Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммуноферментный метод диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц

россш1сяая акадения сельскохозяйственных наук

р р ^ КЕЖРрДйОНАЛЬНЫИ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ЦЕНТР "ПЛЕМПТИПА*

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ / 11 л г п .го' АХАДЕНИЯ ВЕТЕРИНАРНОИ МЕДИЦИНЫ

/ ч СЕН 158э

На правах рукописи

УДК 619:576.807.7/858:636.5

КОТЛЛР ПАВЕЛ ЮРЬЕВИЧ

Ш-ШКЯЕРШГГНЫа йетоя диагностики ИНФЕКЦИОННОГО /1ЛРИНГ0ТРАХЕИТА птизх

16.00.03 - ветеринарная микробиология. вирусология.

эпизоотология. микология и иммунология

автореферат диссертации ка соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург 1995

Работа выполнена во всероссийском научно-иссяедовательскон ветеринарном институте птипеводства (ВНИВИП).

Научные руководители: Доктор ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент Россельхозакадемии Р. Н. Коровин;

Доктор ветеринарных наук, профессор I в. в. Налэтдко [

Официальные оппоненты; Доктор ветеринарных наук.

старший научный сотрудник а. с. Алиев кандидат ветеринарных наук, доцент П. ф. Сонии

Ведущая организация - Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

зашита состоится ¿Щшь^жг'Г 19Э5 г. в часов на заседании диссертационного совета Д. 1£0.20. ог при Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины по адресу. 1960081. г. Санкт-Петербург, уд. черниговская. 5

I

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке санкт-Петербургской государстзенной^шгаденвд ветеринарной медицины.

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук.

доцент " Узюмова о. в.

- 3 -

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность дроблены, своевременная диагностика й профилактика болезней обеспечивает возможность интенсивного развития промышленного птицеводства и значительно снижает экономический ушерб, в случае возникновения заболеваний.

Наибольшую потенциальную опасность для птицеводства представляют вирусные болезни, к числу которых относится инфекционный ларинготракеит птиц (ИЛТ).

Эта болезнь часто протекает атипично, в ассоциации с другими инфекционными заболеваниями (Малушко в.в.. 1962: Коровин Р.Н.. Зеленский в. П.. Гроше ва г. А.. 1989; сюрин в. м. и др. , 1991). что значительно затрудняет ее своевременную диагностику.

В настояшее-время диагностика инфекционного ларинготрахеита птиц в нашей стране основана на применении серологических методов - реакций нейтрализации и непрямой гемагглютинапии, эффективность которых не отвечает требованиям промышленного птицеводства из-за значительной трудоемкости или недостаточной чувствительности. Поэтому усовершенствование, разработка и внедрение высокочувствительных и специфичных методов экспресс-диагностики ИЛТ согласуется с запросами промышленного птицеводства, имеет научное и практическое значение.

По данным отечественных и зарубежных исследователей одним из наиболее эффективных методов диагностики вирусных болезней животных и птиц, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью является иммуноферментный анализ (ИФА), в частности твердофазный - ELISA (Джавадов Э. Д, и др,, 1988; BlocK J., 1988; Аб-дукалыкова С. т. и др., 1989; Сергеев В. Д. и др., 1990; Fenzes Z. , Heszaros J., 199Е; Тышенко и.п.. 1993; гулямов Н.К., 1995).

Цель.и задачи работы. Целью наших исследований явились разработка и испытание метода иммуноферментного анализа для серологической диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц, в соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

- разработать методику получения и контроля специфических компонентов для иммуноферментного анализа;

- экспериментально обосновать и отработать методику постановки ИФА для выявления антител к вирусу илт птип;

- изучить диагностическую ценность иммуноферментного анализа в сравнении с реакцией непрямой гемагглютинации;

- ц -

- испытать ИФА для диагностики илт в лабораторных и произ

• - i .

ВОДСТЕеННЫХ УСЛОВИЯХ.

Научная новизна. Для серологической диагноста ки инфекционного ларинготрахеита разработана и испытана иммуно ферментная тест-система с использованием отечественных црепара тов и реактивов. Впервые предложена технология очистки вируса и Фекционного ларинготрахеита птиц на основе гель-Фильтрационноп метода. Отработана методика постановки ИФА для выявления вирус специфических антител, изучена динамика накопления антител к ви русу илт в сыворотках крови экспериментально зараженных и вакци нированных цыплят. Впервые дана сравнительная оценка неш>ямог< варианта ИФА и реакции непрямой гемагглютинааии при диагностик! данной инфекции. Установлена высокая чувствительность и спепифи1 ность ИФА при выявлении антител к вирусу инфекционного ларинго трахеита птиц.

Практическая ценность работы. На основа нии проведенных исследований разработана иммуноферментная тест систеиа. обеспечивавшая ранимо серологическую диагностику инфек шхонного ларинготрахеита птиц.

Разработаны и одобрены Ученым советом БНИВИП "Методически! рекомендации по ретроспективной диагностике инфекционного ларин готрахеита птиц иммуноферментным методом" (протокол нб от 26,06, 1995). Установлена высокая чувствительность и специфичность ме тода ИФА, обеспечивашего возможность проведения массовых диаг ностических исследований.

Материалы исследований используются в учебном процессе н. курсах повышения квалификации ветеринарных врачей и в диагноста ческом центре внивип.

Апробация работы. Разработанная иммунофермен-ная тест-система выявления антител к вирусу илт птиц прошла ко миссионные испытания во внивип (протокол н ю от 10. ов. 93) i апробацию на птицефабриках России (акты от 31.08.93 и 18.03.94).

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобР! ны на: заседаниях Нетодического совета отдела вирусологии и Ученого совета ВНИВИП (1989-1994 гг.); XXXII всесоюзной конференцм молодых ученых и аспирантов по птицеводству (г. Загорск.. 1989); всесоюзной научно-производственной конференции "Комплексная сис тема ветеринарных мероприятий в птицеводстве - резерв повышена

эффективности птицеводства» (г.Ленинград, 1989); межрегиональном научно-производственном координационном совещании "Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве" (г. Петрозаводск, 1994).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в ю печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на -ÍQO страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследовании, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложение. Работа иллюстрирована 14 таблицами. 14 рисунками, 3 фотографиями. Список литературы включает 293 наименования работ, в том числе 165 зарубежных.

г. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 1988 по 1994 гг. в отделе вирусологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства и птицеводческих хозяйствах страны.

В опытах использованы штаммы вируса ИЛТ птиц: вакцинные -"ВНИИБП", "ЛТ-Айвакс" (США). "Интервет" (Голландия), "СА-2" (Австралия) и патогенный - "24а".

При выборе биологической системы, обеспечивающей получение высокоактивного вируса ИЛТ, были использованы первично-трипсини-зированные культуры клеток Фибробластов и почек эмбрионов кур, перевиваемые линии клеток почечной ткани эмбриона свиньи - СПЭВ, обезьяны - Vero, хомячка - ВНК-21 (Институт цитологии, г. Санкт-Петербург) и развивающиеся эмбрионы кур 9-10-суточной инкубации (РЭК).

В опытах по получению отрицательных и гипериммунных сывороток использовались СПФ-цыляята 14-45-суточного возраста. Динамику накопления вирусспецифических антител изучали на цыплятах 30-суточного возраста породы белый леггорн кросса 288, В контроле использовали иммунные сыворотки крови к гетерологичным вирусам болезней кур (ньюкаслскоя болезни, болезни Марека, инфекционного бронхита, инфекционной бурсальной болезни, ССЯ-76. гриппа ( Ай/ 315) и лейкоза птиц) и нормальные - отрицательные сыворотки от здоровой птипы.

- б -

Испытание разработанного иммуноферментного метода проводили в лабораторных и производственных условиях, исследуя более 3-х тысяч проб сывороток крови от птиды разного возраста, из птицехо-; зяйств восьми областей России.

Первично-трипсинизированные культуры клеток готовили и культивировали в соответствии с "Нетодическими рекомендациями по работе с клеточными культурами птиц" (внивип. 1986). при культивировании перевиваемой линии клеток спэв в ростовой среде использовали ю-процентное содержание сыворотки крови северных оленей (Щелковский биокомбинат).

заражение РЭК вирусом ИЛТ в хориоаллантоисную полость (ШП и на хориоаллантоисную оболочку (ХАО) проводили по общепринятым методам. Наличие вируса изучали по характерным очагам поражения на ХАО. Титр инфекционной активности расчитывали по Риду и Менчу.

Концентрирование вируса илт проводили методом ультраФильтрации на ультрафильтрационных ячейках типа ФМ-ог. Для гель-Фильтрационной очистки вируса И/ГГ использовали колонки, заполненные макропористым стеклом М1С-1гоо-гх и ипс-гооо-вгх. количество белка в пробах определяли по методу Ьомгг О. Н. ег а1. (1951).

Стерильность вируссодержащего материала, сывороток проверяли по ГОСТ 26065-69.

Реакиив непрямой гемагглютинагаи (РИГА) проводили согласно методике постановки с эритроцитарными диагностикумами (ИЭ КВН УААН, Украина).

Реакцию нейтрализации проводили по ГОСТ 25582-83.

Непрямой вариант твердофазного ифа проводили с использованием антивидового имиунопероксидазного коньюгата - меченные перок-сидазой антикуриные 1вс кролика - изготовленного в Лен. ниивс, инструментальную оценку результатов ифа проводили на компораторе. оптическом микропроцессорном К0МП-01 ( НПО "Красногвардеец", г. Санкт-Петербург).

Статистическую обработку проводили по методам, изложенным в руководстве Кудрина а, Н. и Пономаревой г. т. (1967).

г. г. получение специфических компонентов для ифа 2.2. 1. Получение вируссодержащего материала и гипериммунных сывороток

Для получения специфического антигена проводили выбор биоло-

отеской системы, обеспечивавшей получение высокоактивного виру-î илт птиц. Использовали культуры клеток различного происхожде-ия и развивающиеся эмбрионы кур.

Исследования показали, что наиболее выраженной инфекционной ктивностью в культуре клеток обладает штамм "/ГГ-Айвакс". Цито-етическое действие вируса ИЛТ отмечается через 72-96 часов пос-ь заражения. Специфичность цитопатического действия подтвержда-и в реакции нейтрализации со специфическими сыаороткаии крови ур. Однако. - низкая инфекционная активность вируса И/ГГ птиа 3,71*.о, 07 le тцд^д/мл). снижавшаяся при дальнейшем пассирова-ии, свидетельствует о невысокой степени адаптации вируса к куль-уре клеток, независимо от их происхождения.

При использовании РЭК для получения вирусного материала, читывали максимальное накопление вируса, а также влияние усло-ий и сроков хранения на его активность. Для определения инфек-ионной активности вируса И/гг птиц штамма "ВНИИОТ" в ХАО и в ви-уссодержашей аллантоисной жидкости (ВАХ). десятикратное разве-ение готовили исходя из Веса ХАО (вес/обьеи) и количества BAS.

Установлено, что разница титров вируса И/ГГ птиц в ХАО и в АХ в среднем состевляет 2.08*_0.27 le ЭИД50/мл. при высокой остоверной значимости Р<0,01. В среднем инфекционная активность ируса И/1Т в хао составила б, б7»_о, 21 le эид5с,/мл, с колебаниен ,20-7,06 ig эид50/нл. Инфекционная активность вируса в BAS начительно ниже и в среднем составляет 4,59^.0,20 1к эид5£)/мл. колебанием 4,36-5.20 18 ЭИД55/мл.

Для облегчения подсчета очагов поражения вируса ИЛТ птид на АО. наии разработана методика, в основе которой лежит тот Факт, то частица вирусной взвеси размножается в месте адсорбции на увствительной биологической системе,'' вызывая характерные, видные невооруженным глазом повреждения. С этой целью кы делили ко-иоаллантоисную оболочку на участок ограниченный пугой и - прн-егяюпий к скорлуповоя оболочке. Установлено, что заражение рэк таимом "ВНИИБП' вируса ИЛТ птиц в ХАП обуславливает образование тдельных очагов поражения по всей ХАО. 25 процентов которых рас-одагается яа участке ограниченной пугой. При этом различие межу количеством вируса на всей ХАО и на участке ограниченном пу-ой составляет О, 51 »_о, 03 le ООЕ/мл и может использоваться как ер<;расчетная величина для определения количества вируса подсче-

- в -

тон очагов поражения на ХЛО.

Изучая условия и сроки хранения вируссодержаиег© материала установлено, что при хранении влх при 4-6°С в течение б суток инфекционная активность штамма "ВНИИБП" снижается с 5.13*_0. от до 5.42*_0.05 эид50/мл. После интенсивного спада, установившийся уровень инфекционной активности сохранялся в течение 30 суток, плавно снижался к 90 суткам (срок наблюдения) и составил 2. П+. 0.27 1« ЭИД50/мл. Аналогичные Результаты получены в экспериментах с вирусом илг птиц из осветленного гомогената ХАО. Пробы ВАХ и гомогената пораженных ХАО.. хранившиеся при температуре - 25-зо' в течекие указанного срока сохраняли исходную инфекционную активность вируса ИЛТ птиц.

Таким образом, проведенные исследования позволили выбрать в качестве биологической системы, обеспечивавшая получение высоко-активного вируса И/ГГ птии (до т,oe ig эид50/мл>, развивающиеся эмбрионы КУР.

Для получения специфической сыворотки крови к вирусу ИЛТ птиц, исполы/еиоя в качестве положительного контроля в ИФА. проводили гиперинмунизапию СПФ-пыплят 14-суточвого возраста, по схе не. разработанной а отделе вирусологии ВНИВИП. методом аппликации на хоньюнктиву цыпленка наносили по 0.025 мл штамма "ВНИИБП" вируса ИЛТ птиц в следующих дозах: в первые сутки - в один глаз «ООО ЭИД50; на вторые - в другой глаз - зооо ЭИД50; на третьи сутки - в оба глаза по 1000 ЭИД50. на 7-е сутки интратрахеально вводили по о. 2 мл штамма "24а* в дозе »ООО JUIjq, через 15 суток после последнего введения вируса, от цыплят получали сыворотку крови, нормальную сыворотку крови, используемую в качестве отрицательного контроля в ИФА. получали от СПФ-щшлят 14-45-суточно-го возраста. Контроль специфичности проводили исследованием полу ченных сывороток на антитела к вирусам ИЛГ. инфекционной бурсаль ной болезни, инфекционного бронхита, ныжаслской болезни. сся-Тб болезни Марека, гриппа (А 6/315) ,и лейкоза птии.

в результате исследований установлено, что полученная гипег иммунная сыворотка к вирусу ИЛТ птиц является активной и специфичной. Индекс нейтрализации гипериммуннои сыворотки составил 4,36 1» . титр вирусспепиФических антител в РИГА - 1:51г. в ИФА 1:12600. В полученной нормальной сыворотке СПФ-цыплят не выявлено антител на исследуемые вирусные инфекции.

Для лиоФилизапки сывороток, в качестве наполнителя исполь-овали 3.75* сахарозы и О, 5у. бычьего сывороточного альбунина. становлено. что лиоФилизированные гипериммунные сыворотки со-раняют исходную активность при 4-6° с в течение года (срок наблю-ения).

г. г. 2. Получение очищенного антигена на основе гель-Фильтрационной хроматографии

Ряд исследователей (Алиев А. С. . 1981; Сергеев В. Д. ■ Рождест-енский И. к., 1964) для получения очишенных препаратов вирусов олезней птиц использовали нетод гель-Фильтрапионной хронатогра-ии на макропористой стекле, отсутствие данных об использовании того нетода для очистки вируса И/1Т птип. явилось необходимостью эучения возможности его применения.

При гель-Фильтрационной хроматографии вируса ИЛТ птиц через еиодифипированные макропористые стекла, наблюдали значительные орбционные потери, которые не устранялись при изненекии рН и онной силы элюента. Установлено, что макропористое стекло (МПС) разным диаметром пор. модифицированное поливинилпирролидонон НПС-1200-ГХ-ПВП и МПС-2000-ВГХ-ПВП) пригодно для очистки и ПРе-отврашает сорбииониые потери вируса ИЛТ птиц.

Эффективность процесса гель-Фильтрационной очистки вируса /ГГ птиц изучали в зависимости от объема исходной пробы и высоты :олонки. Установлено, что оптимальным режимом является; объен читаемой пробы 1.0 мл и высота колонки 80 см, при скорости по-ачи буфера 0,7 нл/смг/мин. Адсорбаия вирионов на поверхности но-ителя не зависит от типа буфера, так как выход вируса из колон-:и был одинаковым с разными буферными растворами. Определяющую ■оль при этом играют значения рН и ионной силы. Установлено, что >ез потерь очистка вируса ИЛТ птиц осуществляется при использовали элюента с рн 7,6 и о,5 И содержанием хлорида натрия.

При изучении условий гель-Фильтрационной хронатографии для ¡таммов "ВНИИБП" и "21а" установлено, что штаммовые различия ви->уса не влияют на процесс очистки.

Условия для проведения гель-Фильтрационной хроматографии сконцентрированного вируссодержашего материала оказались пригод-[ымн для концентрированного, что весьма важно для получения высо-соактивного очишенного антигена.

Концентрирование вируссодержашего материала методом ультра Фильтрации через мембраны диаметром пор во ни. позволило получит обьем в ю-20 раз меньше исходного. При этом инФекдионяая активность вируса повышалась на 0,5-1.0 1в эид50/ил. а содержание бел ка увеличивалось в среднем с 6, Об до б1,0*_0,84 мг/мл.

При проверке активно с-.-и и специфичности очишенного вируса илт в Ифа установлено, что он имеет антигенную активность 8,б и вступает в иммунологическую реакцию с сыворотками, содержащими антитела к вирусу ИЛТ. Степень очистки вируса от белковых примс-сей составила 94, ех. что соответствовало 3, г»_ 0,2 мг/нл.

При соблюдении разработанных условий гель-хроматографичес-кий профиль очистки вируса ИЛТ птиц характеризуется двумя пикам? первым - малым и вторым - большим. Наличие вируса отмечается тол ко во фракциях первого пика, который является вирусным, а вторе пик. значительно по размерам превышающий первый и содержащий бе лок примесей - примесным.

2. з. Отработка нетодики постановки ифа для выявления

антител к вирусу илт птии отработка методики сводилась к созданию иммуноферментно{ тест-системы на основе непрямого варианта твердофазного ифа, обеспечивающей выявление антител к вирусу илт и включала подбо! основных параметров проведения реакции.

При выборе оптимальной конаентрапии сорбируемого очишенног< вируса ИЛТ (антигена) учитывали отношение оптической плотносп (0ДЧ5д) положительного контроля (р) к величине ОД^отрипательно-го контроля (К)i используя различные конаентрапии антигена, ста] дартное разведение положительной и отрицательной сывороток 1:10( и рабочее разведение антивидобого иннунопероксидазного конъюгат« 1:21. Значение 0ДЧ50 в лунках с положительной сывороткой достиг« ет максимума при конаентрапии антигена ю нкг/мл и составляв' 1.0. Экстинкгжя продукта пероксидаэной реакции при конпентрашп антигена 12,5 -15,0 мкг/ил, также равна 1,0. Однако, при увели чении концентрации антигена более 10.0 мкг/мл увеличивается зна ченйе одотрицательного контроля, что приводит к уменьшена значения Р/К. Установлено, что адсорбированный антиген в конаен трапии 10.0 мкг/мл обеспечивает максимальную экстинкаию положи тельноа сыворотки (ОДЧ50 : 1,01 при допустимом : значении Фон.

- И -

<0Дч50 =0.1), Имеющаяся разница зна!ений ОД^д0 при ляализе положительной и отрицательной сывороток указывает, что концентрация антигена ю.о мкг/нл является оптимальной при проведении ИФА для выявления антител к вирусу ИЛТ птиц.

Выбор оптимального значения рН буферного раствора для адсорбции антигена на полистироловых планшетах проводили используя буферные растворы с рН 4.4; т. з; д. б; И.о. при этом было установлено, что интенсивность реакции достигает максимума при рН 7.3.

При изучении температуры и времени адсорбции антигена установлено, что насыщение поверхности лунок полистироловых планшетов наступает при 37°С через 2 часа, при го"с - через 4 часа, а при 4еС - через 16 часов. По результатам многократного титрования контрольных и испытуемых сывороток отмечали совпадение средних значений экстинкпии и титров при использовании полистироловых планшетов отечественного сленмедполимер", г. Санкт-Петербург; "БНИИмедполимер". г. Москва) и зарубежного (1ЛпЪго/ТИеггеК, США) производства.

Исследованием стартовых разведений сывороток яани установлено . что при постановке непрямого варианта ИФа для выявления антител к вирусу Л/1Т птиц контрольные и испытуемые сыворотки необходимо исследовать начиная с разведения 1:100. так как при меньшем разведении возрастает значение ОД^ отрицательного контроля. что обуславливает получение ложноположительных результатов

При выборе времени инкубации сывороток и коньюгат-т -¡«ли изучены следующие периоды: 15. 30. 60 минут при температуре 37°с. На основании полученных результатов Установлено, что оптимальное время инкубации составило 30 минут.

При -определении оптимального значения рН буферного раствора для проведения ИФА испытывали 0.01 Н фосфатно-буферный раствор с содержанием о. 13 н хлориданатрия и 0,05* твкна-во (фврт) с рН 7,01 7.3; 7,6; 8.0. Установлено, что для разведения контрольных и испытуемых сывороток, антивидового иммунопероксидазного конъю-гата и промывки необводимо использовать фбрт с рН 7,3, ори которой обеспечивается наибольшее значение р/н=!0,0 при достаточно низком Фоне.

На заключительном этапе проведения ИФА в качестве субстрата использовали 3-амнносалициловую кислоту рН 6.0 п присустствин 0.005* нго4. для выбора оптимального времени проведения субстрат-

ной Реакции определяли значение Ойщ0 в положительной и отрицательном контроля« через 20. 30. 40. 50 кинут. Установлено опти-нальное время проведения субстратной реакции - зо минут.

при визуальном учете результатов анализа первоначально оценивали контроли: положительный контроль - содержимое лунок должно иметь интенсивное коричневое окрашивание; отрицательный контроль. контроля растворов коньюгата и субстрата - содержиное лунок должно быть бесцветным или иметь бледно-соломенную окраску. Это дает основание считать, что компоненты отвечает требованиям и можно приступать к учету реакции с пробами испытуемых сывороток, опенку которых проводили по 4-х крестовой системе: интенсивная коричневая окраска - ♦♦♦♦ коричневая окраска - ♦ ♦♦

светло-коричневая окраска - ♦ ♦ желтая окраска - ♦

окрашивание отсутсвует

За титр антител к вирусу илт принимали'максимальное разведение исследуемой сыворотки, которое обеспечивает окраску продукта Ферментативной реакции на и в 2.1 раза превышает зкетинк-дию раствора в луиках с отрицательным контролем.

Исследованиями отрицательных, специфических к вирусу ИЛТ и гетерологичных сывороток крови кур была подтверждена высокая специфичность разработанной имнуноферментной тест-системы, показывавшей положительные результаты наличия"антител в специфических к вирусу ИЛТ сыворотках.

Таким образом, для постановки непрямого варианта твердофазного ИФА использует планшет, в лунках которого адсорбирован очищенный антиген вируса ИЛТ птиц. Объем вносимых компонентов на этапах постановки ИФА составляет О.1 мл в лунку, промывки - 0.2 мл в лунку. В соответствующие для каждого компонента лунки планшета вносят отрицательную, положительную, исследуемые сыворотки крови и ФБРТ (для последующего контроля коньюгата и субстрата) в установленных разведениях и концентрациях, и термостатиРУют при 37 °С в течение 30 минут.

Лунки планшета освобождают от содержимого и промывают. В лунки вносят антивидовой иммунопероксидазный коньюгат и ФЕРТ (для контроля субстрата). Выдерживают 30 минут при 37°С и вновь освобождают от содержимого и промывают. Во все лунки вносят субстрат.

выдерживает в теином месте при комнатной температуре 30 минут и Производят учет результатов ИФА.

г. Испытание имкунофериентного метода для диагностики ИЛТ птиц

для изучения накопления специфических антител к вирусу илт сипи сформированы три группы цыплят ЗО-суточного возраста, по 50 голов в каждой. Сыворотки цыплят перед опытом были исследованы на наличие антител к вирусу илт в ифа и рнга.

Цыплят первой группы заражали интратрахеально штаммом "24а" вируса илт в объеме 0.2 нл. содержащем 1000 ИД50. Клиническое проявление заболевания у экспериментально зараженных цыплят отмечено на третьи сутки опыта и характеризовалось угнетением, взъе-рошенно.тьо. отказом от корма, затруднением дыхания с приоткры-ванием клюва и вытягиванием шей при вдохе, на пятые сутки опыта падеж составил 10 Я

Цыплят второй группы вакцинировали методом аппликации на конъюнктиву штаммом "вниищ* вируса илт птиц в объеме 0,05 мл, содержащем 1000 зиДдд.

Цыплята в третьей группе служили в качестве контроля.

динамику накопления антител к вирусу ИЛТ в сыворотке крови изучали через 3. т и в дальнейшем через каждые 7 суток в течение 7 недель в ИФА и РНГА. Результаты опыта приведены в таблице 1.

Исследования показали, что нарастание титра антител к вирусу ИЛТ происходит у цыплят до 3-х недель после заражения и вакцинации, а затеи титр антител сохраняется на одной уровне до 7-и недель (срок наблюдения). Кетовом ИФА антитела к вирусу ИЛТ выявлялись на 7-е. а а РНГА - на 14-е сутки, в 100у. случаев. Коэффициент корреляции обоих методов составил 0.631 при Р<0.01. Высокая чувствительность метода ИФА подтверждается.также отношениями СГТ. которые в среднем в бб раз выше, чем в РНГА. При исследовании сывороток контрольной группы, антитела к вирусу ИЛТ не выявлялись.

Для сравнительной опенки ифа и рнга исследовали сыворотки крови На птицефабрике "Скворилы* ленинградской области, проводя-шей трехкратную аэрозольную иммунизацию птицы против илт вирус-

вакииноп из штамма "внииеп", в возрасте 33. то и 90 суток. Обратные величины среднегеометрического титра антител к вирусу илт в

- in .

Таблица i

Результата исследований в ИФА и РИГА сывороток крови экспериментально зараженных и вакцинированных цыплят вирусом ИЛТ

СУТКИ ИФА РИГА

иссле- зараженных вакииниров. зараженных вакшширов.

дования -------------------------------------------------------

пр сгт ш> сгт пр сгт пр сгт

3

т 100 170 100 100 - - - -

14 too 197 0 100 9в0 100 29. 9 100 14. i

21 100 4220 100 21 iO 100 бв. б 100 32. 0

гв 100 4160 100 1970 100 64. 0 100 29. 9

35-49 100 4200 100 2040 100 66. 3 100 31. 0

Примечание: ПР - количество положительно реагирующих проб U);

СГТ - обратная величина среднегеометрического титра антител: - антитела к вирусу ИЛТ не выявлены, сыворотках крови и процент положительно реагирующих про с с r.ovi-вили в ИФА и РИГА соответственно:

- за семь суток до вакцинации 167.5 в во х и 13. s в бо у.;

- за одни сутки до вакцинации 100,0 в бо * и 6.о в 40

- через ю суток после первой вакцинации 330.0 к it.4 u tоок;

- через 14 суток после второй вакцинации 690.0 в юох и ib.o в 80*:

- через го суток после третьей вакцинации гт40-0 и 5г. в о 100*.'

- через гю суток после третьей вакцинации 1330.0 и 26. в в юох.

Из изложенного иожно сделать вывод, что к началу вакцинам« уровень антител к вирусу илт в сыворотках крови цыплят снижался, а после иммунизации постепенно увеличивался и его максимум отмечали после третьей вакцинации. По показателям обратных величин СГТ антител к вирусу ИЛТ птиц и проценту пояолителы: > реагирующих проб можно сделать вывод, что ИФА по чувствительности гкач«-

тельно превосходит РИГА.

Для серологической диагностики инфекционного ларинготрахеи-та птиц нани были исследованы "сыворотки крови кур из птицехо-зяйств, благополучных по ИЛТ, где наблюдалось увеличение падежа и снижение продуктивности птицы, результаты этих исследований представлены в таблице 2.

Из данных таблицы г видно, что в обследованных птицехозяй-ствах регистрируется высокий уровень положительно реагирующих птиц к вирусу илт в ИФА. СГТ и процент положительно реагирующих проб в ИФА значительно превосходят эти показатели в РИГА. Вирусологическими исследованиями патологического материала, постудившего из птидехозяйств, выделен вирус ИЛТ тггид.

Таким образом, разработанная нами иммуноФерментная тест-система позволяет достоверно и быстро проводить раннюю серологическую диагностику илт птиц в лабораторных и производственных условиях, обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

таблица 2.

Результаты серологической диагностики ИЛТ в птидехозяйствах

МН Наименование областей (краев) ИФА РИГА

пп и птицехозяйств пр сгт пр сгт

1 2 3 4 5 6

1. Мурманская обл. Полярная звезда Снежная

2. Курская обл. Краснополянская Фатежский

3. Владимирская обл. Центральная

4. Московская обл. Красногорская Смена

5. Черкасская обл. Первое мая

100 3940 76, 7 48, 5 100 4530 100 68*6

100 2990 62.5 45.3

96.7 3430 73.3 55, 7

100 3680 86,7 59,7

100 4850 93,3 73,5

1 г ..■!., з 4 5 б

б. Ставропольский край Обильненский

Т. свердловская обл. свердловский

в. Новосибирская обл. лебедевская

Примечание - как в таблице 1.

ВЫВОДЫ

1. Разработана иммуноферментная тест-система на основе непрямого твердофазного метода ИФА для ретроспективной диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц, включающая специфический очищенный вирусный антиген, специфическую иммунную (положительную) и отрицательную сыворотки крови.

г. при культивировании в развивающихся эмбрионах кур вирус ИЛТ накапливается преимущественно в .хориоаллантоисной оболочке (б,го-т.ов 1в эид50/мл). инфекционный титр вируса в аллантоисной жидкости составляет 4. 36-5. го гя эид50/мл.

3. Метод ультрафильтрации обеспечивает возможность концентрирования вируса ИЛТ птиц в Ю-го раз. Гель-Фильтрационная очистка концентрата вируса на колонке макропористого стекла позволяет получить высокоактивный антиген, свободный от белковых примесей' не менее чем на 90х.

4. Схема гипериммунизации цыплят, основанная на аппликации штамма "ВНИИБП" на конъюнктиву и интратрахеальном введении штамма "г4а". позволяет получать высокоактивные (1:1гв00 в ИФА). специфические сыворотки крови к вирусу ИЛТ птиц.

5. Установлена высокая активность, специфичность и стабильность иммуноспепиФических компонентов для ИФА. Лиофилизированные компоненты диагностического набора сохраняют активность в течение 1 года при 4-6°с (срок наблюдения).

6. Оптимальными параметрами проведения ИФА при ИЛТ являются: адсорбция очищенного антигена в концентрации 10 нкг/мл при 4° С

- 17 -

о °

в течение 16 часов, при 20 С в течение 4 часов или при 37 С - 2

часа; инкубация сывороток, коньюгата при 37°С и проведение субстратной реакции в течение 30 минут; использование для разведения сывороток, коньюгата и промывки 0,01 Н ФосФатно-буферного раствора с содержанием 0,15 М хлорида натрия и 0.05У. твина-80 <рн 7,3).

7. Метод ИФА диагностики ИЛТ по сравнению с РНГА позволяет выявлять антитела на 7-е сутки после инфицирования, максимальный уровень которых отмечается на 21 сутки. Результатом наличия антител к вирусу ИЛТ птиц в непрямом варианте ИФА следует считать положительную реакцию исследуемой сыворотки с разведения 1:100. Титр антител в ИФА в среднем в 66 раз выше, чей в РНГА.

8. Проведенные испытания ИФА в экспериментальных и производственных условиях показали, что он обладает высокой чувствительностью, специфичностью, позволяет достоверно и быстро проводить серологическую диагностику ИЛТ птип, подтверждаемую выделением вируса из патологического, материала.

■ ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ На основании проведенных исследований разработаны и предложены для практического использования:

1. технология очистки вируса ИЛТ птиц на основе гель-Фильтрационной хроматографии.

£. схема получения гипериммунных сывороток крови к вирусу ИЛТ птиц.

3. "Методические рекомендации по ретроспективной диагностике инфекционного ларинготрахеита птиц иммуноферментным методом" (одобрены Ученым советом ВНИВИП, протокол Н б от 2В.ОЪ. 95).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Котляр П. Ю. , Сковородкин В. А. Получение антисыворотки к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц // Тез. докл. Всесоюз. конФ. молод, учен, и аспирантов по птицеводству / Загорск. - 1989. -С. 93-94.

2. сковородкин в. а. . котляр п. ю. к вопросу о культивировании вируса инфекционного ларинготрахеита птиц в культуре клеток // Тез. докл. всесоюз. науч. -произв. конФ, ; комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве - резерв повышения эффективности птицеводства / Л. - 1989. - С. 50.

3. Котляр п. Ю., сковородкин В. А. влияние метода заражения развивающихся эмбрионов кур на показатели биологической активности вирус вакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц // Там же. - С. 52-53.

4. сковородкин в. А.. котляр п. ю., комиссаров К. П. Культивирование перевиваемых линий клеток с использованием сыворотки крови северных оленей // Там же. - С. 55-56.

5. Котляр п. Ю,, Сергеев в. д.. Налушко В. в. ИммуноФерментная тест-система для выявления антител к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц // инф. листок / даг. цнти. - 1993. - н 116-93. -з с.

6. Котляр п. К>. Получение отрицательной и специфической сывороток крови кур к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц // Тез. докл. межрег. науч. -произв. координ. совещания: Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве / Петрозаводск - Санкт-Петербург - Ломоносов.- 1994.- с.4-5.

Т. Котляр П. ю. Локализация вируса инфекционного ларинготрахеита птиц при накоплении вирусного материала в эмбрионах кур. условия и сроки его хранения // Там же. - с. 5-6.

в. Котляр П. ю.. Сергеев в. д. очистка вируса инфекционного ларинготрахеита птиц нетодом гель-Фильтрационной хроматографии на макропористом стекле // Там же. - с. 10-11.

9. Котляр П. ю., Сергеев в. Д.. Налушко в. В. Непрямой твердоФазный иммуноФерментный анализ для выявления антител к вирусу инфекционного ларинготрахеита птиц // там же. - С. 11-12.

10. Котляр П. ю. Теоретические и практические основы определения количества биологически активного вируса инфекционного ларинготрахеита птиц подсчетом очагов на хориоаллантоисной оболочке (в печати).