Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Инактивированная вакцина против инфекционного ринотрахеита телят (иммуногенные, реактогенные свойства и способ применения)

всероссийская академия сельскохозяйственных наук

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИЛ1ЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я. Р. КОВАЛЕНКО

На правах рукописи

ЩЕРБАКОВ Павел Николаевич

ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА ТЕЛЯТ (ИММУНОГЕННЫЕ, РЕАКТОГЕННЫЕ СВОЙСТВА И СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ)

(16.00.03— Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология)

Авторефер ат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва — 1993

! > /

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я- Р- Коваленко.

Научный руководитель: лауреат Премии Совета Министров СССР, доктор ветеринарных наук, профессор

к. п. Юров

доктор ветеринарных наук, профессор Ю. Д. Караваев

(ВИЭВ)

кандидат ветеринарных наук 3. Я. Чистова (ВГНКИ)

Ведущая организация: Московская ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия им. К. И. Скрябина

Защита диссертации состоится « » ¿¿¿Р-г-гр^^ 1993 г. в IV часов на заседании Специализированного Совета К 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Официальные оппоненты:

Автореферат разослан «

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

- I -

I. ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность проблемы. Все страны шра с развитым промышленным животноводством несут значительные экономические потери от респираторных и желудочно-кишечных заболеваний молодняка.

Наибольшее распространение имеют герпесвируснке инфекции крупного рогатого скота, среди которых: ведущая роль принадлежит герпесвирусной инфекции первого типа или инфекционному рикотра-хеиту крупного рогатого скота.

Ринотрахеит крупного рогатого скота распространен в виде моноинфекции, часто регистрируется в ассоциации с пастереллезом, диплококковой, стрептококковой инфекциями. Смешанные вирусно-бактериальные инфекции отличаются злокачественным течением и высокой летальностью (Музичин С.И. к соавт., 1987; №отав, 1973).

С целью профилактики инфекционного ринотрахеита телят в мире применяйт целый ряд вакцин. Только в нашей стране для профилактики ИРТ используется пять живых и инактивированных вакцин.

. Однако, проблема разработки новых высокоиммуногенных и безопасных вакщн против'инфекционного ринотрахеита телят не теряет своей актуальности. Считается, что наиболее перспективным направлением этих исследований является разработка субъединичных и генноинженерных вакцин. Не отрицая значишсти этих исследований, шесте с тем считаем, что альтернативное репение проблемы лежит на пути более полного использования резервных механизмов иммунной системы макроорганизма, в нашем случае, система иммунитета крупного рогатого скота, которая характеризуется рядом существенных особенностей.

Цель и задачи. В связи с этим целью наших исследований явилась разработка выеокоиммуногенной инактивированной вакцины против ринотрахеита крупного рогатого скота, отличающейся низкой

реактогенностыо для животных различного возраста, возможностью использования ее для иммунизации коров в племенных хозяйствах, быков-доноров спермы на станциях искусственного осеменения, а также племмолодняка.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить пермиссивныэ условия выращивания производственного штамма ИРТ с целью повышения выхода вирусной массы.

2. Отработать метод частичной очистки и концентрирования вируса. '

3. Провести сравнительное изучение иммуностимулирующей активности различных адьювантов. . "

4. Изучить реакции иммунитета у крупного рогатого скота на внутрикожное введение антигена герпесвируса крупного рогатого скота первого типа.

5. Провести сравнительную оценку напряженности иммунитета к ринотрахеиту у крупного рогатого скота после внутрикожной

и подкожной иммунизации различными вакцинами. - /

6. Разработать нормативно-техническую документацию на экспериментальные серии вакцины.

Научная новизна. Впервые установлено формирование иммунитета у телят против герпесвируса I крупного рогатого скота при' ■ внутрикожном введении инактивированной вакцины. Имцунный ответ на внутрикожное введение инактивированного герпесвируса I крупного рогатого скота существенно повышается в сочетании с масляным адьювантом.

Изучена динамика формирования гуморального иммунитета у телят после внутрикожной вакцинации.

Установлено, что внутрикожное введение герпесвирусного анти-

гена в форме водно-масляной змульсии не вызывает значительной отрицательной местной и общей реакции.

Получено положительное решение на выдачу авторского свидетельства ВНИИГПЭ № 20II555OT 28 декабря 1992 г. по заявке "Инактивированкая вакцина против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота".

Практическая значимость. Разработана инактивированная масляная вакцина для внутриножного применения против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. Реактогенные и ишуно-генкые свойства этой вакцины изучены в экспериментальных условиях.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на межлабораторном совещании сотрудников и Хченом Совете Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии (1992 г., 1993 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы (272 наименований, s toit числе 71 - отечественных и 201 иностранных авторов), работа иллюстрирована 9 таблицами и 14 рисунками.

г. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Материалы .й методы исследования.

Вирус. В опытах использовали эпизоотический штамм "Щапово" вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, выделенный из патологического материала от телят из опытного хозяйства "Щапово" Московской области в отделе вирусологии в 198Тг,

Культура клеток. В исследованиях использовали первичнотрип-синизированные культуры клеток почки эмбриона коровы (ПЭК), почки теленка (ПТ), тестикулы бычков (ТВ) и их субкультуры, а также перевиваемые линии культур клуток ТР, ВДВК. Суспензию культур клеток получали в лаборатории ¡культур клеток и питательных сред ВИЭВ. Для приготовления субкультур из первичнотрипсинизи-рованных культур клеток применяли бесцентрийгужный метод, описанный В.А.Сергеевым (1963), Н.Г.Осидзе и соавт. (1964).

Выращивание вируса ИРТ в культурах клеток. Адсорбцию вируса на монослой клеток проводили в течение 2 часов при 37°С. Затем после удаления вируссодержащей жидкости зараженная культура клеток подвергалась трехкратно^ отмыванию, после чего и добавляли подаерживагацую среду - ГЛА или 199 без сыворотки. Такую же > среду вносили в контрольные культуры. Зараженные и контрольные культуры клеток инкубировали в термостате при 37°С.

После проявления ЦПД вируссодержащую жидкость подвергали многократному замораживанию и оттаиванию, затем центрифугировали. Полученная после центрифугирования надосадочная жидкость служила источником вируса.

Определение инфекционного татра вируса-. Инфекционный титр вируса определяли по цитопатическому действию (ЦЦД) в пробирочных культурах клеток цутем приготовления десятикратных разведений вируссодержащей культуральной жидкости на поддерживающих средах. Инфекционном титром вируса считали наибольшее разведение его, при котором в пробирочных культурах клеток наблюдали ЦОД не менее 50$ монослоя. Величина титра вычислялась по методу Рида и Менча и выражалась в тканевых цитопатических дозах (ТЦ^/мл).

Концетрированне вируса ИРТ. Концентрирование вируса прово-

дили методом осаждения полиэтиленгликолем 6000

Инактивация вируса. Концентрированный вирус инактивировали формалином в конечной концентрации 0,02-0,03$ в течение 46-48 часов при 37-3?,5°С. Контроль полноты инактивации вируса проводили на чувствительной культуре клеток.

Подопытные тавотные. В опытах использовали 61 теленка 3-6-месячного возраста черно-пестрой породы, у которых отсутствовали специфические антитела к вирусу ИРТ (серонегативные).

Реактогенные свойства вакцин против инфекционного ринотра-хеита определяли введением препаратов в различных дозах внутри-кожно и подкожно. Учитывали клиническую реакцию на введение препарата путем ежедневного двукратного измерения температуры тела подопытных животных утром и вечером, осмотром видимых слизистых оболочек верхних дыхательных путей, коныйстивы и влагалища, наличия выделений из носовой полости и их характера, кашля. Местную реакцию на введение оценивали по размеру воспалительного очага и продолжительности воспалительной реакции.

Для оценки клинической реакции телят на введение опытных серий - вакцины при контрольном заражении вирусом

ИРТ применяли 25-балльнуп шкалу:

5 баллов - температурная реакция;

-до 40,0° - I балл;

- 40,5° - 2 балла;

-41,0° - 3 балла;

- свыше 41,0° - 4 балла,при продолжительности лихорадки свыше 4-х суток - дополнительно I балл.

3 балла - саливация;

4 балла - кашель

продолжительность кашля до 5 дней - 3 балла;

свыше 5 дней - дополнительно I балл.

5 баллов - поражение слизистой оболочки носовых ходов:

- серозный ринит - 3 балла;

- серозно-гнойный ринит - 4 балла;

- образование везикул и язв в преддверии носовых ходов -5 баллов.

3 балла - поражение слизистых оболочек глаз:

- серозный конъюктивит - I балл;

й

- гнойный коньк&тивит - 3 балла.

5 баллов - местная воспалительная реакция:

- размер воспалительного очага в диаметре до 10 мм - I балл;

- размер воспалительного очага в диаметре до 50 мм - 2 балла;

- размер воспалительного очага в диаметре до 100 мм - 3 балла;

- продолжительность воспалительной реакции до 10 суток -I балл;

- продолжительность воспалительной реакции свыше 10 суток - 2 балла.

Реакцию на заражение вирусом ИРТ крупного рогатого скота оценивали следующим образом:

отсутствие реакции - 0 баллов

слабая реакция - 1-5 баллов

умеренная реакция - 6-10 баллов

сильная реакция - 11-15 баллов

тяжелая реакция - 16-25 баллов ....•■

Антигенные свойства серий вакцины при различньсс дозах и способах введения- определяли по нарастанию титров гуморальных антител в пробах сыворотки крови животных, полученных в разные сроки после иммунизации. Титр антител к вирусу ИРТ определяли в реакции нейтрализации (РН).

Оценку иммуногенных свойств лабораторных серий вакцины проводили по реакции вакцинированных телят на контрольное заражение,

которое проводили на 28-42 сутки после вакцинации. Для заражения использовали вирулентный штамм вируса UFT "Щапово" с инфекционным титром 10®»® ТВДбоЛга. Вирус вводили внутримышечно по 2 мл или интранаэально по 2,0-4,0 мл в каждый носовой ход. Клинические наблюдения вели в течение 15-20 дней.

Для реизоляции вируса использовали пробы носовых секретов от больных животных.

Реакция нейтрализации. Для установления иммунного фона животных и определения уровня специфических антител в пробах сыворотки крови использовали реакцию нейтрализации в культуре клеток (РН) (В.Н.Сюрин и др., 1986).

Реизоляция вируса ИРТ. Для реизоляции вируса использовали носовые секреты. Вирус выделяли на чувствительной культуре клеток и идентифицировали в РН.

Статистическая обработка результатов. Полученные цифровые величины обрабатывали методом вариационной статистики.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЩОВАШЙ

Изучение чувствительности различных клеточных культур к герпесвирусу I типа, штамм "Щапово".

Задачей исследований на первом этапе являлось изучение условий культивирования гаруса ИРТ, ст. "Щапово", в первипнотрип-синизированных и перевиваемых клеточных культурах с цель» определения оптимальной щеточной системы, позволявшей получать ыаксимально высокие урожаи вируса.

При изучении спектра чувствительности к герпесвирусу ИРТ, втаым "Щапово", испытнвались следующие нультуры клеток:

I. Первичнотрипсинизированные и их субкультуры - ПТ (почка теленка), ТВ (тестикулы бычка).

2. Перевиваемые - ПГ-80 (почка теленка), ТР (трахея эмбриона коровы), МДВК (почка теленка), ПЭС (почка эмбриона сайги.), СПЭВ (субкультура почки эмбриона свиньи).

Культуры клеток получали в лаборатории технологии культур тканей и питательных сред ВИЭВ. Для культивирования вируса отбирали культуры клеток с полностью сформированным монослоем и типичной морфологией. Заражение клеточных культур проводили в дозе I ЩЛ^ф/клетку. В каждой культуре клеток было проведено по 5 последовательных пассажей. Результаты определения титра урожая вируса представлены в таблице I.

Таблица I

Показатели инфекционного титра вируса ИРТ шт. "Щапово" при культивировании в различных клеточных культурах

Культура клеток I Титр вируса в [р^ *ЩПб(/мл

I I пассаж 1 3 пассаж 1 5 пассаж

ПТ, СПТ 5,8 + 0,22 6,5 £ 0,15 7,25+0,14

ТБ, СТБ 5,94 + 0,18 6,2 + 0,18 7,1 + 0,22

ПТ-80 5,4 + 0,17 5,92+ 0,17 6,25 + 0,3

ТР 5,4 + 0,17 6,0 + 0,15 6,0 + 0,15

вдвк 5,6 + 0,22 6,25 + 0,25 6,25 + 0,22

ПЭС 3,8 + 0,14 4,25 + 0,18 5,0 + 0,25

СПЭВ 3,94 + 0,14 2,0 + 0,15 . 1,25 ¿0,1 • •

Наиболее чувствительными цулыурами клеток оказались пер-вичнотрипсиниэированные культуры клеток и их субкультуры ПТ, СПТ, ТВ, СТБ. В них вирус накапливался в титре V, 1-7,251е ТЩ^дЛля. В гомологичных перевиваемых культурах клеток вирус накапливался в более низких титрах 6,0-6,5 1г ТЩ^о/мл. В гетерологичной культуре клеток ПЭС титр урожая вируса при последовательных пассажах

возрастал, однако он был существенно ниже, чем в гомологичных перевиваемых линиях клеток. В культуре клеток СПЗВ титр вируса при последовательных пассажах снижался, что свидетельствует о слабой чувствительности этой линии клеток к данному вирусу.

С целью оптимизации методов культивирования вируса ИРТ, штамм "Щапово", были проведены эксперименты по установлению оптимальной заражающей дозы. Установлено, что оптимальной заражающей дозой для герпесвируса I типа, штамм "Щапово", является 0,1-1,0 ТОД/клетка, при. которой вирус накапливается в титре 5,25-7,0 ХйЩД^/мл.

Сравнительная оценка реактогенных свойств

различных масляных адьювантов на телятах

Для оценки реактогенных свойств нами в предварительном опыте были испытаны 5 различных адыовантов, включающих растительные и минеральные масла, под кодовыми названиями: "Д", "B-I", "В-2", "Ю-5", "J5-I0".

Опыт проводился на 24 телятах 3-б-месячного возраста в производственных условиях.

Подкожное введение адыовантов "Д", "B-I", "В-2" вызывает у телят на месте введения препарата на 2-3 сутки образование воспалительного очага диаметром 60-120 мм. Местная воспалительная реакция продолжается 15-20 суток и заканчивается образованием гранулемы диаметром 30-60 мм. Общая реакция у животных на введение указанных адьювангов проявляется на 3-6 сутки в виде лихорадки до 39,6-41,4°С, угнетения и снижения аппетита.

Внутрикояное введение адыовантов "Д", "B-I", "В-2" и "Ю-5" вызывает на вторые сутки слабую' местную воспалительную реакцию (диаметр воспалительного очага 5-8 мм). Общая реакция в виде кратковременной лихорадки до 39,б-39,7°С отмечается в течение 1-2 суток с незначительным снижением аппетита.

Внутрикожное введение телятам адъвванта "D-IO" вызывало у телят выраженную воспалительную реакции (диаметр воспалительного очага - 10-20 мм), которая через 15-20 суток заканчивалась образованием гранулемы. Общая реакция организма в виде лихорадки до 40,2-41,5°С и снижение аппетита и угнетения отмечалась

в течение 2-3 суток. ___ _

Зависимость -реакции астителообтшования к вирусу ИРГ <?х. ело carta вввлвния пакпккн

В первом опыте было использовано 12 телят 3-4-месячного возраста, серонегагивных к вирусу ИРТ. Все животные были разделены на 4 подопытные и I контрольную группы.

Телятам I группы (3 головы) вводили вчутрикожно препарат Ив дозе 0,4 ш (2x0,2), антиген ИРТ без адыованта.

Животным 2 группы (3 головы) вводили вчутрикожно препарат № 2 в дозе 0,4 мл, составленный в соотношении 3:1 антигена вируса ИРТ и масляного адьюванта "B-I" соответственно.

Телятам 3 группы (2 головы) вводили подкожно препарат № 3 в дозе 6,0 шг, составленный в соотношении 1:19 антигена вируса ИРТ и масляного адаюванта "B-I".

Телят 4 группы (2 головы) с целью сравнительной оценки реактогенных, антигенных и иммунных свойств иммунизировали коммерческой вакциной "IFPAYAI ГВН" производства фирмы "ННОМЕ " SHEBIBV2", Франция, согласно наставлении по применению по 5,0 мл подкожно.

Во всех случаях препараты вводили в область средней трети

иеи.

Животных 5 группы (2 теленка) не иммунизировали.

После вцутрякожного введения препаратов № I и № 2 у телят в месте введения развивался ограниченный очаг воспаления диамет-

ром 6-7 мм, который рассасывался у животных I группы на 5 день, а у телят 2 группы - на 8-10 день после введения. У животных 3 группы, которым вводили подкожно препарат № 3, очаг воспаления максимально развивался на 2-3 сутки после введения, достигая максимального диаметра до 100 мм. У двух телят этой группы воспалительный отёк распространялся вниз по подкожной клетчатке. В месте воспаления отмечали повышенную местную температуру и болезненность.

Местная реакция на введение препарата I? 3 исчезала в течение 14-20 суток, однако.под ножей, в месте введения, образовывалась гранулема дкаизтрои 30-40 мм.

Каких-либо других отклонений в клиническом состоянии животных отмочено ш было.

Динамика прироста вируснейгрализукщюс _ антител представлена в таблице 2. У всех иммунизированных телят отмечали прирост ви-руснейтралгаущих антител на прививку. Однако, у животных 1-ой группы, которым вводили антиген без адыованта, прирост специфических гуморальных антител был существенно ниже во все сроки исследования и составил 1,66+0,28 log2 к 14 дня после вакцинации и 3,0+0,48 logg к 14 Д!ш посла ревакцинации.

Динамика антител! у животных 2 и 3 групп, иммунизированных внугрикокно и подкожно препаратом с адьювантом, принципиально не отличалась. К 14, дио после ревакцинации титр антител составлял 4,66+0,28 хоз2 и 5,5+0,35 Xog2 соответственно.

Во втором опыте бшю использовано 10 телят 3-6-месячного возраста,: сёронегативных к вирусу ИРТ. Всех животных разделили на 4 группы. Для испытания бета изготовлена лабораторная серия вакцины, состоящая из инактигарованного антигена вируса ИРТ и адьзванта "В-2"'в соотноеэнии 1:1. ..

■ Таблица 2

Динамика вируснейтрализущих антител к вирусу ИРТ в сыворотке крови телят после иммунизации лабораторными образцами вакцины против ИРТ в зависимости от дозы и способа введения и экспериментального заражения

№ !Кол-!Способ}Доэа ¡Соотношение 1Титр антител к вирусу ИРТ

ппы'Й- !нияД6"! ' |антиген/адъювант|после х И1Я.гун!,зацИИ |после П иммунизации (после КЗ }ных~! I I |з день|7 день }14 день|з день |7 день |14 день|14 день

I 3 в/к 0,4 ' ч 3/1 (культу-(2x0,2) ральная среда) 0 1,0+ 0 1,66+ 0,28 2,0+ 0 0,48 3,0£ 0,48 4,33;+ 0,28~

2 3 в/к 0.4 (2x0,2) 3/1 (В-1) 0 1,33+ 0,28" 2,33+ 0,28" 3,33+ 0,28" 3,66+ 4,66+ о|2ег 5,33+ 0,28""

3 2 п/к 6,0 1/19 (В-1) 0 1,5+ 0,35 2,5+ 0,35 3„5+ 0,35 4,5+ 0,35 5,5+ 0,35 6,5+ 0,35

4 2 п/к 5,0 . вакцина хррауах о хве 1,5+ 0,35 3,0+0 3,5+ 0,35 5,0+0 6 .с^о 6,5+ 0,35

5 2 контрольная группа

КЗ-контрольное заражение

Двух телят первой группы вакцинировали подкожно в дозе 2,0 мл двукратно с интервалом 21 день. Животных второй группы (3 головы) иммунизировали внутрикожно в дозе 0,2 мл двукратно с тем же интервалом. Трех телят третьей группы вакцинировали внутрикожно по 0,4 мл (две инъекции по 0,2 мл) двукратно с интервалом 21 день.

Четвертая группа - 2 теленка - служила контролем.

Динамика гуморальных вируснейтрализутацих антител у иммунизированных телят представлена в таблице 3. Подкожное введение препарата (I г) вызывает выраженную местную воспалительную реакцию, проходящую в течение 30 дней, тогда как внутрикожное введение 2 и 3 г образует ограниченную воспалительную реакцию на месте введения, исчезающую к 21 суткам.

Иммунная реакция телят при подкожном и внутрикожном способах введения принципиальных отличий не имела. Титр антител у животных во всех группах на 21 сутки после I и 2 вакцинации существенно не отличался. Разница титра антител по всем группам статистически недостоверна (Р> 0,1).

Обтазованиа гуморальных антител к вирусу ИРГ при внугрикожной вакцинации в зависимости от составу вакпинн и свойств ад-шварта-

Для изучения реактогенных и антигенных свойств лабораторных образцов инактивированной вакцины при использовании различных адьювантов и соотношения антиген-адьювант в препарате проведен опыт на 15 телятах 3-4-месячного возраста, серонегативных к вирусу ИРТ. Всех животных разделили на 5 групп.

Трем телятам первой группы вводили вакцину с масляным адью-вантом "Д" в дозе 4,0 мл. Соотношение антиген и адыовант составляло 1:1.

" ■ Таблица 3

Динамика нейтрализующих антител к вирусу ИРТ в сыворотке крови телят после иммунизации в зависимости от дозы и способа введения вакцины

1Нол-!Дрза!Споеоб 1Титр антител в РН к вирусу ИРТ

! {введения | после \ вакцинации ~ } после 2 вакцинации

ппы !жи- ! 1

!вот-1 !

1ных 1 1

\ 1 1

I иислц е. ъаяцппдции I на 10 день I_______ { _{после КЗ

|3 день | 7 день |21 день | 3 день | 7 день | 21 день |~~ "

I 2 2,0 подкожно О

2 3 0,2 в:

вцутри- О

кожно ' . ■ ;

3 3 0,4 внутри- О ',. ..' • кожно ■"• '

1,0+0 3,5+0,35 4,0+0

1,66+ 3,0+0 3,33+

0,27"" 0,27"

2,0+0 3,0+0 3,66+

; " : " . о,27~

5,0+0 6,0+0

4,33+ 0,27

5,33+ 0»27

5,0+0 6,0+0

6,5+0,35 6,0+0

6,33+ 0,28"

Р> 0,1

Животным второй группы (3 головы) вводили аналогичный препарат внутрикожно в дозе 0,4 мл (2 х 0,2 мл).

Четырем телятам третьей группы вводили вакцину с масляным адыовантоы "D-5" внутрикожно по 0,4 мл (2 х 0,2 мл). Соотношение антиген/арьювант было 1:19 соответственно.

Трем телятам четвертой группы вводили вакцину с масляным адьювантои "D-I0" внутрикожно по 0,4 мл (2 х 0,2 мл). Соотношение антиген/адьювант составляло 1:9.

• Животные пятой группы служили контролем, их не иммунизировали.

Повторно всех животных иммунизировали на 14 сутки тем же способом и в той же дозе.

Телята I группы, иымунизированные подкожно, проявили местную реакцию на 2 сутки в виде воспалительного очага диаметром 100 ым с отеком подкожной клетчатки.

У телят второй и третьей групп, которых вакцинировали вну-': трикожно, на месте введения образовывался ограниченный очаг воспаления диаметром 7-8 мм, который рассасывался в течение 10 ' дней. ; ;

\ У животных .4 группы на месте введения- на 2 сутки образовывался разлитой воспалительный очаг диаметром 30-40 мм. Воспалительный очаг.был ограничен дермой и не распространялся на подкожную клетчатку. ' . ■ -

На повторное введение препарата животные реагировали ана-. логичной местной реакцией. \

У телят.I группы, иммунизированных подкожно, титр вирус. нейтрализующих ¡антител на 7 сутки составлял 1-2 iog2 (1,33+ 0,27 1°8г), к 14 суткам составлял 2,0+0 1°е2«Повторное введение вакцины индуцировало прирост антител, титр которых через 14 су-

ток после ревакцинации достигал 5-6 log2 ( 5,33+0,27 log2).

У животных 2 группы, иммунизированных внутрикожно препаратом с масляным адьгаантом "Д", титр антител на 14 сутки'составлял 2-3logg (2,33+0,27log2). После повторного введения уровень антител возрастал и через 14 суток составлял 5-6 log2 (5,66+ 0,27 logg). ,,

Иммунная реакция у телят 3 группы, иммунизированных внутрикожно препаратом с адъювантом "Ю-5", была выражена слабее, титр антител через 14 дней после повторного введения вакцины составлял 4,0+0 logg«

У животных 4 группы реакция антителообразования быпа ниже, чем в других группах. Так, максишльный титр антител через 14 суток после повторной иммунизации составил 3,0+0 logg.

Динамика антител у животных I и 2 групп, иммунизированных вакциной с адъювантом "Д" различными способами и дозами, существенно не отличалась. Титр антител через 14 суток после первой и второй иммунизации в обеих группах практически не отличался (Р > 0,4). Кроме того, телята 2-й группы, иммунизированные внутрикожно в-10-кратно меньшей дозе, имели сравнимый (и даже незначительно выше) уровень вируснейтрализующих антител, что указывает на более интенсивное раздражение.имцунной системы при внутри-кожном введении антигена.

Разница титра антител у животных 3 и 4 групп, иммунизированных вцутрикожно препаратом с различным соотношением антиген/ адыовант (1:19 "Ю-5" и 1:9 "D-I0" соответственно), составила 1,0 (0,4>Р>0,2), что свидетельствует о разной иммунобиологической активности используемых адьювантов.

Опенка напряженности вакцинального иммунитета у телят к вирусу ИРГ при внутримышечном и шггтаяа-эальюм заражении эпизоотическим вирусом

Напряженность иммунитета'у вакцинированных телят оценивали-по результатам контрольного заражения их вирулентным штаммом ИРТ. Телят заражали вирулентным штаммом вируса ИРТ "Щапово" с инфекционным титром Ю®«® ТЦП^о/мл, Вирус вводили внутримьшечно по 2,0 мл.

Телята I группы, иммунизированные внутрикожно вирусным антигеном без адыованта, на заражение реагировали на 3 сутки повышением температуры тела до 40,5°С. Продолжительность лихорадки составляла 4 дня. В период лихорадки у них отмечалось угнетение, отказ от корма и незначительный серозный ринит. По 25-балльной системе реакция телят этой группы была оценена в 8 баллов, как умеренная. В пробах носовых секретов вирус выявляли на 5 и 7 сутки в титре Ю1»0 ТЦ^/ш.

Телята 2 группы, вакцинированные внутрикожно вакциной с масляным адьювантом "В-1", на контрольное заражение реагировали на 3 сутки незначительным подъемом температуры до 39,7°С с продолжительностью лихорадки 3 дня, со слабовыраженным угнетением. Клиническая реакция телят этой группы была оценена в 2 балла, как слабая, Реизолировать вирус из проб назальных секретов не удалось.

Телята третьей группы, иммунизированные подкожно вакциной с масленым адьювантом "В-1", на контрольное заражение реагировали незначительным повышением температуры до 39,б°С с продолжительностью 3 дня, со слабовыраженным угнетением. Клиническая ре-

----—=SLz_____________'____

акция телят этой группы была оценена в 4 балла, как слабая. Вирус из проб носовых секретов выделить не удалось.

У контрольных телят после заражения на третьи сутки наблюдали повышение температуры тела до 40,2°С, продолжительность лихорадки составила 7 дней с максимальной температурой тела 40,8°С, а также наблюдались характерные для ИРТ клинические признаки - угнетение, отказ от корма, слизисто-серозный ринит, коныбктивит, кашель. От контрольных телят вирус из проб носовых секретов выделяли на 5, 7 и 10 сутки после инфицирования в титре: 5 день - I03'0 ТЦДзд/мл, 7 день - I02 ВД^/мл, Ю дань - ;. 10* '^ТЦЦ^мл-. Клиническая реакция телят этой группы оценена, в 16 баллов как тяжелая реакция.

Показателем иммунитета, который сформировался после вакцинации, является увеличение тигра вируснейтрализутацих антител в результате контрольного заражения. Тан» у нэвакцинированных телят на 14 сутки после заражения вирулентным, штаммом антитела выявляли в титре в среднем по группе I log2 , а у иыцушзиро ванных телят нейтрализущие антитела выявляли в I группа - 4,38+ 0,28 logg, во 2 группе - 5,33|+0,28 logg, в 3 группе - 6,5+ 0,35 log2, и в 4 груше -"6,5+0,35 logg. Причем 'более высокие титры антител бьшк получены в 3 и 4 группах,

Во втором опыте напряженность юаунитота у вакцинированных телят проверяли контрольным заражением,* вирулентным штампом вируса ИРТ "ЩапоЕо" с титром, Ю&>5 Щ^д/мл. Вирус вводили интрана-зально по 4,0 'кл ь каадый носовой ход.

Телята первой гфуты.имцушзкроБакнш подкожно, реагироБа-. ли на контрольное ааражаниена в-тораз сутки лихорадкой, которая продолжалась 4 дня, с максимальной ссшера^уроГг тола до 40,4°С. У одного теленка на 3-4 сутки отмочали серозный ришт. Других--

- 19 -

отклонений от физиологической нормы не отмечали, аппетит был сохранен. Из проб носовых Секретов вирус реизолировали на 3 и 5 сутки в титре ЩД^ф/мл (5 баллов).

Животные второй группы, иммунизированныз внутрикожно в дозе 0,2 мл, проявили реакцию на инфицирование на 3 сутки, которая выражалась лихорадкой в течение трех суток, максимальное значение температуры составляло 40,б°С. Серозный ринит в течение двух суток отмечен у одного теленка. Угнетения и снижения аппетита не наблюдалось. Вирус из проб назальных секретов выделяли на 5 сутки из цельных проб (5 баллов).

Телята третьей группы, вакцинированные внутрикожно в дозе 0,4 мл (2 х 0,2) на заражение реагировали на вторые сутки лихорадкой в течение 3 дней с максимальной температурой 40,3°С. Других отклонений от «физиологической нормы не наблюдалось. Реизоли-ровать вирус из проб носовых секретов не удалось (2 балла).

У контрольных животных четвертой группы на вторые сутки после заражения отмечен подъем температуры тела, который достигал максимального значения (41,5°С) на 4 сутки. Продолжительность лихорадки составляла 8 суток. Телята переболели с характерным для инфекционного ринотрахеита клиническими признаками в виде: носовых истечений серозно-слизистого характера, фибринозных наложений на слизистой коса, переходящих в изъязвления; кашля, угнетения, отказа от корма. Контрольные телята выделяли вирус с носовыми секретами до 10 суток (срок наблюдения) в титре: на 3 сутки - Ю2»0 ТЩ^ф/мл, на 5 сутки - Ю4'0 ИЦ^д/мл, на 7 сутки -И*0 ТЦ%о/мл, га 10 сутки - Ю1»0 ПЩ^/т (8 баллов).

На основании внутримышечной и интраназальной аппликации патогенного вируса можно выявить, что телята, вакцинированные как подкожно, так и внутрикожно, обладают выраженным как местным, так и общим иммунитетом.

Напряженность иммунитета в зависимости от свойств адиованга при внутрикожной вакцинации телят интра-назальной аппликацией вирулентного вируса ИРГ Иммуногенность лабораторных образцов вакцины оценивали в третьем опыте по напряженности иммунитета вакцинированные телят; при контрольном заражении контрольных и вакцинированных животных через 14 дней после повторной иммунизации заражали вирулентным штаммом вируса ИРТ "Щапово" с инфекционным титром 6 5

Ю ' ТЩ^мл путем интраназальной инсталляции в дозе 2,0 мл.

Телята первой группы, вакциниро ванные подкожно вакциной с масляным адъювантом "Д" в дозе 4,0 мл, на контрольное заражение реагировали на 3 сутки 3-дневной лихорадкой с максимальной температурой тела до 40,4°С и незначительным угнетением. У одного теленка наблюдался слабый серозный ринит. Из проб носовых секретов вирус реизолировали на 3, 5 сутки в титре 10*.»® ТЩ^/мл. Клиническая реакция на заражение телят этой группы была оценена в Z балла, как слабая.

Телята второй группы, вакцинированные внутрикожно аналогичным препаратом в дозе 0,4 мл, на контрольное заражение реагировали на 3 сутки лихорадкой в течение 2 суток с максимальной температурой тела до 40,0°С со слабовыраженнш угнетением. Из проб носовых секретов вирус реизолировали на 3, 5 сутки в титре Ю1»0 ТЦЦзд/мл. Клиническая реакция телят этой группы была оценена в I балл, как слабая.

Телята третьей группы, вакцинированные вцутрикожно вакциной, содержащей масляный адиовакт ,}Ю-5", на контрольное заражение реагировали на 2-3 сутки лихорадкой продолжительностью 5-6 суток с максимальной Темиературо!"; тела до 40,8°С с выраженными клиническими признаками респираторного заболевания в виде угнетения, еерозно-слизистого ринита и конък?ктивита, кашля в период

гипертермии и незначительными очаговыми некротическими наложениями на слизистой преддверия носа. Из проб носовых секретов вирус удавалось реизолировать на 3, 5, 7 сутки в титре Ю2'®'. ТЦД^ф/мл. Клиническая реакция телят этой группы оценена в 10 баллов, как умеренная.

Телята четвертой группы, вакцинированные вакциной с масляным адьювантом "Ю-10", на контрольное заражение реагировали на 3 сутки, лихорадкой в течение 4 дней с максимальной температурой тела 40,6°С. Кроме того, у животных отмечали гиперемию слизистой носовой полости, слабый серозный ринит и угнетение в период лихорадки. Из проб носовых секретов вирус удавалось реизо-

р А О П

лировать на 3, 5, 7 сутки в тигре 10 • ' ТЦД^о/мл. Клиническая реакция на контрольное заражение оценена в 6 баллов, как умеренная.

Контрольные телята заболели на 2-3 сутки. Заболевание сопровождалось угнетением, отказом от корма, кашлем, лихорадочной реакцией в течение 9 суток с максимальной температурой до 41,2°С. У животных наблюдали гиперемию слизистой оболочки носовой полости и конъАтивы, носовые истечения носили слиэисто-серозный характер, а затем слизисто-гнойный. На 4-5 сутки на слизистой оболочке носа образовывались некротические наложения желто-серого цвета. Контрольные телята выделяли.вирус с носовыми секретами в течение 10 суток после инфицирования. На 3 и 5 сутки титр ви-

о П

руса в культуре клеток составлял 10 ' ЩЦ^мл, на 7 сутки -10**® "ЩЦ^о/мл. На 10 сутки температура тела нормализовалась, состояние животных стало улучшаться.

Реакция контрольной группы животных на заражение оценена в 18 баллов (тяжелая).

Иммунная реакция вакцинированных животных на контрольное

крови, титр которых на 14 сутки после инфицирования составлял:

1 группа - 1:64 - 1:128 (6,33+0,27 log2)

2 группа v- 1:64 - 1:128 ( 6,66+0,27 log2)

3 группа - 1:32 - 1:64 (5,25+0,27 iog2)

4 группа 7 1:16 - 1:32 (4,66+0,27 log2>

Сравнительная оценка реактогенньи, антигенных и иммуногекньи свойств лабораторных образцов инактивировакной вакцины против инфекционного ринотрахеита и коммерческой вакцины против инфекционного ринотрахеита "IFPA.VAX IBR"

Для профилактики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота во Франции и ряде других стран Западной Европы успешно используют инактивированные вакцины, которые производятся различными фирмами. В связи с этим в опыте № I наш проведено изучение реактагенных, антигенных и имцуногенных свойств коммерческой вакцины «imvu IBR" фирмы "нноыв MKBIEVX" в сравнении с лабораторными образцами инактивдрованной вакцины против ИРТ, изготовленными в отделе вирусологии ВйЭВ.

Двум телятам (4 группа, см. табл. 2) вводили коммерческую' вакцину "imVAX та" .подкожно в дозе 5,0 мл в области ересей трети шеи, согласно наставлению по применению. Лабораторные серии инактивированной вакцины вводили телятам согласно схемы опыта подкожно и внутрикожно в различных дозах (см. тебя. 2).4

Кивотные, иммунизированные кошзрческой вакциной, реагировали на введение препарата только местной реакцией в вире воспалительного очага диаметром 100 ым, который развивался через 2-3 • суток после введения вакцины. Воспалительная реакция продолжалась в течение 10-12 дней, после чего на месте введения образовывалась грацулема (4 балла). •

Иммунная реакция телят на введение коммерческой вакцлны сопровождалась выработкой специфических гуморальных антител, которые выявлялись на 7 сутки в титре 1,5+0,36 i0g2 , к 14 суткам уровень гуморальных антител составлял 3,0+0 iog2.

Повторное введение вакцины стимулировало прирост специфических антител, уровень которых на 14 сутки повышался до 6,0+ О logg.

Динамика антител у животных, имитированных лабораторными образцами вакцины, представлена в таблице 2.

Напряженность иммунитета у всех вакцинированных телят проверяли контрольным заражением на 14 сутки после повторной иммунизации, путем внутримышечного введения вирулентного вируса ИРТ

с

штамм "Щапово" с инфекционным титром 10 ' ТЦЦрф/мл в дозе 2,0 мл.

Животные, иммунизированные вакциной "iffavax ibr", реагировали на заражение на 3 сутки повыпением температуры тела. Продолжительность лихорадки составила двое суток с максимальной температурой тела до 40,4°С. Других отклонений от физиологической нормы, за исключением слабого угнетения в период лихорадки, не отмечали. Реиэолировать вирус из проб носовых секретов не удалось (5 баллов).

ВЫВОДЫ

1. Вцутрикожное введение инактивированного герпесвируса I' крупного рогатого скота стимулирует у телят образование выраженного иммунного ответа.

2. Иммуногенность инактивированного препарата вируса ИРТ существенно повышается в сочетании с масляным! адъювантами.

3. Иммуностимулирующая активность масляных адьювантов в составе вирусных вакцин при их применении по предлагаемому спо-

собу.достигается при использовании различных масел.

4. Внутрикожное введение амульсжЯ'вакцины против ринотра-хеита крупного рогатого скота стимулирует у телят формирование выраженного системного и местного иммунитета, напряженность которого не уступает этому показателю при подкожной вакцинации.

5. При вцутрикокном введении вакцины образуютст гуморальные антитела. Динамика формирования гуморального иммунного ответа на внутрикожное введение вакцины принципиально не отличалась от таковой при подкожном введении препарата.

6. Масляные адыованты, содержащие углеводородные масла отечественного производства, легкие эфирные масла или патентованные фирменные препараты в сочетании с инактивированным антигеном герпесвируса I крупного рогатого скота при подкожном применении обладают сильным реактогенным действием {местным и общим),

в особенности..для телят раннего возраста.

7. Применение вакцины против ИРТ с масляным адыовантом по разработанному способу исключает неблагоприятную реакцию на вакцину. Испытание экспериментальных серий инактивированной вакцины на телятах показало, что неспецифические общие и местные реакции на прививку предлагаемого препарата значительно ниже- в сравнении с известными коммерческими эадульгированными препаратами.

8. Предлагаемая вакцина является перспективным препаратом для внедрения в ветеринарную практику.. V

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Получено положительное решение на выдачу авторского свидетельства ВНИИГПЭ $ 2011555 от 28 декабря 1992 г. по заявке

• "Инактивированная вакцина против инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота".

2. Материалы по "Еакц;;не против инфекционного ринотрахеита

крупного рогатого скота ияакгивированной ВЙЭВ" рассмотрены и-одобрены Госветблогомлссией при МСХ В5 и рекомендованы ГУВ МСХ К) для < утверждения НГД на оптово-промышленную партии препарата для- испытания в производственных условиях.

СПИСОК ВШ)Т, ОПУЕЛИЮМННЫХ БО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Инакг тированная вакцина против инфекционного ринотрахе-ита крупного рогатого скота. Описание изобретения к заявке на авторское сведет ель от во Л 2011555. Получено положительное решение ВНИИГПЭ га выдачу авторского сведетельства от 2В декаоря 1992 г.

2. Щербаков П.Н., Юров К.П. Реакгогенные и иммуногенные свойства новой ияакгивированной вакцины пртив ринотрахеига крупного • рогатого скота.//БИЭВ-Москва, 1993.-Деп. в ВНШГЭИагропром.

Подписано в печать //. Ю. 1993 г._____3|к.

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕТИТ»