Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Характеристика некоторых биологических особенностей ретровирусов крупного рогатого скота (BLY, BIV) при использовании экспериментальных моделей

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ РГб ОД им. К.И СКРЯБИНА

1 3 ПИВ 1ЯП7

На правах рукописи

КАСЬЯН ЕВГЕНИЙ НИКОЛАЕВИЧ

ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ РЕТРОВИРУСОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (ВЬУ, В1У) ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЕЙ

16.00 02 - патология, онкология и морфология животных 16.00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К И. Скрябина

Научные руководители: академик РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор ШИШКОВ В.П., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук КРИКУН В А.

Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Валихов А.Ф. доктор ветеринарных наук, профессор Белоусова Р.В.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко

Защита диссертации состоится " 3/ •> ¡Я^иС^фЯ 1997 г. в "_ " часов на заседании диссертационного совета Д 120.36 01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехяологии им К.И. Скрябина по адресу. ■ 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23, тел. 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке академии. .

Автореферат разослан 1996 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Слесаренко Н А

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1 1 Актуальность исследований За последние годы исследователи большинства развитых стран проявляют огромный интерес к изучению уникального семейства ретровирусов Вызываемые ими заболевания являются объектом как медицинской, так и ветеринарной вирусологии, патологии, онкологии, молекулярной биологии

На сегодняшний день особое значение имеют два ретровируса крупного рогатого скота вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) и иммунодефицитподобный вирус крупного рогатого скота (BIV)

ВЛКРС идентифицирован как этиологический агент лейкоза крупного рогатого скота, являющегося хроническим инфекционным заболеванием опухолевой природы (Miller JM et al, 1969, Шишков В П , 1979 ) Заболевание наносит значительный экономический ущерб вследствие гибели и вынужденной выбраковки животных, утилизации органов и туш при убое, нарушения племенной работы, расходов, связанных с ограничительными мероприятиями.

Лентивирус крупного рогатого скота, BIV, менее известен. Клиническое проявление болезни описано только при первичной изоляции (Van Der Maaten М J ei al, 1972) Главная причина, побуждающая ученых на более глубокое исследование особенностей данного вируса - его сходство с другим лентивирусом - вирусом иммунодефицита человека В последние годы появи-лись предположения, что BIV выступает кофактором при инфекции ВЛКРС (Gonda М et al, 1989, Храмцов В В , 1995) Поэтому нам представляется целесообразным изучение распространения BIV среди поголовья крупного рогатого скота в России, особенно в контексте проявления двойной инфекции Так при серологическом исследовании отдельных стад в США, Канаде, Европе, Австралии обнаружен 4 - 16% уровень инфицирования (Forman A J. et al, 1992, McNab WB. et al, 1994) Однако при приготовлении диагностических средств исследователи столкнулись с проблемой - неудовлетворительное накопление гликопротеи-дов вируса в культурах клеток млекопитающих Для решения этой задачи мы взяли экспериментальную модель - рекомбинантный ба-куловирус, имеющий клонированные иммунодоминантные участки R1V и реплицирующийся в культуре клеток насекомых.

За последние два десятилетия гораздо больше внимания было уделено изучению ВЛКРС, однако проблема инфицированности им поголовья крупного рогатого скота остается актуальной для многих стран мира. Так как заболевание имеет хронический, часто латентный характер, а проведение экспериментов на группах телят или коров в настоящее время ограничено по экономическим причинам, то необходимо разработать новую экспериментальную модель для инфекции ВЛКРС В частности, большая работа проведена по экспериментальному воспроизведению лейкоза крупного рогатого скота на овцах и ягнятах (Olson С et al, 1972, Шишков В.П с соавт., ] 985, Бу-зераиб А., 1986).. Кроме овец в экспериментах различных авторов были использованы другие животные Наиболее интересные результаты были получены на кроликах (Стасенко В С., 1983, Wyatt С R et al, 1989). Полученные данные указывали еще на одну характерную деталь патогенеза ВЛКРС - его иммуно-депрессивное воздействие, которое у кроликов проявляется сильнее, чем у крупного рогатого скота (Шишков В П., Гевондян В.С , 1985). Таким образом, на данный момент показаны возможность заражения кроликов ВЛКРС и иммунодепрессивное воздействие вируса на организм кролика В нашей работе мы развиваем эти вопросы и исследуем критерии, позволяющие использовать кроликов как биологическую модель для изучения особенностей инфекции ВЛКРС материал и доза заражения, степень чувствительности животных и возможность использования их для тестирования химиотерапевтических препаратов

1 2 Цель и задачи исследования Целями нашей работы была разработка кроличьей биологической модели онкорнавирусной инфекции с помощью комплексного изучения процессов, протекающих у кроликов, экспериментально зараженных ВЛКРС, наблюдение репликации лентивируса крупного рогатого скота в клеточных культурах и характеристика рекомбинантного бакуловируса, содержащего клонированные участки генов BIV как источник получения иммуно-реактивных белков

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи 1. Проследить по гематологическим, серологическим и иммунологическим данным развитие онкорнавирусной инфекции у кроликов, зараженным различным материалом, содержащим ВЛКРС;

2. Изучить по гематологическим, серологическим и иммунологическим показателям возможность тестирования препаратов, обладающих воздействием на инфекцию ВЛКРС;

3. Изучить морфологию клеток и особенности морфогенеза В1У в культурах клеток млекопитающих;

4. Клонировать участки генома В1У, кодирующие иммунодо-минантные белки в рекомбинантный бакуловирус и охарактеризовать их экспрессию.

1.3 Научная новизна. Проведено комплексное изучение экспериментально индуцированной онкорнавирусной инфекции у кроликов с точки зрения использования этих животных в качестве биологической модели в опытах с вирусом лейкоза крупного рогатого скота.

Впервые кроличья модель инфекции ВЛКРС была использована для изучения возможности применения химиотерапевтических препаратов для искоренения инфекции. Показано иммунодепрессив-ное действие ВЛКРС на кроличьей биологической модели.

Комплексно изучены особенности морфогенеза В1У в клеточных культурах. Впервые экспрессированы иммунодоминантные участки генома В1У (gag-3, епу-8) в бакуловирусном векторе с целью выработки антигенов для диагностикума.

Научно-практическая ценность. Результаты исследований по воспроизводству инфекции ВЛКРС на кроликах могут быть использованы для тестирования химиотерапевтических и вакцинных препаратов

Полученные данные вносят свой вклад в подтверждение виру-со-иммуно-генетической концепции возникновения и развития лейкоза крупного рогатого скота (иммунодепрессивное воздействие ВЛКРС на организм кроликов).

Схема клонирования в бакуловирусный вектор (ПЦР - ТА вектор - бакулоплазмида - трансфекция с бакуловирусной ДНК) может быть использована специалистами в области биотехнологии для разработок современных диагностикумов и вакцин.

Полученные рекомбинантные белки будут использоваться для создания диагностических средств и проведения серологического обследования рогатого скота в России, а также тестирования импортного скота.

Г)

1.5 Научные положения, выносимые на защиту

1. Кролики являются чувствительными к вирусу лейкоза крупного рогатого скота; наиболее предпочтительный метод воспроизведения инфекции BJIKPC - внутривенное введение нативных лейкоцитов от коровы с персистентным лимфоцитозом;

2. Возможно использование кроликов как биологической модели для тестирования противовирусных препаратов;

3. Метод заражения B1V клеточных культур млекопитающих не позволяет получать необходимое количество полноценного антигена для диагностических исследований;

4. Экспериментальная система (рекомбинантный бакуловирус -клетки насекомых) может использоваться для получения иммуноре-активных белков; данный метод является более приемлемым для выработки антигена, чем экспрессия в E.coli или пассирование BIV в культурах клеток млекопитающих.

1.6 Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Работа содержит 187 страниц машинописного текста, иллюстрирована 9 таблицами и 43 фотографиями. Список литературы включает 218 источников, из них 165 зарубежных.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в течении 1993-1994 гг. в лаборатории по изучению гемобластозов и иммуномодуляторов Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина и в течение 1995 года в лаборатории молекулярной вирусологии департамента микробиологии, иммунологии и превентивной медицины колледжа ветеринарной медицины государственного Университета Айовы, США.

Всего в опытах использовано 32 кролика, разделенные на 7 групп. На первом этапе животные заражались внутривенно двумя видами вируссодержащего материала : клеточной культурой FLK-BLV и нативными лейкоцитами от коровы с персистентным лимфоцитозом; на втором этапе кроликам внутривенно инокулировались нативные лейкоциты с последующим введением препаратов «Гамма-плант» и «Позевать».

При гематологическом исследовании определяли общее количество лейкоцитов и производили их дифференцированный подсчет

с выведением лейкоцитарной формулы согласно общепринятой методики.

Для выявления антител к BJIKPC у подопытных животных сыворотки крови исследовали с помощью реакции иммунодиффузии в агаровом геле (РИД) с гликопротеидным антигеном. Для подтверждения наличия вируса в организме зараженных кроликов использовали два метода: 1) тест синцитиеобразования (ТСО) на покровных стеклах с индикаторной культурой СС-81. Синцитием считали многоядерное образование, содержащее не менее пяти ядер; 2) электронную микроскопию нативных лимфоцитов и краткосрочных культур лейкоцитов крови кроликов.

Определение титров антител к сальмонеллезному и шигеллез-ному антигенам в обычной и специальной средах проводили с помощью реакции пассивной (непрямой) гемаглютинации. Полученные данные интерпретировались для оценки модуляции уровня антител и их авидности.

Взятие патологического материала от павших кроликов и подготовка гистологических срезов, а также их окраска проводились по общепринятой методике.

В исследованиях, связанных с BIV, проведенных в США, были использованы следующие методики и биологические объекты :

Для наблюдения репликации BIV в клеточных культурах млекопитающих были взяты первичные культуры легких (ЛЭК) и селезенки (СЭК) эмбриона коровы, которые выращивали в среде ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Для поддержки дикого типа бакуловируса, а также рекомбинантных клонов использовались клетки насекомых Sf-9 (клетки незрелых яичников Spodoptera frugiperda), выращиваемые в питательной среде SiPOOIISFM. Условия культивирования и правила обращения с клетками насекомых несколько отличались от применяемых в работе с культурами клеток млекопитающих.

Определение антигенов BIV в вышеупомянутых клеточных культурах проводили при помощи непрямого иммуиопероксидазного теста. В качестве первичных антител использовались как монокло-нальные, так и поликлональные сыворотки; вторичными служили антивидовые аититела, конъюгкроваиные с пероксидазой.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на оборудовании и с использовании реактивов фирмы «Perkin Elmer». Методы молекулярного клонирования, а именно : выделение и преципитация ДНК, лигирование, трансформация рекомбинантной плазмиды в штамм E.coli DH5oc , гибридизация с ДНК-зондом на фильтрах, амплификация плазмидной ДНК, рестрикционный анализ, электроэлю-ция ДНК, применялись согласно наставлению Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis Т. (1989).

Котрансфекцию бакуловирусной ДНК с плазмидой,. содержащей гомологичные участки и перенос рекомбинанта в Sf-9 клетки осуществляли методом липосомной трансфекции.

Для характеристики экспрессии белков BIV и рекомбинантно-го бакуловируса использовали nMMyH06fl0T(Westem blot) с проведением электрофореза белков в 12% SDS-полиакриламидном геле.

Статистическую обработку полученных в экспериментах цифровых данных проводили по Лакину Г.Ф. (1980).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Серологические, гематологические и вирусологические исследования кроликов, зараженных ВЛКРС-содержащим ма териалом: нашивными лейкоцитами и культурой клеток FI.К. Первым этапом комплексной работы по разработке кроличьей биологической модели стал эксперимент по заражению кроликов различным ВЛКРС-содержащим материалом. Животных заражали внутривенно: шесть животных (группа №1) -клетками культуры FLK в дозе 0,5Х106 и четырех кроликов (группа №2) - нативными лейкоцитами от коровы с персистентным лимфоцитозом в дозе 70х106 . Три кролика (группа №4) служили контролем.

В наших опытах для серологических исследований использовали реакцию иммунодиффузии в геле агара (РИД). На 9 день после инокуляции вируссодержащего материала не были выявлены антитела к ВЛКРС ни у одного из животных. Во второй группе (нативные лейкоциты) на 21 день 75% животных стали сероположителными. Далее титр антител постепенно нарастал и поддерживался в среднем на уровне 1:8 на протяжении всего опыта. Кролики группы № 1, зараженные культурой клеток FLK, дали положительную реакцию на 1,5-2 месяца позже животных группы К» 2 (нативные лейкоциты). После этого интенсивность выработки антител к ВЛКРС несколько нарастала. Данный процесс наблюдался на протяжении 1,5-2 месяца,

а далее титры антител резко снизились. Титры антител у кроликов второй группы были в 2-4 раза выше, чем у животных первой группы. То обстоятельство, что у кроликов, зараженных BJIKPC-содер-жащим материалом, вырабатываются антитела на ВЛКРС в течение длительного времени, а также то, что у части животных титр антител в дальнейшем не снижался, говорит о персистенции вируса в организме.

Для изучения оикогенного действия ВЛКРС на кроличьей модели мы ежемесячно после заражения кроликов различными вирус-содержащими материалами брали образцы крови, определяли абсолютное количество лейкоцитов и выводили лейкоформулу. Анализируя средние данние по группам, можно сказать, что количество лейкоцитов повышалось в пределах 30-60% по сравнению с контрольной группой. Примерно в те же сроки наблюдали развитие относительного лимфоцитоза (64-74% у зараженных ВЛКРС и 55-60% у кроликов контрольной группы). У кроликов, зараженных нативными лейкоцитами, относительный лимфоцитоз достигал более высоких показателей. Повышение количества лимфоцитов начиналось через месяц после заражения и продолжалось в течение 6 месяцев, затем количество лейкоцитов несколько снизилось, но превышало уровень лейкоцитоза у контрольных кроликов, (Р<0,05).

Для установления онкорновирусной инфекции у подопытных кроликов наряду с серологическими исследованиями были применены прямые методы: тест синцитиеобразования (ТСО), позволяющий обнаруживать инфекционний вирус, и электронная микроскопия, позволяющая выявлять вирусные частицы в исследуемых образцах. У кроликов, зараженных как клетками FLK, так и нативными лейкоцитами, был выявлен активный инфекционный вирус. После культивирования лейкоцитов крови с культурой клеток СС-81 были обнаружены специфические изменения - синцитии. У кроликов контрольной группы, являвшихся серологически негативными, подобных изменении не выявили.

В культивированных в течение 48-72 часов лимфоцитах крови экспериментально зараженных ВЛКРС, серологически положительных в РИД животных выявили вирусные частицы типа С, имеющие размеры и морфологию, типичные для вируса лейкоза крупного рогатого скота. Зрелые и незрелые вирусные частицы располагались на поверхности клеток, а также в большом количестве выявлялись в ци-

топлазматических вакуолях. Почкующиеся частицы формировались из плазматической мембраны клетки и гладкой мембраны цитоплаз-матических вакуолей. Часто зрелые вирионы располагались вне клеток в виде скопления вирионов. Зрелые частицы диаметром 90-120 нм имели округлую или овальную форму, состояли из электронно-плотного нуклеоида, диаметром 75-80 нм, окруженного двухслойной оболочкой. Нуклеоид отделен от внешней оболочки электронно-прозрачной зоной, диаметром 7-12 нм.

3.2 Влияние некоторых препаратов па развитие инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота у кроликов Хронологически данный опыт можно разделить на два этапа. На первом проводился опыт по обработке кроликов, инокулирован-ных с BJIKPC-содержащими лейкоцитами, препаратом "Гамма-плант". В нем были задействованы три группы:

1) опытная, № 3 (4 кролика). Животным внутривенно ввели нативные лейкоциты от коровы с персистентным лимфоцитозом в дозе 70 X 10б. Затем через 9 дней после заражения им внутривенно ввели по ЗОО мг "Гамма-планта", еще через 15 дней - по 100 мг препарата.

2) Группа № 2 (4 кролика). Было проведено заражение ВЛКРС по той же схеме, что и для группы № 3, за исключением обработки препаратом.

3), Контрольная, № 4 (3 кролика). Животным этой группы вводили лейкоциты от коровы, имеющей отрицательные результаты в РИД и ТСО.

В следующем опыте исследовалось воздействие на течение инфекции ВЛКРС препарата "Лозеваль". Пятнадцать кроликов были разделены на три группы по 5 голов :

1) Опытная, № 6. Животным внутривенно ввели лейкоциты от коровы с персистентным лимфоцитозом в дозе 70 X10Г> , через 1 и 3 дня после этого их обработали препаратом "Лозеваль" двумя способами: внутримышечно (75 мг) и внутрибрюшинно (50 мг).

2) Группа № 5. Введение только вируссодержащих лимфоцитов (70хЮ6).

3) Группа № 7, контрольная. Условия аналогичны группе № 4.

Результаты наблюдения антительного ответа к ВЛКРС с помощью РИД показали, что двукратная обработка "Гамма-плантом" через 9 и 24 дня после заражения ВЛКРС прерывает развитие онкор-

новирусной инфекции у двух из четырех кроликов, а у других животных снижает интенсивность инфекционного процесса.

Наблюдая изменения гематологических показателей у подопытных кроликов, можно заметить развитие временного лимфоци-тоза как у кроликов, зараженных ВЛКРС, так и обработанных препаратом «Гамма-плант».

Таким образом, препарат «Гамма-плант» оказывает определенное воздействие на вирус лейкоза крупного рогатого скота. В нашем опыте выявлено 50% протектнвное действие при примененной схеме обработки.

Проведенные опыты по сходной схеме для выявления антивирусного действия препарата «Лозеваль» не дали положительных результатов. У всех кроликов, зараженных ВЛКРС, произошло развитие инфекции ВЛКРС.

3.3 Изучение реипфицировстия кроликов вирусом лейкоза крупного рогатого скота

Сравнивая серологические, гематологические и иммунологические показатели кроликов, зараженных различных вируссодержа-щим материалом, мы заметили, что у животных, инокулнрованных клеточной культурой БЬК, течение инфекции существенно ослабло. Поэтому спустя шесть месяцев после заражения культурой клеток ИЬК, те же самые кролики (группа № 1,6 голов) были реинфициро-ваны нативными лейкоцитами от коровы с персистентным лимфо-цитозом.

В опыте по повторному заражению кроликов уже через 9 дней у животных наблюдался высокий уровень антител. Это говорит о наличии иммунной памяти на данный антиген. Сильный антительный ответ продолжался в среднем 2-3 месяца, затем произошло его угасание. У части кроликов наблюдался период отсутствия реакции с последующим возобновлением выработки антител. Анализируя полученные данные, можно объяснять результаты опыта, используя разные предположения. Для их подтверждения необходимо использовать методы молекулярной вирусологии.

3.4 Наблюдение за развитием иммуиодепрессичного состояния у кроликов, зараженных ВЛКРС, с использованием иммунологических, клинических и гистологических исследований В проведенных опытах из семи групп животных четыре находились под наблюдением более длительный период - 20 месяцев, на этих кроликах удалось наиболее полно проследить иммунодепрес-сивное воздействие ВЛКРС.

Для исследования функционального состояния иммунной системы выявляли реактивность антител в-класса путем проведения РПГА с одним и тем же антигеном в разных средах, а также определяли модуляцию титров нормальных антител. У контрольных кроликов за период наблюдения сумма титров нормальных антител, выраженная в \оц,2, варьировала в пределах 8-13, а соотношение высокореактивных антител к общему количеству антител - 80-100%. Согласно средним данным по группе кроликов, инфицированных на-тивными лейкоцитами с последующим развитием инфекции ВЛКРС, титры нормальных антител в РПГА постепенно снижались, достигнув минимального показателя 6.6+0,81 (^2) на третий месяц. Процентное соотношение высокореактивных антител также снижалось (до 63.0+5,18 %). Затем через 4-6 месяцев наблюдалось плавное повышение этих двух показателей с последующим их падением до уровня соответственно 5-7 (1о§2) и 40-60%. Анализируя данные отдельных кроликов, можно заметить, что перед гибелью животных происходило резкое снижение как титров нормальных антител к сальмонеллам и шигеллам, так и процентного соотношения высокореактивных антител.

Из 17 кроликов, бывших в опыте длительное время, 12 подверглось воздействию вирусной инфекции. Кролики, зараженные на-тивными лейкоцитами, и у которых развилась инфекция ВЛКРС, погибли в 1р0% случаев через 8-16 месяцев (по одному кролику через 8, 9, 12, 16 месяцев и два кролика на 13й месяц). У кроликов (6 голов), зараженных первоначально культурой клеток РЬК, а затем ре-инфицированных через 6 месяцев, соотношение выживших и погибших в течение опыта 3:3 (двое животных через 13 месяцев, один кролик - на 20й). Падеж кроликов происходил в разное время, находившиеся в контакте особи не заражались.

На основании клинических данных, дополненных осмотром при вскрытии и изучением гистопрепаратов, можно заметить, что

наиболее выраженной патологией были пневмонии (крупозная и катаральная формы) - 5 кроликов, множественные абсцессы, отиты паразитарного происхождения, хроническое истощение животных. Следует добавить, что по клиническому состоянию кролики, зараженные ВЛКРС резко отличались от животных из контрольных групп.

От павших кроликов брали пробы различных органов для гистологического исследования. Изменений в органах и тканях опухолевого характера ие было выявлено. В основном преобладали воспалительные и дистрофические процессы. В легких наблюдали различные стадии крупозной пневмонии (красная и серая гепатизация) . В печени - развитие хронического пролиферативного холангиогепати-та. В почках наблюдали различные патологические процессы, такие как острый гломерулонефрит, фибранозный нефрит, аденоматоз, зернистую и гиалиново-капельную дистрофию эпителия канальцев. При исследовании образцов лимфоузлов и селезенки от павших кроликов замечали гиперпластические изменения, увеличение количества клеток крови различной дифференцировки.

3.5 Изучение чувствительности первичных кулыпур клеток

СЭК и ЛЭК к В1У и оптимальных условий для репродукции вируса.

Для разработки диагностических методов и изучения биологических особенностей В1У необходим надежный источник вируса и вирусных антигенов. Наиболее удобной моделью являются культуры клеток.

Задачей нашего исследования было изучение чувствительности первичных культур клеток ЛЭК (легкие эмбриона коровы), СЭК (селезенка эмбриона коровы) к В1У и разработка оптимальных условий выращивания клеток для репродукции вируса.

Обе исследуемые культуры на первых пассажах представляли собой смесь клеток различной морфологии. В первичной культуре СЭК преобладали клетки округлой формы с ядерно-цитоплаз-матическим индексом примерно 1:2, в культуре клеток ЛЭК большую часть составляли полигональные фибробластоподобные клетки. Культура клеток ЛЭК имела большую потенцию роста, чем клетки СЭК (при пассировании в одинаковых условиях). В процессе постоянного пассирования фибробластоподобные клетки постепенно вытесняли другие виды, и культура становилась более однородной

При первичном заражении данных клеточных культур B1V наблюдали образование синцитиев на 3-4 день, при дальнейшем пассировании синцитии появлялись через 2 дня, а на 4-5 день они равномерно распределялись по всему монослою. Было проведено пассирование клеток с применением различных схем: без добавления неин-фицированных клеток и с добавлением. Установили оптимальное соотношение инфицированных ЛЭК- BIV клеток к добавляемым как 2:1.

Для наблюдения репликации BIV в данных клеточных культурах применили непрямой иммунопероксидазный тест с монокло-нальными телами к капсидному антигену BIV. Вирусный антиген обнаруживался в большой концентрации в цитоплазме как синцитиев, так и одиночных клеток. Иммунопероксидазный метод был использован для титрации BIV, при этом за инфекционную единицу принимали положительно окрашенную одиночную клетку или синцитий с последующим пересчетом в 1 мл исследуемого материала. В зависимости от различных факторов (вирусный изолят, клеточная концентрация и т.д.) титр BIV варьировал в пределах 103 -Ю3 инф. ед./мл, наибольшее количество инфекционных вирусных частиц содержалось в культуральной жидкости через 3 дня после пересева клеток.

Далее накопление антигена BIV оценивали с помощью имму-ноблота, для этого проводили электрофорез образцов лизатов как зараженных BIV, так и незараженных клеток в 12% полиакриламидном геле. После переноса белков на нитроцеллулезную мембрану ее инкубировали с поликлонапьной сывороткой, содержащей антитела к BIV, а затем в растворе протеина G, конъюгированного с |Ь1 (50 мкКю). Было установлено, что основную массу реагирующего антигена составляет капсидный белок BIV - р26, тогда как реакция с обо-лочечными гликопротеидами была очень слабой.

3.6 Конструирование плазлшдных векторов, содержащих

последовательность BIV и участки, гомологичные

бакуловирусной ДНК

В настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность BIV, составлены рестрикционные карты генома этого вируса и изучены открытые рамки чтения генов gag, pol, env. Мы выбрали следующие предполагаемые иммунодоминантные участки: на открытой рамке чтения гена gag нуклеотидную последовательность

от 631 до 1442 положения, названный gag3 и кодирующую полностью капсидный белок р26; и участок на открытой рамке чтения гена env - env8 от 7020 до 7645 положения, кодирующий МН2-терми-нальную часть трансмембранного гликопротеида.

В работе использованы две плазмиды фирмы «Invitrogen» -pBlueBacHis и pLV1393, которые содержали участки, гомологичные бакуловирусной ДНК, для возможности проведения рекомбинации. В последовательность плазмиды pLV1393 необходимо было включить старт-кодон АТГ в соответствующую рамку чтения. Участок gag-З был клонирован в обе плазмиды по сайтам BamH I - ВатН I; а env-8 только в pBlueBacHis по сайтам BamH I - Pst I. Старт-кодон АТГ, а также первый сайт BamH I и сайт Pst I были созданы искусственно, включив данную последовательность в праймеры при проведении полимеразной цепной реакции.

После успешной амплификации с помощью ПЦР оба участка были клонированы в pCR II вектор, далее плазмиды трансформировали в штамм E.coli DH5a . Коэффициент трансформации при ТА-клонировании был в пределах 5-24X10'' колоний на мкг ДНК. В результате проведения ПЦР получены фрагменты следующих размеров: gag-3, gag-3atg -1,27 Кб, env-8 - 0,6 Кб.

Отбор положительных колоний проводили, используя метод гибридизации с 32Р -меченным ДНК-зондом. Правильность ориентации вставок проверяли с помощью рестрикционного анализа различными ферментами : для pCR II gag-З и pCR II gag-3atg - Bgl II; для pCR II env-8 - Barn HI.

Следующим этапом стало рестриктирование плазмидных ДНК с последующей электроэлюцией необходимых участков и лигирова-ние их в плазмиды pLV1393 и pBlueBacHis. С помощью рестрикционного анализа (для pBlueBacHis gag-З и pLV1393 gag-3atg - Pst I, для pBlueBacHis env-8 - Xho I) проверяли не только правильность ориентации вставки, но и наличие множественных вставок.

3.7 Характеристика экспрессиирекамбинаитиых белков на основе бакуловирусного вектора с клоиироваииыми участками gag3 и env8.

Изучение репликации как дикого типа, так и рекомбинантного бакуловируса проводили на культуре клеток насекомых Sf-9. Данная культура клеток на разных уровнях пассажа имела одинаковую морфологию и состояла из мелких округлых клеток с ядерно-цито-

плазматическим индексом 4:6 - 5:6. Пересев осуществляли в соотношении 1:2,5, количество клеток удваивалось за 20-24 часа, монослой достигался к четвертому дню. В отличии от культур клеток млекопитающих, Sf-9 клетки после образования монослоя легко отрывались от поверхности.

Заражение диким типом бакуловируса (AcNPV) проводили из расчета 10-20 вирусных частиц на клетку. Со второго дня наблюдали образование характерных "окклюзивных тел" в ядрах клеток. Они (количеством 5-10) занимали пространство всего ядра и имели вид "жемчужных бусинок". Многие клетки отрывались от поверхности.

Для котрансфекции бакуловирусной ДНК с приготовленной плазмидной ДНК (pBlueBacHis gag3, pLV1393 gag3aTg, pBliieBacHis env8) мы использовали липосомный метод, который необходим для первичного попадания инфекционной ДНК в клетки. После этого ре-комбинантный бакуловирус реплицировался самостоятельно. Таким образом, мы создали рекомбинантный вирус, где имеются в наличии все компоненты дикого типа бакуловируса, за исключением белка полиэдры, и компонент BIV, кодируемый нашей вставкой.

Наблюдение за экспрессией рекомбинантного gag и gag3atg белка было существенно облегчено наличием разработанного в лаборатории непрямого иммунопероксидазного теста и моноклональ-ных антител к капсидному белку BIV. После первой котрансфекции и трехдневной инкубации, клетки были исследованы с помощью этого метода. В контрольных чашках (незараженные клетки и клетки, инфицированные диким типом бакуловируса) наблюдали бледный фон, т.е. белки Sf-9 клеток и бакуловируса абсолютно не реагировали с моноклонапьной сывороткой к капсидному белку B1V. А в опытной чашке на фоне негативно окрашенных клеток были замечены единичные клетки, окрашенные в различные оттенки от красного до темно-розового. При дальнейшем пассировании наблюдалось быстрое увеличение количества положительных клеток и появилась возможность титрации рекомбинантного бакуловируса.

Для получения лучшего штамма проводили пурификацию (очистку) вируса с помощью метода образования бляшек (скоплений мертвых инфицированных клеток) под твердым агарозным покрытием. Одновременно изучалась зависимость титра рекомбинантного gag3 бакуловируса от проводимой очистки, а также сравнение титров gag3 (pBlueBacHis)H gag3aTg (pLV1393). Можно заметить, что при

очистке с помощью бляшек отбираются лучшие изоляты, а рекомби-нантный вирус, полученный на основе последовательности плазмиды pLV1393, позволяет получить большее количество вирусных частиц.

Для изучения репликации env-8-рекомбинантного бакуловиру-са не удалось применить иммупопероксидазный метод из-за сильного сопутствующего фона. Поэтому была проведена ПЦР с ДНК из зараженных клеток, в результате был амплифицирован участок предсказываемого размера - 0,65 Кб.

Следующим этапом стали серии экспериментов с различными изолятами рекомбинантного бакуловируса, в которых экспрессию белков оценивали с помощью иммуноблота, так как этот метод является основным для доказательства иммунореактивности белков.

Для gag-3-рекомбинантного белка расчетная масса (на основании перевода нуклеотидной последовательности в аминокислотную) составила 57 КД. При проведении иммуноблота при любых условиях получали один результат - две линии, соответствующие белкам с молекулярной массой примерно 57 КД и 48 КД. Появление продукта немного меньшей массой, по нашему мнению, связано с наличием вероятного места расщепления.

Далее проводили эксперимент по изучению временной зависимости экспрессии белков. Для этого Sf-9 клетки заражались в соотношении количества инфекционных частиц к количеству клеток равному 10 и лизировались на 1 - 7 дни. Большее количество белка наблюдали на 3 день после заражения gag3 рекомбинантным бакуло-вирусом.

Расчетная масса для gag-3atg рекомбинантного белка - 33 КД; после проведения иммуноблота были выявлены три продукта с молекулярной массой 33 КД, 26 КД и 23 КД. Временная зависимость экспресии gag-3atg рекомбинантного белка оказалась сходной (максимальное количество белка на третий день).

Расчетная масса для env-8 рекомбинантного белка - 48 КД, в ходе экспериментов обнаружены белки молекулярной массой 50 КД, 46 КД, 42 КД, максимальное их количество наблюдалось на третий день.

4. ВЫВОДЫ

1. После введения кроликам внутривенно материала, содержащего вирус лейкоза крупного рогатого скота было установлено, используя РИД, ТСО и электронную микроскопию, развитие вирусной

инфекции. Антитела к ВЛКРС в РИД появлялись с 21 дня, их титр достигал 1:16 - 1: 32.

2. У зараженных ВЛКРС кроликов наблюдалось временное повышение количества лимфоцитов в пределах 30-60% по сравнению с контрольной группой как реакцию на введение инфекционного вируса. Опухолевых процессов у инфицированных животных выявлено не было.

3. Введение кроликам нативных лейкоцитов от коровы с пер-систентным лимфоцитозом вызывает более сильный иммунный ответ на антиген ВЛКРС, чем инокуляция клеточной культуры ИЛС.

4. У кроликов, зараженных ВЛКРС, наблюдалось снижение титров нормальных антител в РПГА (шигелезный и сальмонеллез-ный антигены) и уменьшение процентного содержания высокоавид-ных антител, что говорит о дисфункции иммунной системы.

5. Кролики, зараженные нативными лейкоцитами от коровы с персистентным лимфоцитозом, и у которых развилась инфекция ВЖРС, погибли в 100% случаях через 8-16 месяцев; зараженные клеточной культурой ЕЬК - в 50% случаях. Клинически выявлялись заболевания респираторной системы, а также хронические отиты, абсцессы. Гистологически обнаружены патологические процессы дистрофического и воспалительного характера.

6. Предварительные результаты по исследованию действия препаратов «Гамма-плант» и «Лозеваль» показывают, что кроличья биологическая модель может быть использована для изучения антивирусного действия различных препаратов.

7. При заражении ВТV первичных клеточных культур легкого эмбриона коровы и селезенки эмбриона коровы наблюдали прогрессирующее размножение вируса с образованием множественных син-цитиев. Установлено, что накапливаемый антиген при выявлении его методом иммуноблота представлен в основном капсидным белком.

8. В результате клонирования участков генов В1У^а£-3 и епу-8 в бакуловирусный вектор был создан новый рекомбинантный вирус, имеющий наряду с собственными и белки, распознаваемые антителами к В1У (иммунопероксидазный тест и иммуноблот).

9. Эффективность экспрессионного бакуловирусного вектора на основе плазмиды рЬУ1393 выше, чем аналогичный показатель при использовании длдя клонирования плазмиды рВ1иеВасН1з

1 У

10. Максимальная экспрессия рекомбинантных белков наблюдается на третий день после заражения культуры клеток Sf-9.

5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Предлагаем использовать кроликов как биологическую модель для следующих целей: моделирование иммунодепрессивного синдрома, изучение молекулярных аспектов патогенеза инфекции ВЛКРС, а также для тестирования противовирусных препаратов. Оптимальной схемой, по нашим данным, может быть заражение кролика в возрасте трех месяцев внутривенно в дозе 40-70х106 нативных лейкоцитов от коровы с персистентным лимфоцитозом. Главный метод наблюдения за течением инфекции ВЛКРС - реакция иммуно-диффузии (РИД).

2. Рекомендуем использовать в биотехнологии для получения антигенов ретровирусов экспрессионныю систему на основе реком-бинантного бакуловируса, особенно в случаях неудачных попыток использования экспрессионной системы E.coli.

3. Полученные нами данные могут быть использованы при чтения курса лекций по проблемам лейкозологии и иммунологии и при написании учебников и монографий по гемобластозам животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Касьян E.H. Изучение некоторых параметров течения ВЛКРС-инфекции у кроликов. // Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней животных: Сб. науч. тр. / Моск. госуд. акад. вет. мед. и биотехн., 1994, - С.143-147.

2. Крикун В.А., Касьян E.H., Чекановская Л.А. Влияние препарата «Гамма-плант» на развитие инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота у кроликов. // Актуальные вопросы инфекционных и инвазионных болезней животных: Сб. науч. тр. / Моск. госуд. акад. вет. мед. и биотехн., 1994, - С.147-151.

Размножено Юи экз., в Типографии "POToiiC"; зап.¿Иг. тясницкая, 35.