Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Индикация Staphylococcus aureus методами ДНК-диагностики в молоке и молочных продуктах
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 16.00.06
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Индикация Staphylococcus aureus методами ДНК-диагностики в молоке и молочных продуктах
На правах рукописи
ГОРЯИНОВЛ ГАЛИНА МИХАИЛОВНА
ИНДИКАЦИЯ
SIAPIIYLOCOCCUS AUREUS МЕТОДАМИ ДНК-ДИАГНОСТИКИ В МОЛОКЕ И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТАХ
I б.ОО.Об - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2004
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВСГЭ РЛСХН)
Научный руководитель:
доктор ветеринарных наук Л.Д- Демидова (ГНУ ВНИИВСГЭ)
Офнцияльные оппоненты:
- доктор ветеринарных наук, профессор В.А. Долгов (ГНУ ВНИИВСГЭ)
- доктор биологических наук A.M. Лысенко (Институт
микробиологии РАН)
Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии (МГУПБ)
Защита состоится «_»_2004 г. в «_» часов на
заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, г. Москва, Звенигородское ш., Д.5).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии.
Автореферат разослан «_»_2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
Е.С. Майстренко
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одними из наиболее опасных возбудителен п плане возникновения пищевых токсикозов и токсикоинфекций являются стафилококки, листерии и сальмонеллы. Пищевые отравления людей при данных инфекциях возникают в случае употребления в пищу молока, молочных, мясных, рыбных и других продуктов, причем чаще всего они связаны с молочными продуктами (Поставин В.А., 1980; Логвинов Д.Д., 1992; Eshraghi H., 1997; Pfleger R. et al., 2002).
Золотистый стафилококк широко распространен во внешней среде, может жить и размножаться в тканях молочной железы, на коже сосков и вымени и является основным возбудителем мастита у коров (Демидова Л.Д., 1997; Гаврилин А.С., 2002; Matsunaga Т. et. al., 1990; Fitzgerald J.R. el. al., 2000).
Заболевания людей, вызванные употреблением контаминированных золотистым стафилококком продуктов, обусловлены наличием в данных продуктах энтеротоксинов, которые вырабатываются стафилококками при определенных условиях.
Сырое молоко и молочные продукты всегда содержат то или иное количество стафилококков и поэтому они могут представлять опасность в плане возникновения стафилококковых интоксикаций (Коган Г.Ф. и др., 1990; Логвинов Д.Д., 1992).
Содержание Staphylococcus aureus в термически обработанном молоке и в молочных продуктах является одним из основных показателей безопасности и нормируется у нас в стране согласно требованиям СанПиН 2.3.2. 1078-01. Индикация Staphylococcus aureus определена в программе Государственного мониторинга сырья и продуктов. Большой объем исследований требует разработки быстрых и вместе с тем высокоспецифнчных и чувствительных методов индикации золотистого стафилококка. Поэтому разработка ускоренных методов определения золотистого стафилококка в молоке и
з
весьма актуальной, так как это позволяет своевременно выявлять продукты с высокой контаминацией и определять пути ее устранения.
13 настоящее время существует достаточно много тестов выявления Staphylococcus aureus, основанных на методах бактериологического анализа, серологических методах и методах генной диагностики. Наиболее специфичными и чувствительными тестами зарекомендовали себя методы ДИК-диагностики. Они позволяют проводить анализ без предварительного обогащения материала в присутствии близкородственной микрофлоры (Гинзбург Л.Л., 1999; Hill W. et. al., 1983; Moseley S.L. et. al., 1989; Gannon V.P. et. al., 1992; Hashimoto Y., 1995; Myllys V. et. al., 1997; Khan M.A. et. al., 1998; Raimundo O. et. al., 1999; Lange С et. al., 1999; Capurro Л. et. al., 1999; Edingloh M. et. al., 1999; Giese S.B. et. al., 2000).
Из литературных источников известно о применении методов на основе ДНК - диагностики для индикации Staphylococcus aureus, однако актуальным остается совершенствование методов и тест-систем индикации, разработка оптимальных вариантов, адаптация их к проведению анализа конкретных объектов (Khan M.A. et. al., 1998).
Большое значение, наряду с индикацией золотистого стафилококка в продуктах питания, придается вопросам их выявления в молоке коров на фермах при диагностике мастита, так как они являются наиболее опасными возбудителями. Однако, учитывая тот факт, что кроме золотистого стафилококка возбудителями мастита являются и другие микроорганизмы (стрептококки, . эшерихии, псевдомонады, коринебактерин, микоплазмы и др.) (Карташова В.М., 1973; Карташова В.М. и др., 1988; Демидова Л.Д., 1997; Гаврнлин А.С., 2002; Erskine RJ. et. al., 1987; Fang W. et. al., 1993), при изучении этиологии мастита важным является проведение идентификации всего спектра возбудителей. При этом большое разнообразие видов возбудителей, относящихся к разным
родам и семействам, а также масштабность предполагаемых исследований •...... *
скрининговых методов идентификации
микроорганизмов в молоке от коров, больных маститом. Эту задачу можно также решить с помощью одного из методов ДНК-диагностики, а имении» метода, основанного на изучении гомологии ДНК.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка методов и тест-систем индикации Staphylococcus aureus па основе ДНК-диагностики в молоке и молочных продуктах.
В задачи исследований входило:
1. Разработать методику ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе полимеразной цепной реакции.
2. Разработать методику ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах с использованием генных зондов.
3. Провести идентификацию бактерий на основе гомологии ДНК для ускоренной оценки микробных контаминаций молока от коров, больных маститом.
4. Провести оценку методов ДНК-диагностики для быстрой индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и молочных продуктов.
5. Разработать методические рекомендации по индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ДНК-диагностики.
Научная новизна. Отработаны условия выделения ДНК и параметры проведения полимеразной цепной реакции при индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах.
Разработаны методики индикации Staphylococcus aureus с использованием генных зондов, меченных биотипом, в молоке, сметане, твороге, сыре.
чувствительность и специфичность методов индикации Staphylococcus niirens в молоке и молочных продуктах на основе 11ЦР и
и биотиновой метками.
Проведена оценка методов ДНК-диагностики для быстрой индикации Staphylococcus при мониторинге молока и молочных
продуктов.
методика идентификации бактерии на основе гомологии для ускоренной оценки микробных контаминации
молока от коров, больных маститом.
Практическая ценность. Па основании результатов исследовании разработаны:
- Методические рекомендации по индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ДНК-диагностики (утверждены Отделением ветеринарной медицины РЛСХН, 10.12.2003 г.).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены
на:
- Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов»
(г. Щелково, 2000 г.);
- Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» ПИИТиПП IWCXH (г. Щелково, 2001 г.);
- Международной научной конференции «Биотехнология па рубеже двух тысячелетни» (г. Саранск, 2001 г.);
- 4-и Международной научно-технической конференции «Пиша. Экология. Человек.» (г. Москва, 2001 г.);
- заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2003 г.);
- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2003 г.).
Основные положения выносимые на защиту.
- Условия выделения ДНК и параметры проведения полимеразноп цепной реакции при индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах.
- Методики индикации Staphylococcus aureus в молоке, сметане, твороге, сыре с использованием генных зондов, меченных биотипом и тритием.
Чувствительность и специфичность методов индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ПЦР и ДНК-гибридизации с тритиевой и биотиновой метками.
- Результаты сравнительной оценки методов ДНК-диагностики для быстрой индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и молочных продуктов.
- Методика идентификации бактерий на основе гомологии ДНК для ускоренной оценки микробных контаминации молока от коров, больных маститом.
Публикации. Результаты исследований отражены в 5 научных статьях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений.
Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 9 рисунков. Список литературы включает 210 источников отечественных и зарубежных авторов.
2. СОБСТВЕННЫЕИССЛЕДОВАНИЯ
2.1.Материалы и методы исследований. Работа проводилась в период- с 1999 по 2003 гг. Диссертационная работа выполнена на основании плана научно-исследовательских работ ВНИИВСГЭ и является частью темы 05.02.12.1. Экспериментальная часть выполнена п лаборатории санитарии молока и профилактики мастита, в отделе сертификации и в лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГЭ, а также в Институте микробиологии РАН.
Праймеры получали с помощью Центра пренатологии, акушерства и гинекологии РАМИ.
Материалами для исследовании служили музейные штаммы Staphylococcus aureus 209 Р, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli 0141-K99, Pseudomonas aeruginosa, образцы молока и молочных продуктов.
Для контаминации использовали культуры микроорганизмов различных таксономических групп: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. В качестве эталонных ДНК использовали ДНК этих же микроорганизмов.
Микробиологический анализ молока и молочных продуктов проводили по ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа» и ГОСТ 30347-97 «Молоко. Метод выявления и определения Staphylococcus aureus».
Выделение и очистку ДНК, постановку реакции гибридизации проводили по Маниатису Т. (1984). Суммарные ДНК бактерий метили в реакции ник-трансляции. Получение ДНК-зондов и их мечение биотином или тритием осуществляли в полимеразной цепной реакции, а также в реакции ник-трансляции.
Радиоактивность фильтров с гибридными молекулами определяли в жидкостном сцинтилляционном счетчике «LKB» (Швеция).
Интенсивность окрашивания фильтров с гибридными молекулами определяли визуально или по поглощению при длине волны 500 нм на фотометре.
Экспериментальные данные подвергали статистической обработке по Стыодеиту.
2.2. Результаты исследований.
2.2.1.Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе полимеразной цепной реакции.
При разработке методики ускоренной индикации, Staphylococcus aureus в качестве праймеров были выбраны следующие нуклеотидные последовательности:
Sa442-1 (5'-ЛАТ СТТ TGT CGG ТАС ACG ATA TTC TTC ACG-3'), позиция с 5 по 34; Sa442-2 (5'-CGT GAG ATT TGA GAT АЛТ АСА ЛСА-3'), позиция с 83 по 112.
В результате исследований были отработаны параметры полимеразной цепной реакции с использованием данных праймеров. Оптимальные режимы амплификации для соответствующих этапов были следующими: 1) денатурация - 95°С; 2) отжиг - 55°С; 3) элонгация -72°С.
Использование -указанных праймеров позволило специфично выявлять ДНК S.aureus. Полоса амплификации наблюдалась только в системе, содержащей указанные праймеры и матричную ДНК S.aureus. При использовании матричных ДНК S.epidermalis и E.coli реакции не проходила.
Для постановки ПЦР очень важным является этап выделения матричных ДНК из бактерий, контаминирующих молоко и молочные продукты, так как из литературных данных известно, что недостаточная
очистка проб бактериальных ДНК от белков молока может приводить к ингпбпровашио амплификации.
Памп было проанализировано несколько вариантов выделения и очистки Д1 IK S.aureus из молока и молочных продуктов.
При анализе молока и сметаны бактериальные клетки осаждали дифференциальным центрифугированием. Сметану дополнительно перед центрифугированием разбавляли физраствором. Осадок бактериальных клеток лизировалн в буфере с лизостафином, проводили депротеинизацию хлороформом, ДИК осаждали этанолом и осуществляли амплификацию, как описано в методах.
При исследовании творога и сыров, имеющих твердую консистенцию, бактериальные клетки элюировали физраствором, осаждали центрифугированием, лизировалн лизостафином, проводили депротеинизацню нротеиназой и далее проводили ПЦР.
Различия в пробоподготовке молока и жидких молочных продуктов, а также продуктов твердой консистенции обусловлены тем, что в жидких объектах было трудно отдифференцировать бактериальные клетки от липопротеидной фракции.
Па следующем этапе были проведены исследования по определению чувствительности индикации S.aureus в молоке и молочных продуктах. С этой целью указанные объекты контаминировали S.aureus, выделяли ДНК по приведенной выше схеме и амплифицировали. Параллельно пробы молока и молочных продуктов анализировали микробиологическим методом с использованием жидких и твердых питательных сред.
Порог чувствительности индикации S.aureus составлял 10-100 клеток в пробе (табл. 1).
Таблица I
Чувствительность метода индикации S.aureus в молоке и молочных продуктах на основе ПЦР
( - ) - отсутствие полосы амплификации (+ ) - наличие полосы амплификации
При этом чувствительность определения 8.аигеш в твороге и сыре на порядок выше, чем в молоке и сметане. Это связано, по-видимому, с тем, что при данной методике выделения ДНК происходит частичная потеря бактериальных клеток при дифференциальном центрифугировании в результате их сорбции с липопротеидами сметаны и молока.
2:2.2. Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах с использованием генных зондов.
При разработке методов и тест-систем индикации S.aureus в молоке и молочных продуктах генные зонды получали и метили тритием или биотипом в полпмеразнои цепной реакции с использованием выбранных праймеров и меченых дезоксинуклеотидтрифосфатов.
При этом пробоподготовка для тритиевой и биотиновой меток отличалась тем, что для биотиновой метки очистку ДНК проводили с использованием органических растворителей (хлороформа или фенола).
В случае тритиевой метки из проб выделяли бактериальные клетки, обрабатывали лизостафииом и протеиназой. Проводили термическую денатурацию ДНК и иммобилизовали на мембранные фильтры с диаметром пор О,45мкм. После проведения гибридизации с Н3 ДНК -зондом фильтры отмывали от неспецифической сорбции раствором SSC и радиоактивность фильтров определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике. В качестве отрицательных контролен использовали аналогичные образцы продуктов, контаминированные близкородственными микроорганизмами, а также пустые фильтры.
При индикации S.aureus с ДНК- зондами, меченными биотипом, из проб элюировали бактериальные клетки, концентрировали их с помощью дифференциального центрифугирования и проводили лизис лизостафином. Далее осуществляли депротеиннзацию додецилсульфатом натрия и хлороформом. ДНК осаждали этанолом и денатурировали тепловой обработкой. Затем ДНК иммобилизовали в виде точек на мембранные фильтры, проводили гибридизацию и реакции с конъюгатом, субстратом и красителем. Результаты оценивали по интенсивности окрашивания точек с гибридными молекулами ДНК. Как показали исследования, использование ДНК-зондов обеспечивало выявление S.aureus в исследуемых образцах. При этом специфичность анализа позволяла обнаруживать S.aureus даже в бактериальных смесях, включающих S.epidermidis, E.coli, Ps.aeruginosa.
Чувствительность индикации с применением ДНК-зондов была на два - три порядка ниже, чем при использовании методики ПЦР и составляла Ю3- 104 клеток в пробе (таблицы 2 и 3).
Таблица 2
Результаты определения чувствительности индикации S.aureus в молоке методом гибридизации с ДНК-зондом, меченным тритием*
Разведение проб Объекты исследований
культуры молоко сметана творог сыр
З.аигеиэ в
жидкой среде Радиоактивность фильтров с гибридными молекулами в
имп/мин
Исходное 3238+181 3966+154 7320+190 5421+99
ю-' 2915+179 3748+140 7100+181 5280+97
10-2 2431+160 3300+135 6560+165 4873+86
10-3 360+24 455+24 850+20 692+15
Ю"4 45+2 58+3 106+5 87+3
Ю-5 0 0 0 0
10"* 0 0 0 0
10-7 0 0 0 0
ю" 0 0 0 0
контроль**' 0 0 0 0
*- удельная активность ДНК-зонда составляла 2,5x105 имп/мин/мкг **- контроль - культура E.coli > 108 КОЕ/см3
Таблица 3
Результаты определения чувствительности индикации S.aureus в
молоке методом гибридизации с ДНК-зондом, меченным биотипом
Разведение Результаты гибридизации
проб культуры S.aureus в жидкой среде молоко сметана творог сыр
Интенсивность окрашивания точек с гибридными молекулами
Исходное 10 1 Ю-2 10° I0-4 Ю-5 10 6 Ю-7 10* контроль* ++++ ++++ +++ ++ + ++++ ++++ +++ ++ + ++++ ++++ ++++ +++ ++ + ++++ ++++ ++++ +++ ++ +
* - контроль - культура E.coli 108 КОЕ/ см3
Повышение чувствительности метода до 10-100 клеток в пробе было получено в результате модификаций схем индикации S.aureus путем подращивания бактерий на твердых или жидких питательных средах.
При индикации S.aureus с предварительным подращиванием на твердых питательных средах исследуемые пробы переносили на нитроцеллюлозные фильтры, которые помещали на твердую питательную среду и подращивали до отдельных колоний, как описано в методах бактериологического анализа стафилококков. Далее фильтры помещали на стопку фильтровальной бумаги, смоченной соответствующим раствором для лизиса клеток, депротеинизации, щелочной денатурации ДНК и иммобилизации:
- раствор лизоцима 2 мг/ см3,40 ед. лизостафина (в 50 мМ трис-НС1, содержащий 25% сахарозы, рН-8,0, 10 мин);
- Трис-HCI буферный раствор IМ, рН-7,8 (10 мни);
ДНК на фильтрах фиксировали прогреванием в течение I часа при температуре 80°С и проводили гибридизацию с мечеными тритием ДНК в присутствии декстрансульфата в течение 8-12 часов.
После гибридизации осуществляли отмывку фильтров от неспецифической сорбции. Радиоактивность гибридных молекул ДНК на фильтрах определяли в жидкостном сцинтилляционном счетчике. В качестве контроля использовали чистые нитроцеллюлозные фильтры, обработанные аналогичным путем (контроль сорбции).
В случае использования биотинилированных зондов колонии золотистого стафилококка суспендировали в лизирующем буфере, ДНК очищали с помощью проназы, проводили тепловую денатурацию и иммобилизовали на мембранные нитроцеллюлозные фильтры в виде точек. Гибридизацию с биотинилированным ДНК-зондом и регистрацию конечного результата проводили по интенсивности окрашивания точек с гибридными молекулами.
Разработанные модификации методов с предварительным подращиванием на твердых питательных средах позволяли проводить индикацию S.aureus в молоке и молочных продуктах, как с тритиевой, так и с биотиновой метками.
При использовании методики индикации S.aureus с подращиванием в жидкой среде бактерии предварительно концентрировали из образцов дифференциальным центрифугированием, вносили в жидкую питательную среду и подращивали в течение нескольких часов. Бактериальные клетки осаждали центрифугированием, выделяли ДНК, иммобилизовали на фильтры и проводили гибридизацию с мечеными ДНК-зондами.
Исследования показали высокую специфичность данного метода при индикации S.aureus в искусственно контаминированных образцах молока и молочных продуктов.
На основании проведенных исследовании нами был разработан тест-набор для индикации стафилококков в молоке и молочных продуктах с использованием биотинилированных ДНК- зондов. Он включает реагенты для выделения ДНК и постановки реакции точечной ДНК-гибридизации с биотиновой меткой.
2.2.3. Идентификация бактерий на основе гомологии ДНК для ускоренной оценки микробных контаминаций молока от коров, больных маститом.
Кроме основных возбудителей мастита - стафилококков и стрептококков в этйологии этого заболевания принимают участие и другие микроорганизмы: эшерихии, коринебактерии, псевдомонады, а также микоплазмы. Вследствие этого, очень важным является проведение идентификации всего спектра микроорганизмов при мастите. При широкомасштабных исследованиях актуальной является разработка ускоренных скринпнговых методов идентификации микроорганизмов в молоке от коров, больных маститом.
Метод определения гомологии ДНК на основе ДНК гибридизации нашел широкое применение в систематике бактерий. Он используется, как для уточнения систематики генетического родства между уже описанными группами, так и при установлении таксономического статуса новых форм. Высокая чувствительность и избирательность позволяет использовать его также для идентификации вновь выделяемых штаммов бактерий.
В классическом варианте идентификацию проводят по следующей схеме: из исследуемого микроорганизма выделяют ДНК, в нее вводят соответствующую метку и проводят гибридизацию с ДНК этого же
штамма (гомологичная система), а также с эталонными ДНК других штаммов (гетерологичные системы). Уровень гибридизации в гомологичной системе принимают за 100% гомологии сравниваемых молекул ДНК. При этом учитывают, что степень генетического родства микроорганизмов дискретна, поэтому определенному уровню гомологии соответствует и определенный таксономический ранг. Так, Медниковым Б.Н. и Леваиовой Г.Ф. на основании математической обработки экспериментальных данных было показано, что ~70-100 % гомологии ДНК свидетельствует о принадлежности к одному виду, -40-60% - к одному роду, -25% - к одному семейству, ближе к 0% - к разным семействам (Медников Б.Н., Леванова Г.Ф., 1974; Медников Б.Н., 1978).
Этот подход может быть использован для ускоренной оценки спектра микробных контаминации молока от коров, больных маститом.
Схема анализа заключалась в следующем: исследуемые пробы высевали на твердые питательные среды и подращивали до отдельных колоний; высевали чистую культуру на агар газоном и из полученной биомассы выделяли ДНК; метили тритием в реакции ник-трансляции и гибридизовали с эталонными, предварительно выделенными бактериальными ДНК.
Проведенные исследования показали, что степень гибридизации исследуемых ДНК соответствовала уровню гомологии внутри рода и между представителями разных родов и семейств. Полученные данные свидетельствуют о возможности идентификации бактерий в исследуемых образцах молока и молочных продуктов.
Для ускоренной оценки спектра возбудителей при мастите нами предлагается следующая тест-система на основе гибридизации ДНК. Она включает тест-набор для ускоренного выделения ДНК бактерий, тест-набор для мечения ДНК методом ник-трансляции, фильтры с эталонными иммобилизованными ДНК и тест-набор для проведения гибридизации ДИК с тритиевой меткой.
Предложенная методика. в 3-4 раза сокращает время анализа по сравнению с микробиологической оценкой.
2.2.4. Оценка методов ДНК-диагностики для быстрой индикации S.aureus при мониторинге молока и молочных продуктов.
Для оценки методов ДНК- диагностики при индикации S.aureus использовали образцы молока и молочных продуктов, отобранных для сертификации и мониторинговых исследований. Параллельно проводили испытания бактериологическим методом. Были исследованы образцы йогурта, пудинга, молока, кефира, сметаны, сыра, масла, как импортного, так и отечественного производства.
Результаты испытаний методами ДНК-диагностики в основном коррелировали с данными бактериологического анализа. Однако в единичных случаях положительные результаты были получены только в опытах по ДН^ диагностике. Это могло быть связано с тем, что в этих образцах присутствовали L- формы S.aureus.
Для подтверждения этого предположения, получали L-формы путем воздействия антибиотиков на культуру S.aureus и контаминировали ими, а также вегетативными формами молоко и молочные продукты.
При проведении модельных экспериментов с искусственно контаминированными вегетативными и L- формами S.aureus образцами молока и молочных продуктов методы ДНК-диагностики позволяли проводить индикацию вегетативных и L- форм.
При микробиологических исследованиях были получены отрицательные результаты, однако длительная инкубация посевов позволяла выделять вегетативные формы S.aureus, что объясняется реверсией L-форм.
Наличие L-форм контролировали также с помощью электронной микроскопии. При этом электронномикроскопические тесты показывали присутствие S.aureus в разных стадиях L-трансформации (Рис.1).
Рис.1. Фрагмент колонии Staphylococcus aureus, обработанным антибиотиками. Сканограмма, х 10000.
ВЫВОДЫ
1. разработана методика ускоренной индикации S.auieus в молоке и молочных продуктах на основе ПЦР, включающая этапы дифференциального центрифугирования для выделения бактерии, лизис клеток с использованием лизостафина и депротеинизацию хлороформом и нротеиназой.
2. Специфичность методики индикации S.aureus с использованием праПмеров Sa442-I (5'-АЛТ СТТ TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG-З'), позиция с 5 по 34; и Sa442-2 (5'-CGT GAG ATT TG A GAT ЛАТ АСА АСА-З'), позиция с 83 по 112, позволяет проводить анализ в присутствии близкородственных видов бактерий.
3. Чувствительность метода индикации S.aureus на основе ПЦР составляет в твороге и твердых сырах 10 клеток в 1 г, а в молоке и сметане - 100 клеток в 1 см3.
4. Разработана методика индикации S.aureus в молоке, сметане, TBopoie и твердых сырах с использованием ДНК-зондов, меченных тритием, включающая этапы дифференциального центрифугирования для концентрирования бактерий, лизиса клеток с использованием лизостафина, депротеинизации додецилсульфатом натрия и протеиназой, гибридизации на фильтрах и детектирования гибридных молекул жидкостной сцинтилляцией.
5. Разработана методика индикации S.aureus в молоке, сметане, твороге и твердых сырах с использованием ДНК-зондов, меченных биотипом, включающая этапы дифференциального центрифугирования для концентрирования бактерий, лизиса клеток с использованием лизостафина, депротеинизации додецилсульфатом натрия и хлороформом, осаждения ДНК этанолом, точечной гибридизации на фильтрах и детектирования
гибридных молекул по интенсивности окрашивания визуально или фотометрированием.
6. Чувствительность метода индикации S.aureus с использованием трнтиевых ДНК-зондов составляет 10* клеток в пробе всех исследуемых объектов, порог чувствительности с использованием биотиповых зондов составляет для молока и сметаны 104 клеток в пробе, а для творога и твердых сыров - I О3 клеток в пробе.
7. Разработаны схемы с предварительным обогащением S.aureus в жидких и твердых питательных средах, позволяющие повысить чувствительность индикации ДНК- зондами до 10 - 100 клеток в пробе.
8. Проведенными мониторинговые исследованиями различных образцов молока и молочных продуктов показана возможность индикации вегетативных и L-форм S.aureus в присутствии близкородственной микрофлоры:
9. На основе определения степени гомологии ДНК методом гибридизации молекул показана возможность идентификации бактерий, являющихся возбудителями мастита.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ
Для использования в научных учреждениях и исследовательских лабораториях могут быть рекомендованы разработанные нами «Методические рекомендации по индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ДНК-диагностики» (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 10.12.2003 г.).
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
1. ,Горяинова Г.М. Выявление Staphylococcus aureus методом полимеравной ценной реакции // Груды ВНИИВСГЭ «Проблемы ветеринарной санитарии и экологии», Москва, 2000, том 109, стр. 93-96.
2. Светличкнн В.В., Орлов А.В., Доля Е.А., Горяинова Г.М., Белоусов В.И. Разработка переносной портативной укладки индикации н идентификации микроорганизмом в объектах ветеринарно-санитарного и экологическою контроля с использованием генных зондов // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию института «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВИН и ТИБП РАСХН, Щелково, 2000, стр. 389-390.
3. Горяинова Г.М., Демидова Л.Д., Светличкин В.В. Ускоренное обнаружение и идентификация стафилококков на основе ДНК-диагностики // Сборник докладов Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИ и ТИБП РАСХН, Щелково, 2001, стр. 197-198.
4. Светличкин В.В., Коноиенко А.Б.; Доля Е.А., Мамаев М.А., Денисова Е.А., Горяинова Г.М., Светличкин О.В., Макаров М.М. Тест-системы и технические средства ДНК-диагностики объектов ветеринарно-экологическот контроля // Материалы Международной научной конференции «Биотехнологня на рубеже двух тысячелетий», МГУ им. Н.П. Огарева, Саранск, 2001, стр. 138-140.
5. Горяннова Г.М. Методы контроля стафилококков при сертификации продукции и перспективы их развития // Материалы 4-й Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек.», Москва, 2001, стр.329.
ГНУ ВНШШСГЭ. г. Москва, Звенширодское шоссе, 5 Закм б 4fi ■ Тираж SQ з«.
W. 170 t
РНБ Русский фонд
2004-4 26845
Оглавление диссертации Горяинова, Галина Михайловна :: 2004 :: Москва
ВВЕДЕНИЕ.
1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.
1.1 Характеристика стафилококков.'.
1.2 Staphylococcus aureus и другие возбудители мастита коров
1.3 Санитарное значение золотистого стафилококка в молоке и молочных продуктах.
1.4 Методы индикации Staphylococcus aureus.
1.4.1 Микробиологические методы.
1.4.2 Методы ДНК - диагностики.
2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1 Материалы и методы.
2.1.1 Методы идентификации Staphylococcus aureus.
2.1.2 Методы определения Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах.
2.1.3 Метод дифференциального получения и индикации вегетативных и L - форм Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах.
2.1.4 Методика выделения ДНК из Staphylococcus aureus.
2.1.5 Включение метки в ДНК методом ник-трансляции.
2.1.6 Получение и мечение ДНК-зондов в реакции амплификации
2.1.7 Методика ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с ДНК, меченной тритием.
2.1.8 Методика ДНК-гибридизации на мембранных фильтрах с
ДНК, меченной биотином.
2.1.9 Методика гибридизации колоний.
2.1.10 Методика полимеразной цепной реакции.
2.1.11 Амплификация ДНК методом "рассеянной" затравки.
2.1.12 Статистическая обработка результатов.
2.2 Результаты исследований.
2.2.1 Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе полимеразной цепной реакции.
2.2.2 Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах с использованием генных зондов.
2.2.3 Идентификация бактерий на основе гомологии ДНК для ускоренной оценки микробных контаминаций молока от коров, больных маститом.
2.2.4 Оценка методов ДНК-диагностики для быстрой индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и молочных продуктов.
3 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.
Введение диссертации по теме "Ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза", Горяинова, Галина Михайловна, автореферат
Актуальность темы.
Вопросы повышения качества продуктов, используемых в питании людей, являются актуальными, и требования к производимым продуктам с каждым годом повышаются. В соответствии с этим в России был принят закон «О защите прав потребителя», • который стоит на охране здоровья населения страны от реализации некачественных продуктов питания, способных вызвать пищевые отравления.
Одними из наиболее опасных возбудителей в плане возникновения пищевых токсикозов и токсикоинфекций являются листерии, сальмонеллы и стафилококки. Пищевые отравления людей при данных инфекциях возникают в случае употребления в пищу молока, молочных, мясных, рыбных и других продуктов, причем чаще всего они связаны с молочными продуктами (46, 66, 120, 184).
Золотистый стафилококк является одним из наиболее опасных возбудителей заболеваний человека и животных. Он широко распространен во внешней среде, может жить и размножаться в тканях молочной железы, на коже сосков и вымени и является основным возбудителем мастита у коров (14, 24, 124, 170).
Заболевания людей, вызванные употреблением контаминированных золотистым стафилококком продуктов, обусловлены наличием в данных продуктах энтеротоксинов, которые вырабатываются стафилококками при определенных условиях.
Сырое молоко и молочные продукты всегда содержат то или иное количество стафилококков и поэтому они могут представлять опасность в плане возникновения стафилококковых интоксикаций (41,46). Таким образом, разработка методов определения золотистого стафилококка в молоке и молочных продуктах является весьма актуальной, так как это позволяет своевременно выявлять продукты с высокой контаминацией и определять пути ее устранения. Особая актуальность разработки ускоренных методов индикации золотистого стафилококка в молоке и молочных продуктах в настоящее время связана с возможностью вступления России в ВТО и необходимостью проведения большого объема мониторинговых исследований продуктов питания, с помощью скрининговых методов.
Содержание Staphylococcus aureus в термически обработанном молоке и молочных продуктах является одним из основных показателей безопасности и нормируется у нас в стране согласно требованиям СанПиН 2.3.2. 1078-01 (70). За рубежом Staphylococcus aureus также определяется при мониторинговых исследованиях молока и молочных продуктов.
Большой объем исследований требует разработки быстрых и вместе с тем высокоспецифичных и чувствительных методов индикации золотистого стафилококка. В настоящее время существует достаточно много тестов выявления Staphylococcus aureus, основанных на методах бактериологического анализа, серологических методах и методах генной диагностики. Наиболее специфичными и чувствительными тестами зарекомендовали себя методы ДНК-диагностики. Они позволяют проводить анализ без предварительного обогащения материала, в присутствии близкородственной микрофлоры (16, 103, 117, 129, 131,137,149, 154, 155, 160., 175, 177, 186, 188, 192).
Из литературных источников известно о применении методов на основе ДНК-диагностики для индикации Staphylococcus aureus, однако, актуальным остается совершенствование методов и тест-систем индикации, разработка оптимальных вариантов, адаптация их к проведению анализа конкретных объектов (61, 154, 156, 161).
Большое значение наряду с индикацией золотистого стафилококка в продуктах питания придается вопросам их выявления в молоке коров на фермах при диагностике мастита, так как они являются наиболее опасными возбудителями. Однако, учитывая тот факт, что кроме золотистого стафилококка возбудителями мастита являются и другие микроорганизмы (стрептококки, эшерихии, псевдомонады, коринебактерии, микоплазмы и др.)
14, 23, 36, 37, 119, 123), при изучении этиологии мастита важным является проведение идентификации всего спектра возбудителей. При этом большое разнообразие видов возбудителей относящихся к разным родам и семействам, а также масштабность предполагаемых исследований требуют создания ускоренных скрининговых методов идентификации микроорганизмов в молоке от коров, больных маститом. Эту задачу можно также решить с помощью одного из методов ДНК-диагностики, а именно метода, основанного на изучении гомологии ДНК. Этот метод широко известен и с успехом применяется как для идентификации различных микроорганизмов, так и для уточнения таксономического положения вновь выделенных штаммов (9, 53, 79).
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлась разработка методов и тест-систем индикации Staphylococcus aureus на основе ДНК-диагностики в молоке и молочных продуктах.
В задачи исследований входило:
1. Разработать методику ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе полимеразной цепной реакции.
2. Разработать методику ускоренной индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах с использованием генных зондов.
3. Провести идентификацию бактерий на основе гомологии ДНК для ускоренной оценки микробных контаминаций молока от коров, больных маститом.
4. Провести оценку методов ДНК-диагностики для быстрой индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и молочных продуктов.
5. Разработать методические рекомендации по индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ДНК-диагностики.
Научная новизна. Отработаны условия выделения ДНК и параметры проведения полимеразной цепной реакции при индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах.
Разработаны методики индикации Staphylococcus aureus с использованием генных зондов, меченных биотином, в молоке, сметане, твороге, сыре.
Определены чувствительность и специфичность методов индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ПНР и ДНК-гибридизации с тритиевой и биотиновой метками.
Проведена оценка методов ДНК-диагностики для быстрой индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и молочных продуктов.
Разработана методика идентификации бактерий на основе гомологии ДНК для ускоренной оценки микробных контаминаций молока, от коров больных маститом.
Практическая ценность. На основании результатов исследований разработаны:
- Методические рекомендации по индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ДНК-диагностики (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 10.12.2003 г.).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на:
- Международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» г. Щелково, 2000 г.);
- Международной конференции молодых ученых «Научные основы технологии производства ветеринарных биопрепаратов» ВНИТиБП РАСХН (г. Щелково, 2001 г.);
- Международной научной конференции «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (г. Саранск, 2001 г.);
- 4-й Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек.» (г. Москва^ 2001 г.);
- заседании Ученого совета ВНИИВСГЭ (2003 г.);
- межлабораторном совещании ВНИИВСГЭ (2003 г.).
Основные положения выносимые на защиту.
- Условия выделения ДНК и параметры проведения полимеразной цепной реакции при индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах.
- Методики индикации Staphylococcus aureus в молоке, сметане, твороге, сыре с использованием генных зондов, меченных биотипом и тритием.
- Чувствительность и специфичность методов индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ПЦР и ДНК-гибридизации с тритиевой и биотиновой метками.
- Результаты сравнительной оценки методов ДНК-диагностики для быстрой индикации Staphylococcus aureus при мониторинге молока и молочных продуктов.
- Методика идентификации бактерий на основе гомологии ДНК для ускоренной оценки микробных контаминации молока, от коров больных маститом.
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Заключение диссертационного исследования на тему "Индикация Staphylococcus aureus методами ДНК-диагностики в молоке и молочных продуктах"
выводы
1. Разработана методика ускоренной индикации S.aureus в молоке и молочных продуктах на основе ПЦР, включающая этапы дифференциального центрифугирования для выделения бактерий, лизис клеток с использованием лизостафина и депротеинизацию хлороформом и протеиназой.
2. Специфичность методики индикации S.aureus с использованием праймеров Sa442-1 (5'-ААТ СТТ TGT CGG ТАС ACG ATA ТТС ТТС ACG-3'), позиция с 5 по 34; и Sa442-2 (5;-CGT GAG ATT TGA GAT AAT АСА АСА-З7), позиция с 83 по 112, позволяет проводить анализ в присутствии близкородственных видов бактерий.
3. Чувствительность метода индикации S.aureus на основе ПЦР составляет в твороге и твердых сырах 10 клеток в 1 г, а в молоке и сметане -100 клеток в 1 см3.
4. Разработана методика индикации S.aureus в молоке, сметане, твороге и твердых сырах с использованием ДНК-зондов, меченных тритием, включающая этапы дифференциального центрифугирования для концентрирования бактерий, лизиса клеток с использованием лизостафина, депротеинизации додецилсульфатом натрия и протеиназой, гибридизации на фильтрах и детектирования гибридных молекул жидкостной сцинтилляцией.
5. Разработана методика индикации S.aureus в молоке, сметане, твороге и твердых сырах с использованием ДНК-зондов, меченных биотипом, включающая этапы дифференциального центрифугирования для концентрирования бактерий, лизиса клеток с использованием лизостафина, депротеинизации додецилсульфатом натрия и хлороформом, осаждения ДНК этанолом, точечной гибридизации на фильтрах и детектирования гибридных молекул по интенсивности окрашивания визуально или фотометрированием.
6. Чувствительность метода индикации S.aureus с использованием тритиевых ДНК-зондов составляет 104 клеток в пробе всех исследуемых объектов, порог чувствительности с использованием биотиновых зондов составляет для молока и сметаны 104 клеток в пробе, а для творога и твердых сыров - 103 клеток в пробе.
7. Разработаны схемы с предварительным обогащением S.aureus в жидких и твердых питательных средах, позволяющие повысить чувствительность индикации ДНК- зондами до 10 - 100 клеток в пробе.
8. Проведенными мониторинговыми исследованиями различных образцов молока и молочных продуктов показана возможность индикации вегетативных и L-форм S.aureus в присутствии близкородственной микрофлоры.
9. На основе определения степени гомологии ДНК методом гибридизации молекул показана возможность идентификации бактерий, являющихся возбудителями мастита.
10.Разработаны методические рекомендации по индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ДНК-диагностики (Утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.12.2003 г.)
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ
Для использования в научных учреждениях, исследовательских лабораториях могут быть рекомендованы разработанные нами «Методические рекомендации по индикации Staphylococcus aureus в молоке и молочных продуктах на основе ДНК-диагностики» (Утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 10.12.2003 г.)
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2004 года, Горяинова, Галина Михайловна
1. Акатов А.К., Зуева B.C. Стафилококки // М., изд. «Медицина», 1983, с. 8794.
2. Антонов А.С. Молекулярные основы геносистематики // Изд. МГУ, М., 1980, с. 24-31.
3. Асеев Н.В., Светличкин В.В., Астахова О.И. Тест-система для ускоренной индикации и идентификации сальмонелл и кишечной палочки в продуктах убоя сельскохозяйственных животных на основе генных зондов //Труды ВНИИВСГЭ, 1994, т. 94, с. 95-98.
4. Безбородов A.M. Биохимические основы микробиологического синтеза // М.,' 1984, с. 76-83.
5. Белоусова Р.В., Гончарова Т.М., Асеев Н.В. и др. Разработка способов и технических средств полевой индикации возбудителей инфекционных заболеваний животных на основе генных зондов. В кн.: Вопросы ветеринарной биологии // М., 1994, с. 68-70.
6. Билич Г.Л., Габрилович И.М. Морфология и физиология микроорганизмов//Грозный, 1991, с. 19-49.
7. Биология и биотехнология микроорганизмов. Под ред. Халмурадова В.И. // Ташкент, 1989, с. 12-57.
8. Блинов Н.П. Химическая микробиология // М., Высшая школа, 1989, с. 3168.
9. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф. Геносистематика бактерий // М., 1976.
10. Ю.Бугрова В.И. Стафилококковые энтеротоксины. Обзор. // Вопросы питания,1983, № 4, с. 11-15.11 .Вальехо-Роман К.М. Гибридизация ДНК. В кн.: Молекулярные основы геносистематики//М., изд. МГУ, 1980, с.86-105.
11. Ветеринарная микробиология. Под ред. Козловского Е.В., Емельяненко П.А.//М., изд. «Колос», 1982, с. 138-141.
12. Выгодчиков Г.В. Стафилококковые инфекции // М., Гос.изд.мед.лит., 1963.
13. М.Гаврилин А.С. Уровень заболеваемости коров маститом и его этиология // Сб. тр. "Селекция, кормление, содержание с.-х. жив-х и технология произ-ва продуктов жив-ва", 2002, Вып. 13, с. 104-106.
14. Гейдрих Г., Ренк В. Маститы сельскохозяйственных животных и борьба с ними. // М., «Колос», с. 1968, с. 376.
15. Гинцбург АЛ. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов и решение задач медицинской микробиологии // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 1999, № 5, с. 22-26.
16. Горбовицкая М. Диагностика болезни Марека с использованием ДНК-зондов // Птицеводство, 1996., № 2, с. 27-28.
17. Госионов Р. Некультивируемые формы микроорганизмов // Ветеринарная газета, 2000, № 5.
18. ГОСТ 10444.2-94. Продукты пищевые. Методы выявления и определения Staphylococcus aureus.
19. ГОСТ 30347-97. Молоко и молочные продукты. Методы определения Staphylococcus aureus.
20. Грабов И.И. Естественная индуцированная изменчивость микроорганизмов // Журнал микробиологии, эпизоотологии и иммунологии, 1988, т.ЗЗ, с. 1823.
21. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий // JL, Изд. ЛГУ. 1989.
22. Демидова Л. Д. Этиология мастита у коров // Тез.докл. IX Между нар. симпозиума по маш.доению с.-х. жив-х., Оренбург, 1997, с. 188-189.
23. Демидова Л.Д. Ветеринарно-санитарные аспекты борьбы с маститом коров и повышение санитарного качества молока // Автореферат диссертации на соискания ученой степени доктора вет. наук, М., 1997.
24. Денисова Е.А. Исследования популяции Staphylococcus aureus в объектах ветеринарно-санитарного контроля и разработка ускоренных методов его индикации // Автореферат диссертации на соискания ученой степени кандидата биол. наук, М., 2001.
25. Дерюшева С.Е. Биотинилирование ДНК-зондов с помощьюполимеразной цепной реакции // Труды ВНИИ генетики и разведения с/к животных, Санкт- Петербург, 1993, с.43-45.
26. Доронина Н.В., Говорухина И.И., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. Анализ ДНК-ДНК гомологии у облигатно-метилотрофных бактерий // Микробиология, 1988, т. 57, № 4, с. 629-633.
27. Друца В.Л. Радиоизотопное мечение ДНК. В. кн.: «Молекулярные основы геносистематики» // М., изд. МГУ, 1980, с. 35-50.
28. Дрыгин Ю.Ф., Бузмаков А.В., Тетерина Н.Л., Морозов С.Ю. Нерадиоактивная диагностика вирусных инфекций зондами «ДНК-пероксидаза» // Молекулярная биология, 1992, т. 26, с. 18-22.
29. Золотарев Ф.Н, Голубев Д.Б., Петров Н.А. Метод точечной гибридизации в вирусологии // Успехи современной биологии, 1989, т. 108, с. 375-382.
30. Иванов Л.Г. Систематика, морфологическая характеристика и биологические свойства возбудителей токсикоинфекций // Автореферат на соискание ученой степени доктора биологических наук МГУ им. Ломоносова, 1992.
31. Ивашура А.И. Маститы коров // М., «Колос», 1972, с. 192.
32. Ивашура- А.И. Система мероприятий по борьбе с маститами коров // М., «Росагропромиздат», 1991.
33. Карташова В.М. Индикация патогенных бактерий в молоке и молочных продуктах // М., «Колос», 1973.
34. Карташова В.М., Ивашура А.И. Маститы коров // М., ВО «Агропромиздат», 1988.
35. Касяичук В.В., Марченко Н.И. Пути получения молока высокого санитарного качества // Повышение качества продуктов животноводства, Киев, 1988, с.40-42.
36. Касянчук В.В. Мастит: основы диагностики и лечения // Молоч. и мясн.скотоводство, 1992, Л»4, с. 15-16.
37. Керопиан Е.А., Коротяев А.И. РНК-азная активность как косвенный показатель энтеротоксигенности стафилококков //ЖМЭИ, 1979, № 7, с. 112113.
38. Коган Г.Ф., Горинова Л.П. Маститы и санитарное качество молока // Минск, «Урожай», 1990, с. 134.
39. Красько А.Г., Ркхадзе Г.Г., Сергеев В.А. и др. Диагностика ротавирусной инфекции человека методом точечной гибридизации // Вопросы вирусологии, 1987, т. 32, № 2, с. 208-212.
40. Кривононосов М.В. Организация защиты качества продуктов питания // Международный медицинский журнал, Харьков, 1998, 4, № 4, с. 104-106.
41. Кудрявцев А.Б. Механические свойства микробных оболочек // М., «Наука», 1988, с. 31-54.
42. Логвинов Д. Д. Маститы и качество молока // Молоч. и мясн. скотоводство, 1992, №5-6., с.5-7.
43. Лысенко A.M., Суходолец В.В. Дивергенция Streptococcus thermophilus по уровню гомологии ДНК. «Микробиология», 1999, №4, с.448-451.
44. Маккреди Б. Д., Чимера Д. А. Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами. В кн.:
45. Молекулярная клиническая диагностика», М., «Мир», 1999, с.496-506.
46. Мальков И.Г. Нетрадиционные методы анализа в ускоренной диагностике патогенных бактерий. В кн. «Проблемы ветеринарной санитарии», 1992, с. 3-14.
47. Мамаев М.А. Разработка ускоренных способов ДНК-диагностики для определения бактерий в мясе и мясопродуктах // Автореферат диссертации на соискания ученой степени кандидата вет. наук, М., 2000.
48. Маниатис Т, Фритч Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование//М., «Мир»., 1984, с. 159-172.
49. Медников Б.Н. Дивергенция геномов и некоторые вопросы эволюционной теории // Автореферат на соискании ученой степени доктора биологических наук, М., 1978.
50. Медников Б.Н., Леванова Г.Ф. О возможных принципах построения естественной системы микроорганизмов. Физиология и биохимия микроорганизмов // Межвуз. сб. №2, Горький, 1974, с. 32-38.
51. Методические указания по бактериологическому исследованию секрета вымени у коров // Утв. Главным управлением ветеринарии МСХ СССР,1983.
52. Методы общей бактериологии. Под ред. Герхардта Ф. и др. // М., «Мир»,1984, с. 89-96.
53. Монахова Е.В., Власов В.П., Вуцан В.Н., Седых Е.И., Михась Н.К. Видоспецифический ДНК-зонд для идентификации холерных вибрионов // Молекул, генетика, микроб., вирусол., М., «Медицина», 1993, №4, с.8-11.
54. Павлова И.Б. Закономерности развития популяций бактерий в окружающей среде (электронно-микроскопическое исследование) Диссертация в виде научного доклада // М., 1999.
55. Париков В.А., Слободяник В.И., Кузьмин Г.Н. и др. Дифференциация кокковой микрофлоры молока // Ветеринария, 1981, №11, с. 64-65.
56. Петров Н.Б. Методы изучения реассоциации ДНК. В кн.: «Молекулярные основы геносистематики», М., изд. МГУ, 1980, с. 51-75. Поляков А.А. Ветеринарная санитария // М., «Колос», 1989, с. 14- 24.
57. Печуркин Н.С. Популяционная микробиология // Новосибирск, «Наука», 1978, с. 39-46.
58. Постовит В.А. Пищевые токсикоинфекции // М., «Медицина», 1984, с. 117.
59. Правила ветеринарного осмотра убойных животных и ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов. Утв. Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР, 27 декабря 1983 г. М, ВО «Агропромиздат», 1988.
60. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-форма бактерий // М., «Медицина», 1981, с. 5-112.
61. Романова Л.В., Мишанкин Б.Н., Сучков И.Ю. Полимеразная цепная реакция: генотипический скрининг штаммов Fran, tularensis с использованием неспецифических праймеров // Биотехнология, 1993, № 6, с. 8-9.
62. Санитарные правила и нормы. СанПиН 2.3.2. 1078-01. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья ипищевых продуктов // М., 1997.
63. Светличкин В.В., Лысенко A.M., Петров Н.Б. и др. Сравнение различных способов введения метки в ДНК микроорганизмов // Биологические науки, 1985, JSfi! 6, с. 130-135.
64. Светличкин В.В. Теоретическое обоснование и разработка тест-систем ускоренной оценки безопасности, и качества- объектов ветеринарно-санитарного контроля // автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук, М., 2002.
65. Синагатуллина Э.М. Разработка тест-систем для выявления инфекционных агентов с использованием нерадиоактивных биотиниллированных ДНК-зондов // Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М., 1992.
66. Смирнова A.M., Трояшкин А.А., Падерина Е.М. Микробиология и профилактика стафилококковых инфекций // М., Медицина, 1977.
67. Стафилококки и стафилококковые инфекции // Изд. Сарат. ун-та, 1980, с. 52-93.
68. Стент Г. Молекулярная генетика // М, «Мир», 1974, с. 1-535.
69. Стикланд Ю.Е. Получение зондов и их мечение. В кн.: «Молекулярная клиническая диагностика» // М., «Мир», 1999, с. 329-372.
70. Тимаков В.Д., Каган Г.Я. L-формы бактерий и семейства Mycoplasmataceae в патологии // М., «Медицина», 1973, с. 3-37
71. Турова Т.П. Определение таксономического положения микроорганизмов с помощью метода гибридизации ДНК // Биологические науки, 1989, № 2, с. 26-28.
72. Турова Т.П., Троицкий А.В., Игнашев В.Г., Светличкин В.В. Применение метода ДНК-ДНК гибридизации для идентификации бактерий из смешанных культур // Лабораторное дело, 1981, с. 48-51.
73. Физиология роста микроорганизмов. Под ред. Глухова Н.В. // Саратов, 1987, с. 6-87.
74. Фрумгарц Л.Ф., Киприянов С.М., Калачиков С.М. и др. Получениефлуоресцентной меченой ДНК и использование ее в качестве'зонда при молекулярной гибридизации // Биоорганическая химия, 1986, №11, с. 1508-1513.
75. Херрингтон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика // М., «Мир», 1999, с.558.
76. Чан Т.В.Т. Гибридизация нуклеиновых кислот. В кн.: «Молекулярная клиническая диагност, методы» // М., 1998, «Мир», с. 374-394.
77. Шаштакаускас Ю., Кучюкас В., Норвейша А. Микроскопические грибы как этиологический фактор мастита коров // Тр. Литов. НИИВ, 1984, т. 9, с. 109-114.
78. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биотопов. В кн.: «Молекулярная клиническая диагностика. Методы.» // М., «Мир», 1999, с. 395-425.
79. Экология и генетика микроорганизмов. Под ред. Иванова А.И. // Свердловск, 1991, с. 5-41.
80. Abdella М. Bacterial causes of bovine mastitis in Wondogenet, Ethiopia // I. Vet. Med., 1996, № 43, № 6, p. 379-384.
81. Almeida R.A., Matthews K.R. et. al. Staphylococcus aureus invasion of bovine mammary epithelial cells //1. Dairy Sci, 1996, v.79, №6, p. 1021 -1026.
82. Andrew V., Sayler G. The use of gene probes in the rapid analysis of natural microbial communities // J. Ind. Microbiol., 1988, 3, №5, p. 281-292.
83. Arends M.J. Identification of HPV: in situ hybridization or polymerase chain reaction//J. Pathol., 1991, v. 164, № 3, p. 191-193.
84. Arrand J. Preparation of nucleic acid probes: Nucleic acid hybridization: a practical approach // ED. By BD Hames, IRL Rpess, 1986, p. 40.
85. Ashall F., Miless M. Diagnosis of parasitic diseases using DNA to DNA hybridization//Trans Roy Soc trop. Med. Hyg, 1988, № 2, p. 235-236.
86. Baker R.F. Binding of DNA to cellulose nitrate filters under denaturing conditions // Anal. Biochem, 1977, v.78, p. 569-571.
87. Basant K. et. al. Subclinical mastitis: A real challenge to dairy industry
88. Detection and bacteriological studies) // Techn. Symposium on Dairy «Mastitis and milk quality», 2002, New Delhi, India, p. 30-33.
89. Bennett R. Milk quality. A second look// Dairy Herd. Manag., 1988, v. 25, №1, p. 30-31.
90. Bolstriolge M.C., Roth G. Enterotoxigenicity of strain of S.aurus isolated from milk and milk products // suid Afrikaance Tydoknifvir Sauvelkande, 1995, v. 17, №3, p. 91-95.
91. Boom R, Sol C, Beld M., Weel J., Goudsmit J., Wertheim-van Dillen Improved Silica-Guanidiniumthiocyanate DNA isolation Procedure Based on Selective Binding of Bovin Alpha-Casein to Silica Particles // J. Clin. Microbiol, 1999, v.37, № 3, p.615-619.
92. Brenner D. Gene Probes in Detection and identification of Pathogenic Bacteria // Clinical Microbiol, 1986, № 7, p. 106-109.
93. Britten R.J., Kobe D.E. Repeated sequences in DNA // Science, 1986, v. 161, p. 529-540.
94. Brun Buisson Ch. Staphylococcus aureus stable of resist methociclin. Evolution, epidemic, part in clinic // Pathol. Biol., 1998, v. 46, p. 227-234.
95. Brytting M, Sundgvist V.-A., Stahlhandske P., Linde A., Wahren B. Cytomegalovims DNA detection of an immediate early protein gene with nested primer oligonucleotides // J. Virol. Meth., 1991, v. 32, № 2-3, p. 1127-138.
96. Capurro A., Concha C., Nilsson L., Ostensson K. Identification of coagulase-positive staphylococci isolated from bovine milk // Acta veter.scand., 1999, vol.40, №4, p.315-321.
97. Cassiman I. Diagnosis of genetic diseases by probes // Acta clin. Belg, 1988, p. 181-184.
98. Chu B.C.F., Wahl G.M., Orgel L.E. Derivatization of unprotected polynucleotides//Nucl. Acid Res., 1983, v. 11, p. 6513-6529.
99. Church R.B. Method for study of hybridization and reassociation of nucleic acids axtracted from cells of higher animals // In: Molecular techniques and approach in developmental biology, ed. by M. J. Chrispeels. N. Y., 1973, p. 223
100. Chanishvili N., Merabishvili M., Porchkhidze K., Natroshvili G. The caucasian product Matsoni: its bacterial composition and properties // Bull. Georg. Acad.sci., 2001, 163, Л»2, p.361-363.
101. Coates P.J., Мак W.P., Slavin G., Ardenne A.J. Detection of singl copies of Epstein-Barr virus in paraffin wax sections by nonradioactive in situ hybridization//J. Clin. Pathol., 1991, v.44, № 6, p. 487-491.
102. Costa A.L., Valenti A., Veronese M. Study of the Morphogunetiohal Alterations Produced Fenticonazole on strains of Staphylococcus aureus, Using the Scaning Electron Microscope (S.E.M.)//Microbiology, 1984., v. 27, p. 29-35.
103. De Ley I., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturatiun rates // Europ. J. Biochem., 1970, v. 12, p.133-142.
104. De Medici Dario, Di Pasquale Simona, Delibato Elisabetta Application of quantitative PCR to foodborne pathogenic microogranisms to evaluate preventive measures applied in food safety // Alimentaria, 2002, 39, №336, p. 11-16.
105. Denhardt D.T. A membrane Filter technique for the detection of complementer DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1966, v.23, p. 641646.
106. Dodd F.H. Progress in mastitis control // Kieler Milchvv. Forsch.-Ber., 1985, v. 37, h.3, p. 216-223.
107. Dorin M, Bonecque C. Fast separation of plastid DNA using discontinuons gradients in the preparative ultracentrifuge // Bio techiques, 1995, v. 18, № 1, p. 90-92.
108. Downing К., McAdam., Mizrahi V. Staphylococcus aureus nuclease is a useful secretion reporter for micobacteria // J. Gene, 1999, v. 23, p. 293-299.
109. Edingloh M., Merck C.C., Manz E. Multiplex PCR zum diagnostischen Nachweis von Coxiella burnetii aus Kuhmilch // Berlin. Und Munch Tierarztl. Wochenschr., 1999, 112, №1, p. 5-9.
110. Erlich H.A. PCR technology // Stockton Press, New York, 1989.
111. Erskine R.J., Umflat J.G. et al. Pseudomonas mastitis. Difficulties in detection and elimination from contaminated wash-water systems // J.Am.Vet.Med.Assc., 1987, v. 191, №7, p.811 -815.
112. Eshraghi H. Staphylococcus aureus inflyence on atount from cinaza contained in milk// J. Vet. Parmacol. and Ther., 1997, v. 20, p. 179-180.
113. Falkow S., Moseley S. Application oftechique of DNA-DNA hybridization in diagnostic microbiology // Патент США № 4187351, 03.04.1980,435/5.
114. Falkow S., Moseley S. Specific DNA probes in diagnostic microbiology // Патент США №4358535, 10.11.1982,435/15.
115. Fang W., Shi M., Huang L.,Shao Q., Chen J. Growth of Lactobacilli, Staphylococcus aureus and Escherichia coli in normal and mastitic milk and whey // Veter.Microbiol., 1993, vol.37, p. 115-125.
116. Fitzgerald J.R., Meaney WJ. et. al. Population and virulence factor analisis of Staphylococcus aureus from bovine mastitis // Teagasc HQ , 2000, p. 1-19.
117. Food-borne and water-borne diseases in Canada, 1981.
118. Forster A., Modness J., Skingle D. Non-radioactive hybridization probes prepared by chemical labeling of DNA and RNA with novel reagent, photobiotin // Nuc. Acid Res., 1985, № 3, p.745.
119. Fox L. Staph, aureus: source, impact. // Dairy Herd. Manag., 1990, v. 27, № 6, p. 32.
120. Fox L., Hancock D. Follow the basics to control S. aureus // Hoards' Dairyman, 1990, v. 135, № 16, p. 767.
121. Gannon V. P., King R.K., Kim J.Y., Thomas E.J. Rapid and sensitive metodfor detection of Shiga-like toxin-produsing Escherichia coli in ground beef using the polimerase chain reaction // Appl. Environ Microbiol, 1992, v.58, p.3809-3815.
122. Garger S., Turpen T. Use of RNA probes to detect plant RNA viruses // Eth. Enzymol., vol.18, Orlando, 1986, p. 717-722.
123. Giese S.B.,. Ahrens P. Detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in milk from clinically affected cows by PCR and culture // Veter.Microbiol., 2000, vol.77, № 3 /4, p.291-297.
124. Gillespie D., Spiegelman S. A quantive assay for DNA-RNA hybrids with DNA-RNA immobilized on a membrane // J. Molecul. Biol., 1965, v. 12, p.829-842.
125. Gramley W.A., Asghar A., Frierson H.F., Powell J.M., Powell S.M. Detection of Helicobacter pylori DNA in Fecal Samples from in fected individuals // J. Clin. Microbiol., 1999, v.37, p. 2236-2240.
126. Haase A. Analysis of infections and pothological condition by in situ hybridization // DNA Probes: Appli. Genet and Infic. Disease and Cancer: Conf, Cold Spring Harbor. Apr. 20-23, 1986, Cold Spring. Harbor. N. Y., 1986, p. 113118.
127. Haase A., Brahic M., Blum H. Detection of viral nucleic acids by in situ hybridization//Meth. Virol. Vol., Orlando c. a., 1984, p. 189-226.
128. Hames B.D., Higgins S.J. Nucleic acid hybridization: a practical approach //IRL Press, Oxford, 1985.
129. Harris S., Jonet D. Optimisation of the PCR // Brit. J. Biomid. Sci., 1997, v. 54, №3, p. 166-173.
130. Hashimoto Y., Itho Y., Fujinada Y., Khan A.Q., Sultana F., Miyake M., Hirose K., Yamamoto H., Ezaaki T. // Development of nested PCR based on the ViaB sequence to detect Salmonella thyphimurium // J. Clin. Microbiol., 1995, v.33, p.775-777.
131. Hayashi K. Manipulation of DNA by PCR. In. PCR the Polimerase chain reaction, Eds.: Mullis K.B., Ferre F. & Gibbs R.A., Birkhauser, 1994, p. 3-14.
132. Herrick J., Michalet X., Conti C., Schurra C., Bensimon A. Quantifying single gene copy number by measuring fluorescent probe lengths on combed genomic DNA // Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, v. 97 (1), p 222-227.
133. Hill W., Payne A. Detection and enumeration of virulent Yersinia enterocalitica in food by DNA colony hybridization // Appl. F Environmental Microbiology, 1984, №4, p. 801-807.
134. Hill W., Madden J. Foodbore enterotoxigenis Escherichia coli: detection and enumeration by DNA hybridization // Appl. and Enviro. Microbiol, 1983, №4, p.1324-1330.
135. Huss H.H. Control of indigenous pathogenic bacteria in seafood // Food control, 1997, v.8, № 2, p.91-98.
136. Ikeda S., Yamamoto M., Nagao K., Zhang В., Watanabe S., Oda T. Nonradioactive hybridization probes prepared using M13 phage vector and the universal sequencing primer // Acta Mod. Okajama., 1989, v.43, № 4, p. 11971202.
137. Ingraham J.L., Maalfe O., Neidhardt F.C. Growth of the Bacterial Cell // 1983, p. 26-37.
138. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. Optimization of PCRs. In: PCR protocols, a guide to methods and applications // Academic Press, San Diego, California, 1990, p. 16-21.
139. Ivanova Т., Turova Т., Antonov A. DNA-DNA and rRNA-DNA hybridization studies in the genus Ectothiorhodosrira and other purple sulfurbacreria//Arch. Microbiol, 1985, №2, p. 154-156.
140. Joseph Т., Navo P.E., Caron C.F. Molecula characterization of Chlamidia trachomatis and Chlamidia psitace; Plasmids // Infect. Innvvn., 1986, v.51, p.699-703.
141. Jremstein M. and Hognes D. Colony hybridization: A method for the isolation• of cloned DNAs that contain a specific gene // Proc. Nail. Acad. Sci.USA, 1975, p. 3961-3965.
142. Kalorey D.R. Recent concepts in epidermiology and control of mastitis // Techn. Symposium on Dairy «Mastitis and milk quality», 2002, New Delhi, India, p. 102-107.
143. Katros Т., Robertson J., Waterbory H. A simple method to make betterprobes from stort DNA fragments // Mol. Biotehnol., 1994, v. 2, № 1, p. 95-98.
144. Khan M.A., Kim C-H et. al. Detection of Staphylococcus aureus in milk by use of polymerase chain reaction analysis//AJVR, vol. 59, №7,1998, p.807-813.
145. Kimpton C.P., Morris D.J., Corbit G. Sensitive non-isotopic DNA ^ hybridisation assay or immerdiate-early antigen detection for rapididentification of human cytomegalovirus in urin // J. Virol. Meth., 1991, v.32, №1, p.189-199.
146. Kneifel W., Manafi M., Breit A. Adaption of two commercially available DNA probes for the detecction of E.coli and S.aureus to selected fields of dairyhygiene an exemplary study // Zentralbl.Hyg. und Umweltmed, 1992, v. 192, № 6, p.544-553.
147. Kohne D. Novel approach for rapid and sensitive detection of microorganisms//Clinicae Microbiol, 1987, №6, p. 110-112.
148. Kotowski K. Flora bakteryjna myosobnina z klimicznych przypadkow mastitis u krow oraz jej wrazlivvosc na antybiotyki // Med.Weter., 1987, r. 43, № 5, c. 278-280.
149. Lakshmi D., James D. A solution hybridization assay for the quantitation of prodynorphin mRNA // Mol. Brain Res., 1987, №2, p. 173-176.
150. Lange C., Cardoso M., Senczek D., Schwarz S. Molecular subtyping of
151. Staphylococcus aureus isolates from cases of bovine mastitis in Brazil // Veter.Microbiol., 1999, vol.67, № 2, p. 127-141.
152. Len J.A. Lipman, Arne de Nijs et. al. Genotyping by PCR, of Staphylococcus aureus strains, isolated from mammary glands of cows // Vet. Microbiology, № 48, 1996, p.51 -55.
153. Lim J.K., Gunther N.W., Zhao H., Johnson D.E., Keay S.K., Mobley H.L.T. In Vivo Phase Variation of Escherichia coli Type 1 Fimbrial Genes in Women with Urinary Tract Infection // Infection and immunity, 1998, v. 66, №7, p.3303-3310.
154. Longer P. Enzymatic synthesis of biotin-labelekl polynucleotides novel nucleic acid affinity probes // Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1981, №11, p. 6633.
155. Luk J.M., Kongmuang U., Trans R.S., Lindberg A.A. An enzyme-linked immunosorbent assay to detect PCR products of the rfbS gene from serogroup D salmonellae: a rapid screening prototype // J. Clin. Microbiol., 1997, v.35, p.714-718.
156. Mann W. Two hour DNA hybridizations using a new transfer membrane //Nucl. acids. Res., 1989, №13, p. 5410.
157. Marmur J., Doty P. Thermal renaturation of deoxyribonucleic acid. // J. Molecul. Biol., 1961, v.3, p.585-594.
158. Martm R. H. Non-radioactive techiques for the labelling of nucleic acids //Biotech. Adv., 1991, v.9, p. 185-196.
159. Metcalf T. G., Jiang X., Ester M. K., Melnick J. L. Nucleic acid probes and molecular hybridization for detection of viruses in environmental samples //
160. Progr. Med.ViroL, 1988, v. 35, p. 186-214.
161. More Mardret J., Henricn James B. Quantitative cell lyses of indigenous microorganisms and rapid exstraction of microbial DNA from sediment // Appl. and Environ. Microbiol., 1994, 60, № 5, p. 1574-1580.
162. Moseley S.L., Hyg J. Detection of enterotoxigen Esherichia coli by DNA ^ colong hybridization // J. Infect., 1989, № 6, p. 892-898.
163. Murtanyh M.P., Lin G.F., Haggard D.L., Weber A.F., Meiske J.C. Detection of bovine leukemia virus in cattle by the polymerase chain reaction // J. Virol. Meth., 1991, v. 33, № 11-12, p. 73-85.
164. Myllys V., Ridell J., Bjorkroth J., Biese I., Pyorala S. Persistence in bovine t^ mastitis of Staphylococcus aureus clones as assessed by random amplifiedpolymorphic DNA analysis, ribotyping and biotyping // Veter.Microbiol., 1997, vol.51, p.245-251.
165. Neeelam S. A rabid method for the preparation of plastid DNA // Indian J. Exp. Biol., 1995, 33, №5, p. 387-391.
166. Nour M.A. et.al. Staphylococci in arab cheese. Incidenc and enterotoxigenicity. Egyptian//I. Dairy Sci, 1986, v. 14, №1, p. 11-13.
167. Ozawa M., Mijazawa K., Ohsaki R. Evaluation of cefroxime in the treatment for bovine clinical mastitis // J. Japan Vet. Med., 1989, v. 42, № 12, p. 843-848.
168. Paul P.S. Application of nucleic acid probes in veterinary infectious diseases
169. Voter. Microbiol., 1990, v. 24, № 3/4, p. 409-417.
170. Peirce C. DNA technology provides new tools for identifycirung genetic causes of disease//Res. Resour. Report., 1988, №8, p. 1-4.
171. Persing D.H., Smith T.F., Tenover F.C., White T.J. Target selection and optimization of amplification reaction // In: Diagnostic molecular microbiology, ASM, 1993, p. 88-102.
172. Pfleger R. Zum hygienischen Status von Milch und Milchprodukten aus der Direktvermarktung// Wien.Tierarztl.Monatsschr., 2002, v. 89, №8, p.227-236.
173. Piparinen H., Vaheri A. Genotyping of herpes simplex viruses by polymerase chain reaction //Arch. Virol., 1991, v. 119 № 13-4, p. 275-283.
174. Raimundo O., Deighton M., Capstick J., Gerraty N. Molecular typing of Staphylococcus aureus of bovine origin by polymorphisms of the coagulase gene // Veter.Microbiol., 1999, vol.66, jM« 4, p. 275-284.
175. Rainard P., Poutrel B. Effect of naturally occurring intramammary infections by minor pathogens on new infections by minor pathogens // AmerJ.Veter.Res., 1988, v.49, №3, p. 327-329.
176. Ranki M. Sandwich hybridization as a convinient method for detection of nucleic acids in crude samples // Gene 21, 1983, p. 77.
177. Renz M., Kiirz C. A colorimetric method for DNA hybridization // Nlicleic Acids Res., 1984. v. 12, № 8, p. 13435-13444.
178. Reyes L., Mota L., Costarrice L. Determination of entero toxigenicity of strains of S.aureus isolated from cheese // Revista Latinoamer. Microbiol, 1984, v. 26, №3, p. 277-283.
179. Rifai S., Barbancon V., Prevost G., Piemont Y. Staphylococcus aureus Synthetic exfoliative toxin A and В DNA probes for detecton of toxigenic Staphylococcus aureus strains // J. Clin. Microbiol., 1989, №3, p. 504-506.
180. Meth., 1991, v.32, № 2-3, p. 181-191.
181. Sausem J. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrothoresis //J.Molec.Biolog., 1975, v. 98, p. 503.
182. Saxena R.K., Dutta G.N., Borah P. Incidence and aetiology of bovine subclinical mastitis // Ind. Vet. 1., 1993, v.70, №11, p. 1079-1080.
183. Serpe L., Battisti A., Alfano F., Scaramuzza A., Gallo P. Brucella spp in derevati del latte prodotti e commercializati nella Regione Campania // Ind.alim.(Italia)., 2000, v. 39, № 388, p.5-7.
184. Smith K.L., Todhunter D.A., Schoenberger P.S. Environmental pathogenes and intramammary infection during the dry period // J. Dairy Sci., 1985, v. 68, №2, p. 402-417.
185. Stickney J., Morgan R. Detection of bovine-specific and human-specific fecal bacteria by the polimerase chain reaction // Mich.Acad.,1999, № 2, p. 273
186. Specter M., Bendinelli M., Friedman H. Quick indication of infectional agent//Immunol. Infect., 1999, v. 28, № 2-3, p. 203-204.
187. Tanivar R.K. et. al. Bacterial isolates and their antibiotic sensitivity pattern in clinical mastitis in cattle // Techn. Symposium on Dairy «Mastitis and milk quality», 2002, New Delhi, India, p. 19-24.
188. Trainer G., Hobbs F. New methods for labeling nucleic acids with reporter groups//J. Cell. Biochem., 1989, suppl., №13, p. 289.
189. Trinidad P., Nickerson S.C. Adkinson R.W. Histothology of Staphylococcus mastitis in unbred dairy heifers // I Dairy Sci, 1990, v.73, p. 639-642.
190. Vaitilingom M., Gendre F., Brignon P. // Direct detection of viable bacteria, molds, and yeasts by reverse transcriptase PCR in contaminated milk samples after heat treatment//Appl.and Environ.Microbiol, 1998, 64, №3, p. 1157-1160.
191. Vesa Myllys, Jouko Ridell et. al. Persistence in bovine mastitis of Staphylococcus aureus clones as assessed by random amplified polymorphic DNA analysis, ribotyping and biotyping // Veterinary microbiology, № 51, 1997, p.245-251.
192. Viscidi R.P., Yolken R.G. Molecular diagnosis of infection diseases bynucleic acid hybridization// Mol. and cell, probes., 1987, №1, p. 3-14.
193. Waage S., Aursio I. Microorganisms causing mastitis in cows (Microorganismer some fararsaker mastitt hosk) // Meieriposten, 1992, v. 81, №12, p. 337-339.
194. Weihuan Fang, Minghua Shi et. al. Growth of Lactobacilli, Staphylococcus aureus and Escherichia coli in normal and mastitic milk and whey // Veterinary microbiology, № 37,1993, p. 115-125.
195. Wetmur J. G., Davidson W. Kinetics ofrenaturation of DNA // J. Mol. Biol., 1968, №31, p. 349-370.
196. Who surveillance programme for control of food-borne intections and intoxications in Europe, 1983, p.l 19.
197. Wilde J., Yolken R., Willoughby R., Eiden J. Improved detection of rotavirus shedding by polymerase chain reaction // Lancet., 1991, v. 337, № 8737, p. 323326.
198. Woolaway M.C., Bartlett C.L., Wieneke A.A. International Food Poisoning caused by contaminated lasagne //1. Hyg., 1986, v.96, №1, p.67-75.