Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изучение диагностической ценности реакции пассивной гемагглютинации при везикулярных болезнях сельскохозяйственных животных

ГОСУДАРСТВЕНЕН КСШГЕГ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР Г Л А В А ГРОБИОПР О М

ВСЕСОЮЗШЛ НЛУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬМ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ К Ш^КРСШОЛОПШ

На правах рукописи

УД К 5Г£. а. 03 216. 995.4 3

КРЕМЕНЧУГСКАЯ Светлана Ревдитовна

ИЗУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ РЕАКЦИИ . ПАССИВНОЙ гаШТЛШИНАЦНИ ПРИ БЕЗИКУЛЯРШХ : БОЛЕЗНЯХ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НИВОТШХ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, впизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Покров - Д990

Работа выполнена во Всесоюзном научко-исследовательсксм яэурном институте

Ндучный руководитель - кандидат ветеринарных наук, стар"-»!;!

faytniuii сотрудник, лауреат преиии . Совета Мииистроз СССР ¡2Ш0 H.A. :

0йяциалькк<з оппон&нты: .

доктор вотс'рштардах наук, профессор ЧЕРБ-ы© йяиЯ Александрович . Ш-ШИ); ■ '

кандидат ветеринарных наук, старимй науч№1 сотрудник IxAPllOB Гоннадаа• ¡¡¿аркелович • (ВНйИВВий).

Водуцзе учреждение - .'Ьучш-исследовательский сельскохозяйственный институт Главагробиопрош

Защита состоится " с1990 г. в '/ час

TT / • 1 ■■ .■ на заседании специализированного совета Д-120.61.01 при

Всесоюзной научно-исследовательском институте ветеринарной

•зирусологии и микробиологии. . .

Адрэс института: 60II2Q г.Покров, Владимирской обл,,ВНШВ1

С диссертацией моано ознакомиться в библиотеке ВНШВВиМ.

Ааторе&зрат разослан.- " иож^Р f 1990 г.

У^гн^й сэкззтягл, сп'лгийжипро:;31 шого* совета, кандидат .био^ш'йческих паук

В,И.Рябое

I. Qbii^ii XAPjUOüPHCRíiíA РАБОТЫ

Актуальность твиц. Везикулярные болезни сельскохозяйственных животных представляет опасность для животноводстве в той плане, что при тождестве клинической ксрти-кы их этиологические факторы откосятся к совершенно рваным таксокоюгжскик группам возбудителей, вялэчаюцкх типичных представителей сегеЯств пикоркавирусов (роды si.ro-вирусов и энторовкрусов), кзлкцивкрусоа Срод гишгакзирусов свиноП), ооладашцих шшрали'гетои ( Сгылогй , uolbrook Л.А. е.о., ¿rimsuifcb Л.^.,:.

Ьгош я рабдовирусов. Поэтому важной научно-прак-

тической задачей является совершенствование их дифференциальной диагностики с покопаю лабораторных катодов и унификация диагностических исследований. С это.*? точки зрения одним из перспективных »-етодов может считаться реакция пассивной гемагглитинации. Заложенный н ее основу . принцип егглптинации эритроцитов с ковалентно или химически связанными антителами под влиянием растворимых антяге-нов, обеспечивает ое высоцув специфичность и чувствительность, адекватную чувствительности таких современных методов, xas иммуноферментныЗ или иммунофлуоресцентныЯ, а таю» простоту » наглядность, присущие осадочный реакциям ( Ouldritítíe ti, ы.а. t1>ü2, Jicn-Yio íriace A» ¿i. , 1988, K.AJlaExo, й.в.Кочергина, 1970-1907, D.А.Черняев • » соавт.,1970-1977,. 2otowia* ВагПи^ои, IS70, Buatb и ссмт.,1§75).

Однако при диагностике везикулярных болезней сельскохозяйственных животных эта реакция пока не примвняегся в связи с те», что эритрещитарные диагностику«« разработаны только ка ящур.

Учиплюя необходимость унификации методов лабораторной диагностики всех болезней, протекающих с зазмкуляриуи синдромом, в данные о высокой спвцифичнос/д и чувствительности РИГА ори яцуро» разргботкв технологии изготовления

w . . . f •

ЭД на ВЕС, BSC я ВС для их диагностики с помоцы» РИГА м утратила своей актуальности.

Делили эедаци. Целью нашей диссертационной работ била разработка технологии изгот9вяенияЗДддя РЛГА при ВБС,

• В5С и ВС. . ■ _

iipii этом тесьхо.дао реямть следующиеэвдачи:

- изыскать возможность повышения специфичное« препаратов 8НТИТвл к вирусам ВБС, SIC и ВС;

- определить оптимальные условия сенсибилизации ими эритроцитов оарсна;

- разработать универсальный метод получения оД на везикулярные селезни;

- изучить чувствительностьи специфичность РИГА с

• полученным! при выявлении и идентификации шташоа возбудителей вышеназванных болезней в ерввнении с другими серологическими реакциями.

Настал новизна. Разработан универсальный метод сенсибилизации эритроцитов барана специфическими антитела» против вирусов ВБС, ВХ в ВС.

- Показана возможность ускоренной идентификации возбудителей везикулярных болезней с помоцыв реакции агглвтина-цки латекса (ЕЦ|.

Получены материалы» использованные при оформлении трех заявок на предполагаемые изобретения, на одну из козгорьк с приоритетом, % 46Э039Д/14,подучено полоиитель- .-. - иое решение от 21.Н.Ш.

Практическая значимость работы. На основании лолучен-них денник разработана: - '•.'"" ; •.

~ ''Временнаяинструкция по изгоФовлешш и контроле тэтозвецгфкосдос' иритроцкгврнах даагностш'.уков для иден-. .тк^кацва аирусоп. t-ЬС., и ВС з fUrA4, yisepsg^msaa . двректороы Su&Ii¿4.-П>Ш..-

- "Технические условия иа' двагвостикз>мы ернтроцитар-ные типосаецифические для идентификации вирусов ВБС, BiC к БС в РИГА", утвержденные директором ВйШ 14.П.Ш.

v - 4-

Отработана унифицированная схена исследования материалов в РДГА на четыре везикулярные болезни.

Основные положения, выносиуые на дапигз;.

1. Результаты разработки и апробации f/етода получения оД для идентификации в РИГА вирусов ВВС, ВЬС и ВС.

2. Денные по оценке получению ¿Д в РДГА к РЗДГА для дифференциальной диагностики ящура от других везикулярных болезней.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях ВШйИ (1937-1966гг.); семинарах ветеринарных врачей республиканских', областных и зональных лабораторий (1989-1990гг.).

Публикации.До материалам диссертации опубликовано к подготовлено к печати 6 научных работ.

Объем и структура, диссертации. Диссертация излозена на 131 страницах дешинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы. Последний включает 158 источника отечественной и зарубежной литературы. В диссерта-ционнув рвботу включено 20 таблиц, 3 приложения.'

П. СОБСТВЕННА ИССДКДОВАНШ

Работа выполнена в лаборатории диагностики ВВДпИ ^лавагробиопроиа СССР.

2.1. Материалы и иеговы

В работе использовали производственные штаммы вируса везикулярной болезни свиней (ВВС) типов 0-72 и Т-7Ь, ве-аякудярной экзантемы свиней (БЭС) типов А-48 и С-72, везикулярного стоматита (ВС) типов Индиана и Ныэ-Дяерси.

Исходные штаммы' возбудителей ВБС v ВсС были арзд-ставлвнм афтозныки материаламш, полученными от экспериментально аараявншх свянвЯ (2-4 пассажа), в ВС - культу-ралышм прусом, подученным а жуль туре клеток ВНХ-21 (7-в пассах*). Рабочее расплодки вируса ВБС и ВЭС получали

путем адаптации к культуре клеток перевиваемой линии Lü-KS _2 (Ь-7 пассакей). Крош того, вирус ВЬС адаптировали к 1-Ь дневник Уплатам ЦО-12 па ссаке й).

Дри апробации разрабатываекьк эритроцдтаркых и латекс-ных диагностикуков в качестве модельных антигенов использовали коукерческие. препараты диагностических антигенов вируса ящура, ВЬС, В'«аС, экспериментальны© серим диагностических антигенов вируса ВС, а текке сускензин патологических материалов, поступавших во ЗНИй! для вирусологической экспертизы.

¿рвотные. Б опытах по получению гипзрииыугашх сывороток использовали сзлкей Ь'ассой I8-2Q кг, морских свинок г/дссой 4CO-5ÖOT и взрослых белых кьззей нассой 1&-20г. При получении антигенных материалов для иммунизации взрослых белых кышай использовали кшат-еосунов 1-5 дневного воз-ргсге.

культуры клеток. Для репродукции вирусов ВЬС и BSC использовали монослойную культуру перевиваем клеток линии IB-its—2 * о вируса ВС - конослойцув культуру перевиваемых клеток линии EHxt-2I.;Кроме того, для культивирования вируса ВБС использовал:! суспензионнув культуру пере-виваекых клеток линии ШИ. /

Первичво-трипснякзироввинув культуру клеток СП применяли для обработки сывороток иорских свинок с цельи удзленкя антител, выработанных на свиную ткань.

Для индукции иукуноасцитных жидкостей (ИАЮ у белых 1ьэ1&Я использовала клетки асцнтной карцинош Эрлиха IS -IBÜ. ' Л;

Ссвороткя. В работе использовали коммерческие и 0искари£<енталь«ые' серя» ытвхэдоепецифических гипериумункы снзороток, ■ полученных' путей гяперккиуккзациа свиней и л&Оорат&рицх »ивоткик. (корсккх свинок, Уыаей). .

В ряде оиутов 1'хряду с гиазриккунныш сывороткауи использовали ИАН белых tssseSw ' '

Выделение иггеуноглобулинов. иммуноглобулины из гипзр-иммушых сывороток выделяли трехкратным высаливанием сернокислым амвониек после предварительной очистки кошлексным методом (согласно 1'щенко В.А. с соавт.,19ов). Концентрации белка в них определяли спектрофогоштрически пря длине водны 280 нм. ■ #

Приготовление ЭД. Для сенсибилизации эритроцитов использовали гипернбчгунные сыворотки с вике'i v. ь-ореких свинок, а также иммуноглобулины, наделенные из них и из КАЖ мышей.

Стабилизации эритроцитов барана формальдегидом, их танизацип, а также сенсибилизацию в присутствии треххло-ристого хрома проводили согласно действующей инструкции по изготовлена и контролю типоспецифических эритроцитар-ных диагностикумов для идентификации вируса ящура в реакции пассивной гемагглютинации 29.0G.63.

Сенсибилизацию эритроцитов в отсутствии связующего реагента проводили в кислой среде при рН 6,4 в течение 30 мин. при 56°С.

¡приготовление латекс-диагностикууод ДЛД).. Для получения ЛД на ящур, ВБС, ВХ и. ВС были испытаны различные по характеристикам латексы, изготовленнуе во БНШ особо-чистых препаратов (г.Ленинград), 0,1 Ü глкцнноаый буфер рН 6,2. Их сенсибилизацию антителам! проводили при тато-*янном встряхивании при комнатной температуре в течение 3 часов. •

Достанрвка РОГА и РЗЛГА. Согласно "Наставлению по постановка реакции пассивной гема.гглптинации и задерякя пассивной гекагглютинеции при идентификации вируса яс^-ра в вдлвлэнкл противояцурных антител", утверхденному доктором ВНЙШ в Ш?г.

Постановка РАД. PAS ставили на обезифзнных предметных стеклах, смешивая по 3 капли антигена и I кашю ЛД. Результаты реакции учитывала визуально через 3-й мин. Додоапгельная реакция характеризовалась появлением аггло-

тината, видимого невооруженным глазом. При отрицательных результатах суспензия латекса оставалась гомогенно кутной.

Серологические методы.

РСЯ ставили в соответствии с ГОСТом <&ЗЬ4-й7 "Животные сельскохозяйственные. Нетоды лаСораторной диагностики ятцу-ра".

При постановке реакции радиальной кшунодиффузии (РРЦЦ) руководствовались 'Тетодическига указаниям по выявления, идентификации типовой специфичности и количественному определении антител к вирусу ящура а сыворотках крови жлвотних", утверяденнымаГУВ &СХ СССР 10.02.63.

Исследование антигенов различного происхождения проводили И=)А в соответствии с "Временный наставлением по иден-гификзцки вируса я:дура ишунсфэркентным методом и дифференциации его от возбудителей других везикуляр^шх болезней", утверзцаенккы Главным управлением ветеринарии Гл СМ СССР 01Л0.Ш. Яри выявлен!« антител применяли общепринятый антиглобулиновыЯ вариант этого анализа.

Чистоту гиперишунных сывороток и препаратов иммуноглобулинов определяли икыуноэлектрофорезом (Остеркан Д.А., 1983) в 1,235 агаровом геле на веронал-мединаловои буфере рН 3,6 при напряжении 90 В в течение 2,5 ч. После окончания электрофореза гель инкубировали с антивидовой сывороткой при ¿?°С 48 ч, для проявления дуг преципитации.

Статистическая обработка данных. Статистическую обработку полученных цифровых данных проводили методами, изложенными в работах В.В.Власова (19Ь6,19Ш) с вычислением средних показателей, стандартной шибки¿г -критерия еначйь'ости, чувствительности и специфичности реакций, х^елсетгадьньк/отрщатедьньк прогностичесюк уровней.

' 2.2. Результаты исследований

2.2.1. Сравнительная сценка различных схен получения шмушых сывороток для сенсибилизации эритроцитов

В первой серии опытов № получали типерям^уннцэ сыворотки свиней на производственные пта'-ты вирусов ВЬС и ВЭС. дивотных подвергали зарзаэниа, а затем 3-4 кратно иммунизировали концентрированны!.» в 100 раз иультуральтек вирусом соответствующего -итагма с геашшм адьювснтом, содержащим 2Ь% ланолкка. В качестве сенситака оказались пригодныт.от только гкпзрикдаукные сыворотки свиней, полученные после кногократных ннъеюдеЙ имиунизиругацего антигена, или выделенные из них иммуноглобулины, титры полученных сывороток в РСл составляли 1:6-1:32, а в РРЭД -1:80-1:320.

Во второй серии опытов в качестве доноров гиперим-ыунных сывороток при получении эратрсцитарных диагности-кумоа на везикулярные болезни сельскохозяйственных животных были испытаны карские свинки и белые мяш.

Сыворотки карских свинок получали с применением трех типов адыэвантов: универсального едшванта ВН&Ш, сапонина и масляного адъюванта, содержащего 25% ланолина, Схека грперимнунизации морских свинок предусматривала 3 внутри-ыъяшчйые инъекции 100-кратных концентратов культурального вируса..

Сыворотки, полученные с использованием универсального и масляного адъюванта оказались в 10-20 раз более активными в РСК по сравнении с сыворотками, получекныки с использованием сапонина.

Однако наличие в получаемых сыворотках, наряду с противовирусными антителами, антител к белкам евикеП, обусловленных недостаточной чистотой иккунмзир^вщкх: антигенов, побудило нас провести третьи серте,опытов, в которых для повшения специфичности сенситина были получены

ИДл и гиперакмуяные сиаорогяи. взрослых белых ушей путей ерах краткой кжунизации суспензией мозга белых гпаат, зеракешых интрйцгребрглъно адаптированным вирусом ВЬО. 2 ;.ечсстпэ неспеци^ичееккх стимуляторов икрукогенеза использовали: неполный и полны-/, адшванти -¿ре^нда, а такке ,ун::гс--(; с^льни'; ад:,¡обвит доказано, что в результате

а ст.'йср-зтш хфоси к Ш-.1 игилл-югЕгатся егг:Iис*акт;гтолс, титру которое в Рх'ИД состеа-1:40-1:1с1) 25 1:2^-1:4'л ссответсчгегпс. сыворо'тш, ^гк и обладали строгог типовой спеш^лыиостью и не довели перекрестных -реакций с -нормальным» антигенами, п^-.а с гоалзкна:'« ке тслы:о из тканей белых мылеЛ, но и из 1у;сток сзаного происхозкдекия..

'¿.'¿.'¿. '/.спытанио иммунных сывороток

разного происхождения в качестве сенсктинов эритроцитарных дкагностикумов

Одним из наиболее простых и еффективных приемов, обеспзчквавд^их высокуя специфичность ЗД, является использование для сенсибилизации эритроцитов сывороток от доноров, иммунизированных антигеном, репродуцированным в их о гаюгзье или ин вктро на из огенных им клеточных культурах. у?от приел оказался наиболее эффективным и в наших опытах при получении ЭД на везикуля'рныз Содезни.Д&ксиыальной сп£1р$ичность» обладали ¿Д, полученные при использовании в' качестве, сенситана- гкхюря^тлукивх; оаоро*Ьк: свиней'. и

ь'^аЗу Такие давали' ;отрицательную реакции с гетер-.- г^гйчкшй. ьетиггиак! к-' облздали тксакаяьной чувстви-тзлйностьа. й^« £'к«аланки /гокодопраюс антхгеков. -. -.

аркане»! - доноров' иккуш1зкруй32?ша пре-. ооуслеаякзаш не д-о&ько-значительнее. повшение

нжятс-стл .Ъоху-^аызх' емзоротсн:» но к чувствительности ¿■¿з^ пелу-^йк нря ксЕольгсзанзи 'ьтвх -сывороток''в квчеез ¿о- сонсгакга. ЬакСсл-зе муастзктельнш ЬД были получены

при испытании гипериммунных сывороток после 4-й иммунизации свинеП."

Аналогичное изменение .чувствительности ЭД наблэдаж и при использования в качестве сеяситнна препаратов 'шшу-■ ноглобулинов, выделенных .из.отмеченных вьжз сгаороток. Однако аСсалатные характеристики чувствительности ЬД, полученных на основе иммуноглобулиновых сенситинов, были, как правило," в 8-32 раза вьаае.

Важным преимуществом иммуноглобулиновьгс сенситинов является также то, что они обеспечивают более высокую воспроизводимость методики получения специфичных ЗД.по . сравнения» с • исходным» сыворотками'." •'

В сдерзую^еП соряи опитов мы испытывали в качестве сенситина ентктелосэдерйазуле препараты ¿полученные после 3-4 кратной иммунизации морских свинок 100-кратными концентратами вирусов ВВС и ВоС, репродуцированных в моно-слоГшых культурах клеток перевиваемой линии 1в-Я£-2. В результате было отмечено, что несмотря на очень высокую активность в Р&С Сот 1:128 до 1:1.024), не из всех сер:!Г: сывороток удалось получить специфичные эритроцитарные диагностикумы» что было связано с наличием в них'высоких концентраций ентител к белкам свиного происхождения, поскольку концентраты вируса, применяемые для иммунизации животных были недостаточно очищены. Попытки истощения Ъолууенных сывороток от гетероантител различными способами, в том, числе клетками свиного происхождения, нормальной сывороткой свиней не принесли положительных результатов. Более того, в ходе обработки отмечалось снижение специфической активности сывороток в 2-8 раз, что делало многие из них непригодный для получения ЭД. ¿{рот того, в ряде случаев вещества, применяемые .для "истоденяя" сывороток, вызывали спонтанную агглютинацию эритроцитов. Поэтому в дальнейших опытах-наш. была испытаяы_ сыворотки морских свинок коммерческих серяй, при получении которых используется менее интенсивная схема гипаримкунизацкя до-

норов, исходя из предположения, что содержание в них про-тйвотканевых «нтител должно быть значительно юше, чем в экспериментальных сыворотках. Выделение из таких сыворо-ток1^5 и истощение их осадком формалинизированних эритроцитов давало возможность подучить специфичные ЭД, кото-рыз позволяли выявлять в РДГА гомологичные антигены в разведениях , превышающих юс титры в РСл в 50 и более раз. .

£.£.3. Испытание акрилового альдегида для стаОиякзйцш эротр'сцитов барана

Важным фактсрок при изготовлении <ЭД является стабилизация оритрсцитов. Основываясь на данных литературы (Нараяьник Ь.Б.,1У?6; Носков $.С.,1970) мы проводили срав-'нительнув оценку эффективности--,стабилизации эритроцитов формалином и акролеином. В результате отмечено, что существенна недостатком формлинизации является длительность процесса - 18-24 часа при 37°С при периодическом встряхивании первые 2-3 часа. В то же время стабилизация эритроцитов акролеином протекает в течение 30 минут при комнатной температуре в стационарных условиях. Эритроциты, фиксированные акролеином, оказались болеэ стабильными яри хранения и сохраняли свои свойства в течение 4 месяцев (срок наблюдения). Столь ке стабильными били акролеинизи-рованнуе эритроциты, обработанные танином, которые сохраняли способность, адсорбировать на своей поверхности антитела в.течение 3 кесздев (срок набладзния) к не приобретал;; сяосооноеть' к спонтанной'агглютинации. Стабильность <?-6р1^л:;надировашшх:''Т8Нйзироз.а>»ак эритроцитов была зна-чкчели-.:.:' и уяе через"'1,5-2 месяца сни приобретала схгоеог.иссть- к спонтанной агглатинэции. Важный достоинство а 1фоле}5визкровзнных. эритроцитов является гакне то, что'

¿¡раготозлеякз г,а -и.ч основе характеризуются. более вы-.СО-ЛС1! «у встзкгеяг.нссщ). Такие ЭД позволяв? выявлять в ИГА го:-..ог.ог5ГчН11Э ентигены Св' титрах' 1:2-1:128)' данб в ,.::-лер',:ала>:, которые в РС;{ 'давали отрицательные или соь-нятелыа»'результаты к были страдательным»: в РИГА с

ЗД, приготовленными на основе <$ормалишзированных эритроцитов.

2.2.4. Сравнительная оценка методов

сенсибилизации эритроцитов барана препаратами , виру специфических антител

Известно, что наиболее простыми из известных методов сенсибилизация эритроцитов при конструировании дкггности-кууов для ?1лГЛ яэляйтся кетоды Носкова «.С.(1973) и Реда и Виттуана -С 1972). В основе первого кетода оекит некова-лентное связывание иммуноглобулинов с рецепторами зритро-ци'гов в кислой среде ("кислотный"). При втором методе сенсибилизация проводился в присутствии связуюцего реагента, наиболее аффективным из которых считается греххлористый хром.

Проведенная нами апробация обоих методов п сравнительно к аспекте при получении ЭД на ВВС, ВЗС и ВС показала,что первый из них явдшгтся более стандартным и универсальным, тогда ках при втором ьгетоде параметры сенсибилизации долены определяться эмпирически для каждой нозоД порции сенси-тина. На основании проведенных опытов нам удглось внести ряд модификаций в. метод сенсибилизации эритроцитов в при- . сутствии трэххлористого хрока, а настоящее вреуя используемый при производстве диагностикуков для типирозания вируса ящура в РИГА. Диагностику гад, полученные согласно зтому кетоду с учетом внесенных модификаций, по специфичности, чувствительности и стабильности не уступали препарата«, получении?.! "кислотным" кетодоу. Сопоставимыми оказались оценки обоих методов по технологическим пар,® метра и. Прежде всего следует ответить их экспрзсснсстъ, позволяющую значительно сократить продолгсительность технологаческо.; схеуы изготовления эритроцитаркых диагностикуыоз, и универсальность, позволяющую с равной эффективностью исподьзозз-гь в качества сенситинэ как активныэ в РСК натквнке снзорог;:;- , так и иыыуногдобулины, выделенные из слабое ктивньсс скзоро-ток.

- 13 -

Описанными методами было приготовлено 18 серий ЗД для идентификации в РИГА вирусов ВВС, ВХи ВС.'Из низ 13 серий ЗД, полученных различными способам, в том. числе, на основе формзлиннзированяых-к акролеинизироввнных танизнро-ванных эритроцитов барака, сенсибилизированных антителами свиней и морскгас свинок "кислотным" методом и с лркмеиени-" ем треххлористого хрома, были лиобильно высушены и заложены на хранение при +4°С» В результате изучения стабильнос-тиэтих диогиостикумов установлено, что титры гомологичных антигенов в РД^А с стдкими препаратами составляли 1:512-1:128000, с лнофилизованными препаратами через 7-10 дней йссле сутки 1:512-1:32000. Хранение в течение 12-24 месяцев при +4°С не оказало отрицательного воздействия на чувствительность ЭД и титры гомологичных антигенов с ниш о практически не изменились. Таким образом показано, что ЛЕОфилизоьанные ЗД существенно не отличаются по чувствительности от исходных жидких и не теряют своей активности в течение 24 месяцев хранения (срок наблюдения).

Испытание лиофилизованных ЗД для идентификации вирусов ВЕС, ВЭС и ВС показело, что титры гомологичных им ан-тягеков в РИГА были в среднем в 16-32 раза выше, чем в РСК» Так титрц 3255 суспензий афт св:шей, мышиного мозга в иулътуральных вируссодеркалдех суспензий штаммов вирусов ; ч ВЕС и ВЭС в РПГА составляли 1,3^0,5-5,7^1,5; 3,3±0,6--5,6^0,6; 3,0^1,0-7,7*0,6 лог^ соответственно, а в РСК -менее 1^0-3,0 лог2. Титры концентрированных культурадьных антигенов итаммоо вирусов ВЕС, ВЭС и ВС в РИГА имели значения 7,25-Ц;0 лог2, тогда- кая в РСК - только 5,0-8»0лог2*

Полученные наш 'ЗД на везикулярные болезни были испытаны при идентификаций апизоотических проб в виде афтозно-го материала от свиней, поступающих на вирусологическую экспертизу во ШИШ. В результате проведенных исследований показано, что ни в одном случае материалы, содержащие вирус ящура, не дают положительных результатов при исследовании в РИГА с ЗД на ВВС, ВЗС, и ВС.

Доследующие исследования этих материалов вирусологи-

ческкми методами позволили выделить из них вирус ящура, в том числе 2 изолята признаны оригинальными ктамнэки(вирус ящура типа 0 }? 1182 "Армянский", вирус ящура мша С » 1340 "Закарпатский"), которы-э депонированы ВГШЭД ветпрепоратов и заявлены в качестве объектов предполагаемых изобр«яений.

Для оцени; чувствительности и специфичности PIFA при диагностике болезней с зезикулярным синдромом в сравнении с ре<$еренж\:м методом ш использовали способ, излое8нкы;1 з работах Басова В.В.(Г^Ьб), а-,л ta ¿.Л. С Ь>08), Я»

auvosiio G. С 1ггей), хдаДцгог Jv С1988). В качества рэ;грзнтнсго метода служила РСХ по ГОСТу«5384-8?.

При исследовании 22 пробполевых материалов, полученных от зараженных ЕЬС и SüC свиней, нами было показано, что чувстзктельносгь FIITA в сравнении с РСК составляет 922, а специфичность - Полояштэльные н отрицательные прогностические уровни равны Ш и

Чтобы оценить различия или сходимость результатов РПГА, выполненной разкыки исполнителями, нами был расчитан р-критерия по иетоду Власова В.В.С1983), 1»торыЯ свидетельствует, что благодаря высокой стандартности разр.1Сотон-ных УД, PÍJTA характеризуется высокой воспроизводимостью.

2.2.5. Изучение диагностической ценности .

РПГА и РЗПГА при везикулярных болезнях

■/. Учитывая данные литературы о тон, что чувствительность PÍO и РЗПГА при других вирусных инфекциях, (щур, -СЕИД) совпадала или была выае, чем чувствительность им-муно^ериентного анализа Ш<Ш Jicn-Yia

ISbtí), нами били провэдевд исследования по изучении диаг- ' ностической ценности РхЯ'А и РЗйГА в сравнении с другииг методти, наиболее еироко применяемыми при везикулярных болезнях.

Проведении^ исследования при БЭС показали, что татрн антител в Р2ПГА в сыворотках свиней поело 1,2 и 3 киаунк-• эацхй з 10-40 раз вше, чей в РСК. Более того РЗПГА позволяла, заявить антитела в рекоявалесцентных сыворотках» ке-

. -15 -

активных в РСК. более высокими были титры сывороток в

Однако результаты этого анализа в меньшей стелена характеризовали состояние ишуногенеза у свиней, чем в РЗПГА, поскольку нарастание титров антител в 1Ш по ьерэ пшериы-мунизацЕК носило менее закономерный характер.

Практическая ценность РЗПГА нами была дополнительно ^. оценена при исследования на наличие антител к вирусам ВС, ВЬС,ВЭС, ящура сывороток крови различных зивотних (60 проб), поступавших во ВШШ для экспертизы. Пошшо РЗПГА, для исследования этих сьдаороток использовали непрямую реакции иммукофлуоресценхцш (НРВД, реакцию нейтрализации СРК) и Шк. В результате отмечено, что в исследуекых сыворотках антител к указанным возбудителям ни одним из методов не обнарукено. Это свидетельствует о возможности применения РЗПГА при ретроспективной диагностике, как одного из самых простых и достаточно чувствительных серологических методов.

При исследовании 33$ суспензий афтозного материала и мышиного мозга в РОГА и И$А получены практически совпадающие результаты. Титры концентрированных культуральных антигенов в-РПГА были вше, чем в PCS в 16-64 раза, но в 12-40 раз ниже, чем в И2А. Однако, в последнем случав наблюдали выраженные перекрестные реакции, обусловленные тем, что ори концентрировании полиэтиленгликолеы, ломимо возбудителей везикулярных болезней, концентрируются и контактирующие их латентные агенты (например, микоплазмы), вызывающе в организме доноров накопление соответствующих антител, ды-являемых затем в ИфА антивидовым ксныогатоы.

2.2.6. Испытание реакции агглютинации латекса (РАЛ.) при везикулярных болезнях

Для сравнения чувствительности РДГА с РАЛ были проведены опыты по получению латекс-диагностш^-ков (ДД) на БЗС, ВВС и ВС. С этой целью испытаны экспериментальные образцы полистироловых и полиакролеиновых латексов, изготовленные ВНШ особочнстых препаратов (г.Ленинград). Их сравнительная оцешш в серии опытов показала, что наилучшим является

-16 -

полистироловый латекс 110-11206 с частицами диаметром 0,1 ыкм. Наиболее эффективно сенсибилизация латекса проходила а ОД H глициновом буфере с рН 8,2.

Для повышения эффективности сенсибилизации частиц латекса испытывали способ их предварительной нагрузки белком А, выделенным нз sfc.eureoa штамма Кован 1 (ПО "Восток").

1фи испытании полученных ЛД была отмечена зависимость их специфичности от концентрации частиц носителя. Так,ЛД, полученные с использованием 0,1% и 0,2% суспензий ¿¿латекса, позволяли дифференцировать вирус ВС от возбудителей ящура, ВВС и В<£, а Лд, полученные на основе 0,055» концентрации частиц носителя, позволяли идентифицировать его типовую принадлежность. По чувствительности РМ с такими диагнос-тикуками не уступала PflFA, а с диагностнкуускя, полученными на основе частиц латекса, предварительно сенсибилизированных белком А, бьда в 2-8 раз более чувствительной.Однако в последнем случае, погаыо повышения чувствительности РАЛ, отмечали выраженной;усиление ее неспецифичностн. Аналогичные результаты были получены и на остальные везикулярные болезни при испытания ЛД.

Дальнейшее изучений диагностической ценности РАЛ при везикулярных болезнях сдерживается отсутствием коммерческого отечественного препарата латекса со стандартным! свойствами.

В H В О Д U.

1. Разработан универсальный способ сенсибилизации . эритроцитов барана антителам при изготовлении высокочувствительных и специфичных ЭД на 4 везикулярные болезни; Он характеризуется высокой воспроизводимостью и позволяет в 3 раза сократить производственный цикл по сравнению со способом, ранее разработанным при изготовлении ЭД на яцур.

2. Характеристики ЭД, получаемых разработанным способом, по стабильности и чувствительности выраяенно зависят от методики фиксации эритроцитов. Методика, основанная на их обработке акролеином, имеет ряд праиму^еств перед

- 17 -

формалинкзацией, в «он числе скорость приготовления (30 мин.) к стандартность, благодаря возможности использования фиксированных эритроцитов в течение 4 мес.(срок наблюдения).

3. Методика нековалентной сенсибилизации эритроцитов антителами % кислой среде (рН 6,4) по сравнению с методикой, основанной на использовании связующего вещества, является более экспрессной, универсальной и в рнмой степени аффективной при использовании в качестве исходного сырья препаратов антител, выделенных из сывороток с разными характеристиками по активности.

4. Лиофилизация ЗД существенно не сникает чувствительности исходник жидких препаратов ЗД, получаемых по разработанному способу, и обеспечивает сохранение их активности на исходном уровне в течение 16-24 мес.хранения при 4°С (срок наблюдения).

5. Типовая специфичность ЗД, получаемых по разработанному способу, в значательной пере зависит от наличия, в препарате сенситкка антител против белков свиного происхождения. Поэтому наибольшей типовой специфичностью при £ЗС и ВВС обладает ¿|Д, порученные » результате применения в качестве сенеитвна антвтелышх препаратов из сыворотки крови свиней, сыворотки крови и ШЖ белых ыыоей, иммунизированных антигеном вируса, репродуцированного в их организмах или

на изогенных км клеточных культурах. При ящуре и ВС такие препараты получены при использовании сывороток морских свивок , гшкрикмунизированных адаптированным вирусом.

6. Применение в качестве сеиситина специфических иммуноглобулинов, выделенных из иммукньк сывороток, является кадежкым методическим приемом стандартизации способа лолу-

¿»Д и повышения их качества. По чувствительности ЗД, подданные на основе иммуноглобулинов, в 16-3^ раза превосходят £»Д на основе гипериаогунных сывороток.

7. Проведенная в сравнительном аспекте экспериментальная оценка показала, что наиболее аффективными 'схемами полу чвь^я неходкого сырья ддя ЗД на везикулярные болезни ;

- 18 -

являются такие, которые основаны на 3-4 кратной введении донорам соответствукячзх антигенов в смеси с универсальным ьаслкным адьювантом ВНЙЯИ на основа синтетических компонентов.

8. Статистический анализ результатов экспериментальной апробации диагностической ценности РИГА н P3ÜFA при везикулярных болезнях на основе разработанных <ЗД» проведенный на полевых уатериалах свидетельствует, что чувствительность и специфичность РИГА по сравнении с PCti составляет 92 и 74,í соответственно, а положительные и отрицательные прогностические уровни равна £6 и Абсолютные значения чувствительности PUTA превосходят РСа в 16-64 раза и приближаются к среднестатистическим характеристикам чувствительности наиболее распространенны* вариантов И JA. Результаты РЗйГА при выявления специфических антител в сыворотках крови при ретроспективной диагностике везикулярных болезней не уступают РЙ и РРВД н достаточно объективно отраяаат дтаашшу их накопления в процессе гиперим-уунизащш подопыаЫк животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЩ(ШШ

1. PITA коает быть использована, как унифицированный кетод идентификации япцгра от других везикулярных болезней.

2. Разработанный универсальный ыетод получения ¿Д может быть использован при организации опытно-прок'ыаленного производства типоспецкфических ЭД на ВВС, ВсС и ВС.

3. Полученные ЭД могут быть использованы для ретроспективной диагностики везикулярных болезней n P3GTA.

СПКССИ НАУЧНЫХ. РАБОТ

1. Кременчугская С.Р., Камаловз Н.Е. О получении эрит-роцнтарных диагностикуиов для выявлений противощурных зн~ тнтел. //Акт.пробл.в2т.вирусол. и нукробиол.,3ладмшр,

19й7. с.за-зэ.

2. Кременчугская С.Р. Получение антительных диагнос-тикумов для идентификации возбудителей везикулярных Солез--

_» -■■ * • ' .. , . . ней свиней в РПГА.//Акт.пробл.вет.вирусол.,Владимир, 1968.

4.1.С.57-58. .

3. Кременчугекия С.Р. Использование акролеинизировалных врктр цитов барона для получения диагяоетинумов при ВЭС.//Акт.вопр. вет.вирусол.»Владимир,1990, с.28-29.

4. Кременчугская С.Р. Сравнение чувствительности РЗПГА и ЙЬА при ВЭС.//Акт.вопр,вет.вирусоя., Владимир,1990, с.29-30.

5. Кременчугская С.Р. Получение латекст-диагностикумов для Идентификации вирусов БЭС и АС.//Акт.вопр.вет.вирусол.,Владимир, 1990, с.26-28.

о 6. Шаххо К.А., Маслова Н.С., Кажхо Л.Ф., Егорова А.И.,

Каыалова Н.Е., Фомина Т.А., Кременчугская С.Р. О влиянии адыован-

.....

тов на характеристики сывороток для лабораторной диагностики болезней -с везикулярным синдромом.//Материалы семинара специалисте;

« • . » • ■

стрсйигленов СЭВ "Разработка и использование новых адызвантов дх. биологические целей"» Владимир,1990. С.58-39,