Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Характеристика капсульных антигенов Р. multoeida различных серологических вариантов

. и V. ; 1

На правах рукописи

■ ' г.

ПОПОВА ТАТЬЯНА ЕВГЕНЬЕВНА

ХАРАКТЕРИСТИКА КАПСУЛЬШХ АНТИГЕНОВ Р. ти11:ос1<1а РАЗЛИЧНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1997

Работа выполнена в лаборатории бактериологии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветерианри им. Я.Р.Коваленно и лаборатории молекулярных основ патогенности бактерий научно-исследовательского института эпидемиологии и мик робиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук,

профессор Э.А.Шегидевич, доктор биологических чаук, профессор Ю.В.Езепчук

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор В.А.Бурлаков (МВА)

доктор биологических наук М.Я.Ярцев (ВШИТиБП)

Ведущее учреждение - Московский университет прикладной биотехнологии

Защита состоится " <&f " Jc-W^ 1997 г.

в '0 час. на заседании Специализированного совета К.020.28.0] по защите кандидатских диссертаций во Всероссийском научно-иссле довательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко.

Адрес: Ю9472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией n >жно ознакомится в-научной библиотеке ШЭВ,

Автореферат разослан "

<У5 " 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Тг.Терешков

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность тема. Успешному развитию животноводства препятс-вует рял инфекционных болезней, в том числе пастереллезы сельско-эзяйственннх животных, вызываемые различными серовариантами .multoclda И P.haemolytlca.

Пастереллезы широко распространены во многих странах мира и эносят развитому животноводству значительный экономический ушерб \.Н.Борисенкова. 1971, 1983. Н.П.Чистов и др., 1973, Г.Ищенко и р.. 1983. В.И.Геведэе. 1986. И.Л.Мартиневский и др.. Г989. .А.Нурахметов, 1989. М.Г.Кереселидзе. 1992. В.П.Рютова. 1992, .R.Carter. 1967. 1981. N.MashJko et al.i 199?. K.R.Rhoade3 et 1.. 199?. G.Zhao et al.. 199?, J.R.Brlto et al.. 1993).

В связи с изложенным разработка надежных средств специфичес-эй профилактики пастереллезов является актуальным вопросом в лстеме противоэпизоотических мероприятий. На протяжении лесятиле-;1й отечественные и зарубежные исследователи пытаются создать [фектишше биопрепараты против этих болезней. Однако живые и ^активированные вакцины, созданные на основе целой бактериальной летки. во многих случаях ке обеспечивают желаемого эффекта вслед-гвии повышенной реактогенности и слабой иммуногелности.

В последние годы ведутся интенсивные исследования по разрабо-<е нового поколения биологических препаратов (химических вакцин) з основе антигенных комплексов, функционально относящихся к фак-зрам патогенности бактерий. Среди множества исследований следует мелить- работы по изучению поверхностных антигенов бактерий, в зстности антигенов капсульного слоя, объединенных в группу фякто-

зв патогенности с антифагоцитарной функцией. Накопилось немп.л о - ®

данных, подтверждающих высокую иммуногенную активность капсульш антигенов пастерелл. В связи с серологической и иммунологичесю неоднородностью пастерелл, полученные данные противоречивы, потенциальные возможности капсульной субстанции как протективно] антигена до конца не изучены.

Исходя из сказанного вытекает необходимость дальнейшего вс< стороннего изучения капсульного материала' пастерелл различи! серологических вариантов.

Цель и задачи исследований. Целью настояшей работы явило< выделение капсульной субстанции P.multoclda серологических вариа! тов А. В, Д. изучение ее физико-химических свойств и выявлен! возможности использования в качестве протективного антигена зи профилактики пастереллезов сельскохозяйственных животных.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Изучить характер образования и структуру капсульной субстанш P.multoclda различных серологических вариантов при культивирован] на твердых и в жидких питательных средах.

2. Отработать метод выделения капсульвых антигенов P.muitoci« различных серологических вариантов с проведением контроля ультр) структуры клеток.

3. Исследовать физико-химические свойства капсульных антигенов.

4. Изучить токсические и антигенные свойства капсульных экстра! тов.

5. В опытах на лабораторных животных изучить протективную актш ность капсульной субстанции.

Научная новизна. В сравнительном аспекте изучен характ< роста штаммов P.multoclda серологических вариантов А, В и Д жидких питательных средах различного состава с контролем структу]

шсульной субстанции в фазе экспоненциального роста. Определен фактер распределения поверхностных антигенов в процессе культи-|роввния штаммов пастерелл в жидких питательных средах. Впервые юведено сравнительное изучение токсических свойств водно-солевых [страктов капсульных антигенов пастерелл в тесте изменения массы ¡ла мышей и на культуре клеток ЛЭК. В опытах на мышах исследованы шуногенные свойства капсульных антигенов р.тииос1<1а различных ¡ровариантов с целью возможного их использования в составе компостных вакцин.

Практическая ценность. Результаты проверенных исследований >зволяют внести принципиальные изменения в технологию изготовле-1Я вакцин против пастереллезов сельскохозяйственных животных с 1етом особенностей роста пастерелл в жидких питательных средах. » основе выделенных и изученных антигенов были разработаны и готовлены пастереллеэные антигенные эритроцитарные диагностикумы 1Я контроля напряженности и продолжительности поствакцинального лмунитета, активности производственных гипериммунных сывороток, ¡ротипизации Р.тиПосМа. Исследования протективных свойств выде-знных экстрактов капсульных антигенов открывают возможности для совершенствования биологических препаратов против пастереллезов зльскохоэяйственных животных с учетом факторов патогенности пас-зрелл.

Апробация полученных результатов. Основные положения диссер-зшш доложены и получили поджительнув оценку на ежегодных засе-эниях Ученого Совета Всероссийского научно-исследовательского 1ститута экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко. Звслу-шы в качестве отчетов на производственных собраниях лабораторий зктериологии ВИЭВ и молекулярных основ патогенности бактерий

НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН РФ.

Публикации. По результатам исследований опубликованы 2 науч ные статьи. 2 статьи сданы в печать.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на I? страницах машинописного текста и включает введение, обзор литера туры, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы практические предложения и список литературы. Работа иллюстрирова на 15 таблицами. 19 рисунками. Список литературы содержит 26' источников, в том числе 155 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве итаммов-продуцентов капсульных антигенов использо вали производственные штаммы Pasteurella multocida (P.multocida серологических вариантов: А - штамм 1231, В - штамм В 681 и Д штамм Т-80. Штаммы хранили в лаборатории бактериологии ВИЭВ лиофильном состоянии при +4°С.

Для получения бакмассы использовали сывороточные агар и буль он на основе гилролизата Хоттингера. содержащие 10% сыворотк крови лошади, кровяной агар на основе гидролизата Хоттингера содержащий Ъ% дефибринированной крови барана, агар Дифко, синтети ческую среду 199.

Культивирование в жидких питательных средах проводили в кол бах на июйкере (180 об/мин) при 37°С в течение 24 ч. Культивирова ние на плотных питательных средах проводили в чашках Петри пр 37°С в течение 18-20 ч. Посевной материал готовили из свежей рас плодки лиофилизировь .ных культур, предварительно контролированны по общепринятым в микробиологии методам.

Морфологию клеток изучали в мазках, окрашенных по Гр8му Капсулу выявляли методом негативного окрашивания предварительн

тмытых клеток по Бурри-Гинсу (O.Moller. 1951). Для изучения ульт-|8структуры пастерелл использовали электронно-цитохимический ана-[из в ультратонких срезах. С этой целью отмытые бактерии суспенди-ювали в O.IM какодилатном буфере (рН 7.0). содержащем 5% глутаро-юго альдегида (v/v) и 0,15* рутениевого красного (w/v), и фикси-ювали 2 ч при 20°С. Фиксированные бактерии обрабатывали раствором голикатионного ферритина в конечной концентрации I мг/мл 30 мин три 20°С (R.Weiss et al.. 1979) и иммобилизовали в 4Я> агар Дифко. Толготовленные препараты обрабатывали 2% раствором тетраоксида зсмия в течение 2 ч. подвергали дегидратации в ацетоне и заливали э Эпоксидные смолы (Б.Уикли, 1974). Ультратонкие срезы контрастировали растворами уранилацетата и цитрата свинца и просматривали в электронном микроскопе JBH-lOOex при ускоряющем напряжении 80 kv и инструментальных увеличениях 16.000, 28.000. 53.000х. Данный раздел работы выполнялся под руководством и при участии в.н.с. лаб.физико-химических методов исследований и биотехнологии ВИЭВ Е.А.Асташовой и с.н.с. лаб.морфологии микроорганизмов НИИЭИМ им.Н.Ф.Гамалеи Н.В.КлицуновоЯ.

Растворимые капсульные антигены получали методом водно-солевой экстракции агаровых культур в 2,5% растворе ЯаС1 с непрерывным перемешиванием в течение I ч при 56°С (S.Maheswaran et al.. 1973,. B.syuto et al., 1982). Бактериальные клетки дважды осаждали при 13000 об/мин. . Супернатанты, содержащие капсульнне антигены, длализовали 48 ч против дистиллированной воды и стерилизовали через миллппоровские фильтры с мембраной типа GS-0,22. Процесс декапсулирования контролировали в тупевых мазках и в электронном микроскопе по описанным выие методикам.

Химический анализ включал определение содержания общего белка

в препаратах по методу o.Lowry (1970) и общих углеводов фенол-сернокислым методом (M.Dubois. 1956). Определение нуклеиновые кислот проводили по методу А.С. Спирина (1958).

Фракционирование антигенных препвратов проводили методок гель-фильтрации на колонке с ультрагелем АсА 44. Препараты элюировали 0,01 М фосфатным буфером (рН 7,0-7.1) со скоростью 6 мл/ч при +4°С. Фракции собирали по 3.0 мл. Общее количество белка, наносимого на колонку, составило 4,0-6,0 мг. Во фракциях контролировали экстиншно при 280 нм, содержание белка и углеводов. Колонн) предварительно калибровали голубым декстраном и белками с известным молекулярным весом.

Для изучения однородности антигенного материала и определения молекулярной массы белковых компонентов проводили одномерный электрофорез на вертикальных пластинах в 10% полиакриламидном геле е присутствии 0,156 додецилсульфата натрия (ДСН) в системе U.Laemmli (1970). Количество белка, наносимого на. дорожку составило 12-15 мкг. Разделение проводили в течение 6 ч при постоянной силе тока 20 мА. Образцы готовили на буфере, содержащем IЯ ДСН и 1% 2-меркаптоэтанола (МЭ). После фиксации гели окрашивали раствором, содержащем 0,25« Coomassie Brilliant Blue R-250.

Антигенную структуру и специфичность капсульных антигенов тестировали в реакции иммунодиффузии по H.Ouchterlony (1949). Реакцию ставили в слое 1,2% агарозного геля, приготовленного на стерильном физиологическом растворе (рН 7,1-7,2). Для образования преципитата гели инкубировали во влажной камере 48 ч при 37°С и 72 ч при +4°С. Отмытые и высушенные гели окрашивали 30 мин раствором Coomassie Brilliant Blue G-250.

Для получения сывороток на капсулыше антигены лиофильно

высушенные водно-солевые экстракты культур пастерелл трех изучаемых серовариантов разводили стерильным физиологическим раствором, гтандартизовали по белку до I мг/мл и вводили кроликам породы Пиншилла весом 2.5-3.О кг. Первые пять инъекций делали подкожно в эбъеме 2 мл с неполним адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. По-гледуюцие введения проводили внутривенно по 0.2. 0,3, 0.5. 0.8 и [.О мл. Интервалы между инъекциями составили 3 суток.

С целью получения сывороток к целой микробной клетке кроликов иммунизировали подкожно бактериальными суспензиями Р.muí too ida грех серовариантов, инактивированных формалином. Иммунизация включала 10 инъекций возрастающих доз антигена, начиная с 2 млдр/мл. с интервалом между инъекциями 3 суток. Через 10 дней после последней иммунизации и проверки активности сывороток в РПГА и РИД животных эбеих групп обескровливали, и получали сыворотку по общепринятой методике.

Токсическую активность экстрактов капсульных антигенов изуча-пи Б тесте изменения массы тела нелинейных белых мышей и в культуре клеток ЛЭК (легкого эмбриона коровы) по методике М.К. Зорошидовой (1964). В первой серии экспериментов антигены стандартизовали по белку от 200 до 500 мкг и вводили по 0,5 мл внутрибрю-iiiiHHo мышам живой массой 15-16 г. Контрольным животным вводили по ),5 мл стерильного физиологического раствора. Наблюдения за живот-тами ne .та в течение 7 сут с ежедневным контролем среднесуточных тривесов.

С иелью определения токсичности в культуре клеток ЛЭК из основной концентрация- каждого препврата готовили ряды двойных зазведений на культурэльной среде (1:2, 1:4. 1:8. 1:16, 1:32. [:64), вносили в пробирки с культурой клеток ЛЭК в концентрации

100 клеток в I мл й инкубировали при 37°С. Учет результатов проводили через 24-72 ч по изменению морфологии клеток и степени разру шения монослоя. Работа выполнена при участии с.н.с. лаб. биотехнологии культур тканей И.Л.Куликовой.

Изучение протективных свойств капсульных антигенов включал! опыты с однократной и двукратной иммунизацией белых мышей. Пр| однократной иммунизации антигены стандартизовали по белку до 251 мкг в дозе и вводили внутрибрюшшно по 0,6 мл. При двукратно! иммунизации антигены стандартизовали по белку до 125 мкг в дозе I вводили двукратно внутрибрюшинно по 0,5 мл с интервалом 14 суток Через 21 день после последнего введения антигенов животных опытны; и контрольных групп заражали вирулентными культурами р.тиПосЫа ! дозе I 1>б50. Наблюдения за животными вели в течение 7 суток. Уче1 проводили по количеству павших и выживших животных.

Статистическую обработку цыфровых данных проводили в соответ ствии с методами, описанными в работах П.И.Ашмарина и др. (1962) Е.В.Гублера (1978). Г.Ф.Лакина (1980). При оценке достоверност: различий использовали параметрический критерий г Стьюдента и вепа раметрический критерий и Вилкоксона-Манна-Уитни. Вычисление 50 летальной дозы (Ы)50) проводили по методу Кербера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ОСОБЕННОСТИ РОСТА И КАПСУЛ00БРА30ВАНИЯ Р.1ТшПос1<1а В ЖИДКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ На первом этапе работы было проведено сравнительное изучени кульгурально-морфологпческих свойств популяций пастерелл, услови образования и распределения капсульных антигенов с контролем ульт раструктуры клеток при культивировании в сывороточном бульон Хоттингера (рН 7,2-7,4) и синтетической среде 199 (рН 7,4).

- Б -

В процессе культивирования через каждые 1-2 ч отбирали пробы актериальной взвеси для определения накопления микроорганизмов по птической плотности (ОП). изменения рН среды, определения количе-тва жизнеспособных клеток (КОЕ).

Визуально было констатировано, что при выращивании пастерелл а двух вариантах питательных сред все штаммы давали рост с равно-ерным помутнением среды и образованием незначительного осадка на не колбы. В мазках, окрашенных по Граму, исследованные культуры ыли представлены типичными мелкими грамотрицательными клетками воидной формы. Динамика роста изученных штаммов P.multocida при ериодическом культивировании подчинялась обаим закономерностям азвития бактериальной популяции в жидких питательных средах с оследовательной сменой фаз. Продолжительность фаз варьировала в ависимости от состава питательных сред (табл.1). Сравнительный нализ показал, что в бульоне Хоттингера все штаммы развивались олее интенсивно с максимальной удельной скоростью роста (Цтах> от ,68 до 0,81 1/ч с отсутствием достоверных различий между штаммами р>0,05). Показатели концентрации биомассы к 6 ч роста по оптичес-ой плотности составили - 0,69-0,72. В синтетической среде 199 к 6 роста штаммы имели скорость 0,69, 0,63 и 0.67 I/ч соответственно ля серопариянтов А, В и Д. Концентрация бактериальной взвеси, онтролированная по оптической плотности, не имела достоверных азличий меаду штаммами (р>0,05) и составила в среднем 0.45, 0.4, .42. Более интенсивный рост отмечен в первые 5-6 ч у популяции .multociûa сероварианта А. Однако к 20-24 ч культивирования нако-ление бакмассн по оптической плотности было более выражено для томна сероварианта Д. Максимальное, количество КОЕ наблюдали в ультурах 6-часового роста, что составило в бульоне Хоттингера

Таблица I. Параметры роста Р.тиМоиАа серовариантов А, В, Д при

культивировании в бульоне Хоттингера и синтетической среде 199

пита?, среда

! ! ! серо- ! лаг-

вар.

фаза ч

!

! экспоненц 1

фаза, ч

! | оптическая плотность взвеси (Е),

В/ч | ч

5 ч роста

20 ч роста

бульон Хоттингера А В д 1,8 1,9 1,8 3.0 3.1 2,9 0,81 0,68 0,79 0,85 1,03 0,87 0,71 0,69 0,72 ± 0,015 ± 0,014 ± 0,014 0,9 ± 0,02 0,87± 0,025 1,3 ± 0,015

среда 199 А 2,8 2,1 0,69 1,00 0,45 ± 0,022 0,48± 0,03

В Д 2,7 2,5 2,1 2,5 0,63 0,67 1,06 1,03 0,40 0,42 ± 0,021 ±0,024 0,5Х± 0,022 0,55± 0,04

среда А 3,5 1,8 0,53 1,3 0,24 ± 0,048 -

199 + Ъ% глюк. В д 4,3 3,8 1,8 м ; 0,42 0,53 1,55 1,3 0,22 0,22 ±0,038 ±0,045 ■ ■ ■ - ■'■'.

0

1

Примечаний: - максимальная удельная скорость роста

$ - минимальное время удвоения генерации Е - оптическая плотность, 535 нм

:,02xI09, 1,99x10®, 2,03хЮэ в I мл. в синтетической среде 199 -

ООО

¡.7x10 . 6.59x10°, 6,42x10 в I мл соответственно для штаммов еровариантов А. В, Д. Однако в этой среде отмечен более интенсив-ый процесс отмирания клеток, который к 24 ч культивирования вырвался 1,9-2,2* КОЕ по отношению к 6-часовым культурам. В бульоне оттингера этот показатель составил II-I2S. Общая тенденция иэме-ения рН среды для культур в бульоне Хоттингера выражалась в заие-ачиваяии среды с 7,2 до 7,4-7.9. Для популяций, развивающихся в интетической среде 199. обнаружен значительный сдвиг в кислую торону с 7,4 до 6,2-5,7. При этом культуры сероварианта Л .muítoclda характеризовались самым сильным зааелачиванием среды, ередко до 8,0-8.1. в тоже время для культур сероварианта А отме-ено ярко выраженное закисление , среды. Биохимические свойства ультур как в синтетической среде 199. так и в сывороточном бульо-е Хоттингера были типичны для пвстерелл.

Попытка повышения качества среды 199 за счет увеличения в ней эдериания глюкозы до 5£ приводила к торможению роста пастерелл. взкому снижению рН до 5,0-5,2 и обратно коррелировала с количест-эм жизнеспособных клеток.

Изучение ультраструктуры пастерелл в фазе экспоненциального эста показало, что около 80% клеток, независимо от среды культи-лрования, имели строение/характерное для грамотрицателы'шх бак-зрий, но в среде 199 отличались большим полиморфизмом. Помимо 5эих черт в ультраструктуре P.multoclda выявлен ряд особенностей, зязашгах с серовариантпой принадлежностью штамма и типом питате-зНого субстрата. Это" касалось прегцге всего внеклеточного слоя. В гаороточном бульоне Хоттингера сероварианты А и Д формировали шсулу мелкозернистой, рыхлой структуры, специфически окрашенную

рутениевым красным и поликатионным ферритином. Толщина еб варьира вала от 15 до 75 нм. Отдельные участки в результате отторжени слизистого материала достигали размеров от 91 до 173 нм. Каисуль ный слой Р.ши11оо,1йа сероварианта В представлен тонким электроннс плотным слоем . Внеклеточное образование на клет

ках в среде 199 представлено скоплениями электронно-плотного мате риала, имеющего сродство как с рутениевым Красным, так и поликата онным ферритином.

Дальнейшие исследования продемонстрировали. что при культа вировании с непрерывным перемешиванием растущих клеток слабосв} занные поверхностные слои капсулы переходят в культуральную жи; кость, о чем свидетельствовало нарастание титров антигенов в С5 пернатантах бульонных культур вплоть ло фазы отмирания клеток, сывороточном бульоне Хоттингера к 8-9 ч их значение состава 1:98, 1:128, 1:126 соответственно для серовариантов А. В, Д. синтетической среде 199 - от 1:64 до 1:118. К 24 ч культивирован! уровень титров заметно снижался до 1:8-1:32 в зависимости от серс варианта и состава питательной среды.

УЛЬТРАСТРУКТУРА КЛЕТОК Р.тиПосД<1а, ВЫРАЩЕННЫХ НА ПЛОТНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ Сравнительное изучение культурально-морфологических свойс микробной популяции при культивировании на кровяном агаре Хоттш гера и синтетической среде 199, уплотненной агаром Дифко, показ! ло, что наиболее интенсивный рост пастерелл трех серовариант< наблюдали на кровяном агаре. На агаризованной среде 199 развивал! более бедный бактериальный газон. Все штаммы формировали колош з-типа и независимо от-состава питательной среды были представле] типичными грамотрицательными коккобактериями.

Изучение ультраструктуры пастерелл методом электронно-цитохимического анализа позволило выявить электронно-плотный внеклеточный слой, характер образования которого зависел от метода обработки бактерий и серовариантной принадлежности штаммов. При окрашивании рутениевым краснум у всех штаммов, за исключением сероварианта А, обнаружен тонкий электронно-плотный слой, тесно прилегающий к клеточной стенке. У пастерелл сероварианта А от этого слоя в радиальном направлении отходили короткие или слегка вытянутые выросты. При двойной обработке препаратов рутениевым красным и поликатионным ферритином экстрацеллюлярный слой на поверхности клеточной стенки большинства бактерий представлен электронно-плотными скоплениями, образованными в результате сочетанного отложения гранул поликатионного ферритина и рутенийпозитивного материала. Аналогичную картину наблюдали на ультратонких срезах клеток пастерелл. культивированных на агаризованной синтетической среде 199.

ПОЛУЧЕНИЕ РАСТВОРИМЫХ КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ Р.muí toeida И ИЗУЧЕНИЕ ИХ БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА Капсульные антигены из штаммов р.muítoeida получали методом водно-солевой экстракции агаровых культур пастерелл, которая включала выделение поверхностных антигенов 2,5% рйствором NaOl при непрерывном перемешивании клеток (180 об/мин) в течение I ч при 56°С. Полученные водно-солевые экстракты представляли собой неочищенные растворимые, преимущественно капсульные, антигены. Эффективность процесса экстракции, контролированная в электронном микроскопе, позволила установить, что длительное тепловое воздействие в гипертонической среде приводило к выраженным изменениям нуклеоида и цитоплазмы с образованием вакуолей, заполненных тонкими фибрил-

Таблица 5. Химический состав неочищенных калсульных антигенов штаммов Р.пшМсыфх- . культивированных на кровяном агаре Хоттингера

[ содерианиэ. основных химических компонентов в препаратах

типы ! до/после диализа

капсульнкх I-

антигенов

1 белок, иг/мл углеводы, мг/мл утл/белок* кислоты*

К 0,237^0,04 0,12720,03 0,53-0,59 0,007

0,186^0,02 0,110^0,02

0,308^0,03 ^ 0,151^0,03 0,49-0,48 0,006

0,23410,02 0,113^0,02

Ч 0,24620,05 0,1322^,03 0,53-0,55 0,008

0,17920,02 0,09820,02

лами. Во всех препаратах отмечено частичное отслоение и выпячивание клеточной стенки. Специфически окрашенный капсульный материал выявлялся слабо. Обнаружение рутениевого красного внутри клеток свидетельствовало об усилении проницаемости клеточной стенки бактерий.

Анализ нескольких серий препаратов свидетельствовал о том,' «то в процессе получения растворимых капсульных антигенов из кле-гок p.multoclda экстрагировался материал, включаюший вещества 5елковой и полисахаридной природы со следами нуклеиновых кислот [табл.5). Полученные данные не выявили существенных различий между 1таммами. Тем не менее, отмечено заметное влияние состава питате-ibHoro субстрата на качество полученных антигенов. Экстракты из ультур, выращенных на кровяном агаре Хоттингера, обнаруживали екоторое преобладание белковых компонентов, а из культур с агари-ованной среды 199 - углеводной фракции.

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА НЕОЧИЩЕННЫХ ЭКСТРАКТОВ КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ P.multoclda

В процессе гель-фильтрации через ультрагель капсульные анти-ейы серовариантов А и В элюировали в виде 2-х хроматографических иков, а капсульные антигены сероварианта Д разделялись на 3 пика.

Биохимический анализ фракций выявил неоднородность указанных репаратов по количеству белковых компонентов, их молекулярным эраметрам и распределению общего белка. Капсульные антигены серо-зрианта А формировали 3 белковые фракции с молекулярной массой 3, 42 и 12 кЛ. Основное количество белка распределилось в 1-ой и [1-й фракциях - 4Г и 50% соответственно. Капсульные антигены фовярианта В включали белковые компоненты с молекулярной массой соло 90 и 15 кД, которые составляли около 45л и общего белка.

наносимого на колонку. Капсульные антигены сероварианта Д элюиро-вали в виде 3-х белковых пиков, образованных компонентами с молекулярной массой около 110-120, 85-90 и 12 кД. Углеводные составляющие в данных препаратах формировали 4-6 углеводных пика в зависимости от штамма. Большая часть углеводов от общего количества I образцах представлена высокомолекулярными компонентами. Доля низкомолекулярных компонентов значительно ниже. Они элюировали в зон« выхода ниэкомолекулярных белковых фракций.

Результаты разделения экстрактов капсульных антигено1 Р.тиНосЫа. культивированных на агаризованной среде 199, такж< свидетельствовали об их молекулярной гетерогенности. Белковы< компоненты формировали 3 фракции, молекулярная масса которых варь провала в пределах 90-110, 30-45 и 13-15 кД. Характер распределе ния обшего белка свидетельствовал о преобладании низкомолекулярно: фракции (45-70$). Вещества углеводной природы формировали в про цессе разделения 5-7 пиков. По молекулярно-массовой характеристик' углеводные компоненты в данных препаратах могут быть разделены н три группы, среди которых низкомолекулярная фракция преобладала составила около 60-70%.

Подбор условий проведения электрофорезе показал, что наилуч шее разделение белковых компонентов- достигалось в ПААГ 10%-о концентрации в присутствии 0,1% ДСП и 1-2% 2-меркаптоэтанола. чт позволило выявить значительную неоднородность полученных препара тов по белковому компоненту. Характер распределения белковых фрак ций был индивидуальным для штаммов различных ссроварианто Р.тиИ;ос1с1а. Однако материал, экстрагированный из серовариантов и В, характеризовался высоким сходством между собой по количеств белковых компонентов <10-14) и по их молекулярно-массовым пароме1

уем. Материал, выделенный из штамма сероварианта Д P.multocida. сличался от первых двух и по количеству фракций (8-10), и по их сарактеристике. Основное количество белка распределялось во фрак-шях с молекулярными массами 84-86, 64-67 и 53-60, 37-39, 31-33 и >т 21 до 27 кД. Остальные присутствовали в виде минорных компонентов. В белковом спектре капсульных антигенов сероварианта Д выде-' шлись полипептиды, мигрирующие в области с молекулярными массами 17-39 и 31-33 кД. При сравнительном анализе было обнаружено, что фупные белковые фракции с молекулярой массой 64-67 и 54-60 кД, шалогичны таковым в образце среды роста. Экстракты капсульных 1Нтигенов пастерелл, культивированных на агаризованной синтетичес-;ой среде 199, также оказались в высокой степени гетерогенными и 1КЛЮЧ8ЛЯ от 15 до 23 белковых полос с молекулярной массой в преде-¡ax 14-94 кД. из которых 6-7 с молекулярной массой 84-86, 59-61, 9-41, 30-32 и 25-27 кД являлись основными.

Сравнительный анализ позволил установить, что при прогревании апсульных антигенов при 90°С в течение 4-5 мин с 2-МЭ и без него сдельные компоненты характеризовались различной электрофоретичес-ой подвижностью.

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ НЕОЧИЩЕННЫХ КАПСУЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ P.multocidá Полученный материал характеризовался высокими антигенными войствами. Серологическую (преципитируюиую) активность расчитыва-и как величину обратную минимальной преципитирушей дозе антигена пересчете на содержание белка. Степень ее зависела от типа сыво-отки. использованной в реакции, и серовариантной принадлежности таммов. Отмечена более выраженная серологическая активность кап-улышх антигенов с гомологичными антиснворотками. О наличие род-

ственных антигенных комплексов можно было судить по ойнаружени перекрестнореагирующих компонентов, но они проявляли меньшую акти вность.

Сложность состава выделенных антигенных препаратов подтверди лась и результатами иммунохимического анализа, в соответствии которым неочищенные экстракты капсульных антигенов Р.тиНос1<! различных серовариантов содержали от 3 до 4-5 комплексов, характе ризуюцихся различной скоростью миграции в геле вгарозы, сре/ которых присутствовали типо- и видоспецифические. Последние бы; частично или полностью идентичны в препаратах различных серовар» антова что свидетельствовало об общности их антигенного состав« Ярко выраженное сходство обнаруживали капсульные антигены серс вариантов А и В, В и Д. Среди перекрестнореагируюших компоненте были идентифицированы примеси питательной среды.

. ТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА'НЕОЧИЩЕННЫХ ЭКСТРАКТОВ КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ

Токсичность: растворимых капсульных антигенов Р. 1тШас1( различных серовариантов оценивали стандартным тестом на прибав! массы тела мышей и по цитопатогенному действию на культуру клет( ЛЗК. В результате первой серии опытов было установлено, что 1 один из антигенных препаратов в испытанных дозах не обладал лет льной активностью для мышей (табл.Ю). Однако анализ колебан среднесуточных привесов позволил выявить наличие токсической суб таяшш в антигенных препаратах серовариантов А и Д. действие кот рой проявлялось заметнее по мере увеличения дозы антигена и прол лялось либо снижением среднесуточных привесов, либо уменьшет; массы тела подопытных животных. Препараты сероварианта' В-были токсичны для лабораторных животных.

Таблица 10. Токсичность неочищенных капсульных антигенов из штаммов $.пш&оиЖо. культивированных на кровяном агаре Хоттингера

тип ! беЖ ! углев^в! среднесуточные привесы на дозе, ! дозе ! I животное в г мкг мкг }--;--

антигена

1 сут

2 сут

3 сут I

I итоговый I прирост I массы, г Т

% прироста к контрольн. весу

<о

I

Дх

200 85 0,488 0,588 0,656 3,1 N " 68

350. 148 0,213 • 0,375 0,364 2,7 59

500 207 0,172 0,148 0,332 2,5 44

200 82 0,272 0,492 0,448 3,1 68

350 144 0,402 0,670 1,109 4,0 68

500 • 201 0,325 0,645 1,080 5,1 ИЗ

200 101 0,264 0,336 0,354 2,9 67

350 176 0,008 0,140 0,219 2,0 40

500 239 -0,187 -0,175 . 0,152 0,7 8,8

Контрольные животные

0,710

0,512

1,030

4,5

100

Степень цитотоксического действия в отношении перевиваемо] клеточной линии варьировала от серовариантной принадлежности ютам ма и зависела от состава питательного субстрата. Наибольшей токси чностыо для клеток ЛЭК обладали экстракты капсульных ангигено Р.muítoeida серовариантов А и Д. независимо oí среды культивирова ния бактерий, и приводили к 80% разрушению монослоя. Антигенны препараты сероварианта В были менее токсичны, в аналогичных дозе они приводили лишь к 20%. разрушению монослоя. Прослежена боле выраженная токсичность экстрактов из штаммов пастерелл, вырашеннь на агаризованной синтетической среде 199 по сравнению с препарат« ми, полученными из клеток, выращенных на сывороточном агаре Хот . тингера. В целом, после внесения образцов наблюдали разрушен! монослоя, образование округлых клеток, появление зернистости цитоплазме. Компоненты питательных сред не оказывали токсическо! действия. Сопоставление результатов двух экспериментов продемонс рировало преимущества теста оценки токсических свойств бесклето ных антигенов на культуре клеток ЛЭК.

ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА НЕОЧИЩЕННЫХ ЭКСТРАКТОВ КАПСУЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ P.multocida : С целью выявления протективной активности экстрактов капсул ных антигенов Последние были испытаны в тесте активной заци мышей. Исследованию подвергали только антигенные препараты штаммов P.multocida, культивированных нэ кровяном агаре Хоттиш ра. Животных опытных групп иммунизировали однократно и двукратис последующим заражением вирулентными ; культурами гомологичных гетерологичных серовариантов P.multocida. В результате было ус1; новлено, что привитые Еивотные обладали достаточно выражет резистентностью к заражению, степень которой варьировала в завш

Таблица 14.

Показатели протективной активности неочищенных калсульных антигенов Р. тиЦос1<Ш^ при однократной иммунизации

тип антигена соотнош. 1 бел/угл ! в дозе, I мкг 1 ! ! заражающая { доза 1 иммунологическая эффективность в % при заражении культурами серовариан.

1 А В N А

^ 250/106 1 1 Део 2^6 10% 0

Вх 250/102 м 16,6* 27% 0

Ах 250/120 и _ 0 24,4% 40%

мости от типа антигена и схемы иммунизации (табл.14).

Иммунологическая эффективность при однократной иымуниэашн составила 28%. 27,1% и 40.033» соответственно ,пля капсульных антигенов серовариантов А. В. Д Р.тииос1<1а. Из табл. 14 видно, чтс более высокий защитный эффект прослеживался для капсульных антигенов типа Дх (штамм Т-80) Р.ти)Дос1с1а - 40*. При двукратной иммунизации процент защиты составил 50, 47 и 54,8% соответственно дл1 капсульных антигенов серовариантов А, В, Д . Наиболе!

высокие значения протективной активности зафиксированы в гомоло гичной системе заражения. В то же время отмечена различная степеН1 перекрестной протективной активности за счет наличия родственны; антигенных компонентов. Наиболее четко она была выражена мевд, серовариантами А и В Р.ти]Лос1<1а и серовариантами В и Д.

' ВЫВОДЫ

I. В процессе культивирования Р.тиНосЫа серовариантов А В, Д в жидких питательных средах выявлены различия между штаммам по удельной скорости роста, времени удвоения генерации, концентра или жизнеспособных клеток и степени их отмирания в зависимости о состава питательного субстрата. Наиболее выраженная гетерогенност популяций установлена по характеру изменения рН" среды. В сыворотс чном бульоне Хоттингера отмечали защелачивание среды всеми ттаммв ми, в синтетической среде 199 - закисление. Популяции р.гаиПоск сероварианта А защелачиваля бульон Хоттингера в наименьшей степе ни. но вызывали сильное закисление среды 199 (рН 5.7-5.8). Рази тие штамма сероварианта Д р.тиПос1йа сопровоадалось интенсивна звшелачивалием бульона Хоттингера (рН 7.8-8.1) и в наименьше степени закислешзем среды 199 (рН 6,2-6,4). Серопарипнт В по это; покезйтела занимал промежуточное положение.

2. Методом электронной цитохимиии установлено, что при культивировании в жидких питательных средах капсулъный материал пасте-релл в основном представлен кислыми полисахаридами. Характер образования капсульного слоя зависит от серовариантной принадлежности атаммов. В сывороточном бульоне Хоттингера пастереллы имеют выра-генный квпсульный слой с мелкозернистой, рыхлой структурой. На' ;интетической среде 199 они формируют более узкий капсульный слой з виде электронно-плотных скоплений.

3. В процессе культивирования пастерелл в жидких питательных зредах с постоянным перемешиванием на шейкере слабо связанный сапсульный материал переходит в культуральную жидкость. До стацио-?арной фазы происходит накопление поверхностных антигенов в среде. Максимальный титр (8-9 ч) в бульоне Хоттингера составил 1:98-[: 128. в синтетической среде 199 - 1:64-1:118. После 10^-12 ч роста >тмечено постепенное снижение титра поверхностных антигенов.

4. Установлено, что в агаровых культурах штаммы Р.тиНос1<1а рормируют капсулу полисахаридной природы. При обработке агаровых ¡ультур пастерелл 2.5% раствором Иа01 в течение I ч при 56°С были голучены неочищенные экстракты капсульных антигенов, состоящие из >ешеств белковой и углеводной природы со следовыми примесями ну-¡леиновых кислот. •

5. Методами физико-химического анализа установлено, что вод-го-солевые экстракты капсульных антигенов Р.гаиКос1<1а неоднородны ю молекулярной массе 'и электрофоретической подвижности. В их юстав входят выскомолекулярные и низкомолекулярные фракции белко-юй и углеводной природы.

6. Установлено, что экстракты неочищенных капсульных антиге-:ов Р.тиИос1Ла серовариантов А. В, Л обладают выраженными анти-

генными свойствами. Методом иммунохимического анализа установле! многокомпонентный состав капсульных антигенов, который включает о' 3 до 5 антигенных комплексов, различающихся по скорости миграции i геле агарозы. Более выраженную активность антигенов в РДП отмечен; с гомологичными антисывороками. что свидетельствует о специфичное ти взаимодействия.

7. При определении токсической активности неочищенных капсу льных антигенов Р.muí toeida различных серовариантов на культур клеток ЛЭК и по изменению массы тела белых мышей установлено нали чие токсической субстанции. Наиболее выраженный токсический эффек проявляют водно-солевые экстракты капсульных антигенов P.multooid сероварианта Д. Токсическая активность капсульных антигено P.multocida сероварианта В обнаруживается только на культуре кле ток. Показано преимущество метода оценки токсической активности использованием перевиваемой клеточной линии ЛЭК по стандартности чувствительности.

8. Установлено наличие типоспецифического протективного э4 фекта у капсульных антигенов пастерелл.Коэффициент иммунологичес кой эффективности при однократной иммунизации составил 28. 27. 4С для штаммов серовариантов А, В, Д. а при двукратной - 50. 47 и 54 соответственно. Способность стимулировать развитие перекрестно! иммунитета варьировала от серовариантной принадлежности гатаммог Наибольшей перекрестной защитой (24 и 43$) обладают кппсульнь антигены P.multocida сероварианта Д при заражении культуре P.multocida сероварианта В.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ I. Полученные результаты позволяют внести изменения н техне

югию промышленного изготовления вакцинных препаратов против пас-тереллезов сельскохозяйственных животных с учетом особенностей скопления жизнеспособных клеток и распределения капсульных анти-чзнов при культивировании в жидких питательных средах.

2. Материалы проведенных исследований по получению поверхностных антигенов Р.muí toe ida использованы при разработке и изготов-1ении пастереллезных антигенных эритроцитарных диагностикумов, :оторые в настоящее время применяются для серологического контроля ипериммунных противопастереллезных сывороток, а в перспективе удут использованы для ретроспективного контроля уровня напряжен-ости и продолжительности поствакцинального иммунитета и серотипи-ашш P.multocida.

3. Проведенные исследования являются научным обоснованием озлания компонентных вакцинных препаратов с учетом капсульных нтигенов пастерелл. обладающих протективными свойствами.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

I. Куликова И.Л., Попова Т.Е. Токсичность капсульных антиков P. nuUtcdda . Ветеринария, 1995, №7, с.25-28.

Й Попова Т.Е. Кртьтурально-морфологические свойства '. multceicfa различных серовариантов при культивировании а жид-их питательных средах различного состава. Еурнал микробиологии, пидемкологии и иммунобиологии, 1997, Jî 3, с. Ш

Формат б ОХГ Ч/гб Заказ Í2S-

Тираж

!одгтсзно в печать âi.OS 9?" сл. печ. л. -i,S~

Типография Россельхозакадемяя