Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Неспецифическая профилактика бактериальных кишечных инфекций новорожденных телят и оптимизация микробиоценоза профилакториев молочных ферм

11а правах рукописи

М ¿я Л ¿&са о

СОТНИКОВ Роман Пантелеевич

НЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ НОВОРОЖДЕННЫХ ТЕЛ ЯГ И ОПТИМИЗАЦИЯ МИКРОБИОЦЕ! ЮЗА ПРОФИЛАКТОРИЕВ МОЛОЧНЫХ ФЕРМ

16.00.03.- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микологая и иммуполошя

А втореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1999

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательскок институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ).

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук

Л.С. Кап рук

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук D.M. Юрков (ВНИИВСГЭ); кандидат биологических наук H.A. Соколова (МГУПБ)

Ведущее научное учреждение - Государственный научный центр

прикладной микробиологии.

Защита диссертации состоится << «£ » 2000 г. в /( ча<

на заседании диссертационного совета Д 0^0.56.01 при Всероссийско* научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены 1 экологии по адресу: 123022, Москва, ул. Звенигородское шоссе, 5 ВНИИВСГЭ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийской научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены I экологии.

Автореферат разослан « № 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Пд1/.з,д

Е.С. Майстренкс

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Массовые желудочно-кишечные кк'ншена ния новорожденных телят, сопровождающиеся высокой летальжнмык, продолжают оставаться проблемной болонью молодняка ,пч мнощч животноводческих хозяйств страны, особенно на крупных молочник фермах, нанося им значительный экономический ущерб (И.Л.Царе-градская, 1976; О АЛолякова,1976;Ю1Шолонкии#.М.1>ондарснко, 19X6; С.В.Гриненко,!987; Л.Я.Ставцсва,Т.Н.Грязнева,199|; Ш.Ье.тоуюв и др., 1994; Л.С.Каврук,1994; Л.Н.Курнленки,1996; М.А.Сидоро1«,199<>; Э.АШегидевич и др., 1998).

D большинстве случаев данние заболевания имеют иифеккион ную природу, обусловлены разнообразными агентами и протекают н форме смешанной инфекции. Среди бактериальных агентов, визы«.»-ющнх инфекционную диарею телят, особое место занимают представители условно-патогенной микрофлоры (энтеробактерии родов Hsclie richia, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Morganella, Providencia, Yersinia и др.), многие и i которых постоянно или часто присутствуют а помещениях репродукторных отделений молочных ферм, попадая в них с же крементами клинически здоровых коров-бактерионосителей, гры ту нон, с контаминированными кормами и другими путями. Однако основным источником контаминации этих помещений указанными микроор! <t-низмами являются больные и переболевшие диареей телята, выделяющие их с фекалиями в окружающую среду в огромных количествах. Накопление патогенных энтеробактерий в помещениях профилактория приводит к заражению здоровых родившихся телят через разные предметы и возникновению энзоотической вспышки диареи <Э.А,Сиеточ,1972; Н.Ф.Бруснигнна и др.,1988; Г.Г.Вартанян,1991, Д.С. Каврук, 1994; Н.С.Воронин и др.,1994; М.А.Сидоров.В.В.Суббо i ин,1999,

1).8..1ооп,УК^ига,1993; 5.Р.МсОопои£Ь,еЫ,1994), чему способствуют различные факторы, снижающие иммунофизиологическую резистентность организма новорожденного молодняка.

Существующие средства специфической профилактики бактериальных кишечных инфекций молодняка направлены против ограниченного числа возбудителей болезни (зшерихиоаа, сальмонеллеза, анаэробной энтеротоЕсемнн), тогда как данные заболевания могут вызывать еше и другие виды условно-патогенных и патогенных бактерий, циркулирующие на молочных фермах, в отношении которых иммунные препараты отсутствуют. Указанное обстоятельство во многом способствовало широкому внедрению в ветеринарную практику последнего десятилетия многих новых экологически безопасных и безвредных для животных препаратов, содержащих разные виды микробов антагонистов - пробиотиков. В нашей стране нашли применение такие препараты как Бифидобактерин, Бифацидобактерин, Лактобактернн, Спо-робактерин, Пропиацид, Лактицид, Стрептобифид, Субалнн, Ветом-1.1, Ромакол и др. с целью профилактики и лечения диарейиых заболеваний телят (В.А.Антипов,Т.И.Ермакова,1990; Е.П.Наймытенко и др.,1990; В .В.Смирнов,С.Р.Резннк и др.,1993; Е.С.Воронин и др.,1994; А.Н.Паиин.Н.И.Серых, 1992,1996; Шегидевич ндр.,1998).

Недостатком почти всех названных препаратов является сравнительно узкий спектр их действия в отношении разных родов и видов патогенных бактерии семейства ЕтегоЬаЛепасеае - возбудителей кишечных заболеваний молодняка, а также необходимость многократного, ежедневного или через сутки применения в течение 1015 и более дней, что по техническим и экономическим соображениям не может устраивать практических ветработников.

Ввиду этого большую актуальность приобретем и жрос изыскания пробнотнчсского препарата широкого антиоактср1тм>< го спектра с пролонгированным действием, способного при ишшмалыи.м числе аалнкаций эффективно профилактировать ннфекшкшнми диарею бактериальной этиологии и тем самым шшмп. via формирование благоприятного микробиоценоза помещений ¡< н>(>;-ч выращивания новорожденных телят.

Цель и задачи исследований. Цель работы сводилась к разработке и обоснованию режима применения пробиотического препарата широкою антибактериального спектра с пролонгированным действием, обладающего способностью профилакгпровать бактериальные кишечные инфекции новорожденных телят и оптимизировать микробиоценоз помещений профилактория» молочных ферм. Для осуществления намеченной цели перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку активности н спектра лей с г-виз штаммов-антагонистов, входящих и не входящих и некоторые коммерческие ветеринарные пробнотическнс препараты.

2. Изыскать штаммы микробов-антагонистов, действующих на разные роды и виды патогенных энтеробактернй, определить их анш-мнкробный спектр, провести клонирование н селекцию перспективных штаммов-антагонистов, определить их безвредность для лабораторных животных и новорожденных телят.

3. Установить сроки персистнровання изысканных штаммов микробов-антагонистов в кншечинке новорожденных телят при скармливании разных доз пробионгов.

4. Разработать пробиотнческий препарат широкого антибамерм-аи мого спектра и пролонгированного действия в отношении разных

пндов патогенных энгеробактерий - возбудителей кишечных инфекций новорожденных телят.

5. Определить видовой состав н биологические свойства -энтеробактернй в кишечнике телят и циркулирующих в помещениях профилактория до и после применения разработанного иробиотика.

6. Определить профилактическую эффективность разработанного комбинированного пробиотика на фермах, неблагополучных по массовым диарейным заболеваниям телят бактериальной этнологии, н разработать оптимальный режим его применения.

7. Разработать методические рекомендации по .неспецифической профилактике бактериальных кишечных инфекций новорожденных телят на основе оптимизации микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и помещений профилактория молочных ферм.

Научная новизна. ПолученьТ данные, характеризующие антагонистическую активность и антибактериальный спектр действия некоторых штаммов микробов, входящих и не входящих в коммерческие бациллярные пробнотические препараты.

Разработан новый комбинированный пробиотический препарат Колнфирм, содержащий два штамма пробионтob: Е. coli М-17р74 и Bacillus firmus «CK» для профилактики бактериальных кишечных инфекций новорожденных телят, обладающий широким антибактериальным спектром в отношении разных родов и видов патогенных энтеробакте-рий и пролонгированным действием.

На основании экспериментальных данных по определению сроков персистирования и концентрации в кишечнике телят популяций маркированных иггаммов-пробионтов E.coli М-17р74 и Bac.firmus «CK» предложен режим применения Колифирма, обеспечивающий высокую

профилактическую эффективность препарата.

Разработан новый способ определения микробного антагонизма, зарегистрированный как рационализаторское предложение.

Практическое значение рабозы. Для профилактики инфекционной диареи новорожденных телят и оптимизации микробноценоза помещений профилакториев молочных ферм разработан и рекомендован пробиотический препарат широкого антибактериального спектра с пролонгированным действием в отношении разных родов и видов патогенных энтеробактерий -"Колифнрм".Иа основе положительных результатов производственного испытания указанного препарата разработаны методические рекомендации по его применению, которые одобрены и утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН (1999 г.)

Апробация работы, Основные результаты исследований доложены на ветеринарной секции Всероссийской конференции с международным участием "Пробнотики и пробиотичсские продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека'^ 999 г.), Международной конференции, посвященной 80-летию МГАВМиБ им. К.И.Скрябина (1999 г.), Международной научной конференции "Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии" (ВНИИВСГЭ, 1999 г.) и на межлабораторном совещании сотрудников ВНИИВСГЭ (1999 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Данные, характеризующие антагонистическую активность и спектр действия штаммов микробов-лробионтов, входящих и не входящих в бациллярные коммерческие препараты.

2. Материалы по экспериментальному обоснованию нового пробиотического препарата для неспецифической профилактики

кишечных инфекций новорожденных телят и оптимизации

микробиоценоза профилакториев молочных ферм.

3. Результаты производственного испытания нового пробнотичес-

кого препарата "Колифирм".

Внедрение результатов исследований. Мероприятия по профи-лактнке инфекционной диареи новорожденных телят и оптимизации микробиоценоза в профилакториях молочных ферм внедрены в двух хомйствах Московской области.

Публикации. Но теме диссертации опубликованы 4 научные статьи и рационализаторское предложение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 стр. машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования с обсуждением полученных результатов, выводами и предложениями для практики; список литературы, содержащий 165 отечественных и 61 иностранный источник, приложение.

Работа иллюстрирована 16 таблицами и 11 рисунками.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИСЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работу выполняли в период 1997-1999 гг. в лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГЭ, а также на базе двух хозяйств Московской области: АОЗТ племзавода «Заря Подмосковья» Домодедовского района и колхоза им. Владимира Ильича Ленинского района.

Выделение и идентификацию культур энтеробактерий из проб фекалий телят и соскобов с полов помещений профилакториев молочных ферм осуществляли в соответствии с "Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза. (эшерихиоза)

животных" (1991), а также "Методическими указаниями по бактериологической диагностике смешанной кишечной инфекции молодняка животных, вызываемой патогеными энтеробактериями" (1991).

Определение культур эшерихнй с адгезивными антигенами IC88, К99, 987Р, А20, F41 проводили в соответствии с "Методическими указаниями по ускоренной индикации морганелл, сальмонелл и энтеро-патогенных эшерихнй с адгезивными антигенами в объектах внешней среды, кормах и патологическом материале при помощи реакции ко-агглютииации", утвержденными ГУВ Госагропрома СССР 18 января 1989 г. Антигенные свойства выделенных культур Morganella morganii определяли согласно "Наставлению но применению набора сывороток нативных морганеллезных агглютинирующих серогрушювых", утвержденному Департаментом ветеринарии МСХиП РФ 26 апреля 1997 г.

Для сравнительной оценки активности и спектра антимикробного действия пробионтов на различные виды энтеробактерий использовали паспортизированные штаммы микробов-антагонистов: Bac.subtilis КМ МГУ-20, Bac.brevis КМ МГУ-3, Bac.polymyxa №34, а также цггаммы бацилл, входящие в коммерческие пробиотические препараты - Ветом-1.1, Бактисубтил и Споробактерин.

При изучении антагонистической активности штаммов-нробнон-тов в качестве тестов использовали 90 штаммов разных видов энтеробактерий 8 родов: Escherichia, Citrobacter, Salmonella, Yersinia, Klebsiella, Proteus, Morganella,Providencia. Определение активности и антибактериального спектра микробов-антагонистов проводили по методикам Е.И.Басюк и соавт. (1994), И.Б.Павловой и соавт. (1994), а также по разработанному нами способу определения микробного антагонизма бактерий рода Bacillus (Рац. предложение №137 от 21 сентября 1998 г, принятое к внедрению ВНИИВСГЭ).

Выделение микробов-антагонистов рода Bacillus проводили из проб фекалий клинически здоровых телят первых дней жизни и почвы путем прогревания их суспензий в водяной бане при 80° С в течение 20 мин с последующим высевом на пластинчатый МПА для получения отдельных колоний, у которых изучали антагонистические свойства.

Идентификацию выделенного штамма-пробнонта Bacillus firmus «CK» осуществляли по методике J.M. Parry, P.C.B. Turnbull and J.R. Gibson (1991) на основе изучения его морфологических, тинкториаль-HUX, культуральных и ферментативных свойств.

Безвредность штамма Bac.firmus «CK» устанавливали в бнопробе на белых мышах и клинически здоровых новорожденных телятах. Доза микробов, вводимая мышам внутрибрюшннно, составляла 1,5 млрд. м.к. Телятам суспензию бацилл вводили per os с первой выпойкой молозива в дозе 70 млрд м.к,. ' ;

Определение сроков персистировалия в кишечнике новорожден-• ных телят штамма-антагониста E.coli М-17р74 и выделенного нами нового штамма Bac.firmus «CK» проводили на клинически здоровых , телятах. Наличие и концентрацию клеток штамма-антагониста E.coli М-17р74 в кишечнике телят после дачи препарата устанавливали по маркеру антигенной структуры штамма 02:К1 с помощью гомологичной кроличьей агглютинирующей сыворотки в реакции агглютинации на стекле, исследуя по 10-12 колоний эшерихий, полученных на ; агаре Эндо и Плоски рева после посева каждой пробы фекалий телят. Определение сроков персистирования Bac.firmus «CK» в кишечнике телят проводили со штаммом этих бацилл, маркированным путем генно-инженерного вживления плазмиды, определяющей устойчивость штамма к рйфамлицину. Для выделения маркированного штамма Bac.firmus «CK» Rif-10ö из проб фекалий телят использовали МПА, содержащий

рифампнцин в концентрации 50 и 100 мкг/см'. До начала опытов исследовали пробы фекалий телят и соскобов с пола помещений профилактория с целью определения возможности циркулирования на ферме полевых штаммов с аналогичными маркерами. В опытах с разными штаммами антагонистов пробы фекалий телят брали ежедневно в течение 7-8 суг.

Производственные испытания разработанного нами комбинированного пробиотического препарата Колифнрм проводили в периоды массовых заболеваний новорожденных телят инфекционной диареей. Во всех производственных опытах учитывали эпизоотическую обстановку на ферме в последние два года, уровень заболеваемости теляг диареей и их сохранность, условия содержания и режим кормления новорожденных телят и рационы глубокостельных коров, технологию получения н выращивания новорожденных животных, клиническое состояние телят, а также ветерннарно-санитарные, зоогигненическне н противоэпизоотические мероприятия, проводимые в родильном отделении и профилактории.

До начала и после применения Колифирма определяли видовой состав и биологические свойства микрофлоры, циркулирующей в репродукторных отделениях ферм.

В разных опытах нами было использовано 236 новорожденных телят, бактериологическому исследованию подвергнута 151 проба фекалий телят и соскобов с полов, изучены морфологические, тинкториальные и культурально-биохимические свойства 73 культур бактерий, антигенные свойства 668 культур, антагонистическая активность 117 культур разных видов и клонов микробов.

2.2. Результат»! исследований

2.2.1. Опенка активности и антибактериального спектра некоторых штаммов микробов-антагонистов, входящих и не »ходящих в коммерческие препараты

При изыскании перспективного пробиотика была проведена срав-пиимьная оценка активности и спектра антимикробного действия 3-х ш гяммов-антагонистов, входящих в коммерческие препараты: Uac.subtilis BKI7M В-7095 (Ветом-1.1), Bac.subtiIis-534 (Споробактернн), Bai.subtilis IP-5832 (Бактисубтил) и 3-х паспортизированных штаммов бацилл, ::t используемых для изготовления таких препаратов: Bac.sub-lilis KM М1Т-20, Bac.brevis KM МГУ-3 и Bac.polymyxa-34 в отношения 86 гест-штаммов патогенных энтеробахтерий 8 родов, наиболее часто вызывающих инфекционную диарею телят: Escherichia, Klebsiella, Yersinia, Citrobacter, Morganella, Providencia, Proteus, Salmonella.

V.

Полу ченные результаты исследований представлены в таблице 1, откуда следует, что из числа изученных шгаммов-антагоннстов Вас. subtilis КМ МГУ-20 обладал наиболее широким спектром действия, ин-гибнруя рост преобладающего большинства тест-культур энтеробакте-рий, за исключением прсвидеиций и одного штамма иерсиний. Вас. polymyxa-34 был высокоактивен в отношении всех использованных штаммов эшерихий, цитробактерий, клебснелл, сальмонелл и иерсиний и не действовал на штаммы протея, морганелл и провиденций. Bac.bre-vis КМ МГУ-3 ингабировал рост клебсиелл и нитробактерий, половину иснользованных штаммов протея и провиденций, отдельные штаммы морганелл и иерсиний и не действовал на эшерихий и сальмонелл.

Из числа испытанных штаммов-пробионтов, входящих в коммерческие пробиотнки, наибольшую активность проявлял штамм препарата Ветом-1.1, имевший наиболее широкий спектр действия в

отношении всех родов энтеробакгерий, за исключением сальмонелл, / однако он ингнбировая лишь небольшую часть тсст-культур протея, моршнелл и провиденций. Штаммы пробионтов, входящие в препараты Споробактернн и Бактисубтил, не ингибнропали рост всех или большинства тест-культур использованных родов энтеробакгерий.

Таким образом, из изученных нами бацилл-аншгоннстон наиболее широкий спектр действия и высокую активность имел штамм Вас.*иЫШ$ КМ МГУ-20. Штамм Вас.ро1ушуха-34 и пробионт препарата Ветом-1 Л, обладая сравнительно высокой активностью, имели более угкий спектр действия.

Твблнца 1

Антагонистическая активность штаммов-антагонистов рода Bacillus в отношении различных родов энтеробакгерий____

Штаммы-антагонисты

Роды энтеро-бактерий Вас. brevis KM МГУ-3 1 - Ú-s ffi £> T ГЛ „i ЯЗ Й» m 1 I Vv ÍH Я? v-> * tn IT э а и л. 8 Я ta H • 3 § J5 гп ip a 00 » S I ® ■ i2

Proteus Morganella Providencia Escherichia Citrobacter Klebsiella Salmonella Yersinia 6/3 4/1 4/2 2/0 2/2 2/2 3/0 4/1 14/14 13/13 6/1 3/3 2/2 3/3 3/3 4/3 24/1 23/0 6/0 7/7 3/3 4/4 5/5 4/4 8/3 12/4 6/2 2/2 1/1 2/2 3/0 4/4 8/0 12/0 6/0 2/0 1 /1 2/1 3/0 4/2 8/1 12/1 6/0 2/0 1 /0 2/1 3/0 , 4/2

Обозначения: числитель - общее количество использованных тест-штаммов; знаменатель - количество тест-штаммов, на которые микроб-антагонист оказывал действие.

В ходе работы нами был усовершенствован способ определения микробного антагонизма, принятый к внедрению ВНИИВС'ГЭ как рационализаторское предложение, который является наиболее нагляд-

in,im, млн.(трудоемким и позволяет количественно оценивать степень ашаюннчма тою или другого испытуемого микроба ио величине радиусн зоны ингибирования тест-культуры.

2.2.2. Определение сроков колонизация штамма E.coli М-17ц74 в кишечнике новорожденных телят в зависимости от применяемой дозы бактерий

11о данным ЗА. Шегндскича и др. (1996,1998), ЛСКавруха и др. (1997), ь последние годы в ветеринарной практике нашел широжое применение нробногик Ромакол, содержащий генно-инженерный штамм E.coli М-17р7*1 и продуцирующий микроцины группы С, которые ингибируют рост патогенных энтеробактерий родов Escherichia, Citrobacter, Salmonella. Yersinia и некоторых штаммов Klebsiella, но не действуют на эн-зеробактерии родов Proteus, Morganella, Providencia, также являющихся возбудиз елями кишечных инфекций животных. В исследованиях Л.СКаврука, АЬКононенко, С.В.Бритоаой (1997) было установлено, что назпанный штамм после однократного скармливания новорожденным поросятам в профилактической дозе может персистировать в их кишечнике при высокой концентрации до 7-8 сут.

Исходя нз свойств этого штамма, он был выбран нами в качестве основы для создания нового пробиотического препарата пролонгированного действия. Ввиду того, что экспериментальные данные о времени его персистирования в кишечнике телят отсутствовали, нами были проведены опыты на 19 клинически здоровых телятах по определению сроков персистирования E.coli М-17р74 в их кишечнике при разных дозах скармливания этих бактерий. Предварительно до начала опытов исследовали пробы фекалий телят и соскобов с полов профилактория на наличие или отсутствие в репродукторном отделении фермы ¿шерихий, имеющих идентичную со штаммом-пробионтом антиген-

ную структуру. Эти исследования показали, что в репродуктсрном отделении фермы циркулировали полевые штаммы Е.соН с идентичным антигенным строением, но уровень их в обшей популяции эшерн-хий был весьма незначительным и они встречались лишь в единичных пробах, что не могло влиять на результаты изучения поставленного вопроса.

В опутан по изучению сроков персистирования штамма-лробион-та Е.соН М-17р74 в кишечнике новорожденных телят установлено, что при скармливании им с первой выпойкой молозива суспензии бактерий в дозе 50 млрд м.к. высокая концентрация клеток пробиоита в фекалиях сохранялась в течение 4 сут(до 50% колоний эшернхнй в первичных культурах на агаре Эндо и Плоскнрева после засева фекалий давали положительную реакцию с гомологичной агглютинирующей сывороткой 023(1).На5~6сут число клеток штамма-лробионта в пробах фекалий опытных телят значительно уменьшалось или они полностью отсутствовали. При скармливании дозы 70 млрд м.к. высокая концентрация клеток штамма-пробионта в фекалиях телят сохранялась в течение 5, а у некоторых животных до б сут. Однако такая большая доза пробиоита в экономическом отношении не могла быть оправданной, ввиду чего в последующей работе мы ее не использовали.

На основании полученных данных был предложен режим применения коммерческого пробиотика Ромакол для профилактики

инфекционной диареи новорожденных телят, который вошел в

*

действующее наставление по его применению. -Этот режим предусматривает применение препарата двукратно в дозах по 40-50 млрд м.к. (в зависимости от массы теленка) на 1 прием в первые часы жизни животного с первой выпойкой молозива и на 4-е сутки с молоком или кипяченой водой.

2.2.3. Изыскание мнкробоа-яитагонистов рода ВлсШия, расширяющих спектр Антимикробного действия штамма . Е.соН М-17р74

Учитывая многообразие видов патогенных энтеробактерий, вызывающих инфекционную диарею телят, одной из основных наших задач являлось «-«ыскание штамма-антагоииета, способного расширить спектр антагонистического действия штамма Е. coli М-17р74 и прежде всего найти такой антагонист, который мог бы эффективно действовать на этЪробактерии родов Proteus u Morganella. Наиболее перспективным срсд',; ::ред»прнтельмо изученных нами штаммов бацилл являлся Bac.subiilis КМ МГУ-20, однако он ингибировал рост бактерий рода Escherichia, в том числе пробионта E.coli М-17р74. Кроме того, срок его перенстирования в кишечнике новорожденных телят в опыте с маркированным нпаммом не превышал двух cyt. По этим причинам в дальнейшем мы отказались от использования данного штамма.

При изысхании нового штамма-антагониста было выделено из фекалий телят и почвы 1S штаммов бацилл, нэ числа которых только один, обозначенный нами «CK», отвечал предъявляемым требованиям. Данный штамм ингибировал рост всех или преобладающего большинства тест-культур энтеробактерий родов Proteus, Morganella, Providencia, часть культур Yersinia (таблица 2) В частности, в опытах с использованием 87 различных тест-штаммов энтеробактерий 8 родов он задерживал рост- всех 25 тест-штаммов протея (P.vuigaiis и, P.mirabilis), всех 6 штаммов лровиденций (P.rcttgeri), 17(72%) из числа ! 24 штаммов морганелл (M.morganii) и 3 из числа 5 штаммов мерсиний (Y.enterocoiitica и Y.pseudotuberculosis); в отношении тест-штаммов остальных родов (Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Salmonella) не обладал активностью.

Радиус зон задержки роста разных видов тсст-бактерий составлял от 57 до 18-21 мм, а средний радиус зоны ингибнрования роста был равен для протея 11,8мм, морганелл -12мм, лровиденциП -14,?мм, исрсиний -11,3мм.

Таблица 2

Антагонистическая активность и спектр действия нггамма Bacillus «CK»

Роды тест-бактерий Количество тест-штаммов рода Средний радиус зоны ингибирования, мм

общее в т.ч. угнетаемых антагонистом «CK»

Escherichia 10 0 -

Citrobacter 4 0 -

Salmonella 9 0 —

Klebsiella 4 0 -

Yersinia 5 3 11,3

Proteus 25 25 11,8

Morganella 24 17 12

Providencia 6 б 14,3

итого 87

Штамм Bacillus «CK» и пробионт E.coli М-17р74 не оказывали антагонистического действия друг на друга в перекрестных опытах и могли быть совместимы в применении.

2.2.4. Видовая идентификация выделенного штамма Bacillue firmbs «CK» и его биологические свойства

В результате видовой идентификации штамма «CK» установлено, что он относится к виду Bacillus firmus.

Бациллы имеют вид крупных толстых палочек с закругленными концами длиной-10-12 мкм и шириной 1,5-2 мкм, грамположительные, образуют крупные споры овальной формы (субтерминально), капсулу не образуют, неподвижные, располагаются одиночно и короткими цепочками; не растут в анаэробных условиях, образуют каталазу, не

обра»уюг лецитнназу, не утилизируют цитрат на агаре Симмонса, не образуют ацегилметилкарбннол, индол и уреазу, восстанавливают нитршы в нитриты, растут на МПА с 7% N'aCl, гндролнзуют крахмал, казеин и разжижают мясопептонную желатину; ферментируют глюкозу и маннит с образованием кислоты и не ферментируют ксилозу и арабинозу; не обладают гемолитической активностью.

Штамм неприхотлив к условиям культивирования и хорошо растет на обычных питательных средах в аэробных у словиях при температуре 35-37°С и рН 7,0-7,2. В МПБ отмечается слабое помутнение среды с образованием на дне пробирки хлопьевидного осадка, который при встряхивании разбивается в гомогенную взвесь. На МПА видимый рост бацилл наблюдается уже спустя 20-24 ч в виде слабовыпуклых колоний с матовой поверхностью среднего и крупного размера округлой формы с мелко зазубренными краями, серовато-кремового цвета. При более продолжительном сроке культивирования (свыше 2 сут) колонии, увеличиваются в размере и приобретают концентрическую crpyKiypy.

Штамм Bac.firmus не обладает патогенностью для белых мышей и телят. Суспензия бацилл в физиологическом растворе в дозе 1,5 млрд. м.к., введенная 10 мышам внутрибрюшинно, не вызывала изменения их клинического состояния в течение 7 сут наблюдения. После введения 10 клинически здоровым новорожденным телятам per os с первой выпойкой молозива суспензии бацилл в дозе 70 млрд м.к. клиническое состояние животных не имело отклонений от нормы в течение 4 сут наблюдения за животными.

2.2.S. Клонирование и селекция штамма Bacillus firmus «СК» Для повышения антимикробной активности штамма Bacillus firmus «СК» нами было проведено 5 серий (этапов) опытов по его клонированию и селекции наиболее активных клонов. Опыты проводили с одними и теми же тест-штаммами энтеробактерий родов Proteus, Мог-ganeila, Providencia (по 3 штамма каждого рола). Наиболее активные клоны (культуры) отбирали для последующего этапа опытов. При этом отбор клонов проводили по средним значениям величины зон утетения роста всех тест-штаммов протея, морганелл и провиденций вокруг колоний антагониста.

Следует отметить, что клетки популяций штамма Bacillus firmus «СК» обладали гетерогенностью по показателю активности, т.е. образованию антибактериальных веществ, что особенно заметно проявлялось на третьем этапе клонирования, когда разница в размерах зон ин-гибирования одного и того же тест-штамма составляла от 1 до 10 мм у разных клонов, а наиболее часто - 4-5 мм. На последних трех этапах клонирования были получены клоны антагониста, обладающие значительной активностью. Радиус зоны задержки роста отдельными клонами бацилл тест-штаммов протея достигал 21-23 мм, морганелл - 19-21 мм, провиденций - 17-18 мм. Наиболее активный клон Bac.firmus «СК» от третьего этапа клонирования имел среднюю величину радиуса зоны ингибирования для штаммов протея 18 мм, морганелл - 15,7 мм, провиденций -13,7 мм.

2.2.6. Определение сроков персистировання штамма Вас. firmas «СК» в кишечнике новорожденных телят До начала опытов с использованием маркированного штамма антагониста было установлено отсутствие циркулирования в профилактории н кишечнике телят штаммов микробов, устойчивых к действию рифампииина в концентрации 50 и 100 мкг/см3 питательной среды.

В опытах на 1! клинически здоровых новорожденных телятах с маркированным штаммом Bacillus «CK» Rif-100 установлено, что после однократного скармливания им суспензии этих бацилл в дозе 50 млрд. м.к. шгамм-антагонист способен персистироиать в кишечнике новорожденных телят в течение 3 сут. При этом из преобладающего числа проб фекалий опытных телят искомые бациллы выделялись в высокой концентрации. У отдельных животных высокая концентрация клеток микроба-антагониста в фекалиях отмечалась и на четвертые сутки после скармливания суспензии бацилл.

Полученные в этих опытах данные послужили основой для разработки режима применения комбинированного препарата Колифирм.

2.2.7.Создание комбинированного пробнотического препарата с пролонгированным действием для профилакт ики бактериальных кишечных инфекций новорожденных телят

На основании установленных свойств штаммов-антагонистов E.coli М-17р74 и Bac.fjnnus «CK», в-частности, спектров их антагонистического действия, отсутствия взаимного антагонизма, безвредности для животных, сроков псрсистирования в кишечнике новорожденных телят мы сочли целесообразным совместить их для создания эффективного пробнотического препарата широкого антибактериального спектра с пролонгированным действием и рекомендовать следующий режим его применения для профилактики инфекционной диареи новорожденных телят: двукратное скармливание смеси суспензий обоих штаммов в дозах по 50 млрд м.к. каждого антагониста с первой выпойкой молозива и на 4 сут жизни с молоком или кипяченой водой.

Исходя из видовых наименований штаммов-пробионтов разработанный нами комбинированный препарат был назван «Колифирм».

2.2.8. Результаты производственного испытания разработанного пробиотического препарата "Колифнрм"

Определение эффективности действия Колифирма проводили в АОЗТ ПЗ "Заря Подмосковья" Домодедовского района Московской обл. (отделение Ярлыково) во время энзоотической вспышки инфекционной диареи, возникавшей у телят в первые 3 дня их жизни. Комиссионное производственное испытание препарата осуществляли в соответствии с методикой, утвержденной дирекцией ВНИИВСГЭ, на МТФ колхоза им. Владимира Ильича Ленинского района Московской области, являющимся стационарно неблагополучным по массовым диарейным заболеваниям новорожденных телят.

До начала и после окончания испытания препарата проводили бактериологические исследования проб фекалий больных, клинически здоровых обработанных препаратом новорожденных телят, а также соскобов с полов профилактория для определения видового состава и биологических свойств циркулирующей микрофлоры.

Лабораторные партии препарата готовили каждые 8-10 дней в лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГЭ. Всего в хозяйствах опытные группы телят, получавшие Колифирм, составили 120 голов. Контрольные группы телят, которым пробиотик не давали, насчитывали 80 голов. Препарат скармливали по 50 млрд м.к. каждого микроба-пробионта в первые сутки жизни с молозивом и на 4-е сут с молоком или кипяченой водой в тех же дозах.

В таблице 3 представлены данные о профилактической эффективности Колифирма, из которых видно, что в первом хозяйстве соотношение заболевших диареей телят опытной и контрольной групп составило 38 к 86,5%, т.е. заболеваемость диареей снижалась в 2,3 раза. В

другом хозяйстве указанное соотношение составило 12,3 к 64,3% т.е. заболеваемость сокращалась в 5,2 раза.

Таблица 3

Профилактическая эффективность препарата Колифирм _ при двукратном скармливании телятам______

Показатели ПЗ "ЗаряПодмосковья" Домодедовского р-на М. о. Колхоз им. Владимира Ильича Ленинского р-на М. о.

опытные контроль опытные контроль

Количество телят в группах 50 52 70 28

Число телят, заболевших диареей 19(38%) 45 (86,5%) 9(12,3%) 18(64,3%)

Число телят, погибших от диареи — 6(11,5%) 2 (2,8%) 3(10,7%)

Следует отметить, что у телят, получавших пробиотик, которые заболевали диареей, болезнь протекала в легкой форме, непродолжительное время (1 -2 сут) и заканчивалась выздоровлением обычно после применения одних диетических средств. Случаев падежа телят опытных групп от диареи в первые 10-12 дней жмзнн в ПЗ "Заря Подмосковья" не наблюдалось, а в другом хозяйстве погибло лишь 2 теленка-гипотрофика (2,8%), "тогда как в контрольных группах гибель телят составляла соответственно 11,5 и 10,7%.

2.2.9. Микробиоценоз кишечника новорожденных телят и окружающей среды до и после применения пробнотика

При исследовании 24 проб фекалий больных диареей телят до 10-дневного возраста и соскобов с полов помещений профилакториев, а также трупного материала на видовой состав и биологические свойства микрофлоры до применения Колифнрма из 8 проб (33,3%) выделяли энтеропатогенные эшерихин с адгезивными антигенами К88, К99 и , реже 987Р. Бактерии протея (виды Р.уц^апх а Р.пигаЬИЬ)

содержались в высокой концентрации в 14 пробах (63,5%). В 4 пробах (18%) были обнаружены штаммы родов Enterobacter, Morganella (серогруппы 016), в единичных пробах - Providencia и Hafnia. Таким образом, в период эпизоотического неблагополучия в обследованных хозяйствах доминирующими предсгави гелями микробиоценоза кишечника новорожденных телят и окружающей среды являлись патогенные штаммы эитеробактернй родов Escherichia и Proteus.

После применения Колифирма и существенного улучшения эпизоотической обстановки в репродукторных отделениях ферм отмечалось значительное снижение уровня циркулирующих в них патогенных штаммов энтеробактерий. Так, из числа 20 исследованных проб фекалий телят и соскобов с полов профилакториев бактерии рода Proteus содержались в 3 пробах (15%), т.е. частота их обнаружения снижалась в 4,2 раза. Энтеропатогенные эшерихии с адгезивными антигенами не были выявлены ни в одной пробе.

Таким образом, применение Колифирма создавало благоприятный микробиоценоз в кишечнике телят с преобладанием в нем непатогенных штаммов энтеробактерий, которые, попадая с фекалиями в окружающую среду, способствовали оптимизации микробиоценоза помещений профилактория и снижению возможности заражения новорожденных телят возбудителями болезни.

ВЫВОДЫ

1. При сравнительной оценке антагонистической активности и спектра действия 3-х штаммов-антагонистов рода Bacillus, входящих в коммерческие препараты Споробактерин, Ветом-1.1, Бактисубтил, и 3-х штаммов-антагонистов данного рода, не используемых для изготовления коммерческих препаратов, установлено, что более активными из

них и действующими на энтеробактерки 4-5 родов семейства Entere-bucteriaceac являлись штаммы Вас.poly туха-34 и Bac.subtilis BK1IM В-7095, входящий в препарат Ветом-1.1. Штамм Bac.subtilis КМ МГУ-20 обладал наиболее широким антимикробным спектром, ингибируя рост тт-бактерий 7 родов указанного семейства, однако имел непродолжительный срок персистирования в кишечнике теляг (до 2 сут); штаммы препаратов Сноробактерин и Бактисубгнл обладали наименьшей активностью и узким спектром действия, не вызывая игибироваиия роста большинства тест-штаммов энтеробактерий разных родов.

2. Сроки персистирования штамма Е.сой М- i 7р?4 в кншечиикс новорожденных телят составляли:

• при однократном скармливании дозы 50 млрд. м.к. ~ 4 суток;

• при однократном скармливании дозы 70 млрд. м.к. - 5-6 сут.

На основания этих данных нами предложен режим применения

препарата Ромакол для профилактики инфекционной диареи новорожденных телят, включающий- его двукратное скармливание в дозах по 40-50 млрд. м.к. на 1 прием в первые часы жизни с первой выпойкой молозива и на 4 сут жизни с молоком или кипяченой водой.

3. Выделенный новый штамм Bac.ftrmus «CK» обладает выраженным . антагонистическим действием в отношении энтеробактерий родов Proteus, Providencia, Morganella и некоторых штаммов Yersinia, но не действует на энтеробактерий родов Citrobacter, Salmonella, Klebsiella it Escherichia, в т.ч. на штамм-лробионт E.coli М-17р74, ввиду чего оба штамма-пробионта могут применяться совместно.

IIIiawM Bac.firmus «CK» не обладает патогенностью для белых мышей при внутрибрюшшшом заражении в дозе 1,5 млрд м.к. и новорожденных телят при скармливании дозы 70 млрд. м.к.

4. В результате клонирования и селекции штамма Bac.firmus «СК» получены наиболее активные его клоны в отношении тест-штаммов протея, морганелл и провнденций; эти клоны использованы для создания комбинированного пробиотнческого препарата Колифирм.

5. Установлен срок персистирования штамма Bac.firmus «СК» в кишечнике новорожденных телят, который составляет 3-4 сут при скармливании бацилл в дозе 50 млрд. м.к., на основании чего предложен оптимальный режим применения штамма телятам в составе комбинированного пробиотика Колифирм. *

6. Исходя из свойств штаммов-пробионтов - Exoli М-17р74 и Bac.firmus «СК» создан новый комбинированный пробиотический препарат широкого антибактериального спектра с пролонгированным действием - Колифирм, который предназначен для профилактики бактериальных кишечных инфекций новорожденных телят и способен ннги-бировать in vitro рост патогенных энтеробактерий родов Escherichia, Citrobacter, Salmonella, Yersinia, Proteus, Morganella, Providencia, часть штаммов Kiebsiella.

7. В результате производственного испытания препарата Колифирм установлено, что он способен профилактировать инфекционную

. диарею бактериальной этиологии у новорожденных телят. В частности, в разных хозяйствах заболеваемость телят снижалась в 2,3-5,2 раза, а у большинства заболевших животных болезнь протекала в легкой форме и заканчивалась выздоровлением обычно после диетотерапии. Препарат снижал падеж опытных теяят от диареи в среднем в 3,8 раза.

8. Препарат способен благоприятно влиять на формирование безопасного микробиоценоза помещений профилакториев молочных ферм, существенно снижая уровень циркулирующих в окружающей среде патогенных штаммов разных видов энтеробактерий.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Ни основании проведенных исследований разработаны:

1. Новый комбинированный пробиотический препарат Колифирм длм профилактики бактериальных кишечных инфекций новорожденных клят и предложен режим его применения, позволяющий значи-|ельно снижать их заболеваемость инфекционной диареей н предотвратит ь надеж от данного заболевания.

2. Методические рекомендации по исспецифической профилактике инфекционной диареи новорожденных телят на основе оптимизации микробиоценоза желудочно-кишечного тракта молодняка и репро-дукторных отделений молочных ферм.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сотников Р.П. Влияние разных доЗ пробиотика Ромакол на концентрацию и продолжительность колонизации клеток штамма-антагониста в кишечнике новорожденных телят // Тез. Всерос. конф. с междунар. участием "Пробиотики и нробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека" -М., 19<>9.-С.73-74.

2. Каврук Л.С., Сотников Р.П., Экспериментальное обоснование к созданию пробиотика с пролонгированным действием У/ Тез. докл. конф., посвящ. 80-летию МГАВМИБ им. К.И. Скрябина "Актуальные проблемы ветеринарной науки". - М., 1999. - Т.2 - С.54-55.

3. Сотников Р.П. Результаты испытаний нового комбинированного пробиотика широкого антибактериального спектра с пролонгированным действием // Тез. докл. междунар. науч. конф. 16-17 сентября 1999 г. "Проблемы ветеринарной санитарии и экологии (дезинфекция, дезинсекция, дератизация)": Гр. ВНИВСГЭ. - М., 1999. - С. 164-165.

4. Сотников Р.П. Сравнительная оиенкя антибактериальной активности некоторых шгаммов-антагонистов рода ВасШиз // Проблемы ветеринарной санитарии и экологии: Тр. ВНИВСГЭ. - М., 199(>. --Т.107 -С. 18-22.

5. Сотников Р.П. Способ определения микробного антагонизма // Рационализаторское предложение №137 от 21 сентября 1998 г, принятое к внедрению ВНИИВСГЭ.

ВНИИВСГЭ, 1999 г., г. Москва, Звенигородское шоссе, 5 Заказ ¡&8<>Н Тираж 80 эт.

Массовые желудочно-кишечные заболевания новорожденных телят, сопровождающиеся высокой летальностью, продолжают оставаться проблемной болезнью молодняка для многих животноводческих хозяйств страны, особенно на крупных молочных фермах, нанося им значительный экономический ущерб (10,27,53,67,104,126,128,135,152,158).

По сообщениям разных авторов (10,17,20,39,40,53,108,113,129,135,143, 155,165,176,185,188,191,197,211), в преобладающем большинстве случаев указанные заболевания имеют инфекционную природу, обусловлены разнообразными агентами и протекают в виде энзоотических вспышек чаще в форме смешанной инфекции. Среди бактерий, вызывающих инфекционную диарею телят, особое место занимают представители условно-патогенной микрофлоры (энтеробактерии родов Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, Morganella, Providencia, Yersinia и др.), многие из которых постоянно или часто присутствуют в помещениях репродукторных отделений молочных ферм, попадая в них с экскрементами клинически здоровых коров-бактерионосителей, грызунов, с контаминированными кормами и другими путями. Однако основным источником контаминации этих помещений указанными микроорганизмами являются больные и переболевшие диареей телята, выделяющие их с фекалиями в окружающую среду в огромных количествах. Накопление патогенных энтеробактерий в помещениях профилактория приводит к заражению здоровых родившихся телят через разные предметы и возникновению энзоотической вспышки диареи.

Последней способствуют анатомо-физиологические особенности новорожденных телят первых дней жизни, различные факторы, снижающие их иммуно-физиологическую резистентность, несоблюдение технологических, зоогигиенических и ветеринарно-санитарных требований к воспроизводству и выращиванию новорожденного молодняка, приводящее к накоплению в репродукторных отделениях молочных ферм патогенных и условнопатогенных микроорганизмов - возбудителей диарейных заболеваний (17,27,30,51,63,69,102,123,127,128,135,160,163).

Рядом авторов установлена прямая связь между уровнем условно-патогенной микрофлоры в репродуктивных помещениях животноводческих ферм и степенью заболеваемости молодняка диареей. Это обстоятельство выдвигает необходимость создания и поддержания в этих помещениях безопасного уровня указанной микрофлоры, особенно в тот период жизни телят, когда они наиболее подвержены болезни - в первую неделю после рождения. (17,48,53,63,143,152,163).

Многие работники животноводческих ферм недооценивают значение неспецифической профилактики кишечных заболеваний молодняка в ранний постнатальный период телят и часто игнорируют выполнение важных зоотехнических, зоогигиенических, ветеринарно-санитарных и технологических требований, предъявляемых к получению и выращиванию новорожденных животных, что приводит к снижению естественной резистентности их организма и проявлению патогенности условно-патогенной микрофлоры, попадающей в пищеварительный тракт из помещений, где содержатся животные в первые дни и недели жизни.

Существующие средства специфической профилактики бактериальных кишечных инфекций молодняка направлены против ограниченного числа возбудителей болезни (эшерихиоза, сальмонеллеза, анаэробной энтеро-токсемии), тогда как диарею могут вызывать многие другие патогенные для новорожденных телят микроорганизмы, в частности, такие как представители родов Proteus, Morganella, Citrobacter, Yersinia, Klebsiella, Pseudomonas, Providencia, Campylobacter и пр, в отношении которых специфические средства борьбы пока отсутствуют. Указанное обстоятельство во многом способствовало широкому внедрению в ветеринарную практику последнего десятилетия многих новых экологически безопасных и безвредных для животных препаратов, содержащих разные виды микробов антагонистов - пробиотиков. В нашей стране для профилактики и лечения диарейных заболеваний телят нашли применение такие препараты как Бифидобактерин, Бифацидобактерин, Лактобактерин, Споробактерин, Пропиацид, Стрептобифид, Биоспорин, Субалин, Ветом-1.1, Ромакол и др. (3,22,28,35,38,45,85,96,109).

Недостатком почти всех названных препаратов является сравнительно узкий спектр их антагонистического действия в отношении различных родов и видов энтеробактерий, способных вызывать у молодняка кишечные инфекции. Другим недостатком большинства имеющихся ветеринарных пробиотиков является необходимость их многократного, ежедневного или через сутки применения в течение 10-15 и более дней, что по техническим и экономическим соображениям не может устраивать практических ветработников.

Тем не менее, многие препараты, включающие микробы-антагонисты, зарекомендовали себя как эффективные средства профилактики и терапии дисбактериозов, а также некоторых других заболеваний. Использование экологически безопасных и безвредных для животных микробных препаратов, оптимизирующих микробиоценоз их кишечника и окружающей среды, приобретает особое значение в настоящее время, когда тяжелое экономическое состояние большинства хозяйств не позволяет покупать дорогостоящие лечебные антибактериальные препараты.

Вышеизложенное позволяет заключить, что изыскание пробиотического препарата, обладающего широким антимикробным спектром и способностью продолжительно персистировать в желудочно-кишечном тракте телят, предотвращая размножение в нем разных видов патогенных энтеробактерий, а также снижая их уровень в окружающей среде, является актуальной задачей неспецифической профилактики кишечных инфекций молодняка.

В связи с указанным цель нашей работы сводилась к разработке и обоснованию режима применения пробиотического препарата широкого антибактериального спектра с пролонгированным действием, обладающего способностью профилактировать бактериальные кишечные инфекции новорожденных телят и оптимизировать микробиоценоз профилакториев молочных ферм.

Для осуществления намеченной цели перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку активности и спектра действия штаммов-антагонистов, входящих и не входящих в некоторые коммерческие ветеринарные пробиотические препараты.

2. Изыскать штаммы микробов-антагонистов, действующих на разные роды и виды патогенных энтеробактерий, определить их антимикробный спектр, провести клонирование и селекцию перспективных штаммов-антагонистов, определить их безвредность для лабораторных животных и новорожденных телят.

3. Установить сроки персистирования изысканных штаммов микробов-антагонистов в кишечнике новорожденных телят при скармливании разных доз пробионтов.

4. Разработать пробиотический препарат широкого антибактериального спектра и пролонгированного действия в отношении разных видов патогенных энтеробактерий - возбудителей кишечных инфекций новорожденных телят.

5. Определить видовой состав и биологические свойства энтеробактерий в кишечнике телят и циркулирующих в помещениях профилактория до и после применения разработанного пробиотика.

6. Определить профилактическую эффективность разработанного комбинированного пробиотика на фермах, неблагополучных по массовым диарейным заболеваниям телят бактериальной этиологии, и разработать оптимальный режим его применения.

7. Разработать методические рекомендации по неспецифической профилактике бактериальных кишечных инфекций новорожденных телят на основе оптимизации микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и помещений профилактория молочных ферм.

Научная новизна. Получены данные, характеризующие антагонистическую активность и антибактериальный спектр действия некоторых штаммов микробов, входящих и не входящих в коммерческие бациллярные пробиотические препараты.

Разработан новый комбинированный пробиотический препарат Колифирм, содержащий два штамма пробионтов: Е.соН М-17р74 и Вас.йгтш "СК" для профилактики бактериальных кишечных инфекций новорожденных телят, обладающий широким антибактериальным спектром в отношении разных родов и видов патогенных энтеробактерий и пролонгированным действием.

На основании экспериментальных данных по определению сроков персистирования и концентрации в кишечнике телят популяций маркированных штаммов-пробионтов Е.соН М-17р74 и Вас.Агшиз "СК" предложен режим применения Колифирма, обеспечивающий высокую профилактическую эффективность препарата.

Разработан новый способ определения микробного антагонизма, зарегистрированный как рационализаторское предложение.

Практическая значимость. Для профилактики инфекционной диареи новорожденных телят и оптимизации микробиоценоза помещений профилакториев молочных ферм разработан и рекомендован пробиотический препарат широкого антибактериального спектра с пролонгированным действием в отношении разных родов и видов патогенных энтеробактерий -"Колифирм". На основе положительных результатов производственного испытания указанного препарата разработаны методические рекомендации по его применению, которые одобрены и утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН (15.12.99 г.).

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на ветеринарной секции Всероссийской конференции с международным участием "Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека" (1999 г.), Международной научной конференции, посвященной 80-летию МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (1999 г.), Международной научной конференции "Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии" (ВНИИВСГЭ, 1999 г.) и на межлабораторном совещании сотрудников ВНИИВСГЭ (1999 г.). Основные положения, выносимые на защиту:

• Данные, характеризующие антагонистическую активность штаммов микробов-пробионтов, входящих и не входящих в бациллярные коммерческие препараты.

• Материалы по экспериментальному обоснованию нового пробиотического препарата для неспецифической профилактики кишечных инфекций новорожденных телят и оптимизации микробиоценоза профилакториев молочных ферм.

• Результаты производственного испытания нового пробиотического препарата "Колифирм".

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 научные статьи и рационализаторское предложение.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 стр. машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, собственные исследования с обсуждением полученных результатов, выводами и предложениями для практики; список литературы, включающий 165 отечественных и 61 иностранный источник, приложение.

4.ВЫВОДЫ

1. При сравнительной оценке антагонистической активности и спектра действия 3-х штаммов-антагонистов рода Bacillus, входящих в коммерческие препараты Споробактерин, Ветом-1.1, Бактисубтил, и 3-х штаммов-антагонистов данного рода, не используемых для изготовления коммерческих препаратов, установлено, что более активными из них и действующими на энтеробактерии 4-5 родов семейства Enterobacteriaceae являлись штаммы Bac.polymyxa-34 и Bac.subtilis ВКПМ В-7095, входящий в препарат Ветом-1.1. Штамм Bac.subtilis КМ МГУ-20 обладал наиболее широким антимикробным спектром, ингибируя рост тест-бактерий 7 родов указанного семейства, однако имел непродолжительный срок персистирования в кишечнике телят (до 2 сут); штаммы препаратов Споробактерин и Бактисубтил обладали наименьшей активностью и узким спектром действия, не вызывая игибирования роста большинства тест-штаммов энтеробактерий разных родов.

2. Сроки персистирования штамма E.coli М-17р74 в кишечнике новорожденных телят составляли: при однократном скармливании дозы 50 млрд. м.к. - 4 суток; при однократном скармливании дозы 70 млрд. м.к. - 5-6 сут.

На основании этих данных нами предложен режим применения препарата Ромакол для профилактики инфекционной диареи новорожденных телят, включающий его двукратное скармливание в дозах по 40-50 млрд. м.к. на 1 прием в первые часы жизни с первой выпойкой молозива и на 4 сут жизни с молоком или кипяченой водой.

3. Выделенный новый штамм Bac.firmus «СК» обладает выраженным антагонистическим действием в отношении энтеробактерий родов Proteus, Providencia, Morganella и некоторых штаммов Yersinia, но не действует на энтеробактерии родов Citrobacter, Salmonella, Klebsiella и Escherichia, в т.ч. на штамм-пробионт E.coli М-17р74, ввиду чего оба штамма-пробионта могут применяться совместно.

Штамм Bac.firmus «СК» не обладает патогенностью для белых мышей при внутрибрюшинном заражении в дозе 1,5 млрд м.к. и новорожденных телят при скармливании дозы 70 млрд. м.к.

4. В результате клонирования и селекции штамма Bac.firmus «СК» получены наиболее активные его клоны в отношении тест-штаммов протея, морганелл и провиденций; эти клоны использованы для создания комбинированного пробиотического препарата Колифирм.

5. Установлен срок персистирования штамма Bac.firmus «СК» в кишечнике новорожденных телят, который составляет 3-4 сут при скармливании бацилл в дозе 50 млрд. м.к., на основании чего предложен оптимальный режим применения штамма телятам в составе комбинированного пробиотика Колифирм.

6. Исходя из свойств штаммов-пробионтов - E.coli М-17р74 и Bac.firmus «СК» создан новый комбинированный пробиотический препарат широкого антибактериального спектра с пролонгированным действием -Колифирм, который предназначен для профилактики бактериальных кишечных инфекций новорожденных телят и способен ингибировать in vitro рост патогенных энтеробактерий родов Escherichia, Citrobacter, Salmonella, Yersinia, Proteus, Morganella, Providencia, часть штаммов Klebsiella.

7. В результате производственного испытания препарата Колифирм установлено, что он способен профилактировать инфекционную диарею бактериальной этиологии у новорожденных телят. В частности, в разных хозяйствах заболеваемость телят снижалась в 2,3-5,2 раза, а у большинства заболевших животных болезнь протекала в легкой форме и заканчивалась выздоровлением обычно после диетотерапии. Препарат снижал падеж опытных телят от диареи в среднем в 3,8 раза.

8. Препарат способен благоприятно влиять на формирование безопасного микробиоценоза помещений профилакториев молочных ферм, существенно снижая уровень циркулирующих в окружающей среде патогенных штаммов разных видов энтеробактерий.

96

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании проведенных исследований разработаны:

1. Новый комбинированный пробиотический препарат Колифирм для профилактики бактериальных кишечных инфекций новорожденных телят и предложен режим его применения, позволяющий значительно снижать их заболеваемость инфекционной диареей и предотвращать падеж от данного заболевания.

2. Методические рекомендации по неспецифической профилактике инфекционной диареи новорожденных телят на основе оптимизации микробиоценоза желудочно-кишечного тракта молодняка и репродукторных отделений молочных ферм.