Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Индикация и дифференциация микобактерий туберкулеза методом молекулярной гибридизации

Окайми-

СЯЧспОнг-

Мтмтма

КАЗАНСКИЙ ОЩЕНА ЛЕНИНА ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ имени Н.Э.БАУМАНА

»ТД^

На правах рукописи

ШИЛОВА ВАЛЕНТИНА ИВАНОВНА

ИЩИКАЦЙЯ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ МЖОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

16.00.06 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

КАЗАНЬ 1993

Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского ордена Ленина ветеринарного института имени Н.Э.Баумана и в лаборатории биохимии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института

Научные руководители - заслуженный деятель науки Республики

Татарстан, Лауреат Государственной премии СССР, доктор ветеринарных наук, профессор ХАЗШОВ Н.З., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук АЛИМОВ A.M.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

ЮСУПОВ Р.Х.,

кандидат ветеринарных наук, доцент СИБГАТУЛЛИН P.C.

Ведущая организация - Московская'ветеринарная академия

Зашита диссертации состоится "/<£-" ОС/И,/1£ь(^ 1993 г. в часов на заседании специализированного Совета Д-120.22.01 по присуждению ученой степени кандидата ветеринарных наук в Казанском ордена Ленина ветеринарном институте имени Н.Э.Бау-маиа по адресу» 420074, г. Казань, Сибирский тракт, ветеринарный институт

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского ордена Ленина ветеринарного института имени Н.З.Баумана

Автореферат разослан " 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, доцент-

В.Е.Чеботарев

ОБЩ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Обеспечение населения страны качественными продуктами животноводства является ванной народнохозяйственной задачей. Определенные трудности для ее решения создает заболевание крупного рогатого скота туберкулезом.

Современный уровень изученности туберкулеза животных, передовой опыт борьбы с гош, а также материальная оснащенность колхозов и совхозов позволяют обеспечить защиту стад от заноса возбудителя в благополучные хозяйства и ликвидацию заболевания на неблагополучных фермах. Однако недостатки в реализации планов организационно-хозяйственных и специальных мероприятий по профилактике и ликвидации этого заболевания нередк« служат причиной осложнения эпизоотической ситуации по туберкулезу животных.

Проводимые в настоящее время меры борьбы с этим заболеванием в некоторых случаях не всегда приводят к желаемым результатам.

Одним из препятствий на пути к искоренению туберкулеза является недостаточная чувствительность используемых ыег дов лабораторной диагностики или их непригодность для широкомасштабных оздоровительных мероприятий.

Разнообразие видов, большой диапазон фенотипической изменчивости микобахтерий создают значительно-.а затруднения в их дифференциации и идентификации. В связи с этим в последние годы разрабатыр"-ются новые, более совершенные метода идентификации микроорганизмов на основе современных достижений биотехнологии. Они отличаются высокой специфичностью, чувствительностью, разрешающей способностью, благодаря чему позволяют идь.ггифициро-вать микроорганизмы с измененной -нтигенной структурой и обладающих с антигенной общностью с другими видами. К таким методам относятся молекулярная гибрид зация нуклеиновых кислот, геношая "дактилоскопия", иммуноблотинг.

Имеющиеся сведения по идентификации отдельных бактерий

Airite G.Ii, , Affront! L.F. . 1368; Ulnden P. «t al < 1984; Jeffreys A.J, et al » 1985; йгсков А.П. и др., 1988/, по сте-

пеки сходства ДНК, рестрикционного анализа да, электрофорети-ческих характеристик белков свидетельствуют о перспективности к болылоП информативности этих методов. Однако исследования в этом аспекте еще только развертываются и представляют большой научный и практический интерес, ибо они открывают новые воз- . мощности в идентификации и дифференциации возбудителей инфекционных болезней.

Цель к задачи исследований. Целью нашей работы была индикация и дифференциация мккобактерий туберкулеза методом молекулярной гибридизации. Для разрешения.ее были намечены следующие задачи :

- получись очищенные препараты хромосомальной ДНК разных видов микобактерий ;

- провести сравнительную характеристику гиперхромного эффекта ДцК бактериальных клеток;

- получить ДНК-зонд из м. Ъо-via и определить пригодность его для дифференциации микобактерий;

- изучить ДШ£ генома разных ыикобактерий методом геномной "дактилоскопии".

Научная новизна. Разработан способ дифференциации различных видов бактерий, основанный на расщеплении ДНК рестриктаза-ми, разгонке гель-электрофорезом в горизонтальном блоке с последующи переносом фрагментов ДНК на нитроцеллюлозные мембраны и определении гипервариабельных: участков ДНК при помощи зонда из ДНК ¿[ига 1113, отличающейся тем, что применение рестрикта-зы Eco SI I дает возможность получить генетический паспорт, специфичный для каждого вида микобактерий, что позволяет дифференцировать патогенные иикобактерии от атипичных.

Усовершенствована методика выделения ДНК, которая позволяет получить препараты ДК из кислото- щелочеустоЯчивых ыикобактерий с наименьшими затратами времени, реактивов' и бактериальных культур. Разработан метод выделения ДНК из M. avium , используя для разрушения клеточной стенки ультразвуковой дезинтегратор при частоте 22 кГц в течение 30-60 секунд.

Создан тотальный ДКК-зонд из Ы. Ъопв , с помощью которого удается дифференцировать-патогенные микобаитерии в патологическом материале.

ч

«

Практическое значение. Усовершенствованы методы выделения ДНИ! из микобактерий.

Метод ДНК-ДНК гибридизации позволяет провести индикацию патогенных форм и дифференциацию атипичных и патогенные микобактерий.

Метод геномной "дактилоскопии" позволяет идентифицировать все виды микобактерий туберкулез).

Апробация работа. Основные положения работы доло:?.еиы и обсуждены на республмсанской научно-производственной конференции Казанского ветеринарного института /1931-1992 гг./, межвузовской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 60-летию Ставропольского сельс ^хозяйственного института /1991/, Всероссийской научной ко :ференции в городе Троицк /1992/ и научной конференции ВНИИВН;ь'л в городе Покров /1992/.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б научных работ.

Внедрение. Результаты работы используются в практике лабораторных исследований Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института и Казанского ветеринарного ик.гитута.

Получено положительное решение по заявке на изобретение К- 4942381/13 047174 "Способ дифференциации различных видов микобактерий туберкулеза". Казанским ветеринарии:.! институтом к Всероссийским научно-исследовательским ветеринарным институтом оформлены рационализаторские предложения под 318-91 от 3 апреля 1991 г. и 13 17 от 19 июня 1991 г. соответствен ).

На защиту выносятся. Способ дифферещиедин микобакгер;й туберкулеза, основанный на выявлении гипервариабельных последовательностей геномов, методом молекулярной гибридизации; индикация к идентификация ДНК мк обактерий методом дот-блот гибридизации.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 152 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, иллюстрирована 2 таблицами к 50 рисункам::. Список использованной литературы включает 26а иг ^очнлкоз, в том числе 127 иностранных работ.

МАТЕШЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в 1989-1992 годах на кафедре органической и биологической химии Казанского ветеринарного института имени Н. Э.Баумана и в лаборатории биохимии Всероссийского научг но- .сследовательского ветеринарного.института /г. Казань/.

В экспериментальной работе использовали культуры микобак-рийц. bovis > Ii. bovis штамм БЦЖ, М. avium , М. tuberculo -sie а lt. phlei • M, intracellular • M. fortuitum » M. acrofu-laceum » M. kanoasii « полученные из ВГНКИ и выращенные в лаборатории эпизоотологии ВНИВИ на питательной среде Левенштейна-йенсена в термостате при температуре 38 °С.

Из микобактериальных культур после соответствующей обработки и очистки полезны чистые препараты дезоксирибонуклеиновой кислоты.

Для лизирования клеточной стенки минобактерий били использованы ферменты лизоцим, проназа. Обработка микобактерий 12 %-ной трихлоруксусной кислотой дала возможность получить препараты ДНК в течение одного часа. Депротеишзацию проводили хлороформ :изоаииловым спиртом. Полученные препараты ДНК очищали РНК-зой в концентрации 50 мкг/мл. По этой методике.выделяли ДНК из следующих микобактерий М. bovis штаммы 8, 14, ЕЦК, м. tuberculosis , М. phlei , Ы. intracellulars., 11. fortuitum, И. eorofulaeeum , U. kaasasü . Апробированная методика хотя и оказалась быстрой и эффективной для ввделения ДНК вышеуказанных минобактерий, но все попытки получить ДК из u. avium оказались безуспешными. В связи с этим использование ультразвука для разрушения клеточной стенки И. avium после соответствующей экстракции позволило осадить ДНК этой культуры.

Для определения размера генома требуются высокоочищенные препараты ДНК. Чистоту и концентрацию препаратов ДНК контролировали визуально, используя электрофорез ДНК, окрашенных бромистым гидием, в агарозном геле и по спектрам поглощения в области 190-300 нм, которые регистрировали на спектрофотометре "Ferkin-Eimer " /Швеция/. Оптическая плотность препаратов

ДНК на спектрограмма при длине волны 260 ни позволила рассчитать концентрацию ДНК в растворе для количественного внесения ДНК в лунки при электрофорезе.

Определение состава ДНК проводили по методике Марлура и Доти /1962/. Содержание гуанина и цитозина устанавливали по температуре плавления ДНК. Для этого, поднимая температуру от 60 до 100 °С, провели запись оптического-поглощения раствора ДНК на спектрограмме при длине волны 260 нм и определили температуру плавления ДНК. Используя температуру плавления ДНК, рассчитали процентное содержание суммы гуанина /Г/ и цитозина /Ц/ по форлуле:

Г + ц - Тпл. " 69,3 » где 0,41

Г + Ц - процентное содержание суммы гуанина и цитозина,

Тпл - температура плавления.

Для дот-блот гибридизации исследуемые чистые, нативные препараты ДНК в количестве 3 мил в виде точек были нанесены в квадраты /1,5x1,5 см/, начерченные ка капроновых мембргшгых фильтрах /размер пор 0,2 ши'/, выпускаемые эксперимен- альной лабораторией "Хийу Калур" /Эстония/.

Денатурацию двухцепочечной ДНК проводили с использованием щелочного раствора. "Отниг" одноцепочечной ДНК, адсорбированной на мембране, осуществляли при тешературе 80 °С з течение 2-х часов.

Для приготовления ДНК-зонда обработанную ультра- -уном /при 22 кГц/ в течение 8 минут ДНК н. bovio депротеинизировали равным объемом хлороформшзоавдловым спиртом /24:1/. Экстрагированную 'ДКК растворяли в кипяченной бадистиллироБаьюй воде.

Мечение ДНК-зовда II. bovin -роводили дезоксиаденозик о -/ об- - трифосфатом методом кик-трансляции. Дня получения меченого ДНК-зонда ы. bovis к вкушенной метке /АТФ и ТШ/ добавили дезоксинуклеотвдтри$осфаты /ГШ и ЦЗФ/ и осуществили реакцию полимеризации с использованием ДНК-полимеразы I. Сггесь инкубировали при температуре 37 °С в течение часа. Обычно за это время ДНК метится до требуемой удельной активности. Ник-транслированнуга ДНК отделяли от невключившкхся dinp на .солон-

ке с сефздэксом с - 50. Концентрация метки составляла 345-378«Ю3 имп./минЛясг ДК.

Предгибридкзацгёо проводили при температуре 42 °С в течение 3 часов, используя 50 si-нкй форкш.тид и ДИК носитель из сперши лосося, которую предварительно денатурировали кипячением в течение 5 икнут. Предгкбридизационную смесь вносили из расчета 0,5 ыл смеси на I см^ мембраны.

Гибридизацию проводили при температуре 42 °С в течение 1618 часов. ГибрвдизгциЪннуа смесь, состоящую из меченого ДНК-зовда м. bovis и предгкбридизационной смеси, вносили из расчета 50 ккл смеси на I см мембраны.

Отмнвку фильтра делали в буфере, содержащем 20XSSO и 10 îS-ньй SDS . Высушенную мембрану помещали в кассету с рентгеновской пленкой к ставили в холодильник при температуре -20 °С на 16-20 часов.

Была определена чувствительность метода дот-гибридизации ДЩ-зонда ы. bovis. Дня этого в пробирках по стандарту мутности делали разведение микробных клеток М. bovis. На квадраты /1,5x1,5 см/, начерченные на капроновых фильтрах, наносили различное количество микробных клеток. После высушивания на воздссе фильтр смачивали 10 Si-нык SDS , лизоциыом в концентрации 26 мг/ыл к проназой в концентрации 500 ыкг/мл и инкубировали в термостате в течение 30 минут. Денатурацию проводили 0,5.1 щелочным раствором. Нейтрализовали 0,Si. трис-Ш1, pH -6,0 при комнатной температуре. "Отжиг" адсорбированных одно-цепочечных ДК проводили в вакууме.

Для выполнения геномной "дактилоскопии" требуется расщепление Д1К генома специфическими ферментами - рестриктазами. Путец сравнительного изучения рестрикции ДНК ыикобактериГ: разными ферментами установлено, что рестриктазы Eco 91 I, Eco 64 I, Eco 47 I дают фрагменты, годные для идентификации мико-бактерий.

Гидролиз ДНК ферментами проводили в ультратермостате при температуре 37 °С в течение 3 часов. Результаты рестрикции проверяли ча электрофорезе.

Злектрофоретическое фракционирование ДК осуществляли в горизонтальном блоке I 5^-ного агарозного геля при напряжении

поля 0,8 В/си в течение 16-20 часов. Для визуализации .фрагментов ДК их окрашивали этидиум бромидом. В качестве маркера брали фрагменты ДНК фага Л>.

Фрагменты ДМ, разделенные с помощью гель-электрофореза в агароэном геле, сначала денатурировали в растворе, содержащем 1,51! иась и 0,3.1 гГаШ в течение часа, а затем нейтрализовали, поместив гель в буфер, содержащий 0,5.1 трис-НС1, рН - 8,0 и 1,Ш КаСЬ в течение часа.

Блотгинг проводили при комнатной температуре в буфере, содержащем ЮХ ббс , по Саузерну. Перенос фрагментов ДгК из геля на фильтры происходил в течение 18-20 часов. Спорость переноса ДЩ зависит от размера фраплентов ДК1С и пористости геля. Перенос мелких фрагментов ДКК /I кВ/ из 0,8-1,0 '/-ной г гарозц заканчивается через 1-2 часа, а перенос фрагментов, превышающих 15 кВ, продолжается 15 часов и больше.

Фильтр, пропитанный 6Х ббс в течение 5 миЯут, высушивали при комнатной температуре, а затем под вакуумом при тешерату-ре 80 °С в течение 2 часов.

Предгибридизациы проводили при температуре 65 °С в течение 3-4 часов. Предгибридизацноняая смесь состояла из 20Х .-.БС , 10 ?*-ной Б г® , 5 ОХ Денхардта. Гибридизацию делали с высокоме-ченным /удельная активность Ю7 ими./мин на I мкг ДЕ/ од-ноцепочечныы зондом на основе ДНК фага М'З юр II при темяера-туре 65 °С в течение 16-18 часов /Тазза!^ й. ег аХ , 193?/. "Отетг" .ДНК фага М13 с праймером проводили при температуре 65 °С в тс гение 10-15 минут.

Для введения метки в ДНК фага Ы13 использовали фрагаект Кленова /2 ед. акт./, смесь немеченых трифосфатов, ЮХ буфер ник-трансляции. Па сцинциляционном счетчике измеряв процент включения метки. Чистоту отмывки фильтров проверял;? на счетчике. Затем мембрану высушивали и помещали в кассету с рентгек-пленкой. Ее ставили в холодильник лри ?е:«1пературз -70 °С на 12-16 часов, затем пленку проявляли и делал:! снимки.

Данные, подученные в опытах, подвергали статистической обработке на программируемых микрокалькуляторах "Электро'шка МК-56" /1укшаитов Р.Х., Нигматуллин Н.Х., 1984/.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛВДСВАШЙ

Биохимическая характеристика препаратов ДНК микобактерий. Исследованше нами спектральные характеристики чистоты и количественного содержания препаратов ДНК микобактерий в области 190-300 мл, а тагсге отношение Дзбс/%30 и ^260^280' Указыва" юще„ на коэффициент чистоты от полисахаридов и белков соответственно, указаны в таблице I.

I. Спектральная характеристика препаратов ",ЩК микобактерий

¡Концентрация в! Коэффициент чистоты от; Микобак^ерии .'растворе ДНК, ¡полисахаридов! белков

___! миг/мкд ! ДябО^ЗЗО ! Д260/Д280

11. bovis 2,80 1,83 1,80

М. bovis штамм БЦЙ 2,80 1,92 1,86

М. avium • 3,00 1,81 1,80

Ы. phlei 3,20 1,81 1,87

11. intracellulare 2,65 1,82 1,89

Ii. fortuitum 2,77 1,81 1,31

11. о его fulaceum 3,20 1,81 1,92

ДЖ фага Я 2,80 2,00 1,83

Как видно из таблицы I, отношение величины оптической плотности при длине волны 260 им к величине оптической плотности при длине волны 230 нм, а также отношение величины оптической плотности, измеренной при длине волны 260 нм, к величине оптической плотности, полученной при длине волны 280 im, колебались в пределах 1,8-2,0, что указывает на чистоту препаратов ДНК микобактерий от полисахаридов и белков.

Результаты исследований температуры плавления ДНК микобактерий представлены в таблице 2.

Согласно полученным данным /табл. 2/ препараты ДНК мико-бактери: мокно разделить на три группы.

В первую группу входят препараты ДНК и. bovis , м. bovis штамм БЦД. Средняя температура плавления ДНК этих микобактерий

- II -

2. Сравнительная характеристика ДНК микобактерий

Температура °С .'Средняя тем- .'Мол.

Микобактерии .'начала пла-!конца пла-!пература пла-!гуаншм-_!влегом ДНК !вления .ДНК.' вления ДМ !цитозин

II. bovis 83,5+0,65 99,5+0,29 91,5+0,41 54,1

М.Ъоvis штамм ЕВД 84,8+0,85 99,¿0,48 92,(¿0,35 55,3

М. avium 72,¿0,85 97,6+0,47 85,(¿0,20 38,3

И. phlei 76,3+0,48 94,¿0,48 85,5+0,41 39,5

Н. intraoellulare 77,3+0,43 95,^0,75 86,5+0,20 41,9

II. fortuitum 80,5+0,65 98,5+0,96 89,5+0,35 49,1 ■

II. scrofulaceum 79,8+1,11 99,5+0,29 89,6*0,43 49,3

ДНК фага Л 75,8+1,11 99,2^0,48 87,5+0,54 44,4

была в пределах 91,5-92 °С, а процентное содержание гуанша и цитозина равно 54,1-55,3 мол.

Во вторую группу входят препараты ДНК ц. avium, и. phlei, 11. intraoellulare • Средняя тешература плавления соответственно составила 85,0, 85,5, 86,5 °С, а содержание гуан|ша и цитозина соответственно равно 38,3, 39,5 и 41,9 мол. 'Л.

Оказались близки ме:кду собой показатели ДНК Li. fortuitum. и и. scrofulaceum, которые вошли в третью группу. Средняя температура плавления составила 89,5, 83,6 °С, а сумма гуанина и цитозина равна 49,1, 49,3 мол. Я соответственно.

.ДНК-ДНК гибридизация. Для туцшации и идентификации мико-бактерий туберкулеза нами был создан ДНК-зонд из патогенного шташа и. bovis , который метили дезоксиаденозин 5 - /сб -^Р/ трифосфатон методом ннк-трансляции.

На рисунках I, 2 видны радиоавтографические пятна гибридизации ДНК-зонда Н. bovis С ДЖ II. bovis , Н. tuberculoais, н. bovis штамм БЦЖ.

Гибридизация не произошла с ДНК ц. intraoellulare, ц. phlei, И. scrofulaceum, и, fortuitum и гетерологическнми бактериями Brucella штамм 544, листерии, Brucella canin , культуры клеток, т.е. в этом случае результат был отрицательный.

А В

• • •

0 9

Рис. I. Дифференциация патогенных от атипичных и сапрофитных форм микобактерий А: 1-м. bovie > 2 -Ы. bovis штамм 14, 3-й. intracellulare , 4 -II. scroíulaceuia ; В: I - м. bovis штамы БЦЖ, 2 - И. tuberculosis ,3-11. phlei , 4 -

I!. fortuitujn.

12 3

£

Рис. 2. Результаты точечной гибридизации ДНК ы. bovis,

меченой /АТ<ё, ТШ/, с атипичными формами ми-, кобантерий и другими гетерологическиыи бактериями А: I -ы. bovis , 2 - Brucella штамм 544, 3 - листерия; В: I - ti. bovis штамм БЦ1, 2 -Brucella cania , 3 - культура клеток.

Был испытан зонд из другого вида микобактерий /рис. 3/, в частности из и. phlei , меченый ^Р. При этом были испытаны препараты ДНК Ы. bovis , Ы. katisasii , II. intracellulare » Ii. phlei , u. fortuitum, M. bovis штамм БЦЩ, бруцеллеза, лист ерий, культуры клеток.

- 13 -12 3

А В С

©

Рис. 3. Результаты ник-трансляции ДОС if. phlei , меченой ^Р /АТЗ и 1®/, с атипичными формами микобакте-рий и другими видами микробных клеток /кг I -Н. hovia ,2-11. kansaail , 3 - II. intracellulars В: I - м. phlei , 2 - ы. fortui-tum , 3 - ы. fco-via штамм ЩЕ, Ct Г - Brucella , 2 - Listeria, 3 - культура клеток/..

В результате опытов установлено, что гибридизация меченой молекулы ДНК м. phlei происходит комплементарно только с ДНК И. phlei » а с остальными препаратами ДНК гибридизация отсутствует. _ on

о о

о о о

о О о

Рис. 4. ДНК-ДНК гибридизация ДНК-зоцца II. bovis на патологическом материале /А: I - контроль, 2 -II. bovis , 3 - ДНК из патматериала, В: I, 2, 3 -ДНК из патматериала, С: I, 2-й. bovis штамм БЦН, 3 - ДНК из патматериала/.

Было проведено ДНК зондирование материала, полученного из органов от убитых на мясокомбинате животных больных туберкулезом. В качестве зонда при этом использовалась ДНК ы. bovis, меченая /об - SZ?/ - АТФ.

Из рисунка 4 видно, что испытуемые препараты ДНК дают положительный результат дот-шбридизации с ДНКм. bovis , с ДНК, выделенными из патматериала, и с ДНК Ы. bovis штамм БЩ.

Из проведенных опытов следует отметить, что ДНК-зовд из Ы. bovis не отличает препараты ДНК ы. bovis штаммов 8, 14, БЦЖ, и. tuberculosis н не позволяет дифференцировать эти формы возбудителя туберкулеза.

Чувствительность ДНК-зонда составила 50-100 микробных клеток на точку.

Геномная "дактилоскопия". В научной литературе мы не нашли описания изучения структуры генома микобактерий туберкулеза методом геномной "дактилоскопии". Наш впервые показана возможность паспортизации видов возбудителей туберкулеза и атипичных микобактерий при помощи ДНК зонда MI3, который выявляет специфические гилервариабельше последовательности генома возбудителей туберкулеза.

Качественной характеристикой гипервариабельных полос являются мажорные и минорные фрагменты, которые на рисунке указаны черными полосами. Маркером явилась во всех опытах ДНК фага Я. .

Рестритщионный анализ препаратов ДНК м. bovis , м. bovis штамм БЦЕ, И. avium , M. phlei, M. intracellular , M. fortuitous, M. acrofulaeeum рестриктазой Eco 47 I схематически показан на рисунке 5.

Как видно из рисунка 5, 11. avium отличается от других микобактерий наличием мажорного фрагмента в области 2,951 тпн и минорного фрагмента в области 10 тпн.

В ДНК м. bovis , в отличие от других видов микобактерий, обнаруживаются минорные фрагменты в области 5,7 тпн и 177 пн.

M« bovis штамм БЦН содержит в составе ДНК дополнительно мажорный фрагмент в области 6,7 тпн и минорные фрагменты в области 562 и 141 пн.

ДНК U. phlei по сравнению с другими микобактериями дополнительно имеет мажорные фрашенты в областях 16, 13 тпн.

12345678

• 23130: -18000

- 9400

- 6600

- 4360'

- 3300

- 2320.

- 2000 " 1600

- 320

- 125

Рис. 5. Схематическое изображение радиоаатографического снимка гипервариабедышх участков ДНК микобакте-рий, рестриктированной ферментом Есо 47 I /I -М. avium, 2-М. bovia , 3 - Ы. bovis штамм БЦМ, 4 - И. phlei, 5 — Ы. intracellulars , 6 -М. fortuitum • 7 — Ц. scrofulaceum • 8 - ДНК гаЛ /. Молекулярная масса указана в тпн.

Для н. intracellularв характерно наличие минорного фрагмента в области 2,2Э тпн.

Сравнивая ДНК ц. fortuitum с другими ДНК, можно сказать, что она имеет мажорные фрагменты в областях 4,2, 2,4 тпн и минорный фрагмент в области 1,096 тпн.

ДНК м. sorofulaceua отличалась от других микобактерий наличием мажорных фрагментов в области 12, 10,6 тпн и шторных фрагментов в области 3,6 и 1,8 тпн.

Расщепление препаратов ДНК u. bovia и п. bovia штамм БЦЖ ферментом Есо 47 I дает возможность идентифицировать их методом ген чной "дактилоскопии". В честности, у М. bavin

штамм БЦЖ имеется 15 фрагментов, у м. bovis - 13 Фрагментов. У М. bovis штамм БЦК в области 12, 6 тпн, 562 пн обнаруживаются минорные фрагменты, а у ДНК ы. bovis выявляется дополнительный мажорный фрагмент в области 6,76 тпн.

У всех исследованных видов и штаммов микобактерий в ДНК имеются гипервариабельные последовательности в области 9,12 тпн.

Таким образом, препараты ДНК микобактерий, расщепленные ферментом Eco 47 I, на радиоавтограмме дают характерные гипервариабельные для каждого вида полосы. Это значит, что все штаммы микобактерий имеют определенную для каждого вида структуру ДНК, и они отличаются друг от друга по величине и числу гипервариабельных фрагментов ДНК.

ВЫВОДЫ

1. Модифицированный нами метод выделения ДНК из микобактерий дает возможность с наименьшими затратами труда и времени получать полноценную, нативную хромосомальную ДНК. Полученная ДНК является пригодной для проведения рестрикционного анализа, реакции ДНК-ДНК гибридизации и геномной "дактилоскопии".

2. Метод геномной "дактилоскопии", основанный на выявлении гипервариабельнюс, минисателлитных участков ДНК бактерий при помощи зонда ДНК бактериофага MI3 позволяет дифференцировать патогенные, атипичные и сапрофитные формы микобактерий, а также отличает геном вакцинного штамма БЦЖ от ДНК патогенного штамма H. bovis .

3. Создан тотальный ДНК-зовд из II. bovis, меченый 3%>, который обеспечивает индикацию микобактерий ы. tuberculosis, M. bovis штаммы 8, 14 и Б1Щ, а также дифференцирует патогенные микобактерии от условно-патогенных. Чувствительность ДНК-зовда .в реакции ДНК-ДНК гибридизации составляет 50-100 микробных клеток на точку.

4. Согласно нуклеотидноыу составу ДНК микобактерий туберкулеза можно разделить на три группы. Процентное содержание гуанина и цитозика в ДНК К. bovis и H. bovis штамм БЦЯ составило 54,1-55,3 МОЛ. M. aviua , 11, phlei , Ii. iivtracellulare 38,3-41,9 мол. M. fortuitum, M. scrofulaeeum - 49,1-49,3

мол. %.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРВДЛСШШ

1. Выявле!ше гипервариабельных участков ДАС микобактерий туберкулеза при помопдо зонда ДНК бактериофага !ЯЗ_позволяет дифференцировать патогенше, атипичнне и сапрофитные формы ми-кобактернй. Геномная "дактилоскопия" рекомендуется для идентификации бактериальных штаммов, систематики микроорганизмов и для решения ряда .других теоретических и практических задач микробиологии и эпидемиологии.

2. Методы вццеления ДИ^ из микобактерий туберкулеза, усовершенствованные нами /рацпредложение У 318-91 от 3 апреля 1991 г. и II? 17 от 19 июня 1991 г./, позволяют с меньшими затратами выделять хромосомальную ДНК и рекомендуется к использованию в научных исследованиях и в учебном процессе.

СПИСОК опубликованных работ по теме диссертации:

1. Якупов Т.Р., Шилова В.И. И$А - в прижизненной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота И Тезисы докладов межвузовской научно-практ:1ческой конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 60-летию Ставропольского ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственного института. -Ставрополь, 1991. -С. 133-134.

2. Фаизов Т.Х., Шилова В.И., Алимов A.M., Хазипов Н.З. Разработка экспресс-метода выделения ДНК из микобактерий туберкулеза // Достижения Казанской ветеринарной школы - в практику зхивотноводства: Тезисы докладов. -Казань, 1991. -С. 12.

3. Шилова В.И., Фаизов Т.Х., Алимов A.M., Хазипов Н.З., Вали-ев Li.В. Метод ДНК-ДНК гибридизацга! для дифференциации мико-бантерий /,' Актуальные вопросы ветеринарш! и. зоотехнии: Тезисы докладов. -Казань, 1992. -С. 55.

4. Фал зов Т.Х., Алимов A.M., Хазипов Н.З., Шилова В.И. Использование молекулярной гибридизации для идентификации возбудителей зоонозов // Экологические проблемы животноводства и

совершенствование,подготовки ветеринарных врачей: Материалы Всероссийской научной конференции. -Челябинск, 1992. -С. 68. б. Алимов A.M., 5аизов Т.Х., Шилова В.И. Идентификация возбудителен отдельных зооантропонозов методом молекулярной гибридизации // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Материалы научной конференции ВШШВВиМ. -Покров, 1Э92. -Ч. 2. -С. 218. 6. Шилова В.И., ¿аизов Т.Х., Алимов A.M., Хазипов Н.Э., Вали-ев П.В. Индикация и дифференциация микобактерий методом Д-К-ДНК гибридизации // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: Материалы научной конференции ВНИИВВиМ. -Покров, 19Э2. -Ч. 2. -С. 216.

»

Заказ 12. Подписано г печать 17.02.93. Формат 60 к в*1/« Бумега писчая. Печать . ,,.егная. I п.л. Тирах 100 экз.

УчеС10к 0Фсетной печати КВИ. К8зань-420074. Ветинститут.