Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Гипериммунная сыворотка против некробактериоза рогатого скота (получение и применение)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

(РАСХН)

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им. Я. Р. КОВАЛЕНКО

(ВИЭВ)

БОСХОМДЖИЕВА Елена Дорджиевна

ГИПЕРИММУННАЯ СЫВОРОТКА ПРОТИВ НЕКРОБАКТЕРИОЗА РОГАТОГО СКОТА

(получение и применение)

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

На правах рукописи

Москва — 1994

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко.

Научные руководители:

лауреаты Премии Совета Министров СССР, доктор ветеринарных наук, профессор Ю. Д, Караваев,

кандидат ветеринарных наук И. Н. Семенова

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор М. А. Лучко (ВИЭВ) кандидат ветеринарных наук Н. А. Масимов (МВА)

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

Защита диссертации состоится « » t^u^ifc. 1994 г. часов на заседании Специализированного Совета К 020.28.01. по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан « 1994 р.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

- I -

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Одним из суаестзенньтх факторов,препятствующим получению молока и говядины является высокая заболеваемость крупного рогатого скота копытной формой некробактери-оза,которая причиняет большие потери за счет снижения продуктивности,ухудшения ее качества, преждевременной выбраковки и высоких затрат на лечение при низкой эффективности.С этих позиций важным является разработка системы комплексных мероприятий, включавших изыскание эффективных методов и средств профилактики и лечения некробактериоза животных, среди которых серопрофилактика и серотерапия имеют немаловажное значение.

В отечественной и зарубежной литературе встречаются немногочисленные, часто противоречивые данные об эффективности использования гипериммунной сыворотки для профилактики и лечения некробактериоза животных. По сообщению Ф.И.Каган и Я.Р.Коваленко (1938).получены отрицательные результаты при лечении гипериммунной сывороткой некробактериоза телят. Позднее А.Г.Ревниаых и З.А.Балабырдина (1940) получили гипериммунную сыворотку, облада;-"; ющуга лечебными свойствами при некробактериозе северных оленей. Их данные были подтверждены я.У.Каис е*;.а1. (1977).которые использовали гипериммуннуга сыворотку для лечения больных некро-бактериозом овец. В доступной литературе за последние 10 лет не нашли сообшений о получении и применении гипериммунной сыворотки против некробактериоза животных. Опыт борьбы с некробак-териозом в нашей стране и за рубежом свидетельствует о том, что химиотерапевтические средства и антибиотики недостаточно эффективны и дорогостоящи,требуют постоянного применения во время вспышки эпизоотии, что приводит к затрате большого количества времени и ручного труда. В связи с этим разработка' средств специфической профилактики,а именно гипериммунных сывороток, используемых для лечения и профилактики - научно-обоснованы и весьма перспективны.

Учитывая вышеизложенное, вд считаем, что получение гипер- ' иммунной сыворотки против некробактериоза животных представляет научный и практический интерес.

Цель и задачи исследования. Целью наших исследований явилась разработка метода получения гипериммунной сыворотки против некробактериоза, контроля его и применения.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- провести отбор штаммов я* пеогорЬогит

и отобрать наиболее вирулентный и иммунногенный для получения сыворотки;

- использовать различные схемы гипериммунизации кроликов для получения гипериммунной сыворотки,наиболее оптимальную схему применить на коровах-продуцентах;

- разработать оптимальную схему гипериммунизации коров-продуцентов, позволяюпу» получить сыворотку с высокой агглютинирующей и превентивной активностью;

- подобрать наиболее оптимальный режим консервирования и лио-филизации гипериммунных сывороток крови и молозива;

- изучить лечебные свойства гипериммунных сывороток на больных некробактериозом животных.

Научная новизна. Проведен подбор штаммов Р.песгорЬогит по биологическим свойствам,и наиболее вирулентный и иммуноген-ный штамм предложен для изготоаления гипериммунной сыворотки.

Впервые разработаны схемы гипериммунизации коров - проду- . центов гипериммунной сыворотки крови и молозива.

Использование для гиперимкунизации в качестве инактивиро-ванных антигенов эндо- и экзотоксинов У.песгорЬопт позволило получить более активную сыворотку с широким спектром действия.

Установлена зависимость между агглютинирующей активностью, превентивными и лечебными свойствами гипериммунной сыворотки. Разработаны методы консервирования гипериммунных сывороток. Практическая значимость.Полученные результаты вошли в : Инструкцию по мерам борьбы и профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных, утвержденную ГУВ МСХ РФ ТУ " Гипериммунная сыворотка против некробактериоза рогатого .. скота", "Временную инструкцию по изготовлению и контролю гйпёр • иммунной сыворотки против некробактериоза рогатого скота", ТУ "Молозивная гипериммунная сыворотка против некробактериоза рогатого скота"."Временную инструкцию по изготовлению и контролю молозианой гипериммунной сыворотки против некробактериоза рогатого скота". Нормативно-техническая документация одобрена Ученым Советом ВИЭБ ( протокол № 17 от 22 октября 1993 г).

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и получили положительную оценку на меллабораторном совещании сотрудников и Ученом Совете Всероссийского научно-иссле-

довательскогй института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи.

Обьем и структура лиссертавди. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,собственных исследований, списка литературы. Работа с содержит 17 таблиц и 4 графика. Список литературы включает 245 источников, из которых 85 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материала и методы. Работа выполнена в 1990-1993 годах в лаборатории эпизоотологии,диагностики и профилактики болезней овец ВИЭВ, в хозяйствах Московской и Рязанской областей.

В опыте были использованы более 1000 белых даней,35 кроликов, 50 коров-продуцентов,

В работе использовали 3 штамма возбудителя некробактериоза, выделенные от разных животных. Два штамма взяты из лаборатории эпизоотологии,диагностики и профилактики болезней овец и один шта штамм выделен нами в процессе работе.

Морфологию возбудителя некробактериоза F.neorophorum изучали в мазках из бульонных культур, окраиенных по Грамму.

Культуральные свойства возбудителя некробактериоза исследовали в культурах,выраиенных на среде Китт-Тароцци в течение 18-20 часов при температуре 37-38°С. Сахаролитические свойства изучали на средах Гисса с индикатором Андредэ; протеолитические-на молоке и ШН; способность образовывать индол и сероводород -на среде Китт-Тароцци.

Вирулентность культур исследовали в острых опытах на белых мышах. Выращенную суточную культуру P.necróphorum. вводили вчутрибргаинно в дозах от 2,5x10 до 1,0x10^ м.к. в обьше 0,5 мл., используя по 5-10 кивотных на дозу. Концентрацию Р.пеого-рйогша устанавливали по оптическому стандарту мутности им.Л.А.■ Тарасевича. Результаты опыта учитывали в течение 10 суток. Опыт, повторяли а трех повторностях.

Для приготовления антигена использовали среду Китт-Тароцци с кусочками печени.Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 18-20 часов. По окончании культивирования супернатант отделяли от бактериальных клеток путем центрифугирования при 5500 об/тан в течение 30 минут, с последующим добавлением в супернатант сульфата аммония до 7С$-ной концентрации и диализа

в водопроводной воре и ПЭГ. Дня получения эндотоксина бактериальные клетки дезинтегрировали на ультразвуковой установке УЗД1-2Т. В. образцах зндо- и экзотоксина определяли содержание общего белка по методу Л'оури. Инактивации эндо- и экзотоксина проводили дробным добавлением 0,3% и 0,1% формалина при температуре 42°С в течение 14-16 суток. Стерильность антигенов определяли высевами на Щ1Б,ШБ,ША и среду Сабуро; безвредность -на белых мышах.

Контроль сыворотки. Стерильность сывороток проверяли высевами на МППБ.МПБ.МПА и среду Сабуро. Посевы выдерживали при 37-38°С (среду Сабуро при комнатной температуре 18-20°С) в течение 7-10 суток. Сыворотку считали стерильной при отсутствии роста на всех средах. Безвредность сыворотки контролировали на 5 белых мышах подкожным введением препарата в обьеме .0,5 мл. Сыворотку считали безвредной,если животные оставались здоровыми в течение 7-10 суток.

Активность сыворотки определяли в пробирочной реакции агглютинации (РА) и непрямой иммунофлюоресценции (РИФ). Специфичность сыворотки определяли в РИФ.

Превентивную активность сыворотки исследовали на белых мышах. Сыворотку и ее разведение вводили в обьеме 0,5 мл белым мшам. Контрольным животным вводили нормальную сыворотку коровы или кролика. Заражение проводили через сутки смертельной дозой культуры г.песгорйогит в дозе 0,5 мл. Гибель животных контро-> льной группы отмечали на 3-5 сутки. Учет вели по количеству выживших белых мышей.

Исследование иммуногенных свойств сызоготки проводили на белых мышах, для чего 200 мышам вводилась сыворотка ( по 100 •• мышей на каждую сыворотку крови и молозива), формировали группы по 10 мышей и проводили заражение каждой группы культурой возбудителя некробактериоза в течение 10 суток. Учет вели по количеству выживших животных. Контролем служили животные, получив шие сыворотку от здоровых коров или кролика.

Исследование сыворотки на наличие антитоксина к г.пеого-рЬогит проводили в реакции нейтрализации (РН) токсина в острых опытах на белых мышах. Дяя этого проводили двукратное разведение токсина в пробирках от 1:2 до Г:32 физиологическим раствором рН 7,2-7,4. В каждую пробирку вносилось по 0,5 мл сыворотки и 0,5 мл токсина. Пробирки "сыворотка + токсин" инкубирова--.

тсь d тормостаго при температуре 37°С в течение 30 минут.Белым мытам внугрибршинно вводилась araсь по 0,5 мл. Контролем служили животные, получившие сыворотку от здорового етзотного и гоксина.За тавотными наблюдали в течение 10 суток.

Для конозрвнрования применяли химические ваоэсгва -0,5$-янй раствор фенола, 0,45&-ний раствор формалина,мэртиолят натрия i хлороформ. Для лия:лизадии использовали нативную сыворотку.

Лечебные свойства типвриммунной сыворотки определяли на Зольных некробактериозом ответных в го благополучных хозяйствах. 1ля этого формировали 3 группы тавотных по степени порашэпкя .ссезчпости. Лечение проводили с использованием препарата про-53 ол.

Статистическая обработка результатов.

Полученные цифровые данные обрабатывались катодом вариада- ' энной статистики (Ю.Баюн,1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Подбор штаммов j'usoTMCtcrlum necroohopura.

Культуралыше , иорфолоптад скиэ .ферментативные свойства штампов "А™ ,"Б" и "В" были айшпнн для y.neosophorum.

В лазках из свежих бульонных культур ю.алг форду палочок к шпяяих нитей. Штегял "А" формировал шаровяднда г колбовпдяив «дутая. Штат "Б" характеризовался длинна;.® п короткими палоч-шях.Шшш "В" идол форму коротких палочек. Палочки пзрзходои i веккоойразнаа форма при длительных пересевах (243 месяца).

Куяьтуральние свойства были типична для P.nacrophorum. ía плотной питательной среде отмечался роет нз 2-3 сутки, в виде зосинок, з дальнэйиеи колонии увеличивались до 1-3 ш и имели перчэннга форма с зоной гемолиза. На среде Китт-Тароцци кудь-гуры ктбшов "А"/Б" и "В" давали рост через 18-20 часов. У возх гулктур через 2 сурок отдачалн езмоагглигинаерп), кусочки пвчвкк кжрнвалнсь ckishcthm палатой серого цката.

При опродэлэЕюг протаолитича екпх свойств культур г.пвсгорЬв-»й»-и;-иауталз способность их образовывать индол, сероводород, , зкэртнвать молоко н разотгать жзлатта. Все изученные тташы сультуря F.necrophoriM образовывали индол и выделяли озро-¡одород при культшзироватга на среда Кэтт-Тарсоди. Ни одна кз еультур ко саертывала иол око ж на разгажалп желатин. В наших >пытах к сахараи был активный атаки "А". Ферментировал арабпяо-

- 6 -

sy,глюкозу,мальтозу, сахарозу и слабо лактозу.

Вирулентность штаммов P-neorophorura . все изученные штаммы возбудителя некробактериоза были патогенными для белых мышей. Наибольшей вирулентность® обладал штамм "А". Летальной дозой (ДДдд) считаем культуру F.necrophorum с содарнакнем в объеме 0,5 мл 5х10®м.к.

Все исследованные штаммы имели высокую иммунногенную активность, сыворотка крови гапериммунизнрованннх кроликов в дозе 0,5 мл и 0,7 мл предохраняла от гибели 50% белых мышей.Активной считали сыворотку,предохраняющую от гибели 50$ иммунизированных мкшой в дозе 0,5 мл. Изучение превентивной активности сывороток крови кроликов к штаммам У.пеогоряогиш показала, что сыворотки, полученные к штаммам "А" и "Б",обладали широким спектром защитного действия и предохраняли от гибели белых мышей.

Разработка различных схем гипериммуниэащш кроликов.

Для получения гипериммунной сыворотки на кроликах нами . было разработано три схемы гидариммунизации анатоксинами 11 • neorophorun . кроликов массой 3,0-3,5 кг иммунизировала: I). она не дельно в течение 4-х недель в подошвенную часть мякиша лапки по 0,5 мл эндо- и 0,5 мл экзотоксина; 2) .еженедельно вводится подкожно антиген с ад^шангом (минеральное масло а лано-f!: же) по 0,1; 0,3;0,5;0,7 и 0,9 мл; 3).в первый день вводится I мл антигена с адъювантом.подкошю. Через 21 сутки -2 мл антигена с адъювангом. Через 10 суток посла второго -4 мл смеси антигенов.

В процессе гшвриммушзации от тавотных отбиралась кровь на 7,14,21,28 и 42 сутки после введения антигена. Сыворотки ис- ' следовали в.РА для выяснения динамики накопления агглютинирующих антител. Реакцию ставили по об не принятой методике.

Результаты исследований представлены в таблице I.

Как показано в таблице I, при гипериымунизации кроликов установлен выраженный иммунный ответ на введение антигенов из

P.necrophoruni .

При гипериммунизации кроликов штаммом "А" и изучения динамики спецификеских антител было установлено, что на 21 сутки пос-лю гиперкммуяизации выявлены наиболее высокие показатели титров антител -9,00*0,5 ;8,00*0,6 и: 8,33*0,3 . На 28 сутки посла гяпернммунизации происходит постепенное снижение титров антител по трем схемам -8,65*0,3; 6,25*0,2 и 6,33*0,3 Зо»,,. Сыворотка .

,, Таблица I

ЗЬгра сзэци&пя сках антител в сыворотке крови кроликов, шшршмунизированных шгешшш Р.пеогорЬогит ( М+а : п = 3 )

Шаш £ йошр I

Срока нссяэдозания

I

Защитные

| СНВЩ } Тигра агглютининов ( 1032 ) -1 свойства 1 сыворотки

! I 7 I 14 ! 21 I 28 ! 42

1 7,33+0,3 8,00+0,5 9,00+0,57 8,66+0,33 7,66+0,33 80

"А" г 7,30+0,1 8,00+0,64 8,00+0,61 6.25+0,25 6,00+0,4 60

3> 7,00+0,5 7,6&+0,33 8,33+0,33 6,33+0,3 6,0+0,5 50

£¿0,05 Р^0,05 Р^0,05 ЕгО,05 РЛ0,05

I б,зз+р,з - 7,0+0,57 8,66+0,33 7,66+0,33 7,0+0,5 70

"Б" 2 7,66+0,4 8,66+0,4 8,66+0,4 8,33+0,4 7,68+0,4 70

■ 3 6,66+0,4 7,33+0,4 8,33+0,4 7,66+0,4 7,33+0,4 50

РЬ 0,05 .Р < 0,05 Р<0,05 Рг.0,05 Р^0,05

I 8,66+0,3 7,33+0,3 8,33+0,6 . 7,66+0,3 7,33+0,3 40

"В" г 5,65+0,4 6,66+0,4 8,33+0,4 8,00+0,4 6,66+0,4 50

3 6,33+0,4 . 6,66+0,4 • 7.Б6+0.4 7,66+0,4 6,66+0,4 40

Р>0,05 Р?0,05 Р^.0,05 Р*: 0,05 Р^0,С5

кров к кролик os, получэ иная по ста из I с активностью 9i"og23 обеспечивала защиту 80% белых мышей от заражения культурой возбудителя некробактериоза штамма "А". Сыворотки,полученные, по схема 2 ы 3 с активностью 8 i»g2 соответственно, защищали от гибели 60 и Ь0% белых мышей.

При гкп9ршыуш5ацшг кроликов антигенами из штамма "Б" F.neo-горЬвгаткаиболее максимальная концзнтрацкя антител, наблюдалась на 21 сутки -8,66*0,3 ; 8,66*0,4 и 8,33*0,4 iog2 соответственно до схемам. Сыворотка крови кроликов, полученная по схема I ж 2, обеспечивала защиту от табели 70$ белых мышей, в то время как сыворотка полученная по схеме 3 в 50$ случаях.

При использовании антигенов ив штамма "В" для гипэршмуниза1-цаи кроликов получены менее активные сыворотки, титр антител на 21 сутки составил -8,33*0,6 ; 8,33*0,4 и 7,66*0,4 bg2.Сыворотки, полученные на штамм "В", обладали низкой превентивной активностью, соответственно по схемам процент защиты составил 50,40н-30#. Сшцифгаеекая активность сывороток крови, полученных от кроликов штаммада "А" и "Б" 1'.песгорЬогип(3ЫЛа более высокой, а индивидуальные колебаний титров антител минимальные по сравнении с другими (Р^.0,05). Разница титров в сыворотках,полученных на штамм * "Б" и "В" на 7,14 и 42 сутки статистически достоверны (В<0,05).

Наиболее активные саворогкя получены при гитришунизации кроликов в подошвенную часть мякиша лапки за счет стимуляции лимфатической системы. Так т высокие титры специфических антител получены при использовании схемы 2, при подкожном введении антигена с адъивактои в нарастаювдх дозах. Поэтому для ишэриы-иуяазацин коров-продуцентов объединили эти две схемы и олтямаль» кий вариант приманила иа этих асвотшх.

Разработка схемы гнпэшммунизадгог коров-продуцентов. сыворотки крови против некробактериоза рогатого скота.

Перед нами, была поставлена задача разработать оптимальную сааму гапериммунизации коров-продуцентов с целью получений сыворотки, обладающзй достаточной превентивной активностью при заболевании гокробактериозом животных.Нам предстояло выяснить динамику агглютинирующих ж превентивных свойств в процесса га-периммунизацни коров-продуцентов, а также коррелятивную зависимость ¡ленду ними.

Опыты по получению гипвршшунной сыворотка крова проводила в хозяйствах Московской в Рязанской областей.

Нами было приготовлено 4 серии гипериммунной сыворотки крови в неблагополучных по некробактериозу хозяйствах. В качестве продуцентов использовала здоровых коров в возрасте от 5 до 8 лет .весом 350-400 кг. Перед иммунизацией у коров-продуцентов отбиралась кровь и определялись в сыворотке крови естественные антитела к возбудителю ткробактериоза. Коровы-продуценты с титром агглютинирующих антител 1:2 допускались для эксплуатации. Для грундиммунизации использовали инактивированную эмульсия-вакцину (ВЮВ) против ткробактериоза рогатого скота в дозо 3 мл подкожно. Через 30 днэй проводили серийное введение анатоксинов.

Р.песгорЬогиш.

Схема гипэриммунизации коров-продуцентов сыворотки крови.

! ! !

^ ¡доза ( интервал ;

! антиге на I мэ аду интек,- • I

I (мл) |! циями (сутки) |

I. 2,0 3

2. "3,0 3

3. 5,0 3

4. ПО 1,0 I

5. 7,0 3

6. 9,0 3

7. по 1,0 I

метод введения антигена

подкожно

внутримышечно

подкожно

в правый предлопат очный и левый паховый лимфатические узлы внутримышечно подкожно

в левый предлопат очный и правый паховый лимфатические узлы

• Цикл гишришунизации длился 24 дня. .За этот период коровам-продуцентам било сделано по 7 инъекций антигена в нарастающих дозах до 30 см3 о интервалом мэвду инъекциями в 3 дет.

Пробы ашороткз от каждого аивотного исследовали в РА,за-■г&м смзшивалн к консервировали 0,5$-шш раствором фенола. Полученную сыворотку проверяли: на стерильность, активность и • безвредность.

Характеристика агглютинирующей и превентивной активности сыворотки крова приводана в таблице 2.

Из данных таблицы видно, что агглютинирующая активность сыворотки нарастала с первых-инъекций антигена 4,5*0,3 ; 3.75* 0,3 ; 3,5*0,3 а 3,75*0,3у® к третьей инъекции антигена

-io-

^аблкца 2 .

АгтазоТинирувдая я превентивная активность сыворотки крови ( M + uj п_= 4 ; Р^0,05 )

РА Jna-j 1Л РА ]па-\% 7 PAina-ji ! РА lm-Ш РА Jaa-Iii5°. Ijlo 1 » 1ло ! 1 1ло 5 I до 1 I !до t ! ! !___J__! ! !_J__!___J___]_!___I__! !мг/шг

1 14,5* 5 -5,75* 5 - 6,5* 4 20 7,75* 3 40 9,25*180

0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 58,0

2 3,75* 5 - 5,25* 5 - 6,25*5 - 7,5* 4 20 9,25* 2 60 56,0 ' 0,3 0,3 0,3 о;з 0*3

3 3,5* 5 -4,5* 5 - 6,75* 4 20 7,25* 3 40 8,25*2

0,3 0,3 0,3 0,5 0,3 60 54,0

4 3,75* 5 - 4,25* 5 - 7,0* 4 20 8,25* 2 60 9.25* I

0|3 0,3 0,3 0,3 : 0,3 80 57,0

Контроль 3 - 3 - 3 - 3 - . 3 -

Таблица 3

Аггяю^иниртедая активность сыворотки-крови и молозива. ( М£ M ; п = 3 ; P-z.0,05 )

IVi 1 Раа1ЩИЯ_§Г1Лю2шаг[ИЕ_______Д___:___Р И Ф__.__________•'■

03.4 Тсыв-ка крови__! сыв-ка молозивТТсыв-ка крови Тсыв-ка молозив,

?™_|за 14. ]ь день~| I удой[ 2 удой Isa Ï4 ,в денъ[~I удой) 2 удой .>„{,.,4до оТе-1 отела ! , 'до ото- отела! . -

' • ¡да I I J 1ла, ! I l

~Х б.сйТ^ЖПО* 9,33* ¡6,6*0,3 6,6*0,3"10Г3* 9^66* 0,6 0,3 ! 0,6 0,3

2 5,5*0,3 5,5*0,3 10,0* 9,66* '.6,0*0,3 6,0*0,3 11,0* Ю,Б*

o.é 0,3 î . o,è o,é

3 5,5*0,6 5,5*0,6 10,0* 9,33* i6,0*0,4 6,0*0^4 10.2* ; I0,3±

' o,é 0,6 ! оД o.à

'обш....." " ТГ ~ " " " " "

M*U 5,7*0,1 5,7*0,1.10Д± 9,44* {6,0±0,4 6,0*0,4 10.6* 10Д* ■0,1 0,1 j 0,2 0,2

в сыворотках.крови агглютинирующий титр составил 6,5*0,3; 6,75* 0,3; 6,25*0,3 и 7,0*0,31оз? . В отношении превентивных свойств установлено нарастание титров с трэтьэй инъекции антигена и по свэм группам достигла -20?». Наиболее активные сыворотки получены на 35 день гягориммукизацш,титры специфических антител составили 91°,з2 (9,25*0,3; 9,25*0,3 ; 8,25*0,3 и 9,25*0,3 1°32 ), древэнтившэ свойства в этот период достигли максимального уровня -80$ в сериях I и 4, 50% в озриях 2 и 3. Содержанке обща го белка в гипзриммушшх сыворотках отличалось незначительно, соответственно по сериям -58,0 мг/мл ; 56,0 мг/мл ; 54,0 иш/ил и 57,0 мг/мл.'

В наших опытах различия между выборочными средними величинами ( P«¿0,05 ) было достоверно на 12 и 35 сутки исследования. Различии мзкду данными средними недостоверна (. Р>0,05) на 8,

■ 16 и 28 сутки исследования. Коэффициент коррэляцая (г ), составивший значение (+0,90), свидетельствует о том, -что титры агглотншруйщюс.антптел находятся в прямой коррелятивной связи с ее превентивными свойствами.

В результате проведенных исследований агглстяЕирувщэй'ак--тивпосст и превентивных свойствах сыворотки крови установлено, что агготгвнируящая/активность сыворотки крови корсв-продуцен-тсв возрастает поста первых инъекций антигена, достигает максимального уроияя посла 7 инъекции. Превентивная активность сыворотки .коррелирует с титром агглстинирувпдх антител. Гипер-

■ иммуиную сыворотку крови считали активной при титре антител в РА.'- т няез 8 iog2 .

Агглютиеирующая и превентивная активность • . гигорашуннойсыворотки молозива.

Ишэуш/мунивацию коров-цродуцэнтов сыворотки из молозива пргоодаж до той■ so схэш, что и дал получения сыворотки крови, о той да& разницей,, что антиген вводили за 8-10 дней до отела э надшшшыЗ Ш'4отита екай узел. Опыте проведает в совхоза . и«ш 21 сиз да Ленинского района и в АО "Русское поле" Кашр-. саого ргфока Московской области. Для получения гаперишуннай .-еявороткк использовали молозиво первого к второго удоэв. Пробы сзворотки крови коров—продуцентов за 14 дней до отела, в день отела, сыворотку первого и второго-удоэв исследовала на наличие • сюцифиче ских антител в РА и Р®.

Результаты опыта приведены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 видно, что уровень специфических антител в сыворотке крови коров-продуцентов,полученных за 14 дней до отела и в день отела,были одинаковыми в РА и Р®, разница титров б реакциях составила 0,5 1°з2. Средние агглютинирующие титры грех групп животных составил в РА и РЙ5 соответственно- 5,7*0,1 и 6,0*0,4 1ог2 . Иол оз ив над сыворотка первого удоя имела высокий агглютинирующий титр специфических антител в РА- 10 1ов2(10,3* 0,6; 10,5*0,5 и 10,0*0,5 1оз2 ). Сыворотка второго удоя имела концентрацию антител в 9 1°з2 (9,33*0,3;9,66*0,3 и 9,33*0,6 1оег). Результаты исследований сыворотки молозива в РА и РШ незначительно отличались, о чем свидетельствуют результаты 81-89$ совпадавших данных опыта. Полученные данные использования РА и Р® свидетельствуют о примерно одинаковых активных свойствах этих методов. В дальнейшей работе использовали РА для определения специфических антител в сыворотках.

Концентрация антител в сыворотках молозива первого и второ:-, го удоев в 1,5-2,0 раза прзвышала его концентрацию в крови коров-продуцентов, полученной за 14 дней до отела и в день отела.

При изучении превентивной активности молозивной сыворотки получены следующие результаты.

Контрольные животные,которым вводилась сыворотка нэишуни-зорованных животных,погибли все. Пшериммунная сыворотка молозива коров-продуцэнтов предохраняла от заболевания и гибели 80-100^ белых мышей. При определении количества общего белка в гипериммунных сыворотках молозива отмечена взаимосвязь содержания в сыворотке общего белка а ее еащитных свойствах. Сыворотка молозива о содержанием общего белка -96,0 мг/мл (серия 2) предохраняла от гибели 100$ белых мышей при заражении их смертельной дозой культуры возбудителя некробактериоза. Сыворотка молозива.. ( серии I и 3) с концентрацией обив го балка- 93,0 мг/мл и 90,6' мг/мл предохраняли от заболевания и гибели 80$ белых мышей. Вся кшериммунные сыворотки молозива содержали концентрацию овщэго белка, превосходящего его содержание в гииериммунных сыворо?ках крови ("4-х серий ) в 1,5-2,0 раза.

Учитывая вышеизложенное нами установлено, что титры агглютинирующих антител в сыворотке молозива первого и второго удоев превосходили его содеряанго в сыворотках крови, до и после отела. Превентивная активность молозивной сыворотки связана с концентрацией специфических антител б сыворотке. Установлена коррелятивная зависимость между превентивными свойствами и содержанием

. общего белка в молозивной сыворотке. Реакция агглютинации являв гея простим, эффективным методом определения активности сы- . воротки, о чем свидетельствуй? 81-89$ совпадавших результатов в РА и РИФ.

Сравнительное изучение активности гипериммунных сывороток из крови и молозива коров-продудантов.

При выборе теста для сравнительного изучения активности га-периммунных сывороток мы остановились на превентивных свойствах сыворотки. Наш были испытаны гппериммунные сыворотки, плюющие уровень содержания антител в РА не ниже 9 1огг2 . Для сравнительного изучения превентивных свойств проводили двукратное разведение сывороток от 1:2 до 1:16. Сыворотку и ее разведение вводили подкожно,используя по 20 белых мышей на разведение. Через сутки заражали смертельной дозой культуры возбудителя нзкройактериоза. В наших опытах использовали два метода введения культуры Р.пеего-phorum'подкожный и внутрибрншшный для определения более чувствительного метода. Результаты опыта показали, что сыворотки крова и молозива в разведении 1:8 и 1:16 по превентивным свойствам не отличались от контроля, неиммунной сыворотки коровы. Нативная сыворотка крови и молозива обеспечивала защиту белых мышей от заражения смертельной дозой культуры р.псогорьогипсоответогвенно 80 и 100$. При активности сыворотки крови в разведении 1:2 при внутрибрвшинном и подкожном введении она защищала белых мышей в 30-40$, в то время как сыворотка молозива в разведении 1:2 предохраняла от гибели 40~50$.Прй разведении сыворотки крови 1:4' при внутрибрюшинном заражении процент защиты составил-- 50$, а сыворотка молозива в разведении 1:4 -20$. При подкожном зараяе:-: нии процент защиты сыворотки крови и молозива составил 10 и 30$ соотвез? стванно.

ЙЗ полученных данных установлено, что гипериммунная сыворотка молозета коров-Продуцентов в разведении 1:2 при внутрибрвшинном заражении предохраняла от гибели 30-40$ белых мышей. В наших опытах более чувствительным методом явлжтся внутрибршии-лое заражение белых мышей культурой p.neorophorun .поэтому в дальнейшей работе использовали этот метод и подкожный.

Определение иммунных свойств гипериммунной сыворотки крови и молозива коров-продуцентов.

Для испытания напряженности иммунитета белым мышам вводилась

гшюршмунная сквер отка крови и молозива в дозе 0,5 мл. Методика опыта представлена в собственных исследованиях.

Данные.опыта показали, что сыворотка крови и молозива предохраняли от заболевания и гибели белых мышей в первые двое суток после введения сыворотки в 80-100$. Незначительное снишние напряженности, иммунитета наблюдалось у кивотшх, привитых сывороткой крови,на 5-е сутки -60$ выживших, в то время как у животных,привитых сывороткой молозива, снижает® напряженности иммунитета наблюдали На 7-8 сутки после введения сыворотки, процент защиты составил -60$. В результате опыта установлено, что гипер-шмунная сыворотка крови и молозива против некробактериоза рогатого скота-обладает иммунными свойсгаами.Гигаримкунная сыворотка • крови и молозива,введенная sa 5...7 суток до заражения культуройF* песгорЬогит.заЕЗзд&ет' os гибели 60/? белых t/шей. У ■контрольных животных развивается типичный некробактеркоз к наблздаэгся гибель животных.

Определение активности экзотоксина и антитоксина 1 ■ 3 гипергомунной сыворотке крови и молозива. Для изучения активности экзотоксина готовили даукратне-з разведение токсина от 1:2 до 1:32. Белым мшам по 0,5 мл внутривенно вводили токсин/ и его разведения. В опыте использовали по .4 животных. Контрольный животным вводили до 0,5 мл физиологического рас- . твора. За опытными и контрольными животными наблюдали в течение ■ 48 часов. Учет вели по количеству павших.живопщ.

В результате проведанного опыта .установлено наличие-лвгаль-. ного б$|0ктв, вызываемого "токсином f.TiGcrophorum . Натизшй токсин и его разведение 1:2 вызывали гибель 100$ белых шюй. .'■".■'

При определении антитоксина в отдэрдамушшх сыворотках крови и молозива полученные результаты свидетельствует о наличии аши-' токсинов в сыворотках. Разведение тс;-:ста 1:32 в енвормжи кровк ' . ж молозива предохраняла белых мышей от гнбеАи. В^зведэни-э ч окати; 1:8 и 1:16-и сыворотки крови предохраняло от гибелг 75$ белее ■ шаей. Токсин в разведении 1:4 с'сиворонкой исшшва к крови обеспечивал . защиту 50$ белых мышей. СиБорогка"модоаа?а в разгедэше токсина 1:2 предохраняла от п:бо.та 25$ бегл-; шиз2.

В результате цреводанаых ошз-гов уетаноагано, что з cssoporte крови е молозава короа-цродтдот'оз содержатся аиги»сксЕш' к ваз-'будитеда некробактериоза. ■

Разработка методов консервирования сывороток.

В качество консервирующих веществ использовали 0,4^-яиЙ раствор формалина, 0,5%-ныа раствор фенола, мертиолят натрия в разведеда 1:10000, хлороформ (1чаетъ хлороформа и 99 частей сыворотки) .Для проведения исследования сыворотки крови и молозива разливали во флаконы из иод пенициллина по 3-5 мл. Оштша образцы помащали при температуре +1-60С и исследовали чорез каждые 30 дней з течение 12 мэсяцев. (срок наблюдения). С целью ^ сокрагения срока исследования' ш использовали метод Сг1от1вэ (1960) в модификации Ю.Д.Караваева (1956),суть которого заклю- ■ чается в том,что для определения продолжительности хранения превентивных свойств опытные образцы помешали при повышенных температурных условиях . С этой целью сыворотки паи тали при температуре ,37-38°С и выдерживали в течение 2 месяце^ (срок наблюдения). Исследование проводили каждые 10 дней. Образцы сывороток вводили мышам подкожно в дозе 0,5 мл. Через сутки проводили заражение культурой р.пссгорЬог-ит : Б объеме 0,5 мл.

В результата проведенных исследований получены следующие данные. При,исследовании образцов сывороток крови и молозива, консервированных фенолом и формалином,происходит незначительное снижение активности на 6-7 месяц хранения,затем активность стабилизируется, оставаясь на одном уровне. Сыворотки.консервированные хлороформом,снижали активность на 4-5 месяц исследования, в дальнейшем происходит потеря активности к 11-12 месяцу. Кивотные, • которым вводилась сыворотка.койсервированная мертиолятом натрия, гежело, переносили, препарат, гибеда.наступала чэрез нв сколько часов после введения препарата. ■ '' ■

При храквнии сывороток при темшратурв 37-38°С в течение 2-х иесяцэв наблюдалось снихениэ активности сыворотка »консервированной хлороформом,на 30 оугкя исследования. Гигоришужшэ сыворошг срова и молозива »коноэрвировашше фенолом и формалином,сохраняли аою активность в теченье срока исследования. • - Ишм:образом,бит сделана выводы, что сыворотки крови и' : юлойива^койсорвйрованныэ фенолом и формалином, сохраняют свои истинность в течете срока наблюдения (12 месяцев) по сравнения > хлороформом а трчиоляеон натрия.. Незначительное снижение, ак-'йвноаги сывороток происходит в горвыз 6-7 месяцев хранения при 'ЭМШратура +4°С,затем активность стабилизируется.

Лиофилизация гипериммунных сывороток.

Лио$илизацию сывороток крови и молозива проводили в установке фирмы."Эдварде". Активность препарата определяли по заболеваемости и гибели белых мышей. Лио^илззированную сыворотку оозраняли при температуре +4°С и при температуре 18-20°С.

В результате проведенных опытов установлено, что лио^или-зированные сыворотки крови и молозива оставались активными в течение 12 месяцев Серок наблюдения). Незначительное снижение активности лиофшгеированных сывороток наблюдалось в первые 6-8 месяцев при температуре 18-20°С и оставались на одном уровне до конца срока исследования. Активность лисфглизированных сывороток, хранившихся при температуре +4°С, не отличались от сыворо-. ток хранившихся при температуре 18-20°С. В процессе исследования было установлено, что хранение лио$илизированных сывороток крови и молозива при различных температурных условиях (+4°С и 18-20°С) не влияет на активность препарата.

Лечение больных некробактериозом животных гипериммунной сывороткой крови и молозива.

Ошты по лечению больных некробактериозом животных были проведены в неблагополучных хозяйствах Московской и Рязанской областей. Для лечения были отобраны три группы животных о различной стадией заболевания. Животных каждой группы разделили на две подгруппы. Гиперкммунную сыворотку крови и молозива вводили внутримышечно в дозе 100-150 мл двукратно, о интервалом 10-12 суток. Одновременно проводилась расчистка пораженных конечностей от омертвевших тканей. Животным X подгруппы применяла повязку о препаратом продеол, пропитанную сывороткой (на одну конечность использовали 2 г процеола в вида порошка и 5 мл сыворотки) .животным 2 подгруппы - процеол на применяли. Ватно-мар-лавая повязка фиксировалась на конечности бинтом и вновь сменялась через 4-5 суток.

В качества контроля в хозяйствах была отобрана группа больных животных, которым посла расчистки кошт от омертвевших ткапай и гноя были наложены повязки с процеол ом, смоченные водой.

Результаты опыта представлены- в таблица 4.

Представленные в таблице данные показала положительные рэ-, вультаты применения гипериммунной сыворотки креви в начальной стадии заболевания. У нивотных в этой стадии наблюдали юзначительное утолщаниэ конэчнодти.гдвогнло старается ш ишратьса

Таблица 4

Лечение больных некробактериозом животных гнгориммунной сывороткой крови.

Название |ста-¡кол-|дия ¡во |бо- ¡жи-

_кр^м_выз2оррвешта_швртных__

I подгруппа

1 ! 2 0ЙР-! 1 [2 обр. |

Вазго

_2_повру1®а__|

ПЗЗ иНпко-' новское" Московской области

8 10

6

б

5 4

I

2

3

I

4

Совхоз имени

12

Рязанской области

10 8

10

. 10

4.

8

2

5

2

5

Контроль I 2 3

3 3 3

на больную конечность,боль,хромоту. В I подгруппе аивотшх поо-ла первой обработки сывороткой крови из 18 коров выздоровело 9, посла второй - 7. Выздоровление наблюдали у 88$ нив от них. в точа низ 7 суток. Во 2 подгруппе из II коров посла шрвой обра-' ботки выздоровело -3, посла второй -7 коров. Выздоровление животных наблюдали у 90$ животных в течение 10-14 суток.

При лечении животных во второй стадии заболевания выздоровление наблюдали у 50-60$ животных. В I подгруппа посла юр-вой обработки выздоровлело- 3 коровы, после второй -8 коров из 18, что составляет -60$. После введения сывороткг а налогания повязки с препаратом нроцеол процесс заживлакая стал улучшаться язвы начинала покрываться грануляциями и мэДйЗННО рубцеваться. Выздоровление наблюдали в течение 14 дней. При лэчэши животных 2 подгруппы из 18 животных выздоровело -10 поохз второй обработки.Выздоровление наступало в течение 3-х.кедаль.

При лечении животных в 3 стадии заболевания, которая харак- • теризовалась язвами с изрытыми краями и гнойно-ткротичвским выделением с неприятным запахом,заживление ран происходило длительной время от 21 суток и более. В наших опытах из 33 животных выздоровело -19 коров. В I подгруппа после первой обработки I корова, после второй -9. Выздоровление наступало у 63$-животных в течение 3-х недель. Из 2 подгруппы посла шрвой обработки выздоровлена I корова, ВОСЛе второй - В шгвотных.Заживлениэ ран й выздоровление наблюдали у 50$ животных в течение 25-30 су-:_ Ток и более»

У ейвотйых контрольной группы внвдорошэше наблюдали в начальной стадии аайолаваййа в течение 21 суток и более.При второй и третьей стадии ааболэвакйя загйвлашга рол и вцздорсв-. лэнае йивотных не наблэдалв,.

Аналогичный опыт цо лачани» больных вакробшиераозсм животных шперйммунной сывороткой молозива была проведаны в хозяйствах Московской области. Сыворотка вводилась двукратно в дозе " 100-150 ыл,ькутрюыйэчно о интервалом 10-12 суток. Шрэд V введением шгзоротки был проведан клинический оваотр еиёогей. При втоа откачала поражения в основном тазовах конечностей, одной, рей поражались две конечное«!. Наиболее гдаэло дотекало й&бодзваййэ у коров с боль гай кассой тела л посз» сл.та» ' У киьотйах сниаалсй ышет клп волноигьв «еутасвал, с^агл- ■ ¿¡ась удои,отшчаласъ хромота на больную конечность.Порайонная .

';• . Таблица 5

Лечо нио некробакгеркоза еиеоргшх гипериммунной .сывороткой молозива

Найме нованиа~1^Та""! Кол-в о! _Еол-во_вазаоровмтх_^ отшз^! В се го

упчийгтт ! жгаот- „ТО1ШЯ . Г лечение ТЗез Т хозяйства |бо-_1шх __|

т ¡1 обр. I 2 обр.Т I обр.Т 2 обр«

3 2 1 3

Совхоз 1 3 -22

шла ни -----------— ------

21 съезда с т о л

Ленинского о -

района й 6 - 3 3

3 5 - 3 . 3

3 ' - II

1 10 4 5 9

Совхоз __5____________I___

"Лотошинский

Лотошинского о б I 4 5

района ю 2 4 6

3 10 I 5 5

8 --44

1 5 3 2 5

АО 5 I ' 3 4

"Русское поле"--------------'---.— -----

Каширского то т _ . о

района 2 1 ' 0

4 13 4

3 6 I 3 4 '

5 - 2 2

Контроль ' * 3 3

2 3 ^

3 3

конечность была болезненна к горяча на ощупь

Результаты'опыта представлены в таблице 5.

Из данных таблицы видно, что при лечении коров молозивной гипериммунной сывороткой наилзпшЕэ результаты получеш в начальной стадии болезни. В этой грунт животных после пврвой обработки выздоровело -Э коров, поеяе второй -8 коров из 18, выздоровление, наблюдали у 30$ животных в течение 7 дней. Бо 2 подгруппе выздоровело -2, посла первой обработки и 7 коров, поело второй обработки из 13 коров. Выздоровление наблюдали у 70? тавотных в течение 14 суток.

При лечении кивотиых больных второй стадией заболевания выздоровление в I подгруппе набладали у 17 коров из 23, что составляет 73?, -в течение 10-1 суток. Во 2 подгруппе выздоровело , из 20 коров -12. Закивлэше ран наблзздали в течение 21 суток.

При лэченЕи етзотннх божьнцх третьей стадией болезни, заживление ран происходило длительна? время от 18-20 суток в I подгруппа,так из 21 коров после первой обработки выздорсвело-2, после второй -XI коров, что составляет -60$. При лэчзшш животных 2 подгруппы набладали выздоровление у 7 коров повлэ агорой обработки из 16 животных. Заживление ран происходило дагэльноз время, более 21 суток.

Из контрольной грушш животных выздоровело 3 коровы в начальной стадии заболевания п I корова во второй стадии. Зажигание ран и выздоровление наблшдали в течение 21 суток и более.

В результате проведенного лечения нами било отмечено, что. в процесое выздоровления у животных появлялся аппетит, довивались удои до первоначального объема. В наших опытах лучшо результаты получены от применения сыворотки а налогалия ватко-кзр-ловой повязки с препаратом процеол. В результате опыта у станов- , лэно, что гипзришунныз. сыворотки "крови и иолозгва коров-продуцентов обладают выраженными лэчебныш -своИсгявшс в начальной и и второй стадии заболевания. Ваздоровлзпие наблвдзж у 60-90$ животных в течение 14 суток. ■

вывода

I. Впервые разработана ехэш- гипартгыунЕвацга коров-продуцентов, включающие использований в котэеш» инакгивироваиаах . • антигенов экзо- к эндотоксинов баэтергя некроза, для получения специфической гпшришунной сувоц отм кропи к кслозива предав юкробактариоэа.

2. При гипериммунизации животных штаммом возбудителя нвкробактериоза, обладающим высокой ток сито иной активностью,удается получить иммунные сыворотки с высокой превентивной активностью. Для повышения превентивных свойств гипериммунной сыворотки против некробактериоза трэд проведением гшгаримму-шзации коров необходил подбор штаммов возбудителя некробактериоза.

3. йгшриммунная сыворотка крови против некробактериоза рогатого скота содержала концентрацию агглютинируюгих антител в титрах 8 1ов2 и защищала го меюе 60-80$ белых мышей от заражения смертельной дозой культуры г.песгорьогши.

4. йше римму нная сыворотка молозива коров-продуцангов 1 содержала концентрацию агглютининов в титрах 8-9., имела широкий спектр защитного действия й предохраняла от заболевания и гибели 80-100$ белых мышей, при введении им летальной дозы возбудителя нвкробактериоза.

5. Сыворотка молозива парвого'удоя, полученная от гипзр-.иммунизированных коров, содержала обшвго бежа больше, чем -в гипериммунной сыворотке крови и по активности была выше в 1,5-1,9 раза.

6. Лиофилизированные гипериммунные сыворотки крови и молозива сохраняют свою активность при хранении при +4°С и 18-20°С в тачание 12 месяцев (срок наблюдения).

7. Сочетанное применение внутримышечного введения сыворотки и наложения повязки на рагавуга поверхность больной ко-

■ нэчности препарата процеол о сывороткой приводит к выздоровлению до 90$ животных в начальной стадии заболевания.-

практически: предлсшния

Материалы диссертации вошли в : Инструкцию по шрам борьбы и профилактики некробактериоза сельскохозяйственных животных, утвержденную ГУБ МСХ РФ

ГУ "Пшариммунная сыворотка против нзкробактериоза рогатого скота", " Временную инструкцию по изготовлению и контролю гипериммунной сыворотки против нвкробактериоза рогатого скота", ТУ "Молозивная гипериммунная сыворотка против нзкробактериоза рогатого скота", " Временную инструкцию по изготов--лашю и контролю молозивной гипериммунной сыворотки против некробактериоза рогатого скота". Нормативно-техническая до-