Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Иммуномодулирующие свойства глутоксима у свиней с парвовирусной инфекцией

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВ ЮРИИ ЮРЬЕВИЧ

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ГЛУТОКСИМА У СВИНЕЙ С ПАРВОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

16 00.04 - ветеринарная фармакология с токсикологией 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Троицк- 2004

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины »

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор

Ермолин Александр Васильевич; доктор медицинских наук, профессор Зурочка Александр Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Исмагилова Асия Фахретдиновна

кандидат ветеринарных наук, доцент Петров Анатолий Антонович

Ведущая организация - Оренбургский государственный аграрный

университет

¿¿аше^Л-

в/0

Защита состоится

на заседании диссертационного совета Д 220.066.01 при ФГОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 457100 г. Троицк, Челябинская область, ул. Гагарина, 13; тел. 2-19-89, 2-64-75.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины»

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Неблагоприятная экологическая ситуация, которая сложилась на территориях многих промышленных центров России, в частности, на Южном Урале оказывает весьма негативное влияние на состояние здоровья животных, способствует повышению уровня их заболеваемости и летальности. В значительной степени воздействие экологического прессинга реализуется через изменения функций иммунной системы. Развивающиеся при этом вторичные иммунодефицитные состояния, в свою очередь, обуславливают повышенную восприимчивость организма к вирусным и бактериальным инфекциям, развитие аллергических реакций, хронизацию воспалительных процессов (В.А.Черешнев с соавт., 1997).

Исследования последних лет свидетельствуют о широком распространении заболеваний, вызываемых вирусами, к числу которых относится и парвовирусная инфекция свиней (Б.Г. Орлянкин, 1986; В.А.Сергеев, Б.Г.Орлянкин,1991; О.Г.Петрова с соавт.,1995; А.А.Новых с соавт., 1996; С.М.Усов, 1998).

Применяемая специфическая профилактика не всегда предупреждает развитие вирусной инфекции, поскольку одним из ведущих звеньев патогенеза развития заболевания, является формирование состояния иммунодепрессии (В.М.Апатенко,1992; В.В.Бурдейный, 1998; С.М.Усов, 1998).

Вакцинопрофилактика при ряде болезней не всегда достаточно эффективна по той причине, что поголовье животных после вакцинации не однородно по иммунному ответу. В стаде, всегда присутствуют особи с низкими титрами специфических антител (Л.А.Ладыгина, 1985; А.Х.Аракелян с соавт., 1999). Кроме того, сами вакцины в определенные фазы иммунизации способны подавлять сопротивляемость организма к инфекциям (Л.П. Горшунова с соат.,1980; В.А.Романов, 1980). Титры антител при вакцинации на фоне иммунодефицита часто не достигают необходимых значений, что требует увеличения дозы вводимого антигена (Е.Ф. Касьяненко, СИ. Михлина, 1992; А.М.Земсков с соавт., 1994).

С учетом этого ветеринарная иммунофармакология в последнее время привлекает все большее внимание специалистов различного профиля, поскольку без глубокого знания иммунных реакций в организме в ответ на тот или иной фактор невозможно адекватно раскрыть этиопатогенез болезни, точно провести индикацию возбудителя и обеспечить разработку и внедрение более совершенных методов и средств профилактики и лечения болезней животных. Поэтому тесты иммунологического анализа реально можно использовать для оценки выраженности воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды на состояние здоровья животных и для оценки эффективности действия лекарственных препаратов.

Такая ситуация средств, способных повысить

1 ¿Чйжй

стресс. В то же время иммуномодулирующие средства при вирусных инфекциях должны избирательно и специфически подавлять репродукцию вирусов и не затрагивать процессов жизнедеятельности клеток и систем организма.

В настоящее время в ветеринарной практике для лечения вирусных инфекций широко применяют различные иммуномодуляторы, иммуноглобулины и интерфероны (В.Г. Богуш, 1993; И.В. Волген, 1998; Ф.Г. Гизатуллина и соавт.,1998; Ф.И. Ершов, 1994; В.Н. Жуленко и соавт., 1998"'; М.В. Михайлова, 1999; Б.Г. Орлянкин и соавт., 1999; Н.Д. Придыбайло, 1991; B.C. Прудников, Ю.Т. Земотнов, 1999 и др.). Однако многие иммуномодуляторы в настоящее время остаются еще недостаточно изученными. К их числу относится новый синтетический иммуномодулятор, принадлежащий к классу лекарственных средств тиопоэтинов - глутоксим. В гуманитарной медицине препарат с успехом прошел широкие клинические испытания в комплексной терапии вирусных гепатитов В и С, для сопровождения химио- и радиотерапии в онкологии (В.Е. Жемчугов, А.Г. Румянцева, Л.А. Кожемякин, 2001)..

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение влияния глутоксима на иммунную систему супоросных свиноматок и родившихся от них поросят, с подтвержденным диагнозом на парвовирусную инфекцию.

На разрешение были поставлены следующие задачи:

1. Изучить эпизоотическую обстановку в хозяйстве, провести клиническое обследование поголовья свиней и с помощью ИФА уточнить диагноз на ПВС.

2. Оценить влияние глутоксима на общее состояние и иммунную систему супоросных свиноматок с парвовирусной инфекцией.

3. Определить действие глутоксима на иммунокомпитентные клетки крови у инфицированных поросят in vitro.

4. Установить действие глутоксима на элиминацию вируса, иммунную систему у инфицированных поросят in vivo, их сохранность и продуктивность.

5. Рассчитать экономическую эффективность терапевтического действия глутоксима у свиней с парровирусной инфекцией.

Научная новизна. Впервые изучено влияние глутоксима на состояние иммунокомпетентных клеток и активность гуморальных факторов иммунитета у инфицированных супоросных свиноматок и изученных от них поросят. Выявлены ряд общих черт и различий в действии глутоксима на клетки иммунной системы in vitro и in vivo. Установлено, что глутоксим как in vitro, так и in vivo вызывает снижение активности Тх и Тс, НСТ реакции нейтрофилов, Ig G, CH50 активности комплемента. В тоже время показано, что глутоксим in vitro обладает Лолее выраженным влиянием на иммуннокомпетентные клетки животных. Помимо однонаправленных изменений системы иммунитета,

отмечено и разнонаправленное влияние препарата на ЦИК и С1 - С5 компоненты комплемента.

На основе данных in vitro (активности Т звена иммунитета и метаболической активности нейтрофилов) разработаны подходы по назначению и оценке эффективности препарата in vivo.

Практическая значимость работы. Применение глутоксима свиньям с парвовирусной инфекцией способствует снижению выявляемости АГ вируса в крови, воспалительной реакции иммунной системы за счет уменьшения активности Тх, Тс, ЦИК, НСТ реакции нейтрофилов и комплемента. Это позволяет существенно снизить летальность нарождающегося потомства и повысить его продуктивность.

Полученные данные могут быть использованы специалистами ветеринарных лабораторной для верификации диагноза на ПВС, в учебном процессе на кафедрах фармакологии и эпизоотологии, а также написании монографий, справочников и учебных пособий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Инкубации глутоксима in vitro с цельной кровью от свиней с парвовирусной инфекцией вызывает изменения как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета, проявляющихся снижением количества лейкоцитов, лимфоцитов, количества Тх, Тс, фагоцитоза, НСТ реакции нейтрофилов, В-лимфоцитов, СН50 - комплемента, повышением числа эозинофилов, нейтрофилов, лизосомальной активности нейтрофилов, ЦИК, дисбалансом активности С1 -С5 компонентов комплемента.

2. Действие глутоксима in vivo сопровождается элиминацией АГ вируса из крови и изменениями параметров иммунной системы во многом схожими с его действием in vitro, однако степень этих изменений была менее выражена.

3. Механизм действия глутоксима связан с его регулирующей ролью на редокс-систему клеток иммунитета, наиболее значимым звеном которой является снижение активности Т-клеток и метаболических функций нейтрофилов.

4. Глутоксим in vivo снижает инфицированность супоросных свиноматок, летальность потомства, а при лечении поросят увеличивает их выживаемость и продуктивность.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 14 Российской научной конференции "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях" (Челябинск,2000); научной конференции, посвященной 20-летию ЦНИЛ ЧелГМА "Современные технологии в биологии и медицине" (Челябинск,2000); Межвузовской научно-практической и научно-методической конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины, животноводства, товароведения,

обществознания и подготовки кадров на Южном Урале на рубеже веков (Троицк, 2002); на Международной научно-практической конференции "Новые энтеросорбенты и фармакологически активные вещества и их применение в ветеринарии и животноводстве", посвященной 80-летию Заслуженного деятеля науки РФ, доктора ветеринарных наук, профессора Рабинович М.И. ( Троицк, 2002); на международной научно-практической конференции « Актуальные проблемы ветеринарной медицины», Троицк, 2004 г., на расширенном заседании кафедры фармакологии УГАВМ, ноябрь,2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять научных статей.

Объем, и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их результатов, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы. Она изложена на 118 страницах, иллюстрирована 13 таблицами и 11 рисунками. Список литературы включает 183 источника, в том числе 58 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ РЕЗУЛЬТАТЫ

2.1 Материалы и методы исследования

Экспериментальную часть работы выполняли на базе межкафедральной лаборатории ФГОУ ВПО «Уральская государственная академия ветеринарной медицины" и ЦНИЛ ГОУ ВПО "Челябинская государственная медицинская академия». Она входит в план НИР УГАВМ (номер государственной регистрации 01.9.90002362).

Материалом для исследования служили препарат глутоксим и цельная кровь, стабилизированная гепарином, а объектом наблюдения -подопытные свиноматки и полученные от них поросята, с подтвержденным ИФА парвовирусной инфекции.

Глутоксим представляет собой химически синтезированное в НИИ особо чистых биологически активных препаратов ( г.С.-Петербург ) соединение - гексапептид ( бис-гамма- L-глутамил) - L- цистеинил-бис-глицин динатриевая соль с суммарной формулой Выпускается в ампулах по 1 мл с содержанием 1 мкг препарата.

Научно-производственный опыт проводили в колхозе им. Ленина Увельского района Челябинской области в период 2002-2003 годов.

Клиническому обследованию было подвергнуто 150 поросят возрастом от 1 месяца и старше и 50 основных свиноматок, по результатам которого формировали группы подопытных животных (по 10 голов в каждой). Первоначальный диагноз на ПВС устанавливали с учетом эпизоотической ситуации в хозяйстве: процента яловости, количества относительно здоровых, слабых и мертворожденных поросят в помете, симптомов проявления болезни, их дальнейшей сохранности.

Окончательный диагноз на ПВС осуществляли методом ИФА с

использованием тест-системы для определения антигена в крови на приборе PA-LAB.

В качестве тестов оценки иммунного статуса у животных до и после иммунокоррекции использовали:

- подсчет количества лейкоцитов меланжерным способом в камере Горяева;

- выведение лейкограммы в окрашенных по Романовскому-Гимза мазках крови с использованием трехпольного метода по Филиппченко;

С целью получения популяции нейтрофилов периферической крови от подопытных животных гепаринизированную ( из расчета 20-25 ЕД гепарина фирмы "Гедеон-Рихтер" на 1 мл) венозную кровь отстаивали с 6%-ным раствором деястрана Т-500 ( производство Швеция ) в соотношении 10:1 при 37 °С в течение 30 минут для осаждения эритроцитов. Плазму с лейкоцитами переносили в пробирки и центрифугировали в течение 5 минут при 1000 об./мин. Затем надосадочную жидкость убирали и добавляли к осадку 1 мл дистиллированной воды для лизирования эритроцитов. После этого в. пробирки приливали по 2 мл среды 199 и снова цетрифугировали в течение 5 минут при 1000 об./мин. В дальнейшем надосадочную жидкость убирали и добавляли к осадку 0,7-1,0 мл среды 199, ресуспезировали и получали клеточную взвесь (А.В. Зурочка, 1984 ).

Все манипуляции с клетками периферической крови проводили в дважды силиконизированной посуде.

Изучение способности крови к фагоцитозу проводили на модели поглощения частиц полистерольного латекса диаметром 1,7 мкм по методу И.С.Фрейдлин с соавт. (1976) в модификации Л.Я. Эберта с соавт. (1983).

Для оценки фагоцитоза 0,2 мл суспензии клеток смешивали с 20 мкл взвеси частиц латекса в концентрации 10 частиц/мл. После 30-и минутной инкубации при 37 °С из клеток готовили препараты, которые высушивали, фиксировали 96%-ным спиртом и окрашивали по Романовскому - Гимза.

С помощью иммерсионной системы микроскопии оценивали активность фагоцитоза (АФ) - процент нейтрофилов, захвативших хотя бы одну частицу латекса и интенсивность фагоцитоза (ИФ) - число поглощенных микросфер латекса в расчете на 100 подсчитанных нейтрофилов.

Лизосомальную активность нейтрофилов определяли по суммарному свечению числа лизосом в цитоплазме клеток, окрашенных акридиновым оранжевым, при люминисцентной микроскопии в модификации Л.Я. Эберта и соавт. (1983)..

Подсчет лизосом вели полуколичественно в "крестах" (И.С. Фрейдлин, 1986)..

Исследование внутриклеточного кислородозависимого

метаболизма фагоцитов проводили, используя НСТ-тест (В. Park et ah, 1968; А.Н. Маянский, М.Е. Виксман, 1979), в модификации А.В.Зурочка

(1984)..

Определение Т- и В-лимфоцитов в крови осуществляли в реакции спонтанного розеткообразования по методу М. Jondal et al. (1972) в модификации Р.В. Петрова с соавт. (1984) и А.В. Зурочка (1984).

Учет реакции осуществляли с помощью иммерсионной микроскопии, определяя количество образуемых розеток из 100 сосчитанных лимфоцитов в каждом мазке.

Определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) в сыворотке крови проводили по методике, предложенной В. Гашковой с соавт. (1978), основанной на том, что полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярной массой 6000 при добавлении к сыворотке крови приводит к осаждению белков, пропорционально концентрации циркулирующих иммунных комплексов.

Результаты исследований обрабатывали статистически с использованием пакета прикладных программ "Statistica for Windows 5.0" (В.П. Боровиков, 2001).. О достоверности различий между группами судили по критерию Стьюдента (t). Различия считали значимыми при Р < 0,05 (В.А.Медик и соавт., 2000).

2.2. Влияние глутоксима на состояние иммунной системы супоросных

свиноматок

Прежде, чем приступить к изучению влияния глутоксима на иммунную систему новорожденных поросят, были проведены опыты на супоросных свиноматках, у которых в крови ИФА выявляли антиген парвовируса. Это было сделано с несколькими целями.

Во-первых, считается (А.А. Новых с соавт., 1996; Б.Г. Орлянкин, 1986;; О.Г. Петрова с соавт.,1995; В.А Сергеев, Б.Г. Орлянкин, 1991; С.М.Усов, 1998), что вирус способен проходить через гемато-плацентарный барьер, поэтому большинство поросят рождается уже инфицированными, что и приводит к их значительной ранней летальности.

Во-вторых, как правило, взрослые свиньи не имеют клинических признаков болезни, но являются носителями этого вируса.

В третьих, необходимо было выяснить возможные негативные последствия глутоксима на животных в период супоросности.

С учетом вышесказанного сформировали две группы : опытную и контрольную ( по 10 животных в каждой ). Опытным свиноматкам за 1 месяц до предполагаемого опороса внутримышечно один раз в сутки вводили глутоксим в дозе 0,1 мкг/кг массы в течение 5 дней, контрольным - физиологический раствор натрия хлорида в том же объеме ( для исключения реакции на процесс введения ).

За животными вели наблюдение, в процессе которого учитывали их общее состояние, количество народившихся от них поросят: относительно здоровых, слабых, мертвых. В качестве дополнительного критерия эффективности действия препарата определяли наличие

антигена вируса в крови у родившихся живыми поросят.

Наблюдения показали, что введение глутоксима супоросным свиноматкам не вызывало видимых отклонений в их общем состоянии и поведении. От них родились поросята живыми, в то время как в контроле 16% - мертвыми. Проведенная оценка обсемененности выживших поросят составила в опыте 42, а в контроле -100%. В течение первого месяца жизни в опытной группе свиноматок погибло 5% поросят, а в контрольной - 28%.

Таким образом, применение глутоксима супоросным свиноматкам не оказало негативного действия на плод, а, наоборот, в условиях развития вирусной инфекции, снижало показатели мертворожденности, обсемененности и гибели потомства.

Полученные данные позволили предположить, что положительный эффект после применения глутоксима возможно связан с его действием на иммунную систему свиноматок.

Проведенные в этом направлении исследования подтвердили наши предположения. Так, при отсутствии существенных изменений в формуле крови у опытных свиноматок по сравнению с контролем, за исключением снижения процентного содержания базофилов и эозинофилов, отмечено достоверные изменения в показателях лимфоцитарного звена иммунитета. Так, на 10 сутки после проведенного курса глутоксимом в крови, по сравнению с контролем, достоверно возрастал процент содержания Т-лимфоцитов, в основном за счет Т-хелперов. В тоже время количество Т-цитотоксических клеток снижалось (рис. 1).

Со стороны гуморального звена иммунной системы под влиянием глутоксима при некотором росте В-лимфоцитов происходило снижение показателей А, М и в, активности комплимента СН50 и возрастание циркулирующих иммунных комплексов (рис. 2).

Более существенные изменения под влиянием глутоксима были отмечены со стороны фагоцитарных реакций нейтрофилов: снижались активность и интенсивность фагоцитоза, их фагоцитарное число, спонтанная НСТ-активность и возрастала индуцированная НСТ-реактивность (рис. 3).

Отмеченные изменения в изучаемых показателях свидетельствуют о повышении бактерие - и вирусоцидном потенциале фагоцитарных клеток, снижении воспалительной реакции, улучшении процессов регуляции иммунной системы, усилении биоцидного их потенциала.

В тоже время остается ряд вопросов, которые требуют формирования дополнительных подходов.

Например, у 42% поросят, в крови которых даже после применения глутоксима свиноматкам, выявляется АГ парвовируса. Значит, эти поросята могут в дальнейшем погибнуть и максимально положительный эффект не будет получен. Учитывая это обстоятельство, важно было определить влияние глутоксима на иммунную систему

поросят in vitro и in vivo, так как основная летальность приходится на первые месяцы жизни поросят. Важно отметить и то, что такие поросята служат потом источником эпизоотии.

Рис.1. Активность лимфоцитарного звена иммунной системы свиноматок с ПВС

Примечание: * - Р<0,05.

□ Свиноматки до лечения ■ свиноматки после лечения

Рис.2. Влияние глутоксима на гуморальный иммунитет свиноматок с ПВС

Активность фагоцитоза Спонтанная НСТ-актеаноеть Иидуцироааннм НСТ-акгаеностъ

j О Сцмомата до лечения ИСцмоиалм после лечения |

Рис. 3. Влияние глутоксима на фагоцитоз свиноматок с ПВС

Примечание: * - Р<0,05; ** - Р<0,01

2.3. Оценка влияния глутоксима на иммунную систему инфицированных поросят in vitro

Учитывая, что с помощью ИФА определение АГ не всегда доступно (нужен ИФА анализатор), а выявить животных для назначения препарата только клинически не всегда возможно, особенно в инкубационный период, возникает ряд моментов, требующих формирования нового подхода для решения задачи снижения инфицирования животных. Одновременно это ставит перед нами вопрос о ранней коррекции и выработке критериев назначения глутоксима поросятам из инфицированных пометов.

В начале оценивали действие глутоксима на иммунокомпетентные клетки крови in vitro. Для этого от инфицированных поросят брали кровь и делили на две части; одну часть инкубировали с 0,05 мкг глутоксима, другую - с физиологическим раствором в течение 1 часа. После чего оценивали состояние иммунной системы поросят.

Инкубация крови от больных поросят с глутоксимом вызывала существенные изменения в формуле крови. По сравнению с контролем отмечено снижение количества лейкоцитов, преимущественно за счет лимфоцитов и в меньшей степени за счет моноцитов, что привело к относительному росту количества нейтрофилов . В лимфоцитарном звене наблюдали снижение как абсолютных, так и относительных показателей Т-лимфцитов и их субпопуляций, в частности, Т-хелперов и I'-

цитотоксических клеток, а также индекса Тх/Тс (рис. 4).

В гуморальном звене иммунной системы без особых изменений со стороны В-лимфоцитов, отмечено достоверное снижение содержания Ig А, циркулирующих иммунных комплексов и возрастание отдельных фрагментов комплимента.

Со стороны фагоцитарного звена иммунитета при стабильных показателях в количестве нейтрофилов, достоверно снижались активность и интенсивность фагоцитоза, фагоцитарное число нейтрофилов, спонтанная и индуцированная НСТ-реактивность фагоцитов.

Таким образом, полученные нами данные по оценке влияния глутоксима на состояние иммунокомпитентных клеток крови in vitro во многом сходны с его действием на иммунную систему свиноматок.

? г f

■ - л

■ **■*■ *и ** -

Т-лимфоциты Т-хелперы Т-цитоксические

¡□поросята контроль Шпоросята инкубация с глютоксимом |

Рис. 4. Влияние глутоксима in vitro на клеточный иммунитет

Примечание: *-Р<0,05; **-Р<0,01; -Р 0,001.

2.4. Оценка влияния глутоксима на иммунную систему инфицированных поросят in vivo

Полученные данные о влиянии глутоксима на иммунную систему больных поросят in vitro, поставили перед нами следующий вопрос -осуществляет ли глутоксим подобное действие после его применения in vivo и положительны или отрицательны полученные данные о снижении активности иммунной системы у поросят с парвовирусной инфекцией?

Кроме того, необходимо было оценить клиническую и иммунологическую эффективность глутоксима на поросятах, а также разработать критерии диагностики иммунотропного действия глутоксима, путем сопоставления изменений в иммунной системе in vitro и in vivo.

Для этого подобрали по принципу аналогов две группы больных поросят (по 10 в каждой): опытную и контрольную. Опытной группе животных ежедневно внутримышечно вводили глутоксим из расчета 0,05

мкг/кг массы в течение 10 дней, контрольной - физиологический раствор натрия хлорида в том же объеме. За животными вели кинические наблюдения, учитывали их общее состояние, развитие, прирост живой массы, процент выживаемости. После окончания курса введения глутоксима брали кровь для проведения иммунологического анализа.

Введение глутоксима предотвращало гибель инфицированных поросят в течение периода наблюдения (3 месяца). В этой группе клинически не выявляли признаков диареи, в то время как в контрольной группе у 40% поросят отмечали явления энтерита. Было выявлено, что введение глутоксима поросятам привело к снижению вирусемии, что не могло не сказаться на приросте их живой массы. К концу периода наблюдения прирост живой массы в опытной группе поросят превысил контроль в два раза.

Проведенные иммунологические исследования показали, что при многократном введении глутоксима формула крови также не изменяется. В то же время отмечено, снижение количества Т-хелперов и индекса Тх\Тс ,за счет незначительного снижения числа цитотоксических лимфоцитов. Со стороны гуморального звена иммунитета отмечено четкое отличие от данных in vitro. Здесь, наоборот, наблюдали падение ЦИК и повышение активности С1-С5 компонентов комплемента (рис. 5 и 6).

При оценке фагоцитарной реакции нейтрофилов также выявлены некоторые отличия: при отсутствии изменений в фагоцитарных реакциях, наблюдается четкое снижение спонтанной и индуцированной НСТ реактивности фагоцитов и снижение их лизосомальной активности

Таким образом, полученные данные о влиянии глутоксима на иммунокомпитентные клетки крови in vitro и vivo имеют ряд схожих черт и ряд явных отличий. С чем это может быть связано?

Во-первых, глутоксим in vitro действует кратковременно, a in vivo - длительно и возможно в результате он оказал действие на различные механизмы иммунной системы.

Так, in vitro его действие связано с подавлением лимфоцитарного звена и частично фагоцитарного, вследствие чего снижается активность гуморального звена иммунной системы и в целом достигается депрессивный эффект (по-видимому связанный с регуляцией редокс-системы). Второй момент может быть связан с уходом инфицированных клеток в апоптоз (второй механизм действия глутоксима), а в условиях in vitro, нет выхода новых (неинфицированных клеток) из костно-мозгового депо, тимуса и других органов кроветворения.

За эту гипотезу свидетельствует и тот факт, что и in vivo так же отмечается снижение числа Т-хелперов и НСТ активности фагоцитов. Но в отличие от in vitro, имеет место активация системы комплемента, снижение ЦИК, что, по-видимому, связано с элиминацией вируса из крови, что, естественно, не может произойти за 1 час инкубации крови с препаратом in vitro

Одновременно следует отметить и тот факт, что в целом

отмечается снижение активности клеточного звена иммунной системы как in vivo, так и in vitro. Такое снижение, по-видимому, связано с уменьшением воспалительного процесса у поросят. Так как клинически отмечено снижение вирусемии и летальности , очевидно "депрессивное" действие глутоксима, по-видимому, свидетельствует о нормализации состояния иммунной системы поросят, то есть глутоксим ведет себя in vitro и in vivo как истинный "иммуномодулятор" (что подтверждается и данными, полученными нами при исследовании свиноматок). При повышении показателей иммунной системы он их снижает, а при понижении - повышает.

Кроме полученных ранее данных о механизмах действия глутоксима in vitro и in vivo, просматривается и ещё одно важное решение полученное нами, а именно, об однотипности действия глутоксима на Тх и НСТ-реакции нейтрофилов in vitro и in vivo.

На наш взгляд, эти иммунологические параметры могут служить критериями для назначения глутоксима после оценки его in vitro, для лечения животных с парвовирусной инфекцией.

Итак, проведенные нами исследования показали, что глутоксим можно применять супоросным свиноматкам без ущерба последним и приплоду. Поросятам с парвовирусной инфекцией также можно применять глутоксим для достижения максимального клинического и иммунологического эффекта. Одним из иммунологических критериев положительного, пролонгированного иммунотропного действия глутоксима может служить оценка его иммунотропной активности in vitro по снижению количества Т-хелперов и спонтанной и индуцированной НСТ реакции нейтрофилов, что можно использовать в качестве наиболее информативных тестов для иммунологической и клинической оценки лечебной эффективности препарата. Тесты оценки количества Т-хелперов и НСТ- активности нейтрофилов просты в исполнении и легко доступны в обычной ветеринарной лаборатории и могут быть успешно применены не только в крупных городских центрах, но и в отдаленных районах, так как для их выполнения требуется только термостат, центрифуга и обычный световой микроскоп.

Таким образом, проведенное исследование в целом позволило выявить клиническую и иммунологическую эффективность глутоксима и разработать дополнительные иммунологические критерии для его назначения у поросят с парвовирусной инфекцией.

Рис.5. Влияние глутоксима in vivo на показатели комплемента у поросят с ЛВС

Примечание: *-Р<0,001

контроль после лечения

Рис.6. Показатели ЦИК у поросят до и после лечения глутоксимом

Примечание. * - Р<0,05.

Экономическая эффективность применения глутоксима супоросным свиноматкам и полученным от них поросятам с парвовирусной инфекцией составила 9,8 рубля на 1 рубль ветеринарных затрат.

ВЫВОДЫ

1. 5-кратное введение глутоксима супоросным свиноматкам с парвовирусной инфекцией в дозе 0,1 мкг/кг массы снижает инфицированность приплода и его внутриутробную гибель

2. Изменения в иммунной системе у свиноматок после введения глутоксима выражаются в активации Тх, метаболической реактивности фагоцитов и снижении показателей гуморального звена.

3'. Инкубация цельной крови с глутоксимом in vitro, полученной от поросят с продуктивной парвовирусной инфекцией приводит к выраженному снижению активности клеточного звена иммунной системы, механизм супрессии которой связан с активацией редокс-системы лейкоцитов и уходом пораженных вирусом клеток в апоптоз.

4. 10- кратное введение глутоксима поросятам с парвовирусной инфекцией в дозе 0,05 мкг/кг массы вызывает сходное действие на иммунную систему с его влиянием in vitro, но в условиях рекрутации лейкоцитов из органов кроветворения, степень "депрессивного" действия глутоксима менее выражена.

5. Применение глутоксима поросятам с парвовирусной инфекцией сопровождается элиминацией вируса из крови, снижением процента летальности и увеличением прироста их живой массы.

6. Снижение Т-хелперной активности лимфоцитов и НСТ-реактивности нейтрофилов под влиянием глутоксима in vitro может служить дополнительным критерием для его назначения свиньям, больным парвовирусной инфекцией.

7. Экономическая эффективность ветеринарных мероприятий при парвовирусной инфекции свиней с применением глутоксима на 1 рубль затрат составила 9,8 рубля.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Иммунокорригирующую терапию свиней глутоксимом проводить с учетом выявления антигенемии.

2. При отсутствии возможности ИФА верификации диагноза на ПВС проводить пробу с глутоксимом in vitro из расчета 0,05 мкг препарата, на 10 мл крови, после часовой инкубации, при температуре 37°С, с учетом уровней Тх и НСТ - реакции нейтрофилов.

3. При снижении уровней Тх и НСТ - активности нейтрофилов у поросят с ПВС и ликвидации вирусемии рекомендуем назначать глутоксим из расчета 0,05 мкг/кг массы тела 10- кратно в течение 10 дней.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Степовой И.В. Влияние комбинированной специфической профилактики и иммунотерапии на иммунную систему свиней с парвовирусной инфекцией / Степовой И.В., Ермолин А.В., Зурочка А.В., Яковлев Ю.Ю. // Тезисы докладов Х1У Российской научной конференции. - Челябинск, 2000. - С. 110-111.

2.Яковлев Ю.Ю. Методические подходы к изучению влияния глутоксима на иммунную систему свиней с парвовирусным энтеритом in vitro и in vivo / Яковлев Ю.Ю., А.В.Ермолин., А.В. Зурочка, К.В.

Никушкина, И.Ю. Мельников // Материалы конференции, посвященной 20 летаю ЦНИЛ ЧелГМА «Современные лабораторные технологии в биологии и медицине». - Челябинск. - 2000. - С. 98.

3. Яковлев Ю.Ю. Оценка действия глутоксима in vitro на иммунную систему свиней с парвовирусной инфекцией / Яковлев Ю.Ю., Ермолин А.В., Зурочка А.В. // Материалы международной науч.-практ. конф. «Новые энтеросорбенты и фармакологически активные вещества и их применение в ветеринарии и животноводстве», посвященной 80-летию Заслуженного деятеля науки РФ, доктора ветеринарных наук, профессора М.И.Рабиновича ( 26-27 июля 2002 г ), Троицк, 2002. - С.123-125.

4. Яковлев Ю.Ю. Иммунотропног действие глутоксима у свиней с парвовирусной инфекцией / Яковлев Ю.Ю., Ермолин А.В., Зурочка А.В. // Мат-лы межд. науч.-практ. конф. « Новые энтеросорбенты и фармакологически активные вещества и их применение в ветеринарии и животноводстве», посвященной 80-летию Заслуженного деятеля науки РФ, доктора ветеринарных наук, профессора М.И.Рабинович ( 26-27 июля 2002 г.), Троицк, 2002. - С. 125-127.

5. Яковлев Ю.Ю. Глутоксим - активный корректор иммунной системы у свиней с парвовирусной инфекцией // Мат-лы международной научно-практич. конф. «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», Троицк, 2004. - С.204-206.

ЯКОВЛЕВ ЮРИЙ ЮРЬЕВИЧ

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ГЛУТОКСИМА У СВИНЕЙ С ПАРВОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ

16.00.04 - ветеринарная фармакология с токсикологией 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологиией и ИММУНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Сдано в набор 15.11.2004 г. Подписано к печати 17.11.2004 г. Формат 60х84/16. Печать офсетная. Объем 1 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ №902 Гарнитура "Times New Roman"

Отпечатано в типографии УГАВМ. Лицензия ЛР №021252 457100, г. Троицк, Челябинская область

1223 1 28

Актуальность темы. Неблагоприятная экологическая ситуация, которая сложилась на территориях многих промышленных центров России, в частности, на Южном Урале, оказывает весьма негативное влияние на состояние здоровья животных, способствует повышению уровня их заболеваемости и летальности. В значительной степени воздействие экологического прессинга реализуется через изменения функций иммунной системы. Развивающиеся при этом вторичные иммунодефицитные состояния, в свою очередь, обуславливают повышенную восприимчивость организма к вирусным и бактериальным инфекциям, развитие аллергических реакций, хронизацию воспалительных процессов (В.А.Черешнев с соавт., 1997).

Исследования последних лет свидетельствуют о широком распространении заболеваний, вызванные вирусами, к числу которых относится и парвовирусная инфекция свиней (В.А. Ананьев, 1982; Б.Г. Орлянкин, 1988; В.А. Сергеев, Б.Г. Орлянкин, 1983; А.А. Новых с соавт., 1996; С.М. Усов, 1998; P.Biront, Р. Bonte, 1983; I. Garner, 1983; W. L. Mengeling 1981 др.).

Применяемая специфическая профилактика не всегда предупреждает развитие вирусной инфекции, поскольку одним из ведущих звеньев патогенеза развития заболевания, является формирование состояния иммунодепрессии (В.М. Апатенко, 1992; В.В. Бурдейный, 1998; С.М. Усов, 1998; R. Н. Jonson 1979; W. L. Mencielino, 1981; P. S. Paul W. L. Menoeling, 1980 др.).

Вакцинопрофилактика при ряде болезней не всегда достаточно эффективна по той причине, что поголовье животных после вакцинации не однородно по иммунному ответу. В стаде, всегда присутствуют особи с низкими титрами специфических антител (А.Х. Аракелян, 1996). Кроме того, сами вакцины в определенные фазы иммунизации способны подавлять сопротивляемость организма к инфекциям. Титры антител при вакцинации на фоне иммунодефицита часто не достигают необходимых значений, что требует увеличения дозы вводимого антигена (Е.Ф. Касьяненко, С.И, Михлина, 1992; A.M. Земсков с соавт., 1994, H.S. Joo, 1975 ).

С учетом этого ветеринарная иммунофармакология в последнее время привлекает все большее внимание специалистов различного профиля, поскольку без глубокого знания иммунных реакций в организме в ответ на тот или иной фактор невозможно адекватно раскрыть этиопатогенез болезни, точно провести индикацию возбудителя и обеспечить разработку и внедрение более совершенных методов и средств профилактики и лечения болезней животных. Поэтому тесты иммунологического анализа реально можно использовать для оценки выраженности воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды на состояние здоровья животных и для оценки эффективности действия лекарственных препаратов.

Такая ситуация требует применения иммунокорригирующих средств, способных повысить иммуногенность вакцин и снять формирующийся вакцинный стресс. В то же время иммуномодулирующие средства при вирусных инфекциях должны избирательно и специфически подавлять репродукцию вирусов и не затрагивать процессов жизнедеятельности клеток и систем организма.

В настоящее время в ветеринарной практике для лечения вирусных инфекций - широко применяют различные иммуномодуляторы, иммуноглобулины и интерфероны (В .Г. Богуш, 1993; И.В. Волчек, 1998; Ф.Г. Гизатуллина и соавт., 1998; Ф.И. Ершов, 1996; М.В. Михайлова, 1999; Б.Г. Орлянкин и соавт., 1999; Н.Д. Придыбайло, 1991; B.C. Прудников, Ю.Т. Зелютков, 1999; W.K. Contrib 1984; Е. De Maeyer, 1988; A. L. Dunn 1998; С. A. Dinarello 1986; S. Harraga, 1994; A. Ahers, 1994; I. Fngel, 1994; M. Bakhiet, 1997; P. Colgan Sean et all 1994 и др.). Однако многие иммуномодуляторы в настоящее время остаются еще недостаточно изученными. К их числу относится синтетический иммуномодулятор, принадлежащий к классу лекарственных средств тиопоэтинов - глутоксим. В гуманитарной медицине препарат с успехом прошел широкие клинические испытания в комплексной терапии вирусных гепатитов В и С, для сопровождения химио- и радиотерапии в онкологии (В.Е. Жемчугов, А.Г. Румянцева, JI.A. Кожемякин, 2001 ).

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось изучение влияния глутоксима на иммунную систему супоросных свиноматок и родившихся от них поросят, с подтвержденным диагнозом на парвовирусную инфекцию.

На разрешение были поставлены следующие задачи:

1. Изучить эпизоотическую обстановку в хозяйстве, провести клиническое обследование поголовья свиней и с помощью ИФА уточнить диагноз на ПВС.

2. Оценить влияние глутоксима на общее состояние и иммунную систему супоросных свиноматок с парвовирусной инфекцией.

3. Определить действие глутоксима на иммунокомпитентные клетки крови у инфицированных поросят in vitro.

4. Установить действие глутоксима на элиминацию вируса, иммунную систему у инфицированных поросят in vivo, их сохранность и продуктивность.

5. Рассчитать экономическую эффективность терапевтического действия глутоксима у свиней с парвовирусной инфекцией.

Научная новизна. Впервые изучено влияние глутоксима на состояние иммунокомпетентных клеток и активность гуморальных факторов иммунитета у инфицированных супоросных свиноматок и полученных от них просят. Выявлены ряд общих черт и различий в действии глутоксима на клетки иммунной системы in vitro и in vivo. Установлено, что глутоксим как in vitro, так и in vivo вызывает снижение активности Тх и Тс, НСТ реакции нейтрофилов, IgG, СН50 активности комплемента. В тоже время показано, что .глутоксим in vitro обладает более выраженным влиянием на иммуннокомпетентные клетки животных. Помимо однонаправленных изменений системы иммунитета, отмечено и разнонаправленное влияние препарата на ЦИК и CI - С5 компоненты комплемента.

На основе данных in vitro (активности Т звена иммунитета и метаболической активности нейтрофилов) разработаны подходы по назначению и оценке эффективности препарата in vivo.

Практическая значимость работы. Применение глутоксима свиньям с парвовирусной инфекцией способствует снижению выявляемое™ АГ вируса в крови, воспалительной реакции иммунной системы за счет снижения активности Тх, Тс, ЦИК, НСТ- реакции нейтрофилов и возрастания отдельных компонентов комплемента. Это позволяет существенно снизить вирусемию, летальность нарождающегося потомства и повысить его продуктивность.

Полученные данные могут быть использованы специалистами ветеринарных лабораторий для верификации диагноза на ПВС, оценки его лечебной эффективности, а также в учебном процессе при чтении лекций по фармакологии и эпизоотологии, написании монографий, справочников и учебных пособий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Инкубация цельной крови с глутоксимом, полученной от поросят с парвовирусной инфекцией вызывает изменения как клеточного, так и гуморального звеньев иммунитета, проявляющихся снижением количества лейкоцитов, лимфоцитов, количества Тх, Тс, фагоцитоза, НСТ реакции нейтрофилов, В-лимфоцитов, СН50 - комплемента, при повышении числа эозинофилов, нейтрофилов, лизосомальной активности нейтрофилов, ЦИК, дисбалансом активности С1 -С5 фрагментов комплемента.

2. Действие глутоксима in vivo проявляется элиминацией АГ вируса из крови и изменениями параметров иммунной системы во многом схожими с его действием in vitro, однако степень этих изменений была менее выражена.

3. Механизм действия глутоксима связан с его регулирующей ролью на редокс-систему клеток иммунитета, наиболее значимым звеном которого является снижение активности Т-клеток и метаболических функций нейтрофилов.

4. Глутоксим in vivo снижает инфицированность супоросных свиноматок, летальность потомства, а при лечении поросят увеличивает их выживаемость и продуктивность.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 14 Российской научной конференции «Факторы клеточного и гуморального иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях» (Челябинск,2000); научной конференции, посвященной 20-летию ЦНИЛ ЧелГМА «Современные технологии в биологии и медицине» (Челябинск,2000); Межвузовской научно-практической и научно-методической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, животноводства, товароведения, обществознания и подготовки кадров на Южном Урале на рубеже веков (Троицк, 2002); на Международной научно-практической конференции «Новые энтеросорбенты и фармакологически активные вещества и их применение в ветеринарии и животноводстве», посвященной 80-летию Заслуженного деятеля науки РФ, доктора ветеринарных наук, профессора Рабинович М.И. ( Троицк, 2002); на международной научно-практической конференции « Актуальные проблемы ветеринарной медицины», (Троицк, 2004 г), расширенном заседании кафедры фармакологии УГАВМ, ноябрь,2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять научных статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований и их результатов, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы. Она изложена на 118 страницах, иллюстрирована 13 таблицами и 13 рисунками. Список литературы включает 183 источников, в том числе 58 иностранных авторов.

5. Выводы

1. 5-кратное введение глутоксима супоросным свиноматкам с парвовирусной инфекцией в дозе 0,1 мкг/кг снижает инфицированность приплода и его внутриутробную гибель.

2. Изменения в иммунной системе у свиноматок после введения глутоксима выражаются в активации Тх, метаболической реактивности фагоцитов и снижении показателей гуморального звена.

3. Инкубация цельной крови с глутоксимом in vitro, полученной от поросят с продуктивной парвовирусной инфекцией приводит к выраженному снижению активности клеточного звена иммунной системы, механизм супрессии которой связан с активацией редокс-системы лейкоцитов и уходом пораженных вирусом клеток в апоптоз.

4. 10-кратное введение глутоксима поросятам с парвовирусной инфекцией в дозе 0,05 мкг/кг массы вызывает сходное действие на иммунную систему с его влиянием in vitro, но в условиях рекрутации лейкоцитов из органов кроветворения, степень «депрессивного» действия глутоксима менее выражена.

5. Применение глутоксима поросятам с парвовирусной инфекцией сопровождается элиминацией вируса из крови, снижением процента летальности и увеличением прироста их живой массы.

6. Снижение Т-хелперной активности лимфоцитов и НСТ-реактивности нейтрофилов под влиянием глутоксима in vitro может служить дополнительным критерием для его назначения свиньям, больным парвовирусной инфекцией.

7. Экономическая эффективность ветеринарных мероприятий при парвовирусной инфекции свиней с применением глутоксима на 1 рубль затрат составила 9,8 рубля.

6. Практические предложения

1. Иммунокорригирующую терапию свиней глутоксимом проводить с учетом выявления антигенемии.

2. При отсутствии возможности ИФА верификации диагноза на ПВС проводить пробу с глутоксимом in vitro из расчета 0,05 мкг препарата на 10 мл крови, после часовой инкубации, при температуре 37°С, с учетом уровней Тх и НСТ - реакции нейтрофилов.

3. При снижении уровней Тх и НСТ — активности нейтрофилов у поросят с ПВС и ликвидации вирусемии рекомендуем назначать глутоксим из расчета 0,05 мкг/кг массы тела 10- кратно в течение 10 дней.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В публикациях последних лет как отечественных, так и зарубежных авторов содержатся сведения о широком распространении заболеваний, вызываемых вирусами, к числу которых относится и парвовирусная инфекция свиней (Б.Г.Орлянкин, 1986; В.А.Сергеев, Б.Г.Орлянкин,1991; О.Г.Петрова с соавт.,1995; А.А.Новых с соавт., 1996; С.М.Усов. 1998;

Многие ученые отмечают, что специфическая профилактика, особенно в условиях экологического неблагополучия, не всегда предупреждает развитие вирусной инфекции. Во многом это связано с неоднородностью животных по иммунному ответу, развитием у них поствакциналыюго стресса и другими факторами (Л.А. Ладыгина, 1985; Е.Ф.Касьяненко, С.И.Михлина, 1992; А.М.Земсков с соавт., 1994; А.Х. Аракелян с соавт., 1999 и др.).

Известно, что воздействие токсического агента реализуется через изменения функций иммунной системы. Развивающиеся при этом вторичные иммунодефицитные состояния, в свою очередь, обуславливают повышенную восприимчивость организма к вирусным и бактериальным инфекциям, развитие аллергических реакций, хронизацию воспалительных процессов (В.А.Черешнев с соавт., 1997). Поэтому тесты иммунологического анализа реально можно использовать для оценки выраженности воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды на состояние здоровья человека и животных, а также для оценки эффективности действия лекарственных препаратов.

Для коррекции иммунной системы у животных в настоящее время имеется значительный арсенал препаратов, полученных на основе животного и растительного сырья , а также созданных синтетическим путем.

В НИИ особо чистых биологически активных препаратов ( г.С.-Петербург ) синтезирован препарат глутоксим, относящийся к группе тиопоэтинов. По данным разработчиков этого препарата, он имеет высокую тропность ~ к клеткам центральных органов иммунитета и лимфоидной ткани, регулирует экскалацию редокс-состояния клеток, дифференцированно воздействует на нормальные и трансформированные клетки.

С разрешения Министерства здравоохранения Российской Федерации глутоксим прошел широкие клинические испытания в комплексной терапии иммунодефицитных состояний у людей. Получены положительные результаты при использовании глутоксима в лечении вирусных гепатитов В и С, химио- и радиотерапии в онкологии (В.Е.Жемчугов, А.Г. Румянцева, JI.A. Кожемякин, 2001 ).

С учетом данных Челябинской областной ветеринарной лаборатории по вирусным инфекциям среди свиней, а также большого процента гибели новорожденных поросят в изучаемом хозяйстве была поставлена цель — изучить эпизоотическую обстановку в колхозе им. Ленина Увельского района, провести клиническое обследование поголовья свиней , уточнить диагноз на парвовирусную инфекцию и изучить влияние глутоксима на иммунную систему супоросных свиноматок и родившихся от них поросят.

Установлено, что в хозяйстве на протяжении последних лет отмечается высокий процент яловости среди основных и разовых свиноматок, а у поросят заболеваемости и падежа. У многих свиноматок наряду со здоровым приплодом, рождаются слабые, нежизнеспособные поросята, а нередко имеют место и мумифицированные плоды.

Клинические наблюдения за больными поросятами показали, что у многих из них имеет место диарея с дегидратацией различной степени выраженности, они угнетены, а после приема молока у некоторых из них отмечали явления рвоты. В начале заболевания температура тела была повышена на 1-2 °С, а с ослаблением организма она понижалась. Слизистые оболочки и конъюнктива глаз имели синюшный оттенок, работа сердца и дыхания ослаблены. Указанные симптомы были сходны с таковыми, отмеченными рядом авторов при парвовирусной инфекции (В.А.Сергеев, Б.Г.Орлянкин,1986; P.Biront, P. Bonte, 1983).

Для постановки окончательного диагноза был использован ИФА с тест-системой для определения антигена вируса в крови супоросных свиноматок и полученных от них поросят. Результаты ИФА анализа дали положительный результат.

На первом этапе работы было изучено влияние глутоксима на состояние иммунной системы супоросных свиноматок, поскольку известно, что парвовирусная инфекция у них протекает без особо выраженных симптомов, однако вирус способен проникать через гемато-плацентарный барьер и инфицировать приплод. Одновременно необходимо было установить и возможные негативные последствия препарата в период супоросности.

Проведенные в этом направлении исследования показали, что 5-кратное ежедневное внутримышечное введение препарата в дозе 0,1 мкг/кг массы за месяц до предполагаемого опороса не вызывало каких-либо отклонений в общем состоянии свиноматок. Важно отметить и факт рождения от них живых поросят, в то время как в контроле 16% поросят родились мертвыми. Проведенные исследования по установлению обсемененности выживших поросят в подопытных группах показали, что после применения глутоксима она составила 42%, в то время как в контроле - 100%. Последующие наблюдения за поросятами в течение трех месяцев показали на их лучшую выживаемость в опытной группе, где падеж за период наблюдения составлял от 3 до 5%. В тоже время в контрольной группе он составил 28% от числа родившимися живыми поросятами.

Полученные данные позволили предположить, что положительные результаты в опыте возможно связаны с благоприятным действием глутоксима на иммунную систему супоросных свиноматок. Проведенные в этом направлении исследования подтвердили наше предположение.

Установлено, что в лейкоформуле крови у опытных свиноматок по сравнению с контрольными было несколько снижено процентное содержание эозинофилов и базофилов, увеличено количество Т-хелперов и индекса Тх/Тс. В гуморальном звене иммунитета • отмечено снижение уровней Ig А и G, комплиментарной активности и возрастание циркулирующих иммунных комплексов. Указанные изменения, на наш взгляд, возможно связаны со снижением фагоцитарной активности нейтрофилов, о чем свидетельствует низкое фагоцитарное число. Существенные изменения происходили и со стороны окислительно-восстановительного потенциала нейтрофилов крови. Под влиянием глутоксима снижается спонтанная и возрастает индуцированная НСТ-активность клеток. Отмеченный факт свидетельствует о повышении бактерие- и вирусоцидного потенциала фагоцитарных клеток, снижении воспалительной реакции и улучшении процессов регуляции иммунной системы (рис. 12).

Клеточный иммунитет

Рис. 723. Влияние глутоксима на иммунокомпетентные клетки супоросных свиноматок.

-----^ подавление активности (показателей)

-увеличение активности (показателей)

Учитывая, что у 42% поросят, в крови которых даже после применения глутоксима свиноматкам, выявлялся антиген вируса, важно было определить его влияние на иммунную систему поросят in vitro и in vivo, поскольку такие поросята служат потом источником поддержания эпизоотии, а также установить какой механизм превалирует в иммунокорригирующем эффекте у них. Поскольку у больных поросят в отличие от супоросных свиноматок имеет место фаза активного воспалительного процесса, а определение антигена вируса ИФА не всегда доступно, возникает ряд вопросов, требующих нового подхода для решения задачи по снижению их инфицированности, разработке критериев диагностики и оценке иммунотропного действия глутоксима путем соспоставления выявленных изменений в иммунной системе in vitro и in vivo.

С учетом вышесказанного была проведена следующая серия экспериментов на поросятах, у которых в крови выявляли АГ вируса. Оценка действия глутоксима на иммунокомпитентные клетки инфицированных поросят in vitro показала, что инкубация крови с глутоксимом в опыте по сравнению с контролем приводила к снижению количества лейкоцитов, причем преимущественно за счет лимфоцитов ( Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток) и в меньшей степени - моноцитов. Количество же нейтрофилов возрастало. Со стороны гуморального звена иммунитета отмечено снижение В-лимфоцитов, при некотором росте Ig G и падении комплиментарной активности, а в фагоцитарном звене — снижение как спонтанной, так индуцированной НСТ-реакции.

Полученные данные поставили перед нами следующий вопрос - осуществляет ли глутоксим подобное действие после его применения in vivo? Для этого опытным поросятам внутримышечно один раз в сутки вводили глутоксим в дозе 0,05 мкг/ кг массы в течение 10 дней. За животными в течение 3 месяцев вели наблюдения, оценивали их общее состояние, учитывали летальность, прирост живой массы, наличие АГ вируса в крови и изменения со стороны иммунной системы.

Исследования показали, что введение глутоксима снижало клиническое проявление болезни (исчезала диарея, улучшалось общее состояние), предотвращало их гибель. Так, если в контроле за период наблюдения у 40% поросят проявлялись признаки 1 энтерита, а падеж составил 16%, то в опытной группе он колебался в отдельные месяцы от 3 до 5%. В крови у опытных поросят выявляемость АГ вируса резко снижалась. Прирост живой массы у них по сравнению с контролем превысил в два раза.

Проведенные иммунологические исследования показали, что после проведенного курса лечения глутоксимом у опытных поросят по сравнению с контрольными отмечено выраженное снижение количества Т-хелперов и индекса Тх/Тс (за счет снижении Т-цитоксических клеток). В гуморальном звене иммунной системы в отличие от показателей in vitro шло более выраженное падение ЦИК и повышение активности фрагментов комплимента. В фагоцитарном звене также имели место некоторые отличия: в большей степени снижались спонтанная, индуцированная и лизосомальная НСТ-реактивность фагоцитов.

Таким образом, в действии глутоксима как in vitro, так и in vivo просматривается ряд схожих черт и ряд явных отличий. На наш взгляд, в условиях in vitro глутоксим действует кратковременно и в основном подавляет лимфоцитарное звено и частично -фагоцитарное. В результате происходит снижение активности гуморального звена иммунной системы и, в целом,

90 достигается депрессивный эффект, связанный по-видимому с регуляцией редокс-системы (рис.13).

Клеточный иммунитет

Рис, Влияние глутоксима на активность иммунокомпетентных клеток in vitro

-----подавление активности (показателей)

-увеличение активности (показателей)

В условиях организма, по нашему мнению, под влиянием глутоксима идет активный процесс ухода инфицированных клеток в апоптоз (программируемая гибель) и взамен им поступление неинфицированных клеток из костно-мозгового депо, тимуса и других органов кроветворения, чего не может произойти за час инкубации крови с глутоксимом in vitro. Об элиминации вируса из крови под влиянием глутоксима косвенно можно судить и по снижению уровней ЦИК и активации системы комплимента.

Одновременно следует отметить и тот факт, что как ин витро, так ин виво под влиянием глутоксима идет снижение активности клеточного звена иммунной системы,что свидетельствует об нормализации воспалительного процесса. Об этом также можно судить и по снижению процента вирусемии и летальности у поросят. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что глутоксим ведет себя in vitro и in vivo как истинный иммуномодулятор. При повышении показателей иммунной системы он их снижает и, наоборот, при их снижении — повышает.

Кроме полученных данных о механизмах действия глутоксима in vitro и in vivo, просматривается и еще один факт, а именно, об однотипности действия глутоксима на Тх и НСТ-реакции нейтрофилов. На наш взгляд, эти иммунологические параметры могут служить критериями для назначения глутоксима после оценки его in vitro , для лечения животных с парвовирусной инфекцией. Тесты оценки количества Т-хелперов и НСТ-активности нейтрофилов просты в исполнении и доступны в обычной ветеринарной лаборатории, так как для их выполнения требуются только термостат, центрифуга и обычный световой микроскоп.

Таким образом, проведенные исследования в целом позволили выявить клиническую и иммунологическую эффективность глутоксима и разработать дополнительные иммунологические критерии для его назначения поросятам с парвовирусной инфекцией.