Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммуноферментный метод диагностики энтеровирусных гастроэнтеритов свиней

РГ8 OA

Í з (¡ЮН 1935

НАЦЮНЛЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УН1ВЕРСИТЕГ

На правах рукопису

РЕЗУНШКО Бвгеы Володямирович

1МУН0»ШШТНИЙ МЕТОД Д1АГНОСТИКИ ЕНТЕРОВ1РУСНИХ ГАСТРОЕНТЕРИГ ÍВ СВИНЕЙ

16.00.03 - ветеринарка мгкробЮдсяЧя, вхруаологгя, еп13оотолог1я, ^нолся^я I MiXOUIOriH

АВТОРЕФЕРАТ дисертаци на здоОутгя наукового отупаня кандидата вэтеринарних наук

Khïb - 1995

Дксертец1я е рукопис.

Робота виконана в 1нститут1 ветеринарно! медицина УААН.

Науковий кер!вник - доктор ветеринарних наук,

професор, член-кореспондент УААН, СОБКО А.1.

0ф|щйн1 опоненти: _ доктор сИолоНчаях неук, црофв-сор, член-кореспондвнг УААН 0НУФР15В В. П. - кандидат ветеринарних наук,

шиков о.т.

Цров1даа орган1зац1я - Харкхвський зооветерииарний

1нотитут

Еахист дисертацП в!дбудеться "26 " чэрвня 1995 р. о

_ год на зас1данн1 спед1ал1зовано! ради Д.01.05.10 в

Нац1ональному Аграрноцу Ун1иерситет1 за адресов: 252041, • ы.Ки1в, вул.Потех1на,16, уч.корпус,12, ауд. 412.

Просимо прийняти участь в обговоренн1 дисертацИ при и " захист! або вяслати Ваш в!дгук на автореферат в 1-му прим!рни-ку, засв!дчений печаткою, за адресою: 252041, м.Юпв-41, вул.Ге-ро1в оборони,15, НАУ, сектор захисту дисертац!й.

3 дисертац!сю можна ознайомитись у б1бл1отец! Национального Аграрного Ун1верситету.

Автореферат роз1сланиД " ~ ^ " / '•¿■-б ^-) 1955 р.

ВчениЛ секретар спец1ал]зов«но1 ради, про^есор

В.А.БОРШЧУК

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальн)сть темя. В умовах сучасного промиолового вирощу-вання тварин,стал! внсокоактуальнимж пройлеии максимально можли-вого збереження !х погол1в"я.

Високе окопичення велико: х!лькоот1 тварин на шлих в1дго-д1вельних площах приводить до зниження резистентност!, наростав вплив стресових фактор!в, цо п1двищув можливють заражения тварин 1н$вкц1йни>ы захворюванняия.

Особлива и1сцэ серед затворивань тварин займають 1н$екц11, що передашься фвкально-оральниы шляхом. Пасах 1 збудник)в через орган1зм тварин обумовлюють виникнення штам1в в!рус(в з новиыи (ЯолоПчиями властивостями, а це в свою чергу ще б1льше утрудняз боротьбу з цимя захворюваннямн.

Серед багаточисальних 1нфэкц1й широко роэповсюдхенI захворо-вання тлукково-киыкового тракту. Число випадк1в таких 1кфекц1йних захворювань перввшцуа половину загально! к!лькост1 випадк1в захворювань свиней.

0станн1м часом особливу увагу стали прид1ляти корона,- рота,-еятеров1русам-збудникам 1нфекц1йнях гастроентерят1в, як! эавдають значних ехоном1чних збитк!в.

Значне и1сца серед цих !нфекц1йних захворшань займають ен-тзров!русн! гаотроентерити свиней.

Проведения ветеринарно-сан!тарних заход!в при eнт8poвipycниx гастроентеритах свиней недосгатньо, тому б!лыпа увага при дан1й 1нфвкц11 повинна бути прид1лена розробц! метод!в. иасивнох I активно! 1мунопроф1лактики.

Необх1дао ч1тко знати б!олоИчн1 властивост1 збудаик1в, резервуара та шляхи розповсшдання в!рус1в, 1мунолог1чну Ыдпов1дь

орган¡вцу тварвн на них з урахуваншад того, що в свиногосподар-отвах, як правило, спостер!гають зм!шан! форми 1нфеки1й, в силу чого кл!н1чн1 1 патологоанатом!чн) ознакя 9йтеров1русного гастро-енгериту свиней бувають не ч!ткими. Тому вшшкають трудной! при постанови! д)агнозу в короткий терм!н та орган!зац!I ефективнях закод1в, як! спрямован1 на профилактику захворввання.

В цих уиоввх даже вежливо внкористовувати високочутлив! метода для виявлення збудаик!в 1н$екц!1, що дозволять своечасно викривати ентеров1русний гастроентерит свиней /ЕВГС/ в неблаго-получнюс свиногосподарствах I створювати в1дпов1дн1 заходи для локал!зац|1 захворювання.

Кр1м того, необх|дно мати достов)рн! дан1, як! отосувться диференц!йно! д!агностики в1русних д!арейнях 1н$екц|й для того, иоб своечасно вплянути на еп!зоотичний процвс 1 прогнозувати иоа-ливий х1д 1 наел 1док захворювання.

В ав'язку з цим 1снуе необх!дн!сть розробки нових, б!льш чутлявих I ,специф!чнях метод!в лайораторно! д!агностюш енторов!-русних гастроентерит!в свиней I вквчення ыожлявостей застосуван-ня цкх мэтод!в.

Суттевого прогресу при д!агностиц! захворюваиь набув метод »иуноферментного анал1эу /№/. ЗПдао л!тературнлх данях цей ыэ-тод мае вясоку чутляв!сть I спэциф!чн!сть, економ)чн!сть 1 иро-стоту в постанови!, екопресн!сть 1 ун!версальн1сть.

В УкраШ метод Щуноферментного анал!зу. стосовно до лабораторий д! агностики ентеров!русних гастроентерит1в свиней, не розроблений, що ! явилось предметом наших досл!джень.

Мета досл!джень. Метою наших досл!даень було розробитя метод 1муноферыентного анал!зу для д!агностикя ентеров1русних га-строентврит!в свиней.

Робота проводилась зПдно план!в НДР по задцанню 01.02.

Основн! завдання дослхджень:

1.Розробити метод очищения г концентрування ентеров1русннх ентиген!в, як1 придатн: для постановки 1ФА.

2. Отримати високоактиыи 1 специф1чн! сироватки до ентеро-в1руо!в свиней.

3. Розробити д1агностичну тест-систему п/уноферментного ана-Л1зу для 1ндккад1* специф1чних до ЕВГС антит1л в сироватках кров! I оцпшти п доотогяства.

4. Розробити дгагностичну тест-систему !муноферментного ана-л1эу для хндккац!! ентеровгруснгос антигенхв I визначити II досто-1нства.

5. Визначити оптималыи ушви постановки методу 1ФА.

6. Розробити набори дхагностичних препаратгв для реаквдг

1мунофер>,битного анализу при ентвров1русиому гастроэнтерит! свиней.

Наукова новизна.Впарше розроблэно метод I визначен! оптималь-н1 уыови отримання високоочиаенкх I концентрованих антиген! в ен-торовгрусхв свиней та актпвних г!пер!мунних сироваток; створено експресний метод 1фА для виявлення антиген!в ентеров!рус!в свиней ! специфхчних ан5ит!л.

Практична шннхсть роботп

Вперше розроблено х рекомендовано метод ¡куноферментного ' анализу для дхагностики онтэровхруоного гастроэнтериту свиней в практику науково-дослхднюс закладхв I веторинарних лабораторхй, проведено його виробничу перев!рку на баз: Ьопор!зько1, Харк!в-сько*, Черкасько* облсскгас ветерииарних лаборэторхй, а також на баз: кафсдри дхагностики 1нституту п!сля дишошэго иавчання л!-кар!в ветеринарнои модшшш при ЕЦДОГ1; розроблвна I загвердкена МОГ I продовольства Украпш нормативно-техн!чна документация на

виготовленяя 1 контроль "Набору д! агностик!в для 1ыуноферментного анал1эу при eнтepoвtрусному гастроенгериг1 овиней".

Апг>обап!я роботц. Матер!алв дисертавд! донов!дались на:

- республ1канськ!й конференц!! молода вчених 1 асп!рант!в, с.Борки, Харк1вська область. - 1992 р.;

- республ1канськ1й науково-практичн1й конференц!* "Збережоняя молодняка с/г тварин - запорука роавитку тваринництва Укра!ни", М.Б:ла Дерква. - 1994 р.;

- укра*нськ1й конференц!I молодих вчених "Сучаон! проблеми ве-теринарно! медицини", м.Кигв, - 1994 р.

Нубл!капй. По тем! дисертац!* опубликовано 9 наукових роб!т.

Об"ем I структура дисертаиН. Дисертахця викладеяа на 139 сторожах машинописного текста, тлюстрована 15 таблицями, 13 малинками. Складаеться 31 вступу, огляду л1тератури, особистих досл^даань, обговорення результат!в досд!даень, висноек!в 1 додатк!в. Список використано! Л1тератури включае 154 джерела, в тому числ! 104 в!т-чизняних та 49 - заруб!жних автор!в.

На захист виносяться матер!али по розробц!:

- методу очищения ! концентрування ентеров1рус!в свиней;

- методу отримання специф!чних сироваток до ентеров!рус!в свиней;

- методу !муноферментного анал1зу для !ндшшд1 ентеров1рус!в свиней та специф1чних антит!л.

ВЛАСН1 Д0СЛ1ДШНЯ

Матер!али та методи.

Б робот! були використан!: а/ референтн1 штами еитеров!рус!в свиней по класг.фхкащ! Дер01-шира /1986/ :

- штам Г34 ентеров!русу свиней З-о! серогрупи, який отриманий !з ВДШ ветпрепарат!в 27.05.1982 року у л!оф!л!зованому стан!,

з титром 1пфвкц1йност! в культур! кл1тин СНЕВ 5,33 ^ТЩ^оЛ.О на р!вн! 10 пасажу;

- штам 17 ентеров!русу свиней 6-о1 серогрупи, який отриманий

)з ВН11ВВ1М,м.Покрова 14.03.1982 року в л!офШзованому стан!, з титром !нфекц!йност1 в культур! кл!тин СНЕВ 7,0 ^ ТЦЦ д на р(вн! 6 пасажу;

- штам У13 ентеров!русу свиней 8-о! серогрупи, який отриманий !з ШПВВ1М, М.Покрова 14.СГ?.1982 року в л!оф1л!зованому стан1, з титром 1нфвкц!йност! в культур! кл!тан СНЕВ 7,5 ЩД 50/1,0 па р!вн! 8 паселу.

б/. Рв$ерентний а тан в!русу трансм!сшзного гастроэнтериту свиной "Пурдьв", якяй отриманий 1з ВД1К1 вэтпрепарат!в в 1930 ро-£М з титром 1нфакц!йност1 в культур! кл!тш СНЕВ 5,5 ^/ЩД 50/5^5-в/. Бп1зоотитаай штам Б950/80 коронав!русу свиней, який одер-каний Вабвщевкчеи 5.С. 29.05.1980 року в культур! первяннах кл1тин СН з появов ЦДД в!русу в 2-му пасаж! !з тонкого в!дд!лу кяшечняка хворого 3-лобового поросяти, який належить радгоспу-коибIнату "17 Партз"1зд" Горецыгого району, Могил!всько1 облает!, БССР. В!-рус адаптований до культури кл!тня СНЕВ э титром !нфекц!йност!

5,0 /(¡/ ТЦД50/1,0*

г/. Штам рогав!русу свиней: - штам "К", культуральняй ротавЬ рус свиней, який було отришно !з лаборатор)! в!русолог!1 1ВМ УМН.

В робот! використовували: перещеплюванI культури кл!тин нир-ки свиней - СНЕВ та тест!кул!в поросят - ПТП. Моношарн! культури шНтин одержували у вигляд1 суспенз!1 1з лаборатор!1 культур тканин 1ВМ-УААН. Вкрощування культур кл1тин в!дбувалося в проб1рках I матрасах /1,5 л / зг*дшз "Методичних рекомендац!й по влготоа-'

ню ! викориотанкю в науково-досл!дних ветеринарних лаборатор!ях первинних культур кл!тин тест!кул, нирок 1 щитовидно! залози свиней" .

В!руси тигрували в культур! кл!тин на проб!рках, титри роз-раховували по методу Р!да ! Менча ! виража/и в тканевих

цитопатичних доз в 1,0 см3 /ТЦД 50 /• Дм постановки реак-ц!х нейтрал!эац|1 /РН/ використовувалп еталонн! штами атенуйова-нях ентеров!рус!в свиней КМ, З-о'х серогрупи, Р7, 6-о1 серогрупи 1 V13, 8-01 серогрупи по клаоиф1кац11 Дерб!шира, у робоч!й доз!, яка вм!щувала 100 ТЦД смз !

" Обл!к результате реакц!! проводили протягом 5 Д1<5 за доно-могою м!кроскопа.

Титром антитхл вважали те найсПльше розведення сироватог. як! нейтрал!зували 100 ТЦД ^ в!русу в 50 % !нф!коваких культур кл1 тин в проЙ1рках.

Ддя очищения ! концентрування ентеров1рус1в свиней використовували метода адсорбцШно! хроматографа з подальиою гель-ф!льтрац!ею на кремнеземвм!щуючих сорбентах за дс >могою ультрафиолетового детектора типу "Ув1корд".

Контроль чистоти отриманих ентеров!русних антиген!в оценивали методом реакц!! дифуз!йно! прециШтац!!, електронно-м!к-роскоп^ними досл!даешшш, методом електрофорезу у пол1акр!ла-Шднощу тел!.

Для отримання мои оспециф!чних !мунних сироваток до ентеров!-рус|в свиней використовували дорослих крол1в та к!з, яким внут-рим"язево вводили препарати очищених ентеров!русних антиген!в чотирьохразово з !нтервалом 7 д!б. 1вдун!зацШна доза складала 5,0 х 10®'® ТЦД 50Д>0 .

До очищвного в!русу перед гп;ерЬгун1зац!ею добавляли ад"ю-вант м!лкод!оперсний крегаезеы "Лороолл", який модифхкований гл!-

цер1ном /1 % до об"ему в1русного препарату /.

Активн!сть очищение антиген!в, а також сироваток кров(, що були отриман! П1сля г!пер!мун!зад!1 тварин-донор1в цими антигенами, парев1ряли титруванням у систем! культур кл1тин - реакц1х ней-трал!задII та за допомогою методу !муно^ерментного анал!зу.

Важливими компонентами для постановки НА являються ашкеви-няч! кон"югати, як1 отриман! шляхом-м! тки ферментом пероксидаза хр!ну /Иг- 3,0 / анти!муноглобул!н!в класу (л 1з сироваток кро-в{ крол1в проти глобул ¡¡и в свиней, а такоя антиенгаров1русн1 кон"югати, як! отриман! шляхом «¡тки ферментом пероксидаза хр!ну /Кг-3,0 / 1муноглобул1н1в класу Сп !з г!пер!мунних сироваток кров! до ентеров1рус1в свиней за допомогою перйодатного окисления по Уя/^О-ПС' /1974 /.

Для постановки методу 1ФА використовували пол!стиролов! ы!к-рооланшети, як! придатн! !моб!л1зувати на сво!й поверхн1 ентеров1-русн1 антигеня"! сп8диф!чн! антит!ла.

Хдя визначення споциф!чних до ЕВС антит!л запропоновано не-прямий метод IФА, а для !ндикац!1 ентеров!русних антиген!в -"Свндв!ч" - вар{анг 1ФА. '

00л!к ферментативной реакцП проводили як в!зуально за кольо-ровою шкалою, так ! за допомогою автоматичного спектрофотометру ф!рми "Флоу", Англ¡я. Оптичну щ!льн!сть вим!ряли при довкян! хви-лI 492 нм.

При статистичнИ обробц! результат!^ використовували загаль-нопринят! "летоди / визначення середаьох арифметичнох, сербднього квадратичного в!дхилення, середньох квадратично1 похибки результату/ .

Задача по визначекню кореляц!1 вир!шувалась на ЕВМ "ЕС-1035" по програм! пор!вняння середн!х - НСР в Нац!ональному Аграрному Ун!верситот!.

а

РЕЗУЛЬТАТА Д)СЛ1ДШЬ ТА КХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Отримання очищених I концентрованих ентеров!русних антиген^ для 1ФА.

Очищения 1 концентрування ентеров1рус!в свиней проводили у три основн) етапи: попередня обробка в!русного матер1алу; адсорб-ц!йна хроматограф(я; гель-ф1льтрац!йна хроматограф!я.

Для зв!льнення в(д л 1 п 1 доу трицуотих конгломерат ¡в в1русну культуральну р!дину обробляли хлороформом /20 % до об"ему/ протя-гом 25-30 хв, а пот!м проводили центрифугування при 6000 протя-гом 80 хв. Титр 1нфокц1йност1 1 к(льк1сть в1русу при цьому майкз не зм1шозться.

Надосад викорвстовували для концентрування методой адоорб-ц1йно1 хроматографII на кремнезвизы(щуючих сорбентах.

Для залоб!гашя втрат в1русу проводили п1дб!р сорбенту, пра цьоцу особливу увагу прид!ляли визначеыню д}аметру пор /табл.!/.

Щ : Д1аыетр порп п/п; сорбент!в ГУ

Титр в^усу: 1ФА. з позитив-ИИ дд : ними сироват-

камя

ОЩ при Ж 492

/ни/

1 250 4,5 л 0.3 * 0,235 ± 0,035

2 800 6,2 1 0,4 + *■ * 0,711 ± 0,040

3 1500 8,751 0,2 * + + 1,615 ± 0,029

4 4000 5,0 ± 0,3 + + 0,405 ± 0,051

5 5000 4,8 ± 0,4 + 0,331 ± 0,044

Таблкця 1. Вялив д!аметру пор сорбент!в для концентрування ентеров )рус 1в свиней методом адсорбц1йно1 хроматограф! I.

Для концентрування ентеров1руо!в свиней краще використовува-ти оербенти з д1амэтром пор 1500 5.

Б 1дтпрацвоваи1 параметри проведения всього адсорбц!Йно-хрома-

тограф!чного процосу, а сама: умови сорбц!! BipyclB, умови де-оорбц!! BlpyciB, виб|р швидкоот! подач! ! визначення насичення хроматограф!чних колонок в!русною р!диною ! т.1н.

Встановлоно, що для сорбц!! BtpyoiB краще використовувати 0,01 Ы кал!ево-фосфатний буферний розчян, з 0,15 И Л/О/С^, рН 6,0, а для десорбц!! 0,5 М тр!с буферний розчин з 1 L! tftoW , рН 9,0 - 9,2.

На кожний досл!д по в!дпрацюзаниа методика концентрування ентеров!рус!в свиней використано б!ля 1000-1200 см3 Bipycnoi р!ди-ни з титром !нфекц1йност! в культур1 кл!тин 7,2-7,5 Ify ТЦД gg/lcM? Шсля проведения десорбц!i в!рус!в 1з хроматограф1чно! колонки отрк'лно 10-15 си3 концентрованого ентвров1русу свиней з титром 1нфекц1йност! в культур! кл!тян 8,75-9,2 ^ ЗЦД 50д смз /нал. 1 /. ,

Таким чином по об"ему нам вдалося провести концентрування BlpyciB у 100 раз!в, при цьому !нфекц!йн!сть тек зб!льшусться приблизно у 100 раз!в.

При проведенн! досить ефектиэного концентрування в!рус!в нам не вдалося зв!льнитися в!д супутн1х б1лк!в.

Для повного.вилучення тканинних антнген!в 1з концентрованих ентеров!рус!в свиней використовували метод гель-ф!льтрацШно1 хроматограф!i /ГХ /.

Для проведения ефективно! гель-ф!льтрац!г при м!н!мальних втратах Bipycy вивчали вплив Д1аметру пор модиф1кованого макропористого скла на хроматограф:!чне розд1лення Bipycy в}д б^лкоио-го баласту /табл.2, мал. 2, 3, 4 /.

Для постановки 1ФА. придатн! лише внтеров1русн! антигени, як! отриман! Шсля гель-ф!льтрац!1 на МПС марки С/-з.

Висока шстинн!сть i HKicne очищения ентеров |русних антиген i в п!дтвердженi електронном!кроскоп!чним методом доел 1лжон1!Я, мото-

0U¿254 н н

2,0 VS

W

9,75 02S

r~i

i

Г"* i

i

Г7"

Г-Ч

üvßso/w t-HQ

■Ц0 19,0 ïjQ ï,0

5;0

V

3,0

400c.'H-

ЧООсм2

yoOch4 V VI Vil Vil IX

Мал. i. АдсорбцШна хроматограф!я ентеров!русу сваней 6-oï серогрупи штаиу F7 на сорбент! Сх1500 п.439.

/по ocl абсдис - об" ем елпц!ï J по ос i ординат — оптичка щ 2льн!сть/

---- 1нфекШйна активность сдакц1й-

■ 1 оятична ц1лья1сть

I, П, Ш - посадка Bipycy; 1У-промлвка; Г-змуэ Bipycy до Уо; Л, УП, УШ, IÏ- фракцП вирусного п!ку; X - промивка.

:Д1ачвтр :т з си-: 1ФА з нор-:14А з г!пер-

;пор МПС ¡роваткою : мальною 1мунпою ои-

• / Р / -До кл!тин: сироватков:роваткою до

\ ' к' : ШЕВ : : евгс

1. СИЛ Ш20.0 що моди-ф!коване Д/ -в1н!л-

п1рол|доном 200 - 4 + + *

2. СМП "Биоцвет 500", що модиф1коване по-

л1в(н1лп1рол1доном 500 * + - + + *■

3. СхЗ, що модиф!кована

пол1в1[Шп1рол!доном 700 - • - + + + *

Таблица 2. Вплив д!амвтру пор модиф1кованих сорбент!в на гель-ф!льтрац1ю ентеров!рус1в свиней.

дом електрофоретичного анал1зу пол!пептидного складу у пол|акр1-лам1дному гел1, методом 1мунофарментного анал1зу з гетеролог1ч-ниии сироватками.

Способ очищения 1 концентрування ентеров1рус1в с^инеИ ун1-версальний 1 в!дпов1дае ус)м вимогам до антиген!в, що використо-вуються а {мунофэрментноцу анад!з1.

2. Отршашня високоактивних 1 спеилф1чних сироваток до ентероа!рус1в свиней

Хроматограф¡чно очищеними препаратами ентеров1руо!в свиней проводили г1пер!му1изац1о дорослих крол^в та к!з внутрим"язево /див.розди "Матер1али 1 методи"/.

В1руснейтрал 1зуюча активн!сть отриманкх сироваток кров! в реакц1х нейтрал{зац{г складала в)Д 1:744 до 1:1024, а в МА. в)д 1:3000 до 1:4000.

III скроааткя використонува/ш для вид!ления 1му!юглобул1Н(в гласу й з поол1рут№ яриготуяшшш на !х баз1 (мунолерокси-

Мел. '2. Гель-хроыа тографIя ЕВС 6-oI серогрупи штаму Р7 на СШ IM 200

Мал. 3. Гель-гро№тогре£|я EEC 6-о1 сэрогрупи штаму F-7

на "Биоцвот 500 "

Мал. 4. Гель-хроматограф 1я ЕВС 6-о1 сарогрупи штаму Р-7 на Сх-3

------1и<1екц1Ана акгишМсть

___ , оптичиа МлыМсть'

дазних кон"югат!в для !мунофермьнтного анал1зу. Вид!лешш !муно-глобул!н!в зд!йснювали за допомогою методу осадаення пол!ет!лен-гл!колем I поел! душою галь-хроматограф!ею на "Сефадекс! С! 200".

Контроль активност! 1 специф1чност! .визначали в

реакц|1 нейтралIзац(!, реакцИ дифуз1йно! преципИшШ, методом 1ФА.. Контроль !мунолог1чнох чистоти препарату зд1йснювали у по-л1акр!лам!даому гол! / ПААГ /.

3. Розробка д!агностично! тест-системи 1ФА для 1ндикац!! елециф!чних до ЕВГС антит!л в сироватках кров!.

'В результат! досл!даень пШбран! так! оптимальн! параметра, як вязначення розведення сенсиб!л!зушого антигену, сорбцШ-н! буфэрн! розчини, чао I температура !моб!л!зад!1 на планшетах 1 т. !н.

Титрування в!рус!в проводили безпосередаьо на планшетах из-тодои подв!йних розведвнь в!д 1:2 до 1:4096. Сорбц!я в!руснах антиген 1в краде в!дбувазться'протягом 10 год при 4 °С 8 вккорястан-няц О,ОШ кал!ево-фосфатного буферного розчану з 0.15М ,

рН 7,2-7,4.

Для в!даиаання планшет в буферний ровчнк додають 0,05 % детергенту /тв!и-20 або тв!и-80 /.

Шелл внесения в ряди лунок позитивных до ЕВГС та негати»-. них сироваток шшлшати ставили на !нкубац(я пря 37 протягом 1 год. Шсля в!даивання в!д аятят1л, що не зв"язалися вноешм антявидов! конивгатя у робочому розведанн!, а планшети ставили в термостат при 37 °С на 1 год.

Шсля в!дш1вання планшет I внесения субстратно! сум1ш! проводили обл!к результат!в за допокогов автоматичного 'спектрофотометру або в!зуш1Ьно.

Результата вкзначешш оонсиб!л!зушо1 дози ентеров!русних

и

Антиген!в представлен! у мал. 5.

ОД (В*У32 им)

Мал. 5. Вкзначення оптшгально! сенсибШзуючо! дозн ентеров1-русних антиген (в методом К-А

- - показних О.Ц. з позитивной сироьаткою; .

_— _ показник О.Ц. з негативною сгролаткою.

Оптимальна розведення ентеров!русних антлген1в в 1ФД 1:256, до б!ля 10 ыкг/сы3 в!русного б!лку. При такому розведанн1 з по-зитивними сироватками лунки мали коричнева забарвлення, а з нега тивниш забарвлення не було.

У таблиц! 3 представлен! результата визначення оптимальные умов !нкубац11 сироваток кров! з адсорбованими на пол!стирол! ентеров1русними апгигэнамн.

Оптимальний режим зв"язування специф!чних антит!л з адсорбованими ентеров!руспими антигенами 1 год при 37 °С.

Розроблений метод 1ФА для !ндикац!1 антит!л до ЕВГС е спе-ци^ччний ! активний.'1мунн! сироватки до ЕВС штаму Р34, 3-ох се-рогрупи, штаму 713, 8-01 серогрупи реагують з очищеними онтеро-в!русними антигенами штаму 17, 6-01 серогрупи, що св!дчить про -ч'рнну спор!днешеть штаы!в /табл.4/.

Температура 1нкУ(ЗацП

э позитивн.: сироваткою

з негативною сировот-кою

37 °С

з позитив-; з неганою сиро- : тивною ваткою : сироват-_: коп

1. 2.

3.

4.

20 хв 1 год 3 год 6 год

+ + +

+ + ♦ + + + + + + +

+ +

Тайлиця 3. Визначення оптимальних умов 1ику<5ацП сироваток з адсорбованими антигенами ентеров1рус!в свиней.

Досл1дауван! сироватки ; Титри в ¡ФА

1. 1мунна сировагка в|д крол!в до ЕВС З-ог се-

рогрупя штаму Г34 1 : 1600

2. 1мунна сироватка в!д крол!в до ЕВС 6-о1 се-

рогрупи штаму Т7 1 : 3200

3. 1мунна сироватка в!д крол!в до ЕВС 8-01 се-

рогрупи штаму 4/13 1 : 800

4. Негативна сироватка в!д поросят-гнотоб!от!в 0,0

5. 1мунна сироватка в1д крол!в до кл. СНЕВ 0,0

6. Iмунна сироватка до ротав!русу свиней шт. "К" 0,0

7. 1мунна сироватка до в!русу КЧС 0,0

8. ¡мунна сироватка до ензоотичного енцефалом!с-

л!ту свиней /хв. Тешена/ 1 : 100

9. 1мунна сироватка до в!русу ТГС:

шт. П - 115 0,0

шт. Б - 950/80 0,0

Тайлиця 4. Результат« специф!чност1 1 серолог1чнох активност!

очищевях еитеров{русних антиген!в б-о: серогрупя штаму Б7 при досл1джеш1ях сироваток кров! в!д свиней ! крол!в.

Розведення сироваток в НА 1 : 50 в!дпов1дае розведеншо тих яв скроваток при досл!дженн! в га 1:16. Д1агностичнМ титр в Н1 для сироваток кров! при ЕЕГС 1:32, таким чином д!агностич-ний титр в 1ФА складае 1:100.

При обл!ку результат1в досл!даень за допомогоа автокатичво-го спектрофотометру нами встановлено, що д)агносмчний титр в 1ФА 1:100 в!дпов!дае показпикам оптично! щ1льноот1 при довакн1 ХВИЛ1 /Щ. 492 ни /. 0,100 - 0.0.

Розроблзна технолог1чпа схема постановка непрямого вар!акту 1ФА для 1ндикаи11 специфКних до ЕВГС £нтит1л.

Методом 1ФА досл1даувшш сироваткя кров! в!д свиней 1з иебла-гополучних на 1нфекц!йн! гастроентеряти свиногосподарств.

В таблиц1 5 показано пор|вняння досл1дкень сироваток кров! методом Ш ! РН. 1э таблиц! видно, що результата досл1даень в 1ФА I ГН сп1впадають. Сл!д в!дм1тити-1ФА б!льа чутливий метод, тому виявлено б1льше позитивних сироваток методом 1ФА, чиы в РН.

4. Розробка "Сендв1ч" - вар1анту 1ФА для ИущкацИ ентеров!русних антиген{в.

Необх1дниыа умовами при розробц! "Сендв!ч" - вар!ангу 1ФА для 1нднкац!х ентероа¡русних антигон!в с: п1дб!р оптимально! до-зи спвциф1чних до ЕВГС антит!л /1муноглобул!н1в/; п!дб1р 1нкуба-ц!йного буферного розчину; п!дб1р оптимального розведення анти-ентеров1русних кон"югат!в.

Результата визначения сенсибШзувчо! дози ¡муноглобулПНв На пол!стиролових м!кропланшетах приведен! на мал. 7.

Кращ! результата отримано при концентрацГх ¡му но глобул 1н I в 15 мкг/см3, або 1,5 мкг на 1 лунку.

При так!й концентрац!! фонових з&барвлень негативных контроле не в!дбувалось, иле забезпечувалась висока чутлив1сть роок-и!х.

Ц]Ъ п/п

:К1ль-

Досл1джуванг сироватки :к{сть :проб

Ш

поэит. ;яюэит

РН

позит. Инозит"

1. 1з радгоспу-KON'rti пяту "Калчтяноький".Бровнрсь-кого району,Ки1всько1 областх

2. 1з радгоспу-комбгнату "Апостоловськяй" .jlHÍnpO-петровська область.

3. 1з радгоспу-комб1нату "Слобожанський".Чугусвсь-кий район,Харк1вська область

4. 1з радгоспу-ксжб1 нату "Прикариятськ^й".Калусь-кии ря/.он Двано-Фратшвсь-ка область

б. 1ншг господарства Украпш /6 областей,? господарств/ т/

6. Господарства Pocií

7. Господарства Bipr/.enil

8. Господарства Ustbí? ■

24

20

12 50 8 40

Ш 8

37 40

В сього:

8 5 62 4 50

38 14 25 - -

10 ' 3 30 2 20

115 50 41 14 43

14 • 6 42 4 28

6 4 60 4 60

20 13 65 10 50

'¿ЬЪ ЛЬ 4& ьь ' ЗУ

Таблиця 5. Пор!пняльна таблиця дослхджень сироваток кров! методом ISA i PH.

я/ доол1дження в ГН не проводились, або проводились частково.

Шдб1р робочого розведення антиентеров1русних пероксидазиих кон"вгат1в проводили шляхом титрування з позитивними i негативными антягенами методом 1ФА /мал.8/.

Робе .а концентрац1я антиентеров1русного кон"югату для 1ФА 1000 нг/см8.

Висока cneun$i4HicTb i активн!сть прямого иСендв!ч" вар!анту 1ФА показена в таблиц! 6.

Розроблено технолог!чну схему постановки прямого "Свндв1ч" ввр1анту 1ФА для ÍHflHT.iqi? ентеров!русних ентигэн!в.

(ДЦ^вгнш)

18

<2.8

еч

а

МКГ,/^

с/и ■

Налшнох 7. Результата визначення сенсиб!л!зуючо1 дози 1иуногло-бул!н1 в на пол!стиролових м1кроштншетах:

- позитивний контроль;

- негативний контроль.

Ч92ЧЫ

¥ 05

У 42

юо

гоо

чоо

80с 'ооо 16 со

31с0

си-н ХУсм*

Шлюпок 8. Визначення робочого розввдення антиентеров1русних кон"югат!в методом 15А:

а - концентрац!я кониюгату;

б - значения оятичног щ(льност|; __- показнкк ОЩ з позитивним антигеном;

------'локазник ОЩ з негативним антигеном.

Ентеров¡русн 1 антигени визначали прямим "Сендв1ч" - вар!ан-юи IФА у патологичному матер1ал1 в!д хворих тварин.

Дм досл1джень вИкористовували 10#-ну суспонз¡ю тонкого в1д-¡а.ту кишечника в!д свиней з характерном ознаками на ЕВГС.

Досл!джуван1 антигена : Титри в Ш

1. Культуральн! ентеров(руси свиней:

шт. Б34 1:16

шт. Р7 1:32

шт. У13 1:В

2. Культуральн! коронав1руси свиней:

еталонний шт. П-115 0,0

еп!зоотичний шт. Б-950/80 0,0

3. Культур&льний антиген ротав!русу свиней

штаму К" 0,0

4. Антягени шйтян СНЕВ . 0,0

5. Антигени 1з кишечнику поросят-гнотоб!от1в 0,0

Таблиця 6. Результати виявлення ентеров!русних антаген!в итаму Е7, 6-о! серогрупн пряииа "Сенда!ч"- вар!антем 141.

Е£атор!ал для досл1д8внь надходав як !з промислових свяно-господарств, так I з господарств з традащ!йним ведениям свинар-ства Украгни, РосП, Казахстану.

Процент виявлення ентеров¡рус1в свиней !з матер!алу, що п1д-лягав досл1даешш, склддав 45 %. Результати досл!даень методом ¡ФА, як1 приведен! у таблиц! 7, в основному сп!впадають з результатами досл!джень ¡ншими методами.

Для вмзначення кореляцН результат!в 1ФА 1 И! проводили па-ралелыН досл1дження обома методами !мунних сироваток до ЕВС в1д крол!в ! к!з. Всього було дослШчсено 30 сироваток кров!.

1мунолог!чну активн!сть сироваток кров! визначали методом 1ФА, в1руснейтрал1зуючу активн!сть - реакц!ею нейтрал!зац!г.

В результат! д'осл1джонь встановлено, що !муиолог!чна активность сироваток кров! корелюе з в!руснейтрал!зуючою. Мтя титрам антит!л при доел1дкенн! методами 1ФА 1 ЕН !снуе пряма корелшШ: на залешПсгь.

п/п

К!ЛЬ4 1«.-

Sf; по- % по-.зит. зит.

W

по- % по зит. зит.

ЕМ : ВВ

:в кк

1. Радгосп-комб!нат "Апостолов-еький", Ди1пропетровська область 5

2. Радгосп-комб1нат "Калигянсь-ккй", Броварський район, Кигвсыса область 5

3. Радгосп-комб!нат "Слобоган-ський", Чугуевський район, Харк1вська область 8

4. Радгосп-комб Ыат "Прикарпат-ський", Калуський район, 1ва-но-Фракк!вська область 7

5. 1нш1 господарства Украхня /5 областей, 7 раймпв,

9 господарств/

6. Господарства Рос II

7. Господарства Казахстану

40 2 40 + +

60 2 40 + +

57 4

57 + +

В с ь о г о :

32 18 56 15 43

13 3 23 3 23 + +

3 3 100 1 33 + +

73 33 45 27 37

Табливд 7. Виявлення ентеров!рус!в свиней методами ISA, РТЗК, ЕМ, в!русовид1лення в культур! кл!тин.

Середа!й титр ус!х досл1дя!уваних сироваток методом I3A скла-дас 9,34 ± 0,33 Середня в1руснейтрал!зувча активн!сть цих

сироваток в РН складае 7,63 ± 0,27 ioi|v Коеф!ц!ент кореляцй Mist в1русшйтрал1зуючимя антит!лами в Ш i при досл!даенн! методом 1ФА. дор!внюв 0,862.

На основ! проведених розрахунк!в складен! регресивн! пор!в-някия зв"язку титр!в'в 1ФА i РН.

Встановлено, що чутлив!сть 1ФА по виявленню антит!л в 3,38 раз|в вице н!ж РН.

21

висновки

1. Розроблено 1 залропоновано для впровадження в вотеринар-ну практику метод 1муноферментного анал!зу для д!агноотики енте-poBtpycBHx гастроентерит!в свиней, лкий заснований на визначенн! специфИних до ЕВГС антят!л в сироватках кров1, а також 1ндикац11 ентеров!руснмх антиген!в jr патолог!чноцу матер!алI в1д хворих свиней.

2. Залропоновано технолог1чну схему очищения 1 концентруван-ня ентеров!рус!в свиней за допомогою катоду хроматограф!i з вико-рютанням кремнеземвм!щувчях сорбент 1в.

3. Огримано високоактивн! I специф!чн! !муноглобул!ни кла-су С| 1з Нпер1муннях до ЕВГС сироваток кров! в!д тварин-доно-р|в за допомогою методу осадження ПЕГом а м.в.6000 ! подалыпоп галь-ф1льтрац1в» на "Сефадеко! (л 200*.

4. Визначен! основн! вимоги для постановка методу (мунофер-ментного анал!эу при ентеров!русних гастроентеритах свиней, а сане: розведення ентеров!русних антиген1в для !моб!л!зац1! на но-«II - 1:256 /10 мкг/см8/; оптамальнжй режим аз'язування специф!ч-нях антит!л а адсорбованимн антигенами - 1 год при 37 °С; п!дб!р оптимально! доз» спец«ф1чнях до ЕВГС аитит!л / /- 15 мкг/ом3, або 1,5 шсг на 1 лунку; робоча концентрац!я кон"югат!в -

1000 нг/см8, буферний розчин - 0.0Ш кал1ево-фос$атний з О, I5M /Vtt/Сб I 0,06 % детергенту /тв!н-80/ рй 7,2 - 7,4 i т. 1н.

5. Метод !ЭД при ЕВГС з позигившши результатами випробува-но в експериментальнкх I вяробничих умовах. Вотановлена виоока чутлив|сть ! спвциф!чн1сть методу. При досл1дкенн! б!ля 260 проб сироваток кров! в!д свиней !з неблагополучиях на 1ифекц!йн1 гаст-роентерити свиногооподарств, результата досл!джень в ISA /45 % позитивних/ сп1впадають з результатами досл1джень цих сироваток кро~

в1 в раакцН нейтрал1зац!К /Ш % позитивних/ . Метод 1-М в 3,3а раз!в перевищуе по чутливост! Ш. Коеф!ц!снт кораляцН титр1в ан-тит1л при досл!дхенн! методом 1СЛ I РН складас 0,862.

Процент виявлання ентеров!русних антиген!в 1з патолог!чного матер¡алу, який я!цлягав досл1джонням, склав 45 %. Ц! результата в основному п!дтвардосуються данима досл!дмпь зазшчених проб методом РТЗХ /37 % /.

б. Розооблаао, технолог!ю виготоаяення, контролю ! заотосуван-ня набору д!агностак!в для !муноферментного аяал!зу при внтаров!-русному гастроэнтерит! свиней, а також нормативно-тахн!чну доку-мантац!ю, яка затвардяана МСГ I пюодовольства Украина в 1934 роц!. 1 ДРАКТ1Ш1 ПР0ЛО315Ц11 Закгопонований експресний метод !мунофермоитного анал!зу дозволяв виявляти ентаров!русн! антигена у патолог 1чному ката о 1а-л!, а також визначити р1веиь спацигМчних антит!л у сироватках кров! сшнай. Цей метод використовуеться для проводекня д!агнос-тичних обстажень свинарсыгах госиодарств.

Виготовлення д!агиостик!и К А при К^ГС орган!зовшю в 1чсти-тут! ветеринарной медицини УААН.

Проведено 5 м1жоблас;глх сш41нар!в для вотаринарних л1юр!в в!русолог1чних в!дд!л!в штеринариих лаборатор!й по опануванню методом НА при антеров!ц/сних гастроештештах сшнай.

I. Розунанко С.В., СлШции Б.А. Диагностика ентесов!русного гасг-роеиториту свиной методом !.чуно<Тормонтпого анал!зу // Тозн до-пов1дай роспуол1кднськоЧ кои'ерегаШ ыолодих вчиних "Сучасн! ниоблами ватеринарноК медицини". - лиУв. - 1994. С.7.

Рнзуненко С.В., Син!цин В.А. Одашання високоочшцеиого бичого сировчточного ольбуч!ну для 1Л // Тези донов 1дой сюспубл¡¡аи-сы'.оТ кои:К'ранц!I колодих вчиних "Сучаси! нооблоки нотоиинар-»01 «едшинн", - - 1994. С.7.

3. Сан!цин В.A., Резушшко C.B. Метод !муноферментного анал!зу для д!агностики в!русних гастроантарит!в тварин // Този допо-в1двй Укра'/нськоУ icoFifaDauntï молодих вчоних i асп!рант!в. -

(с.Борки, Харк»всько1[ облает!. - 1992, 6-8 жовтня) Дврк1в-1992Ш9.

4. Собко A.I., Рззунанко C.B., Сии Ищи В.Л. Метод !мунофершнт-ного алал!зу пои антеров1рус1Шх гастсоентеритах cbhhoîï // Мата-р!али науково-практичноУ конфоренц!! "Збереження молодншса

с/г тварии - залорука розвитку тваринництва УкраТни". - /28-29 варесня, IS94, м.Б1лз Церква/, Харк1в. - 1994. С.26-27.

5. Собко A.I., Син!цин В.А., Рззунанко Е.В., Паиченко 0.0. Метод 1муноф9рмантното аяал!зу при ензоотичному енцв(Талом\'сл1т1 свиней /хвороб! Тащена/ // ¡(1атар!алл науково-практично!' кон-ференцН "Збере:коння молодняка с/г тварин - залорука розвит-ку тваринництва Укра'/ни. /¿8-29 верасня, 1994, м.Ыла Цорква/, Харк!в, - 1994. С.58-59.

6. Блоцкая 0.<i>., Старчеус A.il., Иолулях В.И., Розунанко Й.В. Результата изучения антигенного родства энтеровирусов человека и тавотных // ;'.!атериалы республиканской конференции "Ветеринарная медицина - экономические, социалыше и экологические проблему". /20-22 ноября 1990, г.Харьков/, - Харьков. - 1990.

7. Старчаус A.il., Блоцкая О.Ф., Тонкая B.1Î., Лолулях В.И., Рззунанко К.В. Диагностика и профилактика энтэровирусных гастроэнтеритов молодняка свиней // Материалы республиканской научно-производственной конференции "Профилактика и меры борьбы

с болезнями молодняка с/х животных". /12-13 сентября 1990, -г.Витебск/, - :,5ииск. - 1990. С.27.

Ь. Старчаус A.il., Иолулях В.И., Блоцкая О.Ф., Синипнн В.А., Разу-иенко Ii.1i. Лабораторная диагностика вируеннх гастроентаритов при зпизоотичоском обследовании болышх свиной // Тезисы докладов 3 Всесоюзной конференция по эпизоотологии. /24-36 сентября 1991, г.Новосибирск/. - Новосибирск.- 1991. С.259.

9. Старчоус А.;!., драснобаова 0.\'S., Ьлощсая О.Ф., Синицнн В.А., Резуненко ti.ii. использование мелкодисперсных кремнеземов в качества адьчвантов для получения гипоришуншос сывороток при изготовлении диагност ¡неуков к вирусным болезням свиной // Тезисы докладов ссмтюа стран-членов C3J "Разработка а кспользовтшз полых адьюиантов для биотохнологичяских налой". -Владимир. - 1990. С. 12.

• 24 SUMMART

Reiunenko Eugeny Yladlalrovltch.

Inaunoaiuijra* aaaay for tba enteroviruaae gaatroanteriea dlog-noala la «win*.

Right» of manuaorlpt. Tor the application of tha Candidate of Veterinary Solence degree.

16,00.03.- Veterinary Microbiology, Virelogy, Bplxootology

end Ienuiiology. Rational Agrar Univeraity, Kiev,1995.

Maln_idaae_i To oreate axpraea InaunoenayK« aaaay for tha laboratory diagnosis of enteroviruoee gaatroenterltea In swine.

Reaulta* Tha hish-eanaitiva GLISA-taat for th* antarovlruaaa gaatr»ent«rltea dlagnoals woe developed. Tba teat ollowa to define' the apeclflc antibodies level In pig blood aero and to reveal en-' t»roviral antigens in eanplea froa sick pigs,

акшвдия

Резуненко Евгений Владимирович.

Иммуноферментный метод диагностики энтеровирусных гастроэнтеритов свиней.

На правах рукописи, lb соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук.

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология и иммунология.

Национальный Аграрный Университет, г. Киев, 1995. Основные идеи: Разработать экспрессный метод иммуноферментного анализа для лабораторной диагностики энтеровирусных гастроэнтеритов свиней.

Результаты: Разработан высокочувствительный метод ИФА при энтеровирусных гастроэнтеритах свиней, который позволяет определять уровень специфических антител в сыворотках крови свиней, а также выявлять энтеровирусные антигены в патологическом материале от больных свиней.

ftJg?4Qci рда&а: ентеровхрусний гастропнтерит, хмунофершнтиий анализ, хроматограф1я, антиген, антитхло, кои"югати, дхагностика, сироватки.

К*1» «иг*^ПУД«м.1103.100,