Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.04) на тему:Фармако-токсикологическая оценка препарата на основе мебендазола и празиквантела для дегельминтации собак

На правах рукописи

—— г-« г-« Г"3

ВЕРЕЩАГИНА 003050 1^

Любовь Алексеевна

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ МЕБЕНДАЗОЛА И ПРАЗИКВАНТЕЛА ДЛЯ ДЕГЕЛЬМИНТИЗАЦИИ СОБАК

16 00 04 — ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2007

003058126

Работа выполнена в отделе качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств для животных Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (Россельхознадзор) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации

Научный руководитель- кандидат ветеринарных наук, доцент

Виолин Борис Викторович

Официальные оппоненты доктор ветеринарных наук, профессор

Таланов Г А

доктор ветеринарных наук, профессор Архипов И А

Ведущая организация - Федеральное государственное учреждение «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» Россельхознадзора МСХ РФ (г Казань)

ЬО

Защита состоится « гг » ьЛЛАЛ 2007 г в ¿3 часов на заседании диссертационного совета Д 220 001 01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») по адресу Россия, 123022, г Москва, Звенигородское шоссе, д 5

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГУ «ВГНКИ»

Автореферат разослан «/^» 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент, Заслуженный ветеринарный врач РФ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Гельминтозы обширная группа болезней, в значительной степени определяющая состояние здоровья животных В течение жизни практически каждая собака переносит паразитарное заболевание

В Москве заболевания, вызываемые простейшими и гельминтами, занимают четвертое-пятое место среди других болезней животных (Белху Т Н, 2000) До 28% от всех заболеваний собак приходится на гельминтозы и гибель животных от данных болезней достигает 3,8% по отношению к другим заболеваниям (Авданина ДА и др , 2006)

Миллионы собак и кошек, находясь в непосредственной близости к человеку и являясь носителями гельминтов, представляют опасность для своих хозяев, а, загрязняя внешнюю среду испражнениями, содержащими возбудителей заболеваний, представляют угрозу для окружающих животных и людей (Верета JI Е, 1986, Беспалова Н С, 2003, Веденеев С А, 2004, Архипов И А и др , 2006)

В Центральном регионе нашей страны в крупны?, городах среди паразитарных болезней собак преобладают токсокароз, дипшшдиоз, токсаскаридоз и унцинариоз

Рациональное лечение гельминтозов, как правило, основано на этиотропной терапии плотоядных животных антигельминтными лекарственными средствами Учитывая, что животные поражаются несколькими видами гельминтов, для дегельминтизации собак чаще всего применяют комплексные препараты на основе цестодоцида - празиквантела и нематодоцида — пирантела Длительное использование одних и тех же антительминтиков постепенно привело к распространению резистентных популяций паразитов (Головкина JIП , 2001, Саушкин В В , 2001, Тимохина Ю В , 2002, Дубинина И Н , 2004, Duarte Z et al, 1994) Так в Голландии от овец были выделены альбендазолрезистентные Haemonchus contortus (Fred Н М et al, 2007), в Швейцарии от коз и овец выделены авермектинрезистентйые Haemonchus contortus and Trichostrongylus sj3p (Artho R et al, 2007), в Аргентине от телят выделены ивермектинрезистентные Соорепа and Ostertagia (Suarez V Н et al, 2007), в Австралии от телят выделены бензимидазолрезистентные Соорепа oncophora and Ostertagia ostertagi (Wmterrowd С A et al, 2007) Также в Австралии Kopp S R с коллегами (2007) установили, что у собак активность пирантела эмбоната в отношении Ancylostoma canmum снизилась на 1720%

В связи с данным положением разработка новых антигельминтных средств является не только актуальной проблемой, но и пракгически необходима

Учитывая, что применение рационально подобранных сочетаний противопаразитарных соединений на длительный период времени может решить проблему борьбы с резистентными популяциями гельминтов, нами был предложен новый комплексный антигельминтный препарат на основе мебендазола и празиквангела в форме таблеток

Таблетки являются одной из наиболее удобных лекарственных форм, так как дают возможность точной дозировки лекарственного средства животным в домашних условиях, просты в применении и достаточно легко задаются животным

Среди антигельминтных средств, действующих на нематод, широкое распространение получили производные бензимидазолов Одним из характерных представителей этой группы является мебепдазол, который обладает низкой токсичностью, благодаря чему нашел широкое применение в медицине, в том числе в педиатрии Учитывая, что мебендазол раннее не применялся в России для лечения гечьминтозов плотоядных, и к нему, вероятно, отсутствуют резистентные изоляты нематод, он был выбран в качестве одного из действующих веществ лекарственного средства (Бене Ф , 1999, Якубовскии MB и др , 2003, Rew R S et al, 1986, Genchi С et al, 1990, Dollery С T, 1999b, EMEA, 1999, Dayan A D , 2003) Принимая во внимание, что собаки, как правило, поражены несколькими видами гельминтов, для расширения противопаразитарного спектра действия мебендазола, в качестве второго действующего компонента в состав препарата был введен празиквантел, нарушающий нервно-мышечную регуляцию паразитов, высокоактивный в отношении цестод (Баядина ДГ и др , 1981, Белоусов М Н , 1988, Andrews Р et al, 1975, Frohberg Н et al, 1981, Frohberg H , 1984, Diekman H W et al, 1976, Murmann P. et al, 1976, Scubert J et al ,1977)

Цели и задачи исследования

Разработать на основе мебендазола и празиквантела новый противопаразитарный препарат для лечения гельмингозов собак

Дчя этого было необходимо

- обосновать состав и разработать лекарственную форму комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела,

- разработать методы контроля для стандартизации качества препарата, изучить его стабильность в процессе хранения,

- изучить острую и субхроническую токсичность препарата на лабораторных животных,

- изучить субхроническую токсичность препарата на собаках,

- изучить фармакокинетику мебендазола и празиквантела в организме собак после применения препарата,

определить терапевтическую эффективность комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела, и разработать схему его применения для лечения гельминтозов собак Научная новизна

Впервые разработан комплексный противопаразитарный препарат на основе мебендазола и празиквантела для лечения гельминтозов собак

Установлены параметры безопасности комплексного антигельминтного препарата для животных, описана фармакокинетгаса мебендазола и празиквантела в организме собак, подобрана оптимальная схема лечения гельминтозов собак

Практическая ценность работы

Разработан и предложен для ветеринарной практики комплексный антигельминтный препарат на основе мебендазола и празиквантела в форме таблеток для дегельминтизации собак

Разработаны качественные и количественные методы контроля комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела в форме таблеток Установлен срок годности препарата

Разработана схема применения комплексного противопаразитарного препарата дня дегельминтизации собак

Разработана нормативная документация — Стандарты организации (СТО) и инструкция по применению комплексного антигельминтного препарата для дегельминтизации собак

Основные положения, выносимые на защиту.

- Качественные и количественные методы контроля комплексного антигельминтного препарат на основе мебендазола и празиквантела для лечения гельминтозов плотоядных животных

- Результаты изучения стабильности комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела

- Результаты изучения острой и субхронической токсичности лекарственного средства в опытах на лабораторных животных

Результаты изучения субхронической токсичности препарата в ' опытах на собаках

- Результаты исследования фармакокинетики лекарственного средства в организме собак

- Результаты изучения терапевтической эффективности препарата при гельминтозах собак

Практические предложения по применению комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела в ветеринарии

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 163 листах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, выводы, обсуждения, практические предложения и список литературы Работа иллюстрирована 34 таблицами, 3 графиками Список литературы включает 234 источника в том числе 115 на русском языке и 119 на иностранных языках

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы исследований.

Работа выполнена в 2004-2006 гг В опытах было использовано 200 белых мышей обоего пола массой 18-21 г, 10 белых крыс массой 180 — 195 г, 24 собаки массой тела 7,1 — 14,7 кг Клиническое испытание препарата проведено на 86 собаках

Для стандартизации и контроля качества препарата, а также изучения его стабильности при хранении, в соответствии с требованиями, предъявляемыми к таблеткам, были предложены методы качественного и количественного определения действующих веществ препарата с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и тонкослойной хроматографии (ТСХ)

Изучение стабильности таблеток комплексного антигельминтного препарата проводили в соответствии с «Временной инструкцией по определению сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенных температурах» Образцы препарата экспериментальных серий в промышленной упаковке помещали в термостаты при температурах 37 и 50° С на срок, соответствующий 5 годам хранения и исследовали через промежутки времени, эквивалентные 1 году

Оценку качества препарата в процессе хранения проводили по основным показателям внешний вид, цвет, средняя масса таблетки, распадаемость таблетки, подлинность мебендазола и празиквантела, содержание действующих веществ, микробиологическая чистота Содержание мебендазола и празиквантела в препарате определяли методом ВЭЖХ

Острую токсичность таблеток комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела изучали на 80 беспородных белых мышах обоего пола массой тела 19-21 г Таблетки предварительно измельчали в ступке до гомогенного порошка Препарат вводили однократно, внутрижелудочно через зонд в виде взвеси на 1,5%-ном

растворе крахмала в дозах от 800 до 1400 мг/кг массы тела Каждую дозу препарата испытывали на 10 белых мышах

Наблюдение за клиническим состоянием животных проводили в течение 7 суток после введения препарата, учитывали количество погибших животных в зависимости от дозы препарата и рассчитывали токсикологические параметры LDi6, LD50 и LD84 по методу Литчфилда и Уилкоксона (Беленький М Л , 1969)

Субхроническую токсичность препарата изучали на 120 беспородных белых мышах обоего пола с начальной массой тела 18-20 г, разделенных по принципу аналогов на 4 группы по 30 голов в каждой Препарат вводили ежедневно в течение 20 суток перорально в желудок при помощи иглы с оливой в 2%-ном растворе крахмала в дозах 1 группа — 1/5 LDS0 (224,6 мг/кг массы тела животного), 2 группа — 1/10 LD50 (112,3 мг/кг массы тела животного), 3 группа — 1/20 LD50 (56,15 мг/кг массы тела животного) Животным 4 группы вводили 0,5 мл 2% раствора крахмала (контрольная группа) Наблюдение за клиническим состоянием животных вели на протяжении 31 суток с момента первого введения Определение массы тела у всех животных проводили до начала введения препарата и на 7, 14, 21 и 31 сутки опыта

Для выявления возможного гепатотоксического действия препарата на 21 и 31 сутки от начала введения препарата на 10 мышах из каждой группы проводили определение детоксицирующей функции печени с помощью гексеналовой пробы Гексенал белым мышам вводили внутрибрюшинно в форме 0,2% раствора в дозе 60 мг/кг массы тела Учет времени сна начинали с момента принятия мышами бокового положения и заканчивали при появлении координированных движений

В эти же сроки на других 10 мышах из каждой группы изучали компенсаторно-приспособительные способности организма с помощью функциональной пробы плаваньем У этих же 10 мышей из каждой группы определяли относительную массу (коэффициенты) внутренних органов печени, почек, сердца, легких, селезенки, учитывая, что изменение массы органа, как правило, ведет к изменению его функциональных способностей (ГацураВ Н , 1976)

На 21-е сутки у подопытных животных брали кровь для клинического и биохимического анализа Анализ крови проводили фотоэлектроколориметрическим методом на биохимическом анализаторе «HUMALYZER JUNIOR» (Германия) и гематологическом анализаторе «IBX MICROS» (Германия)

Исследование субхронической токсичности завершилось макроскопическим исследованием жизненно важных органов и систем организма

С целью изучения поведенческих реакций при введении субтоксической дозы комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела 10 крысам массой 180-195 г однократно перорально в желудок с помощью иглы с оливой в 2%-ном растворе крахмала вводили препарат в дозе 1/5ЬО50 Оценивали поведенческие реакции — двигательную активность, реактивность, агрессивность, нервно-мышечные реакции — тремор, судороги, расстройство походки, реакцию на прикосновение, силу хватки, вегетативные реакции — размер зрачка, саливацию, состояние волосяного покрова, окраску слизистых оболочек, количество и консистенцию фекальных масс, частоту мочеиспускания и окраску мочи, цвет кожи

Для изучения субхронической токсичности препарата на собаках было отобрано 19 животных, в возрасте от 13 до 18 месяцев и массой тела от 7,1 до 13,2 кг

Для проведения опыта собак разместили в вольерах по 2 или 3 головы в каждом Всех животных разделили на 4 группы, которым давали препарат перорально 1 раз в сутки натощак утром с мясным фаршем в течение 15 дней в различных дозах

1 группа (3 кобеля, 2 суки) - пятикратная терапевтическая доза (5 таблеток

на 10 кг массы тела),

2 группа (2 кобеля, 3 суки) - двукратная терапевтическая доза (2 таблетки на

10 кг массы тела),

3 группа (3 кобеля, 2 суки) - терапевтическая доза (1 таблетка на 10 кг массы

тела),

4 группа (2 кобеля, 2 суки) - контрольная группа

У животных регистрировались показатели, указанные в таблице 1 Табл 1 Показатели регистрируемые у подопытных животных

Показатели Животные Регистрация

Общее состояние Все Ежедневно

Взвешивание Все до опыта, 8 и 16 сутки

Гематологические и биохимические исследования Все до опыта, 8 и 16 сутки

Физиологические исследования Все до опыта, 8 и 16 сутки

Макроскопические исследования Все 16 сутки

Гистологические исследования 1 группа - 2 животных 2 группа - 2 животных 3 группа - 2 животных 4 группа - 1 животное 16 сутки

Фармакокинетику препарата после однократного введения препарата в дозе 1 таблетка на 10 кг массы тела животного (10 мг/кг массы тела мебендазола и 5 мг/кг массы тела празиквантела) изучали на 5 беспородных собаках в возрасте 4-5 лет и массой тела 11,1-14,7 кг В течение первых суток после введения препарата с интервалом 0,5, 1, 2, 3, б, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 часа после дачи препарата у животных брали кровь в гепаринизированные пластиковые пробирки, центрифугировали, отбирали плазму, в которой методом ВЭЖХ определяли содержание мебендазола и празиквантела Предел количественного определения празиквантела составлял 0,06 мкг/мл плазмы, а мебендазола - 0,08 мкг/мл плазмы

Терапевтическую эффективность антигельминтного препарата изучали на базе ветеринарных клиник г Москвы, Всероссийского научно-исследовательского института гельминтологии им К И Скрябина, ветеринарной станции по борьбе с болезнями животных Ельниковского района Республики Мордовия

Диагноз ставился по результатам копроовоскопических исследований методом флотации с использованием в качестве флотационной жидкости раствора сернокислого цинка При этом учитывали количество яиц гельминтов в 1 г фекалий животных при использовании счетной камеры ВИГИС до и через 10 дней после дачи препарата

Эффективность препарата рассчитывали в опыте типа «критический тест» согласно Руководству, одобренному Всемирной Ассоциацией за прогресс ветеринарной паразитологии (1994)

Статистическую обработку полученных результатов проводили методами вариационной статистики Ю С Малета и В В Тарасова (1982)

Результаты исследований

Для стандартизации и контроля качества комплексного антигельминтного препарата, определения сроков его хранения нами были предложены методы исследования качества препарата в соответствии с требованиями, предъявляемыми Государственной фармакопеей (XI издание) к таблеткам, включающие определение внешнего вида и цвета таблетки, ее массы, длительности распадаемости, определение массовой доли мебендазола и празиквантела. определение подлинности мебендазола и празиквантела, определение микробиологической чистоты

Метод определения подлинности мебендазола и празиквантела с использованием ВЭЖХ одновременно является методом его количественной оценки Совпадение времени выхода пика мебендазола и празиквантела на хроматограммах испытуемого образца со временем выхода пика на хроматограммах стандартного образца мебендазола и празиквантела является

подтверждением его подлинности Подлинность мебендазола и празиквантела устанавливали шкжс методом ТСХ и характерной цветной реакцией для мебендазола

Для определения мебендазола и празиквантела методом ВЭЖХ были подобраны растворитель 0,1 М раствор соляной кислоты в метаноле и подвижная фаза смесь 0,1% водного раствора фосфорной кислоты, ацетонитрила и метанола, взятые в соотношении 200 / 200 / 60 Определение проводили на колонке LUNA С 18 100 А (250/4,6 мм) при скорости потока 1 мл/мин и длине волны 210 нм Установлено, что в данных условиях хроматографирования время выхода пика мебендазола составляет примерно 5,5 минут, празиквантела - 9,4 минуты

Для подтверждения подлинности мебендазола и празиквантела, были подобраны условия хроматографии в тонком слое на пластинках «Силуфол УФ-254» восходящим способом Наилучшие результаты для идентификации мебендазола дала система растворителей хлороформ, метанол и аммиак (25% водный раствор), взятых в соотношении 100 4 1, а для празиквантела — ацетон, бензол и гексан, взятых в соотношении 111 При этих условиях пятна, полученные при хроматографировании раствора образца препарата, соответствовали пятнам, полученным при хроматографировании раствора соответствующего стандарта

Определение средней массы, распадаемости и микробиологической чистоты таблеток проводили по общепринятым методикам, изложенным в XI издании Государственной фармакопеи

Для характеристики качественных и количественных показателей комплексного антигельмингного препарата были предложены показатели и нормы, представленные в таблице 2

Разработанные методы контроля при проверке 3 экспериментальных серий комплексного антигельминтного препарата (таблица 2) показали хорошую воспроизводимость и точность определения действующих веществ, что обеспечит оптимальный уровень качества лекарственного средства в процессе ei о производства, хранения и применения

При изучении стабильности трех экспериментальных серий препарата методом «ускоренного старения» установлено, что срок годности препарата составляет 5 лет Все показатели качества препарата находились на уровне исходного Продуктов распада празиквантела и мебендазола, при исследовании образцов методом ВЭЖХ, не обнаружено

и

Табл 2 Показатели качества комплексного препарата на основе мебендазола и празиквантела

антигельминтного

Наименование показателя Серия 1 Серия 2 Серия 3

Внешний вид, цвет Плоскоциллиндрические таблетки с риской, белого с сероватым опенком цвета

Подлинность мебендазола В присутствии спиртового раствора едкого кали дает лимонно-желтое окрашивание Пятно образца соответствует пятну стандарта Время выхода пика образца соответствует времени выхода пика стандарта

Подлинность празиквантела Пятно образца соответствует пятну стандарта Время выхода пика образца соответствует времени выхода пика стандарта

Средняя масса таблетки, г 0,4961 0,4822 0,5084

Распадаемость таблеток, мин 3,5 4,0 3,7

Содержание мебендазола, мг/табл 102,12 99,79 100,46

Содержание празиквантела, мг/табл 49,86 50,14 48,92

Микробиологическая чистота, в 1 г общее число аэробных бактерий плесневых грибов при отсутствии Е coli

27 не обнаружено отсутствуют 65 8 отсутствуют 52 не обнаружено отсутствуют

В результате изучения острой токсичности комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела (таблица 3) на белых мышах установлено, что препарат по параметрам острой токсичности согласно ГОСТ 12 1 007 — 76 относится к 3 классу опасности — вещества умеренно-опасные

Табл 3 Токсикологические параметры комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела

Показатель ДД.б лд50 ЛД84

Доза (мг/кг) 945, 17 1123,02 (1044,68-1201,36) 1300, 87

Результаты изучения субхронической токсичности Длительное (20 дневное) введение комплексного препарата на основе мебендазоча и празиквантела не вызывало гибели лабораторных животных во всех опытных группах

К 21 дню опыта у мышей первой группы, получавших наибольшую дозу препарата (1/5 ЬО50), наблюдался наименьший привес массы тела по сравнению с привесами животных в других группах Это, видимо, связано с токсическим действием высоких доз мебендазола и празиквантела Однако, через 10 суток после прекращения введения препарата показатели массы мышей всех опытных групп достоверно не отличались от контроля (Р>0,05)

Введение препарата в дозах 1/5 ЬБзо и 1/10 ЬБ5о оказывало влияние на антитоксическую функцию печени (таблица 4)

Табл 4 Влияние комплексного антигельминтного препарата на функциональное состояние мышей

№ Доза от Продолжительность сна (мин) Время плавания (мин)

гр LDj0 21 сутки опыта 31 сутки опыта 21 сутки опыта 31 сутки опыта

1 1/5 39,64±4,26 21,19±0,22 6,38±0,82 9,21±1,06

2 1/10 28,17±4,05 19,58±0,28 7,72±0,45 10,06±1,27

3 1/20 23,42±3,70 19,24±0,28 8,60±0,74 9,54±0,80

4 контроль 24,88±3,41 20,80±0,30 8,31±0,59 9,87±0,бб

У животных этих групп в конце опыта продолжительность медикаментозного сна была соответственно в 1,69 и 1,13 раза больше по сравнению с контролем (Р<0,05) Увеличение времени сна у животных из этих групп, может свидетельствовать об ингибировании антигельминтным препаратом микросомальных ферментов гепатоцитов и замедлении метаболизма гексенала

Длительное применение комплексного препарата в высоких дозах угнетало компенсаторно-приспособительные способности животных, о чем свидетельствовало достоверное снижение времени плавания мышей (Р<0,05) в опытных группах, получавших максимальные дозы антигельминтика, в 1,3 раза (1/5 LDso) и в 1,1 раза (1/10 LDS0) по сравнению с контролем (таблица 4) Более длительное время плавания животных 3 группы по сравнению с контролем оказалось статистически несущественным (Р>0,05)

Через 10 суток после прекращения введения препарата время медикаментозного сна и время плавания мышей 1 и 2 групп достоверно не отличалось от контрольной (Р>0,05), что свидетельствует о восстановлении

деятельности печени и нормализации функциональных способностей организма у мышей, получавших повышенные дозы лекарственного средства на основе мебендазола и празиквантела

Применение комплексного антигельминтного препарата в максимальной дозе 1/5 LDso, а также в дозах 1/10 и 1/20 LD50 не вызывало изменений относительной массы внутренних органов как на 21-е, так и 31-е сутки опыта Весовые коэффициенты внутренних органов мышей опытных групп и контрольной группы достоверно не отличались (Р>0,05)

Существенных различий (Р>0,05) гематологических и биохимических показателей крови у мышей опытных и контрольной групп не установлено

У мышей из группы, получавших наивысшую дозу препарата (1/5 LD5o) отмечали незначительное повышение уровня аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы (в пределах физиологической нормы), что подтверждает гапатотоксическое действие максимальной дозы препарата, выявленной при проведение гексеналовой пробы

Паталогоанатомическое вскрытие мышей опытных и контрольных групп в завершении эксперимента, показало, что часть животных, получавших препарат в дозах 1/5 LD5o и 1/10 LDs0, имеют макроскопические изменения в желудочно-кишечном тракте и печени кровоизлияния на слизистой желудка, гиперемию слизистой оболочки тонкого отдела кишечника, увеличение печени, что свидетельствует о токсическом действии высоких доз препарата Длительное введение препарата в дозе 1/20 LD50 не вызывало макроскопических изменений в желудочно-кишечном тракте В других жизненно важных системах организма сердечно-сосудистой, дыхательной, мочевыделительнои, эндокринной, изменений не было выявлено

Таким образом, изучение субхроничсской токсичности на лабораторных животных свидетельствует, что длительное введение максимальных доз комплексного антигельминтного препарата (1/5 LD50 и 1/10 LD50) вызывает паталогоанатомические изменения в желудочно-кишечном тракте и печени Применение препарата в дозах 1/5 и 1/10 LD50 приводит к временному угнетению функции печени и общекомпенсаторных функций организма лабораторных животных, восстанавливающихся до физиологической нормы через 10 суток после отмены препарата

Результаты изучения поведенческих реакций крыс на введение субтоксической дозы комплексного антигельминтного препарата (225 мг/кг) показало, что лекарственное средство вызывает изменения в поведении животных, проявляющиеся в снижении активности и агрессивности, отсутствии реакций на внешние раздражители Нервно-мышечные реакции крыс проявились в незначительном треморе мышц у части животных, расстройством походки, снижением силы хватки Через 24 часа после

применения комплексного антигельминтно го препарата поведенческие реакции начали возвращаться к нормальным показателям, и через 48-50 часов все процессы пришли в норму

В результате изучения субхронической токсичности комплексного антигельминтного препарата на собаках было установлено, что длительное применение препарата, как в терапевтической, так и в два и в пять раз превышающих терапевтическую дозах, не оказывало отрицательного действия на организм животных Таблетки на основе мебендазола и цразиквантела хорошо переносились животными даже в высоких дозах Клиническое состояние собак во всех опытных группах было удовлетворительным (по показателям частота сердечных сокращений и дыханий, температура тела) и в течение всего опыта находилось в пределах физиологической нормы.

Результаты исследования мочи, проводившиеся до опыта, на 8-е и 16-е сутки, показали, что функциональное состояние почек было неизменным по исследованным параметрам цвет, прозрачность, удельный вес, белок, рН, билирубин, кетоновые тела, сахар, лейкоциты, эритроциты, даже при применении высоких доз препарата

Основные биохимические показатели крови собак опытных групп на 8-е сутки опыта, а также через сутки после последнего введения препарата находились в пределах физиологической нормы и не отличались от показателей крови собак до опыта и контрольной группы (Р>0,05)

Изучение влияния комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела на клинические показатели периферической крови у собак показало, что количественный и качественный состав крови в целом соответствовал физиологической видовой норме Эритроциты соответствовали эритроцитам других млекопитающих Величина лимфоцитов была изменчива Малые лимфоциты содержали большое, заполняющее почти всю клетку, ядро Эозинофилы имели интенсивную обильную и плотную зернистость Патологических сдвигов гематологических показателей не отмечалось

В завершении исследования были проведены патоморфологические и гистологические исследования двух животных из каждой группы По результатам макроскопических и гистологических исследований органов* различий между группами установлено не было

Таким образом, результаты изучения субхронической токсичности комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела показали, что длительное пятнадцатидневное применение антигельминтика даже в дозах в два и пять раз превышающей терапевтическую, не оказывает токсического действия на организм животных

Изучение фармакокинетики компонентов комплексного препарата в плазме кропи собак проводили после однократного перорального введения антягея&мянтшеа в дозе I таблетка на 10 кг массы тела,

Исследования показали (график 1), что после введения концентрация п рази кванте па в крови резко повышается до максимальных Значений (4,34 мкг/мл) в течение 2 часов, после чего постепенно начинает снижаться, но остается на высоком уровне в течение 6-9 часов от момента введения препарата.

График Î. фармакокинетика п рази к ванте л а и мебендазола в плазме крови собак после применения антигельмиптиого препарата

Празиквантел

Мебендазол

20 24

Время, чье

Мебендазол, попадая в организм животного, достигает максимума медленнее (через 3 часа от момента поступления препарат), при ¿том значительное время остается в довольно высоких концентрациях (до 15 часов от момента введения препарата). Однако и через 24 часа в плазме крови собак обнаруживаются минимальные количества празиквактела и мебендазола.

Фармакокинетичсские профили распределения мебендазола И празиквантел а в крови после введения комплексного антигельминтногб препарата описываются в рамках одяочастевой модели со всасыванием следующим уравнением: С = А ■ + В ■ где

для прюнкнантела А = ! 1,573. «=0,00290, /) = 0,00879; для мебендазола А - 1.470, а = 0,00158, р = 0.00550.

Результаты математической обработки данных динамики изменения концентрации празиквантела и мебендазола в плазме крови собак в рамках одночастевой модели со всасыванием (таблица 5) свидетельствуют, что после однократного пероралыюго введения собакам комплексного противопаразитарного препарата в дозе 1 таблетка на 10 кг массы тела (10 мг/кг по мебендазолу и 5 мг/кг по празиквантелу) фармакокинетика мебендазола и празиквантела характеризуется быстрым (1!Пах - 2-3 ч) достижением максимальных концентраций (Стах мебснд — 0,78 мкг/мл, СтаХ приикв— 4,21 мкг/мл) Меньшая площадь мебендазола (А11С — 661,9 мкг*мин/мл) под фармакокинетической кривой по сравнению с празиквантелом (АиС — 2679,9 мкг*мин/мл) подтверждает, что нематодоцид обладает ограниченной способностью к всасыванию из желудочно-кишечного тракта, где создаются его высокие концентрации, губительно действующие на гельминтов

Табл 5 Фармакокинетические параметры антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела

Фармакокинетические параметры Празиквантел Мебендазол

Тшк» П11П 78,822 126,000

Т1йе1, тт 239,296 438,053

^гег 0,00879 0,00550

ке. 0,00290 0,00158

Тгмх, П11П 136,3 177,4

Сгаах, тк£/т1 4,21 0,78

Уё, ш1 644,250 9549,506

С1, т1/ тт 1,866 15,107

АиС, тк§*тт/т1 2679,9 661,9

Выбранная фармакокинетическая модель распределения действующих веществ комплексного препарата в организме собак является оптимальной, о чем свидетельствует (таблица 6) отсутствие достоверных (Р>0,05) различий между фактическими и расчетными концентрациями празиквантела и мебендазола в плазме крови

Табл 6 Фактические и расчетные концентрации (мкг/мл)

действующих веществ препарата в плазме крови собак

Время Компоненты

Празиквантел Мебендазол

фактич теоретич фактич теоретич

0,5 ч 1,72 1,72 0,14 0,16

1 ч 3,23 2,90 0,28 0,28

2ч 4,34 4,21 0,69 0,56

3 ч 3,42 3,93 0,82 0,76

6ч 2,28 3,59 0,63 0,63

9ч 1,55 2,32 0,55 0,55

12 ч 1,19 1,42 0,49 0,44

15 ч 0,85 0,85 0,37 0,34

18ч 0,54 0,51 0,23 0,26

21ч 0,29 0,27 0,19 0,21

24 ч 0,20 0,18 0,15 0,15

Подбор оптимальной терапевтической дозы таблеток антигельминтного препарата проводили на базе ветеринарной клиники «Мангуст» г Москвы и Всероссийского научно-исследовательского института гельминтолог ии им К И Скрябина при одном из наиболее распространенных гельминтозов собак — токсокарозе В 1 г фекалий животных до лечения обнаруживали в среднем 257,2±10,3 экземпляров яиц токсокар (таблица 7) Препарат испытывали в дозе 0,5, 1,0 и 1,5 таблетки на 10 кг массы тела животного

Табл 7 Результаты определения терапевтической дозы таблеток комплексного антигельминтного препарата при токсокарозе собак

Кол-во таблеток на 10 кг массы Доза по мебендазолу/ празиквантелу, (мг/кг) Среднее кол-во яиц токсокар в 1 г фекалий, экз Эффективность, %

до опыта после лечения

0,5 5/2,5 269,7±12,8 37,6±6,3 86,06

1 10/5 275,2±10,3 0 100

1,5 15/7.5 278,0±12,7 0 100

Через 10 дней после дегельминтизации у собак получавших комплексный препарат в дозе 1 и 1,5 таблетки на 10 кг массы тела яиц гельминтов в фекалиях не обнаружили Препарат в дозе 0,5 таблетки на 10 кг

массы тела был недостаточно эффективен и обеспечивал освобождение от гельминтов только 86% животных

В связи с тем, что терапевтическая эффективность при применении комплексного антигельминтного препарата в дозе 1 таблетка на 10 кг массы тела животного и 1,5 таблетки на 10 кг массы тела между собой не отличались, а эффективность препарата на основе мебендазола и празиквантела в дозе 0,5 таблетки на 10 кг массы тела была достаточно низкой, дальнейшее изучение терапевтической эффективности проводили в дозе 1 таблетка на 10 кг массы тела животного, что соответствует 10 мг/кг массы тела по мебендазолу и 5 массы тела мг/кг по празиквантелу

Терапевтическую эффективность комплексного антигельминтного препарата при других гельминтозах устанавливали на базе ветеринарной клиники «Мангуст» (г Москва), Всероссийского научно-исследовательского института гельминтологии им К И Скрябина и ветеринарной станции по борьбе с болезнями животных Ельниковского района Республики Мордовия, на базе ветеринарных клиник «Мовет» и «Центр» при введении препарата однократно в дозе 10 мг/кг массы тела по мебендазолу и 5 мг/кг массы тела по празиквантелу

В результате проведенных исследований было установлено, что в фекалиях животных было обнаружено до дегельминтизации в среднем 168,9±9,5 экземпляров яиц токсаскарисов Через 10 дней после дегельминтизации только у одной собаки были обнаружены единичные экземпляры яиц Таким образом, препарат показал 97,1% эффективность (таблица 8)

Табл 8 Терапевтическая эффективность препарата

Заболевание Препарат на основе мебендазола/празиквантела Дронтал плюс

после первичной дачи таблеток после вторичной дачи таблеток после первичной дачи таблеток после вторичной дачи таблеток

Токсокароз 93,4% 100% 92,6% 100%

Токсаскаридоз 97,1% 100% 100% -

Анкилостомоз 100% - - -

Унцинариоз 100% - - -

Трихоцефалез 94,8% 100% - -

Дипилидиоз 100% - 100% -

Тениидозы 100% - 100% -

Дипилидиоз + Токсокароз 100% - 100% -

Однократное применение комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела при трудно поддающемся лечению трихоцефалезе показало эффективность 94,8%

Применение препарата при анкилостомозе (с интенсивностью инвазии в среднем 88.6±8,7 экземпляров яиц анкилостом в 1 г фекалий), унцинариозе (с интенсивность инвазии 78,7±10,5 экземпляров яиц в 1 г фекалий), тениозе (с интенсивностью инвазии 227,8±12,0 экземпляров яиц в 1 г фекалий), дипилидиозе (с интенсивностью инвазии 198,0±9,2 экземпляров яиц в 1 г фекалий) в дозе 10 мг/кг по мебендазолу и 5 мг/кг по празиквантелу (1 таблетка на 10 кг массы тела) показало 100%-ную эффективность при этих заболеваниях

Установлено, что собаки инвазированные цестодами и нематодами со средней и низкой интенсивностью инвазии (не более 500 яиц в 1 г фекалий) полностью избавлялись от гельминтов после однократного применения препарата При сильной интенсивности инвазии (более 500 яиц в 1 г фекалий) гельминтами однократное применение препарата давало только 93,4-97,1%-ную эффективность При повторной даче таблеток (с интервалом в 8 дней) была получена 100%-ная эффективность применения препарата

Высокая эффективность препарата против цестод объясняется не только действием празиквантела, как лучшего цестодоцида, но и наличием цестодоцщшых свойств мебендазола, что видимо свидетельствует о суммировании антигельминтного действия этих веществ

При сравнительном испытании комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела с лучшим зарубежным анналогом препаратом Дронтал-плюс, были получены данные, свидетельствующие о том, что при высокой интенсивности инвазии оба препарата требуют повторного применения При средней и низкой интенсивности инвазии и Дронтал-плюс и антигельминтный препарат на основе мебендазола и празиквантела показали 100%-ную эффективность при однократном применении

Таким образом, дозу комплексного антигельминтного препарата равную 10 мг/кг массы тела по мебендазолу и 5 мг/кг массы тела по празиквантелу (1 таблетка на 10 кг массы тела) можно рекомендовать как терапевтическую, так как она обеспечивает высокую эффективность (99,9100%) против основных гельминтозов собак

Результаты проведенных нами исследований по изучению лекарственного средства на основе мебендазола и празиквантела в форме таблеток, разработке методов его контроля качества, изучению фармдко-токсикологических свойств и терапевтической эффективности были использованы при разработке нормативной документации па препарат

20

ВЫВОДЫ

1 Предложен состав нового комплексного противопаразитарного препарата в форме таблеток на основе мебендазола и празиквантела для лечения гельминтозов собак, фармакологическая эффективность которого подтверждена результатами производственных испытаний

2 Комплексный противопаразитарный препарат на основе мебендазола и празиквантела отвечает стандартным требованиям, предъявляемым к таблетированным лекарственным формам и стабилен в течение 5 лет хранения На основе разработанных требований к качеству препарата подготовлена нормативная документация, с использованием которой возможно осуществление контроля лекарственной формы в процессе производства и хранения

3 Комплексный противопаразитарный препарат на основе мебендазола и празиквантела по параметрам острой токсичности согласно ГОСТ 12 1 00776 относится к 3 классу опасности — вещества умерено-опасные (для белых мышей LDso - 1123,02 мг/кг).

4 Двадцатидневное введение белым мышам комплексного противопаразитарного препарата на основе мебендазола и празиквантела в дозе 1/10 и 1/20 LD50 не вызывает функциональных изменений в организме животных Применение препарата в максимальной дозе 1/5 LD50 приводит к временному снижению массы тела и адаптационных возможностей организма, восстанавливающихся через 10 суток после отмены препарата

5 Применение комплексного противопаразитарного препарата на основе мебендазола и празиквантела в течение 15 дней собакам в пятикратной терапевтической, двукратной терапевтической и терапевтической дозах не вызывает изменений в клиническом состоянии животных, функциональном состоянии печени и почек, системы кроветворения, подтвержденных биохимическими и гистологическими исследованиями

6 После однократного перорального введения собакам комплексного противопаразитарного препарата в дозе 1 таблетка на 10 кг массы тела (10 мг/кг по мебендазолу и 5 мг/кг по празиквантелу) фармакокинетика мебендазола и празиквантела характеризуется быстрым (t^* - 2-3 ч) достижением максимальных концентраций (Стах ыебенд - 0, 78 мкг/мл, Стах „р^икв - 4, 21 мкг/мл) Меньшая площадь мебендазола (AUC — 661, 9 мкг*мин/мл) под фармакокинетической кривой по сравнению с празиквантелом (AUC — 2679, 9 мкг*мин/мл) подтверждает, что нематоцид обладает ограниченной способностью к всасыванию из желудочно-кишечного тракта, где создаются его высокие концентрации, губительно действующие на гельминтов

7 Применение комплексного противопаразитарного препарата в дозе 1 таблетка на 10 кг массы тела (10 мг/кг по мебендазолу и 5 мг/кг по празиквантету) обеспечивает 100% дегельминтизацию животных при низкой и средней степени интенсивности инвазии (до 500 яиц в 1 г фекалий) При высокой интенсивности инвазии (более 500 яиц в 1 г фекалий) требуется повторное применение препарата

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 В результате проведенных исследований разработан и предложен для использования в ветеринарной практике новый комплексный антигельминтный препарат на основе мебендазола и празиквантела для лечения гельминтозов плотоядных

2 Результаты исследования нашли отражение в разработанной нормативной документации, утвержденной и согласованной в Россельхознадзоре РФ 3 апреля 2007 г

СТО 47611900-0002-2007 «Квантум» в виде таблеток для дегельминтизации собак,

- инструкция по применению таблеток «Квантум» в ветеринарии

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Верещагина Л А , Виолин Б В Острая и субхроническая токсичность антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела // Аграрная наука -2005 - № 11 -С 22-24

2 Русаков С В , Виолин Б В, Абрамов В Е, Верещагина Л А Исследование биоэквивалентности препаратов на основе празиквантела и пирантела памоата Научно-технический бюллетень Института биологии животных и Государственного научно-исследовательского института ветеринарных препаратов и кормовых добавок - Львов - 2005 - вып 6 - №3 -С 331-334

3 Виолин Б В, Верещагина Л А Терапевтическая эффективность применения антигельминтного препарат на основе мебендазола и празиквантела для лечения собак Материалы международного симпозиума Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний Казань - 2005 - часть 3 - С 93-95

4 Верещагина Л А, Виолин Б В Терапевтическая эффективность применения антигельминтного препарата на основе мебндазола/празиквантела Аграрная наука —2006 -№9 -С 31-32

Отпечатано в типографии ООО 'Графике В ' г Москва, ул Дочгоруковская, д 33, тел 969-07-72

Форма г 60x90 1/16 Заказ № 324 ог 14 04 2007 г, 1,5 печ л Тираж 100 ->кз

Актуальность проблемы.

Гельминтозы обширная группа болезней, в значительной степени определяющая состояние здоровья животных. В течение жизни практически каждая собака переносит паразитарное заболевание.

В Москве, заболевания вызываемые простейшими и гельминтами занимают четвёртое-пятое место среди других болезней животных (19). До 28% от всех заболеваний собак приходится на гельминтозы и гибель животных от данных болезней достигает 3,8% по отношению к другим заболеваниям (1).

Миллионы собак и кошек, находясь в непосредственной близости к человеку и являясь носителями гельминтов, представляют опасность для своих хозяев, а, загрязняя внешнюю среду испражнениями, содержащими возбудителей заболеваний, представляют угрозу для окружающих животных и людей (9, 24,30,32).

В Центральном регионе нашей страны в крупных городах среди паразитарных болезней собак преобладают токсокароз, дипилидиоз, токсаскаридоз и унцинариоз.

Рациональное лечение гельминтозов, как правило, основано на этиотропной терапии плотоядных животных антигельминтными лекарственными средствами. Учитывая, что животные поражаются несколькими видами гельминтов, для дегельминтизации собак чаще всего применяют комплексные препараты на основе цестодоцида - празиквантела и нематодоцида - пирантела. Длительное использование одних и тех же антигельминтиков постепенно привело к распространению резистентных популяций паразитов (45, 54, 95, 104, 156). Так в Голландии от овец были выделены альбендазолрезистентные Haemonchus contortus (163), в Швейцарии от коз и овец выделены авермектинрезистентные Haemonchus contortus and Trichostrongylus spp. (127), в Аргентине от телят выделены ивермектинрезистентные Cooperia and Ostertagia (221), в Австралии от телят выделены бензимидазолрезистентные Cooperia oncophora and Ostertagia ostertagi (232). Также в Австралии Корр S.R. с коллегами (2007) установили, что у собак активность пирантела эмбоната в отношении Ancylostoma caninum снизилась на 17-20%.

В связи с данным положением разработка новых антигельминтных средств является не только актуальной проблемой, но и практически необходима.

Учитывая, что применение рационально подобранных сочетаний противопаразитарных соединений на длительный период времени может решить проблему борьбы с резистентными популяциями гельминтов, нами был предложен новый комплексный антигельминтный препарат на основе мебендазола и празиквантела в форме таблеток.

Таблетки, являются одной из наиболее удобных лекарственных форм, так как дают возможность точной дозировки лекарственного средства животным в домашних условиях, просты в применении и достаточно легко задаются животным.

Среди антигельминтных средств, действующих на нематод, широкое распространение получили производные бензимидазолов. Одним из характерных представителей этой группы является мебендазол, который обладает низкой токсичностью, благодаря чему нашел широкое применение в медицине, в том числе в педиатрии. Учитывая, что мебендазол раннее не применялся в России для лечения гельминтозов плотоядных, и к нему вероятно отсутствуют резистентные изоляты нематод, он был выбран в качестве одного из действующих веществ лекарственного средства (21, 114, 148, 151, 160,170,207).

Принимая во внимание, что собаки, как правило, поражены несколькими видами гельминтов, для расширения противопаразитарного спектра действия мебендазола, в качестве второго действующего компонента в состав препарата был введен празиквантел, нарушающий нервномышечную регуляцию паразитов, высокоактивный в отношении цестод (10, 15,123, 150, 164,166,197,214).

Цели и задачи исследования:

Разработать на основе мебендазола и празиквантела новый противопаразитарный препарат для лечения гельминтозов собак. Для этого было необходимо:

- обосновать состав и разработать лекарственную форму комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела;

- разработать методы контроля для стандартизации качества препарата, изучить его стабильность в процессе хранения;

- изучить острую и субхроническую токсичность препарата на лабораторных животных;

- изучить субхроническую токсичность препарата на собаках;

- изучить фармакокинетику мебендазола и празиквантела в организме собак после применения препарата; определить терапевтическую эффективность комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела,-и разработать схему его применения для лечения гельминтозов собак.

Научная новизна.

Впервые разработан комплексный противопаразитарный препарат на основе мебендазола и празиквантела для лечения гельминтозов собак.

Установлены параметры безопасности комплексного антигельминтного препарата для животных, описана фармакокинетика мебендазола и празиквантела в организме собак, подобрана оптимальная схема лечения гельминтозов собак.

Практическая ценность работы.

Разработан и предложен для ветеринарной практики комплексный антигельминтный препарат на основе мебендазола и празиквантела в форме таблеток для дегельминтизации собак.

Разработаны качественные и количественные методы контроля комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела в форме таблеток. Установлен срок годности препарата.

Разработана схема применения комплексного противопаразитарного препарата для дегельминтизации собак.

Разработана нормативная документация - стандарты организаций (СТО) и инструкция по применению комплексного антигельминтного препарата для дегельминтизации собак.

Основные положения, выносимые на защиту:

- Качественные и количественные методы контроля комплексного антигельминтного препарат на основе мебендазола и празиквантела для лечения гельминтозов плотоядных животных.

- Результаты изучения стабильности комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела.

- Результаты изучения острой и субхронической токсичности лекарственного средства в опытах на лабораторных животных.

Результаты изучения субхронической токсичности препарата в опытах на собаках.

- Результаты исследования фармакокинетики лекарственного средства в организме собак.

- Результаты изучения терапевтической эффективности препарата при гельминтозах собак.

Практические предложения по применению комплексного антигельминтного препарата на основе мебендазола и празиквантела в ветеринарии.

2. Результаты исследования нашли отражение в разработанной нормативной документации, утверждённой и согласованной в Россельхознадзоре РФ 3 апреля 2007 г.:

СТО 47611900-0002-2007 «Квантум» в виде таблеток для дегельминтизации собак;

- инструкция по применению таблеток «Квантум» в ветеринарии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В результате проведённых исследований разработан и предложен для использования в ветеринарной практике новый комплексный антигельминтный препарат на основе мебендазола и празиквантела для лечения гельминтозов плотоядных.