Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изучение устойчивости Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica в мясопродуктах при СВЧ - обработки

На правах рукописи

РГВ од

Кожаева Джульетта Каральбиевна

2 h ЯНВ 2300

ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ Listeria monocytogenes И Yersinia enierocolilnra-В МЯСОПРОДУКТАХ ПРИ СВЧ- ОБРАБОТКИ

16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология, иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Ульяновск 2000

Работа выполнена в Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии

Шумный руководитель: д.б.н. профессор М.М. Шахмурзов (КБГСХА), Научный консультант: к.в.н. доцеит Г. Н. Гусаров (УГСХА)

Официальные оппонент: Доктор биологических наук, ст. н. сотрудник

Середа А. Д. (ВНИИВВиМ),

Кандидат ветеринарных наук, доцент Зологузии С.Н. (УГСХА).

Ведущая организация: Саратовский государственный аграрный

Университет имени Н.И. Вавилова

Защита состоится января 2000, в 12 часов на заседании диссертационного совета К- НО- Ульяновской государственной

сельскохозяйственной Академии ( 432006 г. Ульяновск. Новый Венец 1)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке УГСХА.

Автореферат разослан : декабря 1999г.

Учёный секретарь Диссертационного Совета К В Н'А ^озин-

А32 - 4сЬЧрО

А (Лл «У_ У П

I. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы.

Значение мясопродуктов в питании человека определяется тем, что они служат источником полноценных белков, жира, минеральных и экстрактивных веществ, некоторых витаминов, потребление которых является необходимым для нормального функционирования организма.

Пищевые продукты, получаемые от животных, болевших любым инфекционным или неинфекционным заболеванием могут содержать микроорганизмы, вызывающие пищевые отравления. Поэтому изучение бактериальной контаминации мяса и мясных продуктов уделяется большое внимание.

Существует значительная группа пищевых инфекций, которых известны человеку тысячелетия это в первую очередь ботулизм, еальмонеллёзы и другие. Однако появляются новые, малоизученные пищевые инфекции. К таким микроорганизмам относятся бактерии Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica. Данные микроорганизмы, несмотря на всё их таксономическое различия объединяет одна особенность - наличие положительного кхолодового» эффекта. При температуре хранения в холодильниках указанные бактерии, в отличие от других не только не замедляют свое размножение, а наоборот размножаются и в определённой степени повышают показатели своей вирулентности. Учитывая широкое расспостранение в последние годы «быстрых» продуктов питания, полуфабрикатов готовых или почти готовых к употреблению в пищу после незначительной кулинарной обработке и хранящихся до этого момента в домашнем холодильнике важное значение приобретают вопросы, связанные с исследованиями по бактериологическому контролю и обеззараживанию мяса контаминированного листериями и возбудителем кишечного иерсиниоза, что в свою очередь, связано с устойчивостью упомянутых бактерий к различным физическим и химическим факторам.

Технологическая обработка мяса требует соблюдения санитарно-гигиенических условий, гарантирующих полную безвредность готовых продуктов для потребителя. Достигнуть этого можно только при совершенствовании существующих технологических процессов и разработки новых, обеспечивающих рациональное использование сырьевых ресурсов, повышение выхода массы и улучшение качества выпускаемой продукции.

По данным В.Я.Щабли и Я.П.Шлипакова (1981) и других авторов СВЧ-обработка мясных продуктов позволяет получить более быстрый и равномерный нагрев, что обеспечивает готовность продукта за короткий промежуток временем. Кроме того, при СВЧ - обработки аенатурационные изменение белков мышечной ткани менее глубокие, чем при нагревании обычным способом, содержание свободной воды в мясе бывает больше на 14-15%, что обеспечивает больший выход массы, выше сохранность аминокислот и экстрактивных в т.ч. и Биологически активных веществ.

Одним из основных направлений в использовании СВЧ-энергии является использование ее в качестве фактора активного воздействия на клетки микроорганизмов с целью их уничтожения, В последнее время в связи с разработкой СВЧ-генераторов открылась зозможность использования СВЧ-энергии с целью стерилизации и пастеризации пищевых продуктов, Рогов И.А., Некругман С.В. (1976); Филипов PJI. (1984), еще в 70-х и 80-х годах в :воих исследованиях указывали на бактерицидное действие СВЧ-полей не только большой [тепловой), но и малой (нетепловой) мощности, а также возможность использования СВЧ-

энергии в стерилизации продуктов биологического происхождения. N. Assinder (1974) сообщаил о положительных результатах полученных по СВЧ пастеризации молока, пива i других напитков. Kase Y. (1978) сообщает о широком использовании СВЧ нагрева дш стерилизации пищевых продуктов.

Таким образом, ширится использование СВЧ печей для быстрого приготовлена продуктов питания готовых сразу же х употреблению в пищу.

Данные обстоятельства задают вопросы, а насколько эффективен мето; термического обеззараживания микроорганизмов в СВЧ печах, и в частности бактерий 1 monocytogenes и Y enterocolitica.

1.2. Цель и задачи исследований.

В связи с вышеизложенным целью данной работы явилось установление санигарно] безопасности продуктов после СВЧ - обработки в домашних.

Исходя из указанной цели были посгавленны следующие задачи: Разработать быстрые методы выделения и идентификации бактерий L monocytogenes и л enterocolitica из мясопродуктов.

Определить показатели термической устойчивости данных микроорганизмов. Разработать и предложить оптимальные режимы обеззараживания мясопродукте] контаминированных бактериями Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica, с помощью СВ обработки.

1.3. Научная новизна.

Научная новизна работы заключается в том, что:

• В результате проведённых исследований впервые практике предложены достаточно быстрь бактериологические методы выделения и идентификации бактерий L monocytogenes и enterocolitica из мясопродуктов.

• В результате проведённых исследований установлении пороговые показатели термическс устойчивости бактерий L monocytogenes и Y enterocolitica.

• В результате проведённых исследований экспериментально доказана надёжное использование для целей инактивации бактерий L monocytogenes и Y enterocolitica бытовь СВЧ - печей, тем самым обоснованна эффективность их применения в условиях быта целью профилактики вспышки данных заболеваний.

• Разработаны и предложены оптимальные режимы обеззараживания мясопродукт! контаминированные бактериями L monocytogenes и Y enterocolitica с помощью СВЧ нагрев

1.4. .Практическая ценность. При выполнении данной работы получе! результаты имеющие определённую практическую значимость:

1.Ha основании проведенных исследований разработаны схемы бактериологическо исследования мясопродуктов на наличие бактерий L monocytogenes и Y enterocolitica.

2. Разработаны и апробированы селективная и накопительная среды для выделен листерий из мясопродуктов.

3. Установлены режимы обеззараживания мясопродуктов, контаминированн бактериями из рода L monocytogenes и Y enterocolitica посредством СВЧ- обработки.

Тем самым предложен ещё один барьер предупреждения вспышки пшцев; инфекций данной этиологии.

4. Материалы диссертации используются при чтении лекций в КБГСХА, в рабе бактериологических лабораторий КБР.

1.5. Основные положения диссертации, выпосимые на защиту;

Методы выделения и идентификации бактерий L monocytogenes и Y enterocolitica из мясопродуктов.

Установление пороговых показателей термоинактивации данных микроорганизмов. Эксперементашюе обоснование надёжность использование для целей инактивации бактерий L monocytogenes и Y enterocolitica бытовых СВЧ - печей и установления эффективности их применения в условиях быта с целью профилактики вспышки данных заболеваний.

Определение обеззараживающего действия СВЧ обработки на мясопродукты (свинина, говядина, баранина, куры) контаминированные бактериями из рода L monocytogenes и Y enterocolitica

Схема оптимальных режимов обеззараживания мясопродуктов контаминированных бактериями L monocytogenes и Y enterocolitica с помощью СВЧ нагрева.

1. 6. Апробация работы и публикация результатов исследования.

Результаты ^ исследований доложены на 4 республиканских и вузовских научно -рактичсских конференциях. По результатам исследований опубликовано 4 печатные работы.

1.7,Объём и структура диссертационной работы.

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, состоит из введения, бзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и фактических предложений, иллюстрирована 37 таблицами, 6 рисунками. Список [спользованной литературы включает 132 наименований из них 38 отечественных и 94 арубежных.

2. Собственные исследования 2.1.Материалы и методы.

Бактериальные штаммы. Материалы исследований.

Бактериальные штаммы Listeria monocytogenes: 766 - 1 серогруппа получен из музея :афедры микробиологии УГСХЛ, 634 - 2 серогруппа получен из музея кафедры микробиологии «ТСХА.

Бактериальные штаммы Yersinia enterocolitica; 03- аналогичного сероварианта, юлучен из музея кафедры микробиологии УГСХА, 09 - аналогачного сероварианта получен из <узея кафедры микробиологии УГСХА.

i качестве объектов исследования были выбраны мясной фарш говяжий, свинной, бараний, ¡уриный, котлеты. Объём материала для исследований указан по ходу описания в разделе " Собственные исследования".

Методы бактериологического исследования.

Изучение бактериальных культур Listeria monocytogenes проводили согласно 'Методическим рекомендациям по лабораторной диагностике листериоза животных и людей" дверждённым ГУВ МСХ СССР от 13-2-87 и МЗ СССР от 4 -9- 86, а так же "Методическим Рекомендациям пищевых продуктов на наличие листерий" И.А. Бакулова, Д. А. Васильева. 1992г.

Изучение бактериальных культур Yersinia enterocolitica проводили согласно тструкции по лабораторной диагностике иерсиниозов, утверждённой МЗ СССР 30-10-90г.

Определение термоустойчивости изучаемых бактериальных штаммов проводили по рекомендациям лаборатории микробиологии ВНИИКОПа (В.И. Рогачёва, Н.Н. Мазохиной).

Изучение кинетики инактивации бактерий под воздействием высоких температур проводили по модифицированной методике Проггорова Б. Штерна

Математическую обработку результатов эксперементов по термоинактивации бактерий проводили по методике расчётов Г. Кука, В. Матвеева, В. Рогачёва, Дейндофера, Хемфри, Ричардса.

Оборудование, растворы, реактивы, питательные среды.

Холодильники бытовые, термостаты, водяные ультратермостаты различных марок и

моделей.

СВЧ - печи, модели « Элекгроника-Зс»

Микроскопы световые, оптические различных моделей производственной объединения «Домо».

Фотоаппараты моделей «Зенит».

Стандартное бактериологическое оборудование микробиологического бокса.

Характеристика растворов и бактериологических питательных сред, используемых i диссертационной работе, указана по ходу описания собственных исследований.

2.2. Результаты собственных исследований.

2.2.1. Разработка оптимальной схемы выделения листерий иг мясопродуктов.

Для целей диссертационных исследований по установлению эффективных режима СВЧ - воздействия на мясопродукты контаминированных листериями, необходимо бьш применять по ходу работы методы выделения и идентификации листерий из указанной объекта. Анализируя результаты исследований в данной области, полученные различным! авторами, мы пришли к выводу о сложности проведения подобных исследований обусловленной высокой стоимостью реактивов, питательных сред и оборудования используемыми зарубежнымы и отечественными исследователями.

Поэтому первоначальной задачей возникшей перед нами являлась разработк оптимального метода выделения и идентификации листерий вида L monocytogenes и мясопродуктов, способного решить возникающие задачи и выполнить поставленную диссертационную цель.

Второй задачей, которую необходимо было решить одновременно с первой, по ход выполнения диссертационных исследований - это разработка простой, надежной, дешево среды накопления и селективной среды для выделения и идентификации листерш позволяющей её эффективно использовать для определения контаминации листериям мясопродуктов.

Решение обеих задач носило поисковый характер, Нами были апробирован] различные варианты зарубежных и отечественных схем выделения листерий адаптированные нашим возможностям и целям. Использованы разнообразные рецептуры и конструкта селективных сред для листерий. В результате проделанной эксперементально! исследовательской работы был предложен следующий «быстрый» метод выделения идентификации листерий вида L monocytogenes из мясопродуктов. Предлагаемая апробированная в исследованиях схема (включающая и собственные прописи селективны сред) состою: из трёх этапов.

• Первый этап. Исследуемый пищевой продукт (не менее 25 г.) измельчают и смешивают с средой накопления в соотношении 1:8 (1 часть продукта и 8 частей среды) встряхивают течение 1 минуты и культивируют при 28 С 24 ~ 48 часов.

• Второй этап. Через указанные сроки 1мл полученной бактериальной суспензии смешивают 5 мл 0,1 - 0,3 %-ного раствора КОН (растворенного в 5%-ном NaCl ) встряхивают и чер минуту высевают на селективный агар.

• Третий этап. Через 24 - 48 часов культивирования при температуре 22°С провод идентификацию бактерий выросших колоний.

Оптимальным решением является постановка на исследование не одной пробы следуемого образца, а целой серии в 10-12 проб.

В качестве образцов использовали мясные фарши от баранины, свинины, говядины, •риного мяса, образцы котлет (коммерческих образцы, выработеа мясокомбинатов). Продукты итаминировали культурой листерий штамм 766 в дозах 4 . 103 - 8. I01 .КОЕ на 1 грамм, ¡сазанная величина контаминации, обусловлена тем, что такая концентрация листерий чаще его встречается в пищевых продуктах.

Как уже указывалось выше, для рекомендуемого метода выделения листерий »бходимо было конструировать доступную в работе среду накопления и селективную, ггательную среду. Опираясь на литературные данные и результаты собственных спериментальных исследований в указанном направлении, был предложен достаточно шёвой и доступной по рецептуре состав накопительной среды:

1. Питательный бульон -16,0г. 5. Хлористый натрий -5г.

2. Д-глюкоза 5,0 г. б. Хлористый литий - 15г.

3. Динатрий фосфат- 2,5 г. 7. Полимгоссиин «В»- 500 тыс.ед.

4. Аммоннйй-железо сульфат - 50 мг. 8.Дист. вода - 1000мл.

Первые шесть компонентов разводят в дистиллированной воде, доводя рН до 7,3 -

4 стерилизуют автоклавированием при +120 С - 15 минут. Охлаждают и добавляют раствор шимиксина «В» в 10 мл физраствора. Компоненты с 1 по 5 необходимо для поддержания изнедеятельности листерий, компоненты 6 и 7 составляют систему, замедляющую рост >сторонней микрофлоры. В экспериментах среда накопления давала 100% рост листерий. В яестве твердой селективной питательной среды для выделения листерий наилучшие :зультаты из дешевых, доступных по составу дала среда имеющую следующую рецептуру:

1. Агар «Д» - 30,0 г. 5. Глицин - 2,0 г.

2. Хлористый натрий - 5,0 г. 6. Хлористый литий - 15,0г.

3. Д - глюкоза - 5,0 г. 7. Полимиксиин «В»- 500 тыс.ед.

4. Аммоний-железо (III) сульфат -50,0 мг 8. Диет. Вода - 1000мл.

Компоненты с 1 по б растворяют в дистиллированной воде доводя рН до 7,3 - 7,4, ерилизуют автоклавированием при +121°С - 15 минут. Охлаждают до +50°С и добавляют ютвор полимиксина в 10 мл физ. раствора. Селективными агентами являются компоненты с 5 ) 7 номер.

Целью следующей серии экспериментов была попытка ответа на вопрос - влияют ли зедлагаемые, селективная и накопительная, среды на те биологические свойства листерий ггорые используются при диагностических исследованиях? Для этой цели необходимо было >авнить биологические свойства листериозной культуры культивируемой на стандартной среде изучаемой селективной среде по одинаковым тестам.

Для выполнения поставленной задачи нами был применён стандартный набор тестов яюльзуемый для идентификации бактерий вида L. Monocytogenes. В исследованиях :пытывали, два референс - штамма 766 и 634. Схема опыта была достаточно простая. По лбранным тестам изучались биологические свойства листериозных культур до посева на зедлагаемьтх накопительной и селективной средах.

Полученные данные свидетельствуют, что при культивировании листерий на гпытываемых селективных средах разницы в биологических, свойствах по изучаемым тестам

5 наблюдается. Этот факт позволяет использовать предлагаемые накопительную и лективную среды для выделения листериозной культуры в дальнейших эксперементах по теме гсеертационной работы, а так же при работе в бактериологических лабораториях страны.

Дня последующих экспериментов были использованы несколько типов мясопродуктов - фарши : говяжий, свинной, бараний, куриный, котлета хранившего в температурном режиме бытового холодильника. Результаты опытов по выделению листериозной культуры схематично предетавленны на рис.1. По горизонтале указано время хранения продуктов при температуре домашнего холодильника. По вертикале % образцов давших положительный результат по выделению листерий.

120%

100%

Результаты опытов по выделению листерий

24ч 48ч 72ч

Вговяжий фарш освиной фарш 0 бараний фарт окуриный фарш □ котла ты

Рис. 1. Результаты опытов по выделению листерий.

Таким образом, резюмируя полученные результаты по эффективности использования сред накопления: и селекции и схем выделения листерии из мясопродуктов следуюет придти к выводу, что 67-100% исследуемых образцов дают положительные результаты. Наиболее эффективна (83-100%) схема при использовании 72 часовой экспозиции продуктов в режиме бытового холодильника. Что позволяет нам рекомендовать указаннук схему по выявлению листерий в мясопродуктах для практического использования i бактериологических лабораториях.

Разработка и решение данной задачи позволило нам перейти к следующим раздала* диссертационных исследований.

2.2.2. Определение пороговых показателей термической инактивации бактерий L monocytogenes и Y enterocolitica.

Одной из задач наших исследований является определение термоустойчивости L monocytogene и Y enterocolitica. Известно, что термическая инактивация микроорганизмов является процесс»! протекающим по двум парамертам : температурной инактивации и длительностью е воздействия. По данным показателям можно определить величину характеризующим стелен отмирания бактерий под действием температуры. Результаты наших исследований приведены таблице № 1

Табл. 1

Показатели термической инактивации листерий и иерсиний.

т°с Ь Zм^ш А В

Ьт Уе Ьт Уе Ьт Уе Ьт Уе Ьт Уе

70 140, 0 152,0 16,9 18,0 0,06 0,055 24,4 24,4 0,36 0,36

75 50,3 55,5 5,9 7,0 0,17 0,14

80 3,5 3,0 0,4 од 2,4 5.0

Б - показатель характеризующий 10 -кратное снижение микроорганизмов при адаваемых температурах,

Ъ - показатель времени максимальной эффективности процесса А, Ь - коэффициент уравнения.

Результаты проведённых исследований позволили установить параметры ермической инактивации листерий и иерсиний, которые соответствовали следующим еякчинам: для листерий 70° С -16,9 мин.,75° С - 5,9 мин, 80° С - 0,4 мин., дая иерсиний - 70° С 18 мин., 75° С -7,0 мин., 80° С-0,2 мин.

2.2.3. Определение эффею-ивностм использования СВЧ печей для термической ¡»активации листерий.

В своих экспериментах для получения бактериальной массы изучаемый штамм ультивировали при 37°С в течение 24ч в пробирках с МПБ. Далее полученную суточную ультуру контролировали на чистоту и однородность микроскопией и высевом на МПА и дновременно засевали матрацы с агаром «Д». Через 24часа культивирования при 37 С юлученный рост бактерий смывали стерильным физиологическим раствором и (ентрифугировали дая осаждения остатков агара про 500 оборотах в минуту в течение 5 минут центрифуга лабораторная). Надосадок являлся бактериальной суспензией в физиологическом >астворе. Его доводили до конечной концентрацией (по стандарту мутности) 10 микробных тел I 1мл.. Готовили две партии колб с содержимым по 200мл. Одну партию подвергали СВЧ бработке в режиме "парить" при номинальной мощности 410вт, в различных экспозициях (5, 6, ', 8, 9 мин). Для каждой экспозиции использовали одну колбу. Вторую партию подвергали акже СВЧ обработке при тех же экспозициях, но в режиме "жарить" при номинальной ющности 540вт. Каждый опыт повторяли 3-х кратно.

Обработанные СВЧ-энергией бактериальные взвеси в количестве по 1мл при каждой кспозиции в каждом режиме высевали на. предлагаемую селективную среду. Посевы икубировали в термостате при температуре 22°С в течение 24-48 часов, после чего проводили ■чет. Результаты экспериментов представлены в таблице № 2.

Таблица № 2

Эффективность стерилизующего действия СВЧ -нагрев на листериозныс бактерия шт 766

Тип обработки, (режимы) № опыта Качественные показатели СВЧ обработки бактериальной суспензии листерий Результаты контроля

5 6 7 8 9 10 (минуты)

« парить» 1 2 3 + + + + + - - Во всех образцах рост

«жарить» 1 2 3 + + Во всех образцах рост

Таким образом, полученные результаты смогли только указать что в диапазоне от 5 мин до 8 минут возможна термоинакгивация листерий. Учитывая достаточно слабое технологическое оснащение данного эксперимента было решено одновременно определить количественные показатели термоинактивации. Для этого провели раститровку обработанной бактериальной суспензии листерий. Так как исходное количество листерий составляло 106 м.т. т мл., то титровать данную суспензию решено было до показателе указанной цифры. Результата опыта представлены в таблице № 3.

Таблица № 3

Количественные показатели СВЧ воздействия на бактериальную суспензию листерий шт.

Тип Обработки Величина титра и показатели КОЕ

1 2 3 4 5 6

Парение + -+ 18 1 - -

Жарение + 54 3

Полученные результаты свидетельствуют, что на 5-й минуте обработки в режим «парения» и «жарения» ш б опытных партий бактериальной суспензии в 2-х (по одной : каждом режиме) сохраняется бактериальная культура. Однако количественные показател! листерий значительно изменены. При обработке в режиме «парение» они уменьшили« примерно в 500 раз, при обработке в режиме «жарения» эта цифра уменьшилась в 2000 раз.

Для изучения стерилизующего эффекта СВЧ обработки на мясо, контаминированно листериями готовили мясной фарш из говяжьего, свинного, бараньего и куриного мяса. Дя этого, сначала мясо резали ножницами в мелкие кусочки, а затем пропустили через мясорубку ( диаметром отверстий Змм). Приготовленный мясной фарш в количестве 200 грамм искус ственно контаминировали листериями с конечной концентрацией 103 в 1гр фарша. Дл равномерного распределения микроорганизмов в массе фарша, последний хорошо размешивает Опытные образцы мясного фарша после их обсеменения культурой подвергал обработке в печах СВЧ в режиме номинальной мощности 410вт "парить" с экспозицией 6, 7, 8, 10,11,12,13,14,15 минут, а также в режиме номинальной мощности 540вт "жарить" с теми ж

кспозициями как при режиме "парить". После СВЧ-обработки мясного фарша, применяли »азработанную ранее схему выделения листерий с использованием среды накопления и елективной среды. Контролем служил мясной фарш, контаминированный в той же дозе (истериями, но не подвергнутый СВЧ-обработке в микроволновых бытовых печах. Результаты [редставлены в таблице № 4.

Таблица №4

Эффективность стерилизующего действия СВЧ-нагрев на лнстериозные бактерии

Тип..обработк и. (режимы) № опыта Качественные показатели листерий в фарше СВЧ обработки Результаты контроля

10 11 12 13 14 15 ( минуты)

« парить» Говяд + + + + - Во всех

Свин. + + + + - образцах рост

Баран. + + + - -

Птица + + - - -

«жарить» Говяд. + + - - - Во всех

Свин. + + - - - образцах рост

Баран + + - - -

Птица + - - -

Эти результаты указывают на несколько выводов:

а) устойчивость листерий находящихся в мясе к воздействию СВЧ - обработки начительно выше, чем бактериальной суспензии физиологического раствора, это можно бъяснить структурой и показателями теплопроводности мяса,

б) граничащим временным параметром инактивации листерий в образце мясного >арша весом 200 грамм, при типе обработке «парить» является экспозиция в 14 минут, при иле обработке «жарить» - 11-12 минут.

в) вид мясного фарша (говядина, свинина, баранина, курятина) практически не грает никакой роли при воздействие СВЧ - обработки на инактивацию листерий.

Однако указанные результаты получены на одном, штамме листерий -766 - первой ерогругаты. Для более точного ответа на поставленную задачу необходимо было использовать, ак минимум, ещё одну бактериальную культуру. Поэтому в следующей серии опытов роводимых по аналогичной методике был использован ещё один, листериозный штамм 634 -торой серогрупны. Опираясь на опыт предыдущих эксперементов данная серия исследований роведена с учётом температурных параметров инактивации листерий шт 766. В результате олученные нами данные свидетельствуют, что практически параметры инактивации листерий од действием СВЧ -обработки не зависят от штаммовой принадлежности.

В предыдущих опытах были исследованы в качестве образцов бактериальная суспензия истерий на физиологическом растворе и мясные фарши от сельскохозяйственных животных аэяичных видов (говяжий, свинной, бараний, куриный). Для полноты исследований еобходимо было изучить вопрос термоустойчивости листерий в цельных образцах мяса швотных тех же сельскохозяйственных видов. Для этой цели были отобраны образцы шшечной ткани весом 200 грамм ото всех 4 -х видов с-х животных и контаминированы ультурой листерий штамма 766. Контаминации проводили путём введения, с помощью шрица, бактериальной суспензии, концентрацией 10й мл., листериозной культуры, в объёме см 3, внутрь куска мяса. Контролем служили аналогичные образцы мяса, контаминированные

по той же методике. Методы постановки опыта и изучения его результатов проводили согласно вышеописанной схемы. Полученные нами данные свидетельствуют, что практически временные параметры инактивации листерий при СВЧ - обработки не зависят от типа обработки мяса. Это наглядно продемонстрировано графически на рис. 2.

А

13

12 4i

11 10 -

А Б говядина

А Б

свинина

А Б баранина

А Б птица

2

1

1

2

1

Рис. 2, Диаграмма инактивации листерий: А- в режиме «парить» и Б- в режиме «жарить» при СВЧ -обработке мяса и мясного фарша.

2.2.4. Определение влияния СВЧ - обработки на биологические свойства используемые при диагностических исследован« на листериоз.

Целью следующей серии экспериментов была попытка ответа на вопрос - влияет .nt СВЧ -обработка на биологические свойства бактерий и в частности листерий? Возможно данный механизм воздействия изменяет некоторые биологические свойства листерий, понижае: патогенность, меняет тесты на идентификацию? Для этой цели необходимо было изучит) биологические свойства листериозного штамма до проведения экспериментов по СВЧ -обработке и, выделив листериозную культуру из изучаемого образца, изучить её биологически! свойства по тем же тестам, а затем сравнить полученные данные.

Для выполнения поставленной задачи нами был применён стандартный набор теста используемый для идентификации бактерий вида L. Monocytogenes. В исследования: испытывали, те два штамма, что использовали и в предыдущих опытах - штамм 766 (перва серогруппа) и штамм 634 (вторая серогруппа). Схема опыта была достаточно простая. П выбранным тестам изучались биологические свойства листериозных культур до контаминаци ими мясопродукта, далее после контаминации мясного фарша (говяжьего) и его обработки СВЧ -печи в режиме "жарить" в течение 10 минут, из него выделяли листериозную культур для последующего изучения по тем же тестам. Бактерии культивировали на стандартны питательных средах, используемых в листериозной диагностике

В результате проделанных эксперементов установление, что воздействие СВЧ обработки на листериозную культуру вида L. Monocytogenes не несёт изменения т« биологических свойств которые используются при идентификации.

2.2.5. Разработка оптимальной схемы выделения Y enterocolitica из мясопродуктов.

Для целей диссертационных исследований по установлению эффективных режимов :ВЧ - воздействия на мясопродукты контаминированных иерсиниями, необходимо было рименять по ходу работы методы выделения и идентификации иерсиний из изучаемых бъектов. Анализируя результаты исследований в данной области, полученные различными вторами, мы пришли к выводу о наличии значительного количества схем проведения подобных «¡следований, которые не всегда нас устраивали, что было обусловлено высокой стоимостью «активов, питательных сред и оборудования, используемыми зарубежными и отечественными ^следователями. Поэтому первоначальной задачей возникшей перед нами являлась разработка птимального метода выделения и идентификации Y enterocolitica из мясопродуктов, пособного решить возникающие задачи и выполнить поставленную диссертационную цель.

В результате проведённых исследований по апробации нескольких методов был |редложен следующий «быстрый» бактериологический метод выделения Y enterocolitica из гасопродуктов.

Изучаемый мясопродукт (не менее 25 г.) измельчают и смешивают со средой гакопления - солевой фосфатно-буферный раствор с 1% спиртовым раствором енцианвиолетта (0,85% NaCL, КН2?04 -0,45 r.,Na2HPO, -б,34г., Н20 - 1000 мл.) в «отношении 1:5 (1 часть продукта и 5 частей среды) встряхивают в течение 1 минута и гудьтивируют при 4° С 24 - 48 часов. Через указанные сроки (24 часа в первую очередь с сальнейшим сохранением в холодильнике исследуемой суспензии) 1мл полученной >акгериальной суспензии смешивают с 5 мл 0,5 %-ного раствора КОН ( приготовленного по яедующей методике: готовят стерильный 40% раствор КОН, из него в пробирку содержащую 1,9 мл.5% стерильного раствора NaCl, добавляют ОД мл. ) встряхивают и через минуту ¡ысевают на селективный агар. На селективный агар можно высевать и непосредственно из ;реды накопления, но не взбалтывая её и с верхней трети пробирки или колбы.

В качестве селективного агара по нашим данным наиболее эффективным является :ледующая плотная среда с составом : желчь медицинская 20 мл., раствор NaOH 4% - 10 -12 сапеяь, сухой питательный агар - 35 г., глюкоза -10 г.. мочевина 5г.. 1,6% спиртовой раствор зромтимолового синего - 8 мл., дистиллированная вода 1000 мл. В случае трудностей с её 1риобретением её состав достаточно доступен и она легко готовится в лаборатории. К 1 литру зоды добавляют сухой питательный агар, медицинскую желчь, авгоклавируют 20 минут при 0, 5 атм. После охлаждения до 80°С добавляют глюкозу, мочевину, индикатор бром тимоловый :иний и всё смешивают. Среда зеленоватого цвета. И хранится неделю. Иерсинии разлагая мочевину изменяют цвет среды на сине-зелёный, а колонии будут синего цвета. Те микроорганизмы, что не разлагают мочевину, растут в виде жёлтых колоний.

Из выделенной, по морфологии и окраске, колони частично берут бакмассу для мазка, окрашивают по Граму. Если при микроскопии наблюдают грамотрицательные, полиморфные палочки, с закруглёнными краями, без спор и капсул, одиночные, возможно кокковидные, реже овоидные, то, оставшуюся бакмассу колонии переносят в МПБ, ресуспендируют, подращивают при 24-26°С и проводят идентификацию по биохимическим гестам.

При положительной уреазной активности, ферментации и отсутствии газообразовании глюкозы, в первые 24 часа при 37°С, исключали все газообразующие энтеробактериии родов: Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Enterobacter, Hafiiia. По способность ферментировать арабинозу исключали ещё два рода - Proteus, Serratia , отсутствие ферментации инозита исключали род Klebssiella. Внутри родовую дифференциацию Yersinia проводили с использованием следующих биохимических тестов: положительные результаты ферментации сахарозы, целлобиозы.сорбозы, сорбита и отрицательные показатели ферментации

рамнозы, мелибиозы, рафиннозы при положительном тесте на уреазу и подвижность при 25°С свидетельствовали о принадлежности выделяемой культуры к бактериям вида Y enterocolitica.

При исследовании ферментативных свойств проводили одновременно постановку по всем необходимым тестам, что бы сократить сроки исследования выделенной кулыуры.

Через 24 - 48 часов культивирования при температуре 22° С проводили идентификацию выросших колоний по биохимическим и культуралъным тестам. Оптимальным решением является постановка на исследование не одной пробы исследуемого образца, а целой серии в 10-12 проб.

В качестве образцов использовали мясные фарши от баранины, свинины, говядины, куриное мясо, образцы котлет (коммерческих образцы выработка мясокомбинатов). Продукты контаминировали культурой Yersinia enterocolitica в дозе 105 мк т. Мп. Экспериментальные исследования, в данном направлении, подтвердили указанный выбор достаточно дешёвых и доступных по рецептуре накопительной и селективной сред.

При проведении экспериментальных исследований на образцах ( фарш :говяжий, свинной, бараний, куриный, котлеты) с использованием перечисленных сред - накопления и селекции были получены результаты представленные на рис. 3.

Результаты опытов по выделению иерсиний I

24ч 48ч 724

□ говяжий фарш Цсвинойфарш □ бараний фарш Q куриный фарш □котлеты

Рис. 3. Результаты опытов по выделению иерсиний

Полученные на селективной среде бактериальные колонии, по внешнему виду идентифицированные как иерсиниозные исследовали по последующим тестам, дм подтверждения их принадлежности к возбудителю кишечного иерсинкоза.- У е^егосоНпса.

Таким образом, положительные результаты по эффективности использования схемы выделения, сред накопления и селекции У ейегосоИса позволили перейти к следующему разделу диссертационных исследований.

2.2.6. Определение эффективности использования СВЧ печей для термической инактивации У еШегосоНиса.

В своих экспериментах для получения бактериальной массы изучаемый штамм культивировали при 37°С в течение суток в пробирках с МПБ. Далее полученную суточную культуру контролировали на чистоту и однородность, засевали матрацы с питательным агаром. Через 24часа культивирования при 37° С полученный рост бактерий смывали стерильным фосфатно - буферным раствором и центрифугировали для осаждения остатков агара про 500 оборотах в минуту в течение 5 минут (центрифуга лабораторная). Надосадок являлся бактериальной суспензией в фосфатно - буферном растворе. Его доводили до конечной концентрацией (по стандарту мутности) 106 микробных тел в 1мл. Готовили две партии колб с содержимым по 200мл. Одну партию подвергали СВЧ обработке в режиме "парить" при номинальной мощности 410вт, в различных экспозициях (5, 6 ,7, 8, 9, 10, 11 мин). Для каждой экспозиции использовали одну колбу. Вторую партию подвергали также СВЧ обработке при тех же экспозициях, но в режиме, "жарить" при номинальной мощности 540вт. Каждый опыт повторяли 3-х кратно.

Обработанные СВЧ-энергией бактериальные взвеси в количестве по 1мл при каждой экспозиции в каждом режиме высевали на предлагаемую селективную среду. Посевы инкубировали в термостате при температуре 24°С в течение 24-48 часов, после чего проводили учет.

Результаты экспериментов представлены в таблице № 5

Таблица №5.

Эффективность стерилизующего действия-СВЧ -нагрев ия изучаемые иерсиниозные ___бактерии шт 03 находящиеся в физиологическом растворе._'

Тип..обработ № Качественные показатели СВЧ обработки Результаты

ки. опыта бактериальной суспензии иерсиний контроля

(режимы) 5 6 7 8 9 10 (минуты)

« парить» 1 + + + + - - Во всех

2 + + + - - - образцах рост

3 + + + - - -

«жарить» 1 + + - - - - Во всех

2 + - - - - - образцах рост

3 + - - - -

Таким образом, полученные результаты смогли только указать что в диапазоне от 6 мин до 9 минут возможна термоинакгивация изучаемых иерсиний. Было решено одновременно определить количественные показатели термоинактивации. Для этого провели раститровку обработанной бактериальной суспензии иерсиний. Так как исходное количество бактерий составляло 105 м.т. в мл., то титровать данную суспензию решено было до показателей указанной цифры в качестве среды используемой для титрования применили селективную среду.

Полученные результаты свидетельствуют, что на 6-й минуте обработки в режиме парения и жарения из 6 опытных партий бактериальной суспензии в 5-ти сохраняется бактериальная культура. Однако количественные показатели У ейегосоШюа значительно изменены. При обработке в режиме «парение» они уменьшились примерно в 300 раз, при обработке в режиме «жарения» эта цифра уменьшилась в 2000 раз.

Для изучения стерилизующего эффекта СВЧ обработки на мясо, контаминированное

Yersinia enterocolitica готовили мясной фарш из говяжьего, свинного, бараньего и куриного мяса. Для этого, сначала мясо резали ножницами в мелкие кусочки, а затем пропустили через мясорубку (с диаметром отверстий 3 мм). Приготовленный мясной фарш в количестве 200 грамм искусственно контаминировали Y enterocolitica с конечной концентрацией 104 в 1мл объема фарша. Для равномерного распределения микроорганизмов в массе фарша, последний хорошо размешивали.

Опытные образцы мясного фарша после их обсеменения культурой Y enterocolitica подвергали обработке в печах СВЧ в режиме номинальной мощности 410вт "парить" с экспозицией 7,8,9,10,11,12,13,14,15 минут, а также в режиме номинальной мощности 540вт "жарить" с теми же экспозициями как при режиме "парить". После СВЧ-обработки ¡мясного фарша, применяли разработанную ранее схему выделения Y enterocolitica с использованием фосфатно-буферной среды накопления и селективной среды. Контролем служил .мясной , фарш, контаминированный в той же дозе Y enterocolitica , но не подвергнутый СВЧ-обработке в микроволновых бытовых печах. Наличие культуры Y enterocolitica выявляли по характерному росту колоний синего цвета на синезелсной среде после 36 часов культивирования при 22°С. Результаты экспериментов представлены в таблице № 7.

Таблица №7

Эффективность стерилизующего действия СВЧ-нагрев на бактерии Yersinia enterocolitica

Тип № Качественные показатели СВЧ обработки Результаты

обработки. опыта бактериальной суспензии иерсиний контроля

(режимы) 7 8 9 10 И 12 13

(мин)

« парить» Говяд + + + + + + - Во всех

Свин. + + + + + . + - образцах рост

Баран. + + + +- + -

Птица -+ + - - - -

«жарить» Говяд. + + + - - - ■ Во всех

Свин. + + + + - образцах рост

Баран + + + - - -

Птица + + - -

Полученные в данных экспериментах результаты указывают на несколько выводов:

а) уегочивосгь У сШегосоШса как и листерий, находящихся в мясе к воздействию СВЧ - обработки значительно выше, чем бактериальной суспензии в физиологическом растворе, это так же объясняется структурой и показателями теплопроводности мяса,

б) граничащие временные показатели инактивации У еЩегосоШса в образце мясного фарша весом 200 грамм, при типе обработке «парить» является экспозиция в 12-13 минут, при типе обработке «жарить» - 8-12 минут.

в) ввд мясного фарша (говядина, свинина, баранина, мясо кур) влияет на показатели временной экспозиции СВЧ - обработки. Так в фарше из мяса кур весом 200 грамм бактерии У еШегосоШюа инактивируюггея при временных пороговых показателях 8-9минут (в режиме "жарить"), а в фарше из мяса свинины весом 200 грамм бактерии У еЩегосоШса инактивируются при временных пороговых показателях 11-12 минут (в том же режиме).

Данные результаты получены при использовании одного штамма У еШегосоШка. Для более точного ответа на поставленную задачу необходимо было использовать, как минимум, ещё одащ бактериальный штамм. Поэтому в следующей серии опытов был использован штамм -09.

)пираясь на результаты предыдущих экспериментов, данная серия исследований проведена с четом установленных временных рамок инактивации Y enterocolitica.

Полученные нами данные свидетельствуют, что практически временные параметры СВЧ -©работки для инактивации Y enterocolitica не зависят от штаммовой принадлежности.

В предыдущих опытах были исследованы в качестве образцов бактериальная суспензия Y nterocolitica на физиологическом растворе и мясные фарши от сельскохозяйственных кивотных различных видов (говяжий, свиной, бараний, куриный). Для полноты исследований (еобходимо было изучить вопрос термоустойчивости Y enterocolitica в цельных образцах мяса кивотных тех же сельскохозяйственных видов. Для этой цели были отобраны образцы шшечной ткани весом 200 грамм ото веж 4 -х видов с-х животных и контаминированы сультурой Yersinia enterocolitica. Контаминацию проводили путём введения, с помощью пприца, бактериальной суспензии, концентрацией 10 мл. в объёме 5см 3, внутрь куска мяса, контролем служети аналогичные образцы мяса, контаминированные по той же методике. Методы постановки опыта и изучения его результатов поводили согласно вышеописанной :хемы.

Опираясь на опыт предыдущих экспериментов данная серия исследований 1роведена с учётом температурных параметров инактивации. Полученные нами результаты ашдетельствуют, что практически временные параметры инактивации Y enterocolitica. при СВЧ ■обработки не зависят от типа обработки мяса.

3. Выводы.

I. Разработан оптимальный метод выделения бактерий L monocytogenes из мясопродуктов включающая несколько этапов:

Первый этап ( 24-48 часа). Изучаемый пщцевой продукт (не менее 25 г.) измельчают и гмешивают со средой накопления в соотношении 1:8 (1 часть продукта и 8 частей среды) встряхивают в течение 1 минуты и культивируют при 28° С 24 - 48 часов. Оставшийся изучаемый образец отправляют в холодильник на +4° С.

Второй этап. Через указанные сроки 1мл полученной бактериальной суспензии смешивают с 5 мл ОД - 0,3 %-ного раствора КОН (растворенного в 5%-ном NaCI ) встряхивают и через минуту высевают на селективный агар.

Третий этап. Через 24 - 48 часов культивирования при температуре 22° С проводят клонирование и идентификацию выросших колоний.

Оптимальным решением является постановка, на исследование не одной пробы исследуемого образца, а целой серии в 10-12 проб. При исследовании по третьему этапу проводят одновременно постановку по всем необходимым тестам, что сокращает сроки исследования выделенной культуры.

При соответствии полученных результатов по тестированию выделенной культуры с вышеуказанными данными полученный бактериальный штамм признают как бактериальную культуру вида L monocytogenes.

В случае если изучаемая бактериальная культура не типируется как бактерии вида L monocytogenes, рекомендуется повторное использование бактериальной суспензии со средой накопления хранящейся в холодильнике при +4" С.

2. Разработана простая, надежная, дешёвая среда накопления для выделения и идентификации листерий, позволяющая её эффективно использовать для определения контаминации листериями мясопродуктов включающая следующие компоненты:

Питательный бульон -16,0г.

Д-глюкоза 5,0 г. Хлористый натрий -5 г.

Динатрий фосфат- 2,5 г. Хлористый литий -15г.

Аммонийй-железо сульфат -50мг. Полимиксин «В» - 500 тыс. ед.

Дистиллированная вода -1000 мл. Первые шесть компонентов разводят в дистиллированной воде, доводя рН до 7,3 - 7,4 стерилизуют автоклавированием при +120 "С - 15 минут. Охлаждают и добавляют раствор полимиксина «В» в 10 мл физраствора. Компоненты с 2 по 5 необходимо для поддержания жизнедеятельности лисгерий, компоненты б и 7 составляют систему, замедляющую рост посторонней микрофлоры.

3. Разработана простая, надежная, дешёвая селективная среда для выделения и идентификации листерий, включающая следующие компоненты:

1 .Агар «Д» - 30,0 г. 6 .Хлористый литий - 15,0 г.

2.Хлористый натрий - 5,0 г. 7.Полимиксин «В» - 500тыс.ед

3.Д-глюкоза - 5,0 г.. 8.Дистиллированная вода -1000мл.

4. Аммоний - железо (Ш) сульфат - 50,0 мг

5 .Глици - 2,0 г.

Компоненты с 1 по 6 растворяют в дистиллированной воде доводя рН до 7,3 - 7,4, стерилизуют автоклавированием при +121°С - 15 минут. Охлаждают до +50° С и добавляют раствор полимиксина в 10 мл физ.раствора. Селективными агентами являются компоненты с 5 по 7 номер. Хлористый литий и глицин ингибировали рост энтеробактерий и бактерий семейства Pseudomones. Полимиксин подавлял рост энтерококков.

Доказана эффективность её использования для определения контаминации листериями мясопродуктов.

4. Определены показатели термической инактивации листерий и иерсиний, которые соответствовуют следующим величинам: для листерий 70° С -16,9 мин.,75° С - 5,9 мин, 80° С -0,4 мин., для иерсиний - 70° С -18 мин., 75° С -7,0 мин., 80° С-0,2 мин.

5. Установлено, что при воздействии СВЧ облучения мощностью в 410 вт. (режим парения) и в 540 вт.(режим жарки) в диапазоне от 5 мин до 8 минут возможна инактивация листерий находящихся в физиологическом растворе при концентрации 106 м.т. в мл. Устойчивость листерий, находящихся в цельном куске мяса весом 200 г., к воздействию СВЧ -обработки значительно выше, чем бактериальной суспензии физиологического раствора и составляет до14 минут экспозиции, это можно объяснить структурой и показателями теплопроводности мяса.

Граничащим временным параметром инактивации листерий в образце мясного фарша весом 200 грамм, при типе обработке «парить» (мощность 410 вт. ) является экспозиция в 14 минут, при типе обработке «жарить» ( мощность 540 вт) - 11-12 минут. Видовые особенности мясного фарша (говядина, свинина, баранина, курятина) практически не влияют на экспозицию воздействие СВЧ - обработки. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что практически параметры инактивации листерий не зависят от серогрупповой, штаммовой принадлежности и от типа обработки мяса.

6. В результате проделанных экспериментов установлено, что воздействие СВЧ -обработки на листериозную культуру вида L. Monocytogenes не несёт изменения тех биологических свойств которые используются при идентификации листерий данного вида.

7. Разработан оптимальный метод выделения иерсиний вида Yersinia enterocolitica из мясопродуктов заключающийся в следующим: изучаемый мясопродукт (не менее 25 г.) измельчают и смешивают со средой накопления - солевой фосфатно-буферный раствор с 1% спиртовым раствором генцианвиолетга (0,85% NaCL, КН2РО4 -0,45 r.,Na2HP04 -6,34г., НгО -1000 мл.) в соотношении 1:5 (1 часть продукта и 5 частей среды) встряхивают в течение 1 минуты и культивируют при 4° С 24 - 48 часов. Через указанные сроки (24 часа в первую очередь с дальнейшим сохранением в холодильнике исследуемой суспецздц) 1мл полученной

бактериальной суспензии смешивают с 5 мл 0,5 %-ного раствора КОН ( приготовленного по следующей методике: готовят стерильный 40% раствор КОН, из него в пробирку содержащие 7,9 мл. 5% стерильного раствора NaCl, добавляют 0,1 мл, ) встряхивают и через минуту высевают на селективный агар. На селективный агар можно высевать и непосредственно из среды накопления, но невзбалтывая её и с верхней трети колбы.

В качестве селективного агара по нашим данным наиболее эффективным является плотная среда следующего состава: желчь медицинская 20 мл.,раствор NaOH 4% - 10 -12 капель, сухой питательный агар - 35 г., глюкоза -10 г.. мочевина 5г.. 1,6% спиртовый раствор бромтимолового синего - 8 мл., дистиллированная вода 1000 мл. К 1 литру воды добавляют сухой питательный агар, медицинскую желчь, автоклавируют 20 минут при 0, 5 атм. После охлаждения до 80°С добавляют глюкозу, мочевину, индикатор бром тимоловый синий и всё смешивают. Среда зеленоватого цвета. И хранится неделю. Иерсшпш разлагая мочевину изменяют цвет среды на син&-зелённй, а колонии будут синего цвета. Те микроорганизмы, что не разлагают мочевину, растут в виде жёлтых колоний.

Из выделенной, по морфологии и окраске, колонии частично берут бакмассу для мазка, окрашивают по Граму. Если при микроскопии наблюдают грамотрицательные, полиморфные палочки, с закруглёнными краями, без спор и капсул, одиночные, возможно кокюовидные, реже овоидные, то, оставшуюся бакмассу колонии переносят в МПБ, ресуспендируют, подращивают при 24-26°С и проводят идентификацию по биохимическим тестам. При положительной уреазлой ахтивности, ферментации и отсутствии газообразовании глюкозы, в первые 24 часа при 37°С, исключали все газообразующие энтеробактерии родов: Escherichia, Edwardsieila, Citrobacter, Salmonella, Enterobacter, Hafhia. По способность ферментировать арабинозу исключали ещё два рода - Proteus, Serratia , отсутствие ферментации инозита исключали род Klebssiella. Внутри родовую дифференциацию Yersinia проводили с использованием следующих биохимических тестов: положительные результаты ферментации сахарозы, целлобиозы,сорбозы, сорбита и отрицательные показатели ферментации рамнозы, мелибиозы, рафиннозы при положительном тесте на уреазу и подвижность при 25°С свидетельствовали о принадлежности выделяемой культуры к бактериям вида Y enterocolitica.

При исследовании ферментативных свойств проводили одновременно постановку по всем необходимым тестам, что бы сократить сроки исследования выделенной культуры.

Через 24 - 48 часов культивирования при температуре 22° С проводили идентификацию выросших колоний по биохимическим и культуральным тестам. Оптимальным решением является постановка на исследование не одной пробы исследуемого образца, а целой серии в 10-12 проб.

Доказана эффективность её использования для определения контаминации иерсиниями мясопродуктов.

8. Установлено, что при воздействии СВЧ облучения мощностью в 410 вт.(режим парения) и в 540 вт (режим жарки) в диапазоне от 6 мин до 10 минут возможна инактивация Y enterocolitica находящихся в физиологическом растворе при концентрации 10 6 м.т в мл. Устойчивость Y enterocolitica, находящихся в мясе к воздействию СВЧ - обработки значительно выше, чем бактериальной суспензии в физиологическом растворе, это так же объясняется структурой и показателями теплопроводности мяса. Граничащими временными показателями инактивации Y enterocolitica в образце мясного фарша весом 200 грамм, при типе обработке «парить» является экспозиция в 12 -13 минут, при типе обработке «жарить» - 8-12 минут. Видовая принадлежность мясного фарша (говядина, свинина, баранина, мясо кур) влияют на показатели экспозииции СВЧ - обработки. Так в фарше из мяса кур весом 200 грамм бактерии Y enterocolitica инактивируются при временных пороговых показателях 8-9минут (в режиме "жарить"), а в фарше из мяса свинины весом 200 грамм бактерии Y enterocolitica инактивируются при временных пороговых показателях 11-12 минут (в том же режиме).

Полученные данные свидетельствуют, что практически временные параметры СВЧ -обработки для инактивации Y enterocolitica не зависят от серовариавтной, штаммовой принадлежности и от типа обработки мяса.

А. Практические предложения.

1. Предложен метод выделение и идентификацию листерий вида L monocytogenes из мяса и мясопродуктов, который рекомендуется для бактериологических лабораториях КБР утверждённый Управлением ветеринарии республики.

2. Выделение и идентификацию иержний вида Y enterocolitica из мяса к мясопродуктов рекомендуется в бактериологических лабораториях проводить по схеме предложенной автором и утверждённой Управлением ветеринарии республики.

3. Для повышения эффективности метода выделения и идентификации листерий рекомендуется в бактериологических лабораториях использовать накопительную и селективную среды предложенные автором.

4. Предложены режимы обеззараживания мясопродуктов, контаминированных бактериями из рода L monocytogenes и Y enterocolitica, посредством СВЧ- обработки, что является ешё одним барьером по предупреждению вспышки пищевых инфекций данной этиологии.

5. Результаты исследований нашли своё отражений в в нормативно - технической документации, утверждённые Управлением ветеринарии КБР.

6. Материалы диссертации используют при проведении учебного процесса в КБГСХА.

5.Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Д.К.Кожаева. Обеззараживания мяса птицы сверхвысокочастотной энергией. Ж. Вестник ветеринарии. №9 3/98. С. 42-44. г. Ставрополь.

2. И.Х.Таов, Д.К.Кожаева, А.М.Атаев. Методика получения прецигоггирующих сывороток. Ж. Вестншс ветеринарии. №8 2/98 с.85-87. г. Ставрополь.

3. Д.К.Кожаева. Методика исследования качества мяса и мясопродуктов. КБГСХА г. Нальчик. 1998.

4. . Д.А.Васияьев, Д.К.Кожаева, Б.М.Коритняк. Термоустойчивость листерий. Тезисы докладов г. Москва 1999. Гос. акад. вет. мед. и биотехнологии им. К.И.Скрябина.

Значение мясопродуктов в питании человека определяется тем, что они служат источником полноценных белков, жира, минеральных и экстрактивных веществ, некоторых витаминов, потребление которых является необходимым для нормального функционирования организма.

В группу разнообразных факторов, характеризующих жизненный уровень населения (экономическая обеспеченность, условия труда, жилищные условия и др.), влияющих на заболеваемость, продолжительность жизни и трудоспособность людей, питанию и пищевым продуктам принадлежит важнейшее место.

Хорошее питание - основа народного здоровья, так как оно увеличивает сопротивляемость организма болезнетворным влияниям и от него зависит умственное и физическое развитие народа, его рабочая способность и боевая сила», - говорил видный советский гигиенист Г. В. Хлопин.

Многочисленные наблюдения подтверждают несомненную связь продуктов питания с заболеваемостью, физическим развитием людей, выносливостью и устойчивостью организма к различным неблагоприятным факторам внешней среды, в том числе и к инфекциям.

Степень восприимчивости человека к инфекционному агенту находится в прямой зависимости от пищи, которую организм получил до внедрения в него возбудителей инфекции. Недостаточное количество в рационах белков, жиров, углеводов, минеральных веществ и витаминов, нарушения в питании, резко снижает иммунобиологические свойства организма. Некачественный пищевой продукт, полученный от больного животного или испорченный в результате его контаминации патогенной микрофлорой не только не поддерживает работу иммунной системы, а наоборот, ослабляет защитные функции этой системы. Данный продукт является одной из причин проникновения болезнетворного агента в организм человека. 3

Необходимо подчеркнуть, что пищевые продукты, получаемые от животных, болевших любым инфекционным или неинфекционным заболеванием могут содержать микроорганизмы, вызывающие пищевые отравления. Поэтому изучению бактериальной контаминации мяса и мясных продуктов уделяется большое внимание.

Существует значительная группа пищевых инфекций, которые известны человеку тысячелетия это в первую очередь ботулизм, сальмонеллёзы и другие. Данные заболевания и вызывающие их инфекционные агенты достаточно изучены за последние сто лет. Однако появляются новые, малоизученные пищевые инфекции. Инфекционные агенты которых только начинают изучать. К таким микроорганизмам относятся бактерии Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica. Данные микроорганизмы, несмотря на всё их таксономические различия объединяет одна особенность - наличие положительного «холодового» эффекта. При температуре хранения в холодильниках указанные бактерии, в отличие от других не только не замедляют свое размножение, а наоборот размножаются и в определённой степени повышают показатели своей вирулентности. Учитывая широкое расспостранение в последние годы «быстрых» продуктов питания, полуфабрикатов готовых или почти готовых к употреблению в пищу после незначительной кулинарной обработке и хранящихся до этого момента в домашнем холодильнике важное значение приобретают вопросы, связанные с исследованиями по бактериологическому контролю и обеззараживанию мяса контаминированного листериями и возбудителем кишечного иерсиниоза, что в свою очередь, связано с устойчивостью упомянутых бактерий к различным физическим и химическим факторам.

Технологическая обработка мяса требует соблюдения санитарно-гигиенических условий, гарантирующих полную безвредность готовых продуктов для потребителя. Достигнуть этого можно только при совершенствовании существующих технологических процессов и разработки 4 новых, обеспечивающих рациональное использование сырьевых ресурсов, повышение выхода массы и улучшение качества выпускаемой продукции.

Помимо существующих способов обеззараживания (проварка, заморозка, посол), в последние годы для этих целей предложено использование ультрафиолетовых лучей, ионизирующей радиацией, электромагнитного нагрева и др. Бесспорно, что этим целям полностью отвечает и сверхвысокочастотный нагрев или СВЧ - обработка пищевых продуктов.

По данным В.Я.Щабли и Я.П.Шлипакова (1981) и других авторов СВЧ-обработка мясных продуктов позволяет получить более быстрый и равномерный нагрев, что обеспечивает готовность продукта за короткий промежуток времени. Кроме того, при СВЧ - обработке денатурационные изменения белков мышечной ткани менее глубокие, чем при нагревании обычным способом, содержание свободной воды в мясе бывает больше на 1415%, что обеспечивает больший выход массы, выше сохранность аминокислот и экстрактивных в т.ч. и биологически активных веществ.

Одним из основных направлений в использовании СВЧ-энергии является использование ее в качестве фактора активного воздействия на клетки микроорганизмов с целью их уничтожения. В последнее время в связи с разработкой СВЧ-генераторов открылась возможность использования СВЧ-энергии с целью стерилизации и пастеризации пищевых продуктов, Рогов И.А., Некрутман C.B. (1976); Филипов P.JI. (1984), еще в 70-х и 80-х годах в своих исследованиях указывали на бактерицидное действие СВЧ-полей не только большой (тепловой), но и малой (нетепловой) мощности, а также возможность использования СВЧ-энергии в стерилизации продуктов биологического происхождения.

Имеются сообщения о стерилизации с помощью СВЧ нагрева различных продуктов, упакованных в пластиковые мешочки под небольшим давлением (О. Meara et. Al 1976., J. Ayob 1974).

N. Assinder (1974); сообщаил о положительных результатах полученных по СВЧ пастеризации молока, пива и других напитков. 5

Kase Y. (1978) сообщает о широком использовании СВЧ нагрева для стерилизации пищевых продуктов в Японии.

Таким образом, ширится использование СВЧ печей для быстрого приготовления продуктов питания готовых сразу же к употреблению в пищу.

Данные обстоятельства задают вопросы, а насколько эффективен метод термического обеззараживания микроорганизмов в СВЧ печах, и в частности этих бактерий, вызывающих пищевые инфекции.

Цель и задачи исследований.

В связи с вышеизложенным целью данной работы явилось разработка быстрых методов выделения и идентификации бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica из мясопродуктов. Изучение эффективности их инактивации в бытовых СВЧ-печах. Тем самым установление санитарной безопасности использования продуктов в домашних условиях после СВЧ - обработки.

Исходя из указанной цели были поставленны следующие задачи:

1. Разработать быстрые методы выделения и индентификации бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica из мясопродуктов.

2. Определить показатели термической устойчивости данных микроорганизмов.

3. Разработать и предложить оптимальные режимы обеззараживания мясопродуктов, контаминированных бактериями Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica, с помощью СВЧ нагрева.

Научная новизна.

Научная новизна работы заключается в том, что:

• В результате проведённых исследований впервые в практике предложены достаточно быстрые бактериологические методы выделения и идентификации бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica из мясопродуктов.

• В результате проведённых исследований установлении пороговые показатели термической устойчивости бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica.

• В результате проведённых исследований экспериментально доказана надёжность использование для целей инактивации бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica бытовых СВЧ - печей, тем самым обоснованна эффективность их применения в условиях быта с целью профилактики вспышки данных заболеваний.

• Изучено обеззараживающее действие СВЧ энергии на мясопродукты (свинина, говядина, баранина, куры) контаминированные бактериями из рода Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica

• Разработаны и предложены оптимальные режимы обеззараживания мясопродуктов контаминированные бактериями Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica с помощью СВЧ нагрева.

Практическая ценность. При выполнении данной работы получены результаты имеющие определённую практическую значимость:

1 .На основании проведенных исследований разработаны схемы бактериологического исследования мясопродуктов на наличие бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica.

2. Разработаны и апробированы селективная и накопительная среды для выделения листерий из мясопродуктов.

3. Установленны режимы обеззараживания мясопродуктов, контаминированных бактериями из рода Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica посредством СВЧ- обработки.

Тем самым предложен ещё один барьер предупреждения вспышки пищевых инфекций данной этиологии.

4. Материалы диссертации используются при чтении лекций в КБГСХА. 7

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• Методы выделения и идентификации бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica из мясопродуктов.

• Установление пороговых показателей термоинактивации данных микроорганизмов.

• Эксперементальное обоснование надёжность использование для целей инактивации бактерий Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica бытовых СВЧ - печей и установления эффективности их применения в условиях быта с целью профилактики вспышки данных заболеваний.

• Определение обеззараживающего действия СВЧ энергии на мясопродукты (свинина, говядина, баранина, куры) контаминированные бактериями, из рода Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica

• Схема оптимальных режимов обеззараживания мясопродуктов контаминированных бактериями Listeria monocytogenes и Yersinia enterocolitica с помощью СВЧ нагрева.

Апробация работы и публикация результатов исследования.

Результаты исследований доложены на 4 республиканских, международных,вузовских научно-практических конференциях

По результатам исследований опубликовано 4 печатных работ. Объём и структура работы.

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и практических предложений, иллюстрирована 37 таблицами, 6 рисунками. Список использованной литературы включает 132 наименований из них 38 отечественных и 94 зарубежных.

5. Выводы

1. Разработан оптимальный метод выделения бактерий L monocytogenes из мясопродуктов в три этапа за 48-72часа.

2. Разработана простая, надежная, дешёвая среда накопления для выделения и идентификации листерий, позволяющая её эффективно использовать для определения контаминации листериями мясопродуктов .

3. Разработана простая, надежная, дешёвая селективная среда для выделения и идентификации листерий. Доказана эффективность её использования для определения контаминации листериями мясопродуктов.

4. Определены показатели термической инактивации листерий и иерсиний, которые соответствовуют следующим величинам: для листерий 70° С -16,9 мин.,75° С - 5,9 мин, 80° С - 0,4 мин., для иерсиний - 70° С -18 мин., 75° С -7,0 мин., 80° С-0,2 мин.

5. Установлено, что при воздействии СВЧ облучения мощностью в 410 вт. и в 540 вт. в диапазоне от 5 мин до 8 минут происходит инактивация листерий находящихся в физиологическом растворе при концентрации 106 м.т. в мл. Инактивация листерий, находящихся в цельном куске мяса или фарша весом 200 г., под воздействием СВЧ - обработке происходит при 14 и 12 минутной экспозиции соответственно.

Видовые особенности мясного фарша (говядина, свинина, баранина, курятина) практически не влияют на экспозицию воздействие СВЧ - обработки. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что практически параметры инактивации листерий не зависят от серогрупповой принадлежности бактерий и от типа обработки мяса.

6. Установлено, что воздействие СВЧ - обработки на бактерии вида L. Monocytogenes не несёт изменения тех биологических свойств которые используются при идентификации листерий данного вида.

7. Разработан оптимальный метод выделения иерсиний вида Yersinia enterocolitica из мясопродуктов за 3 - 4 суток. Доказана эффективность его использования для определения контаминации иерсиниями мясопродуктов.

8. Установлено, что при воздействии СВЧ облучения мощностью в 410 вт и в 540 вт в диапазоне от 6 мин до 10 минут приосходит инактивация У enterocolitica находящихся в физиологическом растворе при концентрации 10 6 м.т в мл. Инактивации У enterocolitica в образце мяса или мясного фарша весом 200 грамм происходит за12 -13 и 8-12 минут соответственно. Видовая принадлежность мясного фарша (говядина, свинина, баранина, мясо кур) влияют на показатели экспозииции СВЧ - обработки. Так в фарше из мяса кур весом 200 грамм бактерии У enterocolitica инактивируются при экспозиции 8-9минут, а в фарше из мяса свинины за 11-12 минут. Эксперементально установленно, что временные параметры СВЧ -обработки для инактивации У

129 enterocolitica не зависят от серовариантной принадлежности бактерий и от типа обработки мяса.

5. Практические предложения.

1. Предложен метод выделение и идентификацию листерий вида L monocytogenes из мяса и мясопродуктов, который рекомендуется для бактериологических лабораториях КБР утверждённый Управлением ветеринарии республики.

2. Выделение и идентификацию иерсиний вида Y enterocolitica из мяса и мясопродуктов рекомендуется в бактериологических лабораториях проводить по схеме предложенной автором и утверждённой Управлением ветеринарии республики.

3. Для повышения эффективности метода выделения и идентификации листерий рекомендуется в бактериологических лабораториях использовать накопительную и селективную среды предложенные автором.

4. Предложены режимы обеззараживания мясопродуктов, контаминированных бактериями из рода L monocytogenes и Y enterocolitica, посредством СВЧ- обработки, что является ещё одним барьером по предупреждению вспышки пищевых инфекций данной этиологии.

5. Результаты исследований нашли своё отражений в в нормативно -технической документации, утверждённые Управлением ветеринарии КБР.

6. Материалы диссертации используют при проведении учебного процесса в КБГСХА.

130