■■ : ■ ■■ Ч ’ВДбО/мл] 50/мл! Js j ^^бО/мл Індекс . !Інфекційність інактивації ¡вірусу після. ; • ефіром І обробки сере •* f |довщем a pH 3, ■'•є | 50/мл і Індекс інактивації середовищем pH 3 ,0 ' 1«

ЗФ- 1266 7,20 - 0,36

С0

. 4$ - 43 б 6,72 - 0,32

0 7,28 І 0,36 0,42 І-0,37 6,86 І 0,30 0,67 І 0,45 6,61 і 0,34

О 6,72 І 0,32 0,33 І 0,48 6,39 ± 0,09 0,58 І 0,72 6,15 - 0,91

! Ізолят і Вірусу І і І Інкубацій- Вік І ний ■ форелей . | період І / діб / Процент леталь -ності Індекс вірулент- ності Середній - титр антитіл в ■ РИГА

ПВ,- 144 цьоголітки 5-ІІ 85,5 2,75 І : 24,3

ПВ'- 144 річняки 7-21 45,5 21,20 І : 2,3

ПВ - 144 трьохлітки - - ; 0 - - • І : 2,0

ЧФ - 43 б цьоголітки 5 - 10 96,5 2,36 І : 25,2

ЧФ -• 43 б річняки- . 7-15 54,5 17,50 І : 2,6

ЧФ - 43 б трьохлітки - 0 -• І : 4,0

ЗФ - 1266 цьоголітки 5-21 67,5 4,80 І : 4,0

ЗФ - 1266 річняки.. 6-22 36,3 22,80 І : 2,6

ЗФ - 1266 трьохлітки - 0 . - І 2,0

Ізоляти ЧФ - 436, ПВ - 144 були більш вірулентними для форелі, ніж ізолят ЗФ - 126 б. Загибелі молоді коропа та буфалло / цього -літок, річняка / в біологічних дослідженнях з вірусом ВГС не реєструвалось, патологоанатомічні зміни у ціх видів риб не проявля -лись. В шести біопробах на 75 екз. цьоголіток форелі вивчалась здатність вірусу ВГС викликати захворювання при контактному способі зараження. Після двогодинної витримки цьоголіток у воді з 10 ^ бляшкоутворювчих одиниць збудника на мілілітр води або контакту на протязі доби з хворою рибою процент загибелі риб складав : для ЧФ - 43 б - 36,6 - 38,5 % ; ПВ - 144. - 33,3 - 20,0 %

3$ - 126 б - 6,6 - 15,0 %, В контактних біопробах інкубаційний,

період розвитку симптомів хвороби досягав 6-22 діб. Клінічні ознаки характеризувались крововиливами у вигляді крапок біля основи грудного плавця, потемнінням поверхні тіла, екзофтальміею з ге -морагіями. Патологганатомічні зміни у форелей з\біопр£б відрізня -лись від змін, що реєструвались при розтині риб з господарств в період гострої форми ВГС відсутністю крововиливів у м’язах, на пілоричних придатках, плавальному міхуру та перивісцеральній тканині. З внутрішніх органів риб, що загинули в біопробах, був реізольований-вірусний агент, ідентифікований в серологічних реакціях як ВГС вірус.

Дослідження способів отримання антигенів вірусу геморагічно? септицемії форелі . Вивчалась чутливість до вірусу ВГС при різних умовах культивування п’яти культур клітин із тканин лосося, коропа, пімефала, форелі, сома та двох культур із тканин поросяти і щура.

В культура* із тканин _теплокровндас-цитопатична-дія'проявлялась "тільки в "клітинах щура / ЛКС / ізолятом вірусу ГП> - 144 / Табл.5./. В культурах з тканин риб вірус ЗГС відтворювався у всіх-випадках.

При статичному культивуванні найбільш високі титри вірусу зареєстровано в культурах ASE та FHM / 6,81 ± 0,38 - 7,23 і 0,2ІХ^ГЦД

Максимальний вихід вірусу при культивуванні в динамічних умовах на цих культурах досягав 8,75 ± 0,33 - 8,0 - 0,43 І2ТЦД мд

Оптимальні умови для максимального накопичення вірусу ВГС були при інкубації в дзохдсбозій. ролерній культурі ASE на протязі 32,5 -'46,5 годин при + 15 0 С та множинності зараження 10 бляшкоутворюю -чих одиниць на клітину. Збір збудника ВГС в період його максималь -ного накопичення зменшував забруднення вірусоуміщуючого середови -ща компонентами клітин, однак це не звільняло від необхідності проводити подальше очищення , яке здійснювали диференційним швид -кісним центрифугуванням, градієнтним центрифугуванням, а також способом.адсорбції. Методи,, що базувались на центрифугуванні характеризувались 98,71 —99,99 % - ким очищенням від баластних білків, багатоетапністю процесу очищення, необхідністю використання спе -ціального обладнання і великою / до 99 % / втратою інфекційного матеріалу. Спосіб очісукч рабдовірусів риб поліметилсилоксаном з розміром пор ЗО нм при співвідношенні сорбенту до рідини, що містила вірус, І : 25 ,не діяв негативно на титри інфекційності рабдовірусу ВГС. Не? спосіб, розроблений нами спільно з О.Н.Деря -біним / Інститут бєт. медицини / та І.А.Волохонським / Інститут хімії поверхні / використовувався при роботі з макрооб’смами вірусного матеріалу і забезпечував 92,42 - 98,33 % очищення.

■ Отримання імукноТ скгі?':іЄ'?ки та зді ^снення серологічної діагност:;-::* ЗГС . Дослідження по піївкхеннв тгтр’в специфічних антитіл у імунизоваких тварин, розробці схем імунізації очищеними антигена -ми.збудника ВГС проводили на п’яти групах кролів, трьох групах білих щурів, морських свинок, райдужних форелей.

При дзохразоГ'і? імунізаиії кролів найбільш раціональним було застс. -сувакнл ?аз:сї схеми імунізації : в кон’юнктиву в сумі зі з повним ад’ювантом. Фрейнла з інтервалом міх ін’єкціями в 14 днів. Середнє геометричне титру зіруснейтраліяуючих антитіл при цьому складало І : 640.- '' щурів і морських свинок при внутрішньочеревній двох -

Куль™ І Метол: V І Титр в і русу / І $ ІВД 50 / мл ?

клітин * } культивування , | ПВ - 144 . | 4$ - 43 б . } 35 -126 6

ВВ • ' Огатичний 6,00 + 0,60 4,25 + - ч* 0,33 4,50 І 0,30

лкс . . . Огатичний .. 2,10 - + 0,35 0 ' 0

ВГС.- 2 Статичний : . , : : б,іб ' + о.зз 7,00 + 0,27 6,37:1 0,33

ЕРС ; ! Статичний :. . б,50 0,21 6,33 + 0,23 6,25 І 0,33

ш ' Огатичний 7,00 + 0,22 7,00 ■ + - 0,31 7,00 ± 0,61

АїЕ . ... Статичний : 6,99 + 0,26 7,23 + 0,27 6,81 2 0,38

Ї?ТС - 2 , Динамічний ' 7,00 + *• ‘ 0,43 , 7,60* + 0,35 7,00 - 0,39

ЕРС / $здвмічиий ' . ' 7,00 + .• — 0,25 7,25 + . а» 0,33 7,00 І 0,38

РНМ ; Дянаійшшй . 8,00 '-+ ■ 0,43 7,75 + 0,33 7,75 І . - л. 0,45

А^Е ' Динамічний 8,60 + 0,39 8,75 +' 0,21 8,75 І 0,33

чотирьох кратній імунізації з/ ад’ввантом Фрейнда виробка специ -фічних антитіл проти,вірусу.ВГСпроходила більи інтенсивно, hís у кролів. Значення титру зіруснейтралі зутих антитіл досягали І : 1280 . В той же час анти. - ВГС сіфоватая .одержані в рззульта -тіімунізаціГбілих~іцурів діяли ’цитотоксично на культури клітин ASE» РИМ, ЕРС та rtg-2 .. Сироватки від морських свинок такої властивості не мали і їх використаній для ідентифікації збудника ВГС в реакції нейтралізації було більш результативним.

Трьохлітки форелі, виробляли антитіла, проти вірусу ВГС з тигра*

І : 5120 після двохразового введення антигену без ад’юванту.

Риби інших видів / короп, буффало / після їх, імунізації вияви голись неспроможними до активної виробки специфічних проти - ВГС віруси;« гогг:ггіл.' - • •••’ . • ■"

У всіх видів тварин зареєстрована тенденція зниження титрів анти -тіл після закінчення курсу, імунізації вірусом, ВГС, що вказус на доцільність здійснення обезкровлювання дослідних тварин не пізні -ше се>ж днів після закінчення хурсу імунізації. . .

Діагностичну цінність одержаних іонних сироваток і антигенів вірусу ІВГС вивчали в слідуючих серологічних реакціях : нейтралізації . / РН / на культурі клітин ASS , вирощеній з про -бірках та пластикові« панелях, РН утворенії" бляїзок, реакції ’ дифузійної преципітації / РДІ /, непрямої гемаглютинації / РИГА/, непрямої імунофяуорсеценції / PÍffl / , а також при імунофергаіт-Hoiíy аналізі / ІФА /.

Як діагностику» для РНГА вікористовузали сенсибілізовані БГС вірусом глютаризовалі, танізовані еритроцити , підготовку яких здійснювали в Інституті рибного господарства. Крапковий І2А проводили в Інституті молекулярної біології . '

При порівняльному титруванні в РНГА , РН та РДІ імунних сиро -.ваток кролів на ізоляти вірусу виділені при епізоотіях. ВГС в форелевих-господарствах, сєредкз геометричне титрів антитіл ста. ловило в Fiü'A І : 538 ; FH - І : 274 ; РДЗ - І : 12 .

Зазначені реакції використовувались і для визначення, рівня анти -тіл в сироватках хворих форелей. При їх дослідженні РНГА по .. специфічності не'поступалася. .РН , була більш простсв щодо тех -ніки виконання, дати мо.їяивість встановлювати наявність антитіл до збудника ВГС безпосередньо в умовах господарств. РІйі та ІФА Використовувались для експрес - ідентифікації виділених ізолятів вірусів в лабораторних умовах.

ІЗ

*йтливість РІШ залежала від технології фіксації дослідкуемих препаратів, йксація на протязі п’яти - семи хвилин охолодаеним до - 20 0 С ацетоном / х.ч. / забезпечувала збереження специ -фічності антигенів вірусу ВГС.

Розробка методів профілактики та оздоровлення господарств від ВГС.

Багаторічними дослідженнями встановлено, що успіх заходів щодо контроле над ВГС , залежить від їх органічного зв'язку з біотех-нікою вирощування форелі. Tas яа основні»! джерелом поширення хзороби е контамінована ВГС вірусом ікра від плідників-вірусоно -сіїв, що підтверджено вірусологічная? дослідженнями, найбільш ефективними в умовах українських господарств були слідуючі заходи:

- щорічні діагностичні дослідження в період весняного боніту -вання плідників та ремонтної групи риб в риборозплідниках ;

- здійснення перевезень для цілей риборозведення або аклімати-

зації тільки ікрою на стадії " вічка " , знгзаралгєиов від моали-вої наявності ВГС вірусу розчином хлораміну - Б І : 20 000 з експозицією ЗО ХВИЛИН. . ■ .

Вірусологічні дослідження семи відібраних в неблагополучии* господарствах проб ікри, обробленої на стадіях я бластула " та " вічко " хлораміном - Б , показали відсутність в них ізолятів віруса. При дослідженні десяти контрольних проб необробленої хлораміном - Б ікри , з однієї проби на стадії "вічка " і пасти проб на стадії " бластули " були виділені ізоляти збудника ВГС.-Дяя контролп в 1984 - 1985 рр. здійскваались тахоз комісійні. . досліди по інкубації в акгаріальній Інституту рибного господарства партій по 1000 ит. ікринок, оброблених та необробленах хлораміном - Б. З восьми дослідкеннк проб ізоляти вірусу гемора -тічиої септицемії виділені в п’яти випадах : в.чотирьох пробах ікри необробленої хлораміном - Б , а також з однієї проби одноразово обробленої хлораміном - Б на стадії . " бластула ".

Проби ікри , що оброблялись двохразово /на стадіях "бластула ", "вічко " /, були вільні від збудника ВГС. За період вирощування колоді форелі, одержаної з ікри , обробленої хлораміном - Б , як в умовах господарств, так і в акваріальних умовах, захворювання і загибелі риб не спостерігалось.

Неблагополучні по ВГС українські господарства класифікувались ними по рибогосподарському використанню, таким чином :

- повносистемні господарстваЕди«ир ", "Шипот“,"Пуїда-ВодіїЦя*;

- репродукційні господарства "Перечин ", " Ричакськ ".

Оздоровлення повносистемних господарств з цінним маточним псго -

лів’ям риб здіЯснювади, згідно з дозволом Головного управління------------~

~ветеринарії Т комплексним методом , шляхом створення умов , які запобігали розвитку епізоотичного процесу : встановлення фільтрів-рибовловлювачів, незалежне водопостачання та окремий інзентар для колоді риб, вибракування плідників - вірусоносіїв, двохразояа обробка всіх наявних вартій-ікри, дороцекня одержаної молоді до ' товарної ваги в тепловодних господарствах .

Невеликі - репродукційні господарства оздоровлювались шляхом осушення Іх "ставків, ••по)^Т..53й$?£фІ.Іри& ‘Дяя використання 5 згкзздах ' громадського баз лЬрсутримання на живорибних базах, .

ретельної дезіяфеісції ‘ \ , ' ' ■ . .

Оцінка ефективності заході в по :оздоровленкв. зді йснявалась • шляхом постзнопки в господаротЕах бг одогівдта проб з чутливими ДО гсио -рагічної еейтйіе4.І ¿ибами.. Тшс, з Закарпатті по закінчений року після останнього випадку загибелі риб з ^ознаками .ВГС: при негатив -них результатам вірусологічну«,досліджень на наявність збудника ВГС, на><и було здійснено ¡2:сть'біологічних проб двох звдіз / контактні та внутрішньочерепні / на 150 єкз. риб , доставлених

з. Івано - банківського рибокомбінату.

З господарстві ” Пуа,«. - Водиця " було організовано проведення контактної біопроби з 300 еяз. річняка форелі з рибколгоспу " Пролетарська правда

Риб утримували в ізсльоБанз.чгу ставу та басейнах на протязі 120 днів при температурі 4 <- 12 0 С , здійснюючи раз в ЗО днів . контрольні дослідження» '

Результати проведекік- біологічних проб, вірусологічних деслідкек», показали відсутність вірусу ЗГС в господарствах. . .

Ріиеанямк відповідних виконкомів вони були визнані оздоровленими

від ВГС. . . . • . >. . . ■■

В наступні роки / 1368 - 1992 рр. / в Україні рецидивів ,5.6о нових логиет, елізоотій ЗГС ке спостерігалось .

висновки

1. Проведеними епізоотологічними обстеженнями і вірусологічними дослідженнями було встановлено наявність в Україні в форелевих, господарствах " Едимир ", " Шипот * Закарпатського рибокомбінату, в репродукційних господарствах Перечинського та Ричанського

. лісокомбінатів, риборозпліднику " Пуща - Водиця " Київського рибокомбінату вірусної геморагічної септицемії райдужної форелі. Розповсюдження інфекції проходило з контаигнованов рабдовірусами ВГС ікров від плідників - вірусоносіїв.

2. Збудником хвороби е ізоляти , що належать до серотипу У - 1 / Egtred -virus / , антигенно споріднені ізоляту вірусу геморагічної септицемії, що спричиняв епізоотіп хвороби в форе -левому господарстві " Чорна річка ". / Північний Кавказ /, чутливі до ефіру, хлороформу, слабо резистентні до температури

і дії pH 3,0.

3. Вивченням біологічних властивостей збудника встановлено , що найбільш чутливими до зараження ВГС групами риб е цьоголітки та річняки райдужної форелі. Хвороба відтворювалась при внутрішньоче-ревноцу, і контактному способах зараження. В виробничих умовах, для оцінки благополуччя оздоровлених від ВГС господарств, можливе здійснення контактних біологічних проб шляхом спільного утримання в ізольованих ставках при нормативній щільності / 120 - 170 eK3/VV цьоголіток або річняка місцевих та завезених із благополучних по ВГС господарств лососевих риб на протязі не менше 120 днів, при температурі води не виде 15 0 С .

4. Для отримання антигенів вірусу ВГС доцільно використовувати дводобову ролерну культуру ASE, котра інкубуеться на протязі 32,546,5 годин після зараження з множинності) 10 бляшкоутворювчих оди -ниць на клітину. Очищення вірусу ВГС від баластних компонентів • можливе в 10 - 50 %-ноиу лінійноцу градієнті сахарози на протязі 120 хвилин прк 60 000 S та 4 °С або шляхом адсорбції, білкових компонентів з культуральної рідини,що містить вірус , поліметилсилоксаном.1

5. Серологічна діагностика ВГС можлива при використанні слідувчрс реакцій : нейтралізації на культурах клітин .¡lse,k-¿£ або SPC , реакції непрямої гемаглвтннаці ї / РИГА / , крапковій І5А .

Отримання діьгносткяних сироваток доцільно проводити на'кролях та морських свинках. ' . ' ; •

6. В повносистемні» форелевих господарствах для боротьби з ВГС необхідно адійснввати комплекс заходів, направлених на створення несприятливих для розвитку збудника умов, що забезпечте ліквідацію захворавакня і оздоровлення господарств .

Результати досліджень використані :

- при розробці "Тимчасової настанови по застосування

хлораміну -Б для профілактичної обробки ікри лососевих^ риб_______

проти вірусної геморагічної -септицемі І / ВГС/ " затвердженої Головним управлінням ветеринарії ііСГ СРСР 03.02.IS87 р. ;

- при складанні "Методичних вказівок по ідентифікації

вірусів і лабораторній діагностиці вірусних хвороб риб * затверджених Головним управлінням ветеринарії МСГ СРСР 14.05.1987 р. .

По матеріалам дисертації опубліковані наступні роботи :

1. Наконечная М.Г., Нестеренко B.C. Изучение бдяшкообразуэдей способности двух штаммов рабдовирусоз форели на перевиваемых клеточных культурах из тканей рыб //Болезни рыб и водная токсикология : Сб.научн. тр. ВНйШРХ. - М., 1$84.-Вып.40. - С. 12 - 16.

2. Наконечная М.Г., Нестеренко B.C. Очистка и концентрирование рабдовирусов форели // УІІ Всес.совещ. по паразитам и болезням рыб: Тез.докл;,Астрахань,апр.1985 г.-Л.:Науяа, IS85 . - С. 98 - 100.

3. Наконечная М.Г.Демниханов Ю.Д.,Нестеренко B.C.,Литвиненко В.З. Метода диагностики вирусных болезней рыб // Материалы секции ихтиопатологии и охраны гидробионтов отделения ветеринарии 8АСХНИЛ, Москва, апр. 1986 г. - М. ВАСХНІЙ , ISS6 . - С. 28 - 30.

4. Наконечная М.Г., Нестеренко B.C., Пукиз А.И. Комплексный не -тпд оздоровления форелевых хозяйств от вирусной геморрагической септицемии / из опыта работы Закарпатского обдрыбокомбииата /

// Передовой опыт предприятий Укрглаврыбхоза за 1986 г. ~ И. ЦНЙИГЭМРХ , 1987 . - С. 24 - 26.*

5. Наконечная М.Г., Нестеренко B.C. Профилактическая обработка

оплодотворенной икры лососевых рыб против вирусной геморрагичес -кой септицемии /Буклет.Передовой опыт производству. - Львов : Облподиграфиздат , 1968 .- 2 с. • .

6. Наконечная И.Г., Нестеренко B.C. Комплексный метод борьбы с вирусной геморрагической септицемией / ВГС / форели // Рыбное хозяйство . - Киев : Урожай, 1989. - Вот.43. - С. 60 - 62.

7. Нестеренко 6.С. Чувствительность к вирусу ВГС семя перевиваемых культур клеток внрряеиках в статических и динамических условиях

Ч Рыбное хозяйство , - Киев : Урожай,1990. - Вып.44- С. 64 - 66.

8. Нестеренко B.C., Литвиненко В.В. Мякрометоды серологических реакций в исследованиях с вирусом ВГС форели // Рыбное . хозяйство . - Киев.: Урожай , 1990 . - Вып. 44. - С. Сб - 67.

9. Нестеренко B.C. Факторы , обуславливавшие развитие вирусной ге?.'аррагичегкой септицемии лососевых рыб // ІУ Всесовэное совещание по рыбохозяйственному использования теплых вод . :

Тез. докл. г.Курчатов , окт. 1990 г. - Ы. ЦНИИГЭИРХ , 1990. - ■

С. 168 - 169 .

10. Нестеренко B.C., Литвиненко В.В. Вивчення уражень перевивае-

мих клітин риб при зараженні.їх рабдовірусаьш. - збудникам вірусних хвороб // Рибне господарство . - Київ : Уро?гай , 1991.

- Вкп. 45 . - С. 60 - 63. ■ '

11. Нестеренко B.C. Реплікація, вірусу ВГС в перевиЕазмій культурі клітин ембріона лосося // Рибне господарство . - Київ: Урожай*, 1991 . - Вип. 45 . - С. 66 - 71 .

В