Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Этиология, эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота и опыт проливолейкозных мероприятий

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ ИМЕНИ Я. Р. КОВАЛЕНКО

На правах рукописи ДСП № 001о

СИМОВАРТ Юхан Александерович

УДК 619:616-006.446:636.2

ЭТИОЛОГИЯ, ЭПИЗООТОЛОГИЯ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА и опыт ПР0ТИВ0ЛЕЙК03НЫХ МЕРОПРИЯТИЙ

16. 00. 02 — патология, онкология и морфология животных 16. 00. 03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук в форме научного доклада

МОСКВА — 1991

Работа выполнена в Эстонской сельскохозяйственной академии

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Г. А. Симо нян

Ведущая организация — Белоцерковский сельскохозяйственный институт им. П. Л. Погребняка.

специализированного совета Д 020.2 I соискание

ученой степени доктора ветеринарных наук при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко по адресу: г. Москва, 109472, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

доктор ветеринарных наук, профессор А. А. Коно-паткин

доктор ветеринарных наук, профессор П. Н. Смирнов

Защита диссертации состоится

заседании

1991 г.

Диссертация в форме научного доклада разослана

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

В. В. АМЕЛИНА

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Настоящая диссертационная работа, представленная в форме научного доклада, является итогом двадцатилетних исследований по эпизоотологии, этиологии, диагностике лейкоза крупного рогатого скота и совершенствованию противолейкозных мероприятий в Эстонской ССР, выполненных в соответствии с Государственным планом по решению научно-технической проблемы 0.69.125 (1970—1975 гг.) и 0.69.05 (1976—1990 гг.).

1.1. Актуальность проблемы. Лейкоз крупного рогатого скота является одним из распространенных лимфопролифератив-ных заболеваний сельскохозяйственных животных. Лейкозы крупного рогатого скота не только приводят к гибели и преждевременной выбраковке животных, но и ставят под угрозу развитие племенных стад, ведение селекционно-племенной работы и осуществление межхозяйственной специализации и производство продуктов скотоводства (А. М. Лактионов, 1967; Л. Г. Бурба и др., 1977; В. П. Шишков, 1979, 1983 и др.).

Однако, несмотря на большое число работ по проблеме лейкозов крупного рогатого скота, опубликованных в 1960—1990 гг. (Л. Г. Бурба, В. А. Бусол, А. Ф. Валихов, Г. Ф. Коромыслов, В. А. Крикун, Т. П. Кудрявцева, Р. Н. Кукайн, А. М. Лактионов, В. М. Лемеш, В. М. Нахмансон, Л. И. Нагаева, В. К. Пара-кин, М. И. Парфанович, О. К. Приедникс, П. Б. Садаускас, Г. А. Симонян, П. Н. Смирнов, В. И. Тамошюнас, С. В. Чапенко, В. П. Шишков, G. Bederke, H.-J. Bendixen, J. Galafat, G. G. Caldwell, R. M. Dutcher, J. F. Ferrer, B. Hofirek, R. Kettmann, H. Liebermann, M. Mammerickx, J. M. Miller, C. Olson, A. A. Ressang, О. C. Stranb, D. Urbaneck, M. J. van der Maaten, W. Wittmann и др.), недостаточно изученными остаются региональные эпи-зоотологические особенности заболевания, пути и факторы передачи возбудителя болезни, роль экзогенных и эндогенных факторов в возникновении и развитии патологического процесса. Без выяснения вопросов этиологии, эпизоотологии, диагностики и патогенеза невожможно разработать научно-обоснованные эффективные меры борьбы с лейкозом крупного рогатого скота.

В период начала наших исследований в 1969 году вирусная этиология лейкозов крупного рогатого скота могла только предг

полагаться на основании результатов эпизоотологических исследований, обнаружения вирионов типа С в нативном материале и в краткосрочных культурах лейкоцитов крови больного лейкозом крупного рогатого скота, а также на основании доказанной вирусной этиологии лейкозов птиц, мышей, кошек и некоторых видов обезьян.

За истекший период получены убедительные доказательства вирусной этиологии лейкозов крупного рогатого скота. Выделен вирус лейкоза крупного рогатого скота (BLV- bovine leukemia virus), который является экзогенным РНК-содержащим вирусом семейства Retroviridae, по морфологическим и биохимическим свойствам классифицированным как онковирус типа С млекопитающих. Лейкоз крупного рогатого скота воспроизведен на телятах и овцах при введении им очищенного препарата BLV. Установлена корреляция между заболеваемостью животных лейкозом и инфекцией BLV в естественных условиях. Начаты исследования по разработке специфических средств профилактики заболевания. Результаты, приведенные в настоящей диссертации, отражают наш вклад в разработку данной проблемы.

1.2. Цель и задачи исследования. Работа посвящена изучению эпизоотического процесса при лейкозах крупного рогатого скота, разработке противолейкозных мероприятий в Эстонской ССР, выявлению этиологического агента и установлению его роли в развитии лейкозов крупного рогатого скота, а также изучению возможности горизонтальной трансмиссии заболевания.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1.2.1. Воспроизвести лейкозный процесс у телят, используя в качестве инфицирующего материала очищенный препарат онкор-навируса типа С, нативный клеточный и бесклеточный материал.

1.2.2. Изучить лейкозогенные свойства инфицирующего материала при пассировании его на ягнятах.

1.2.3. Изучить иммуногенность и защитные свойства препаратов из инактивированного вируса лейкоза крупного рогатого скота в опытах на телятах и ягнятах.

1.2.4. Установить основные причины и закономерности распространения лейкоза в Эстонской ССР на основе эпизоотологи-ческого анализа.

1.2.5. Провести сравнительную оценку чувствительности и специфичности методов диагностики (реакция иммунодиффузии в геле, клинико-гематологический, патоморфологический и электронно-микроскопический) энзоотического лейкоза и онковирус-ной инфекции крупного рогатого скота.

1.2.6. Разработать комплексную систему мероприятий по профилактике и ликвидации лейкозов крупного рогатого скота в Эстонской ССР.

1.3. Научная новизна. Данная работа является новым научным направлением в решении вопроса этиологии лейкозов крупного рогатого скота. Впервые в СССР экспериментально дока-

зана этиологическая роль вируса лейкоза крупного рогатого скота, у телят воспроизведены различные формы лейкозов — хронический лимфолейкоз и лимфосаркома.

В серии экспериментов с применением методов вирусологического и иммунологического контроля установлено, что клинико-гематологическому проявлению заболевания у подопытных животных предшествует развитие онковирусной инфекции.

Наличие вируса лейкоза крупного рогатого скота в организме животных подтверждено положительными электронно-микроскопическими находками вирионов типа С в патологическом материале из печени и селезенки, а также положительными результатами трансмиссии вируса плазмой крови и соматическими клетками молока коров.

Впервые исследована поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме, при спонтанных лейкозах и экспериментальной трансмиссии вируса лейкоза крупного рогатого скота.

Установлено, что при лейкозах существенное значение для реализации эпизоотической цепи имеют факторы внутренней и внешней среды, определяющие иммунный фон и предрасположенность к болезни. Установлены горизонтальные и вертикальные пути передачи возбудителя лейкоза.

Выяснена корреляция уровня ннфнцированности вирусом лейкоза с породой и возрастом животных. У крупного рогатого скота эстонской красной породы процент инфицирования и заболевания был выше, чем у эстонской черно-пестрой породы, а эстонский аборигенный скот оказался свободным от вируса лейкоза.

Показана четкая взаимосвязь между количеством зараженного вирусом лейкоза и больного лейкозом крупного рогатого скота. Составлены картограммы распространенности лейкоза в сопоставлении с породным районированием крупного рогатого скота в Эстонской ССР.

Впервые в Эстонской ССР на основе результатов эпизоотоло-гических исследований разработана и апробирована комплексная система мер профилактики и ликвидации лейкозов крупного рогатого скота.

1.4. Практическая ценность. Положительные результаты опытов по экспериментальному воспроизведению лейкозов у телят и ягнят очищенным препаратом вируса лейкоза крупного рогатого скота и нативным материалом подтвердили вирусную этиологию заболевания и возможность горизонтальной передачи возбудителя, что позволяет разработать методы ранней диагностики онковирусной инфекции у животных, эффективные меры борьбы и профилактики данной болезни.

В плане рекомендаций по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота необходимо учитывать, что источником заражения могут являться кровь и молоко больных лейкозом животных.

Использованные в динамике экспериментов методы диагностики онковирусной инфекции и болезни в настоящее время применяются на практике.

Результаты проведенных исследований позволили выявить эпизоотологические особенности лейкоза крупного рогатого скота и составить картограммы распространения заболевания в Эстонской ССР и на этой основе совершенствовать протнволей-козные мероприятия, внедрение которых позволяет снижать заболеваемость животных в оздоравливаемых хозяйствах ежегодно в 2—3 раза.

Обоснование наличия эпизоотического процесса при лейкозах позволило разработать более совершенные противолейкоз-ные мероприятия как в отдельных хозяйствах, так и в масштабах районов и республики. Внедрение этих мероприятий позволяет ограничить распространение болезни и получить среднегодовой экономический эффект 20—30 тыс. руб. в расчете на одно оздоровляемое хозяйство. _

На основе изучения антигенных свойств вируса лейкоза, изолированного из периферической крови спонтанно инфицированного крупного рогатого скота разработана и апробирована методика получения вакцины против лейкоза. Способ изготовления вакцины защищен авторским свидетельством № 820015 от 5 декабря 1980 года.

Данные исследований и развиваемые в работе теоретические положения нашли практическое применение при составлении ряда республиканских и всесоюзных программ по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота (1985, 1986, 1987 гг.), методических рекомендаций по диагностике (1981, 1983), а также всесоюзных инструкций по борьбе с лейкозом КРС, утвержденных в 1969, 1973, 1984 и 1989 гг.

Материалы диссертации используются в учебном процессе на ветеринарном факультете Эстонской СХА.

1.5. Публикации. Основные научные положения и практические рекомендации изложены в монографии «Лейкоз крупного рогатого скота и борьба с ним (Таллинн, 1973), в монографии «Лейкоз сельскохозяйственных животных» (Таллинн, 1984), в монографии «Поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме и при заболеваниях системы крови» (Таллинн, 1984), в монографии «Индивидуальное развитие и ветеринарная патология» (Таллинн, 1991) и в 156 научных статьях, опубликованных в периодических изданиях, в том числе 8 — в зарубежной печати.

1.6. Апробация. Материалы исследований доложены, обсуждены и одобрены на научных конференциях, симпозиумах и совещаниях. На всесоюзных конференциях и координационных совещаниях по решению научно-технической проблемы 0,69.05 (лейкозы человека, животных и птиц): Харьков, 1972; Рига, 1973; Москва, 1974—1985; Белая Церковь, 1982; Тарту, 1983; Минск,

1986; Кишинев, 1989. На всесоюзных научно-методических конференциях по патологической анатомии сельскохозяйственных животных и птиц: Казань, 1971; Тбилиси, 1972; Таллинн, 1975; Львов, 1977; Москва, 1978; Каунас, 1984. На Всесоюзных научных конференциях по проблемам эпизоотологии и ветеринарной вирусологии: Москва, 1973; Тарту, 1973; Казань, 1983. На VII конференции Региональной комисии МЭБ для стран Европы, Москва, 1976. На XXI Всемирном ветеринарном конгрессе, Москва, 1979. На Международном симпозиуме по сравнительному изучению лейкоза и родственных заболеваний, Пицунда, 1979. На двухстороннем международном симпозиуме (СССР — Финляндия) «Проблемы ветеринарии», Таллинн, 1972; Хельсинки, 1976. На двухстороннем международном симпозиуме (СССР — Нидерланды) «Лейкозы крупного рогатого скота и птиц», Москва, 1982. На Региональных научно-производственных ветеринарных конференциях: Тарту, 1966—1990; Перепаковка, 1972; Душанбе, 1972; Казань, 1973; Гродно, 1973; Москва, 1975, 1976, 1979, 1985; Белая Церковь, 1976; Сигулда, 1977; Рига, 1978; Елгава, 1979; Пярну, 1979; Вильнюс, 1981; Юрмала, 1984; Минск, 1986. На Всесоюзных конференциях по проблеме лейкоза человека и животных: Москва, 1976, Рига, 1978; Гродно, 1982; Белая Церковь, 1982; Тарту, 1988, 1989; Кишинев, 1989. На XXXII Конференции Европейской Ассоциации по животноводству, Ленинград, 1981.

2. МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Экспериментальное воспроизведение лейкоза крупного рогатого скота на телятах и овцах

Выделение в 1973 году в Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР онкорнавируса от больного лейкозом крупного рогатого скота при использовании препаративных биохимических методов позволило впервые поставить опыты по экспериментальному воспроизведению лейкоза крупного рогатого скота очищенным препаратом онкорнавируса, тестированным методом молекулярно-бпологического анализа. До 1973 года опыты по воспроизведению лейкоза крупного рогатого скота как в нашей стране, так и в странах Европы и в США, проводились только различным вируссодержащим материалом от больных животных.

Всего в опытах находилось 49 подопытных животных эстонской красной (21 теленок), эстонской черно-пестрой (24 теленка), эстонской аборигенной пород (4 теленка) и 12 контрольных животных тех же пород (3, 8 и 1 голова соответственно).

В ходе проведения экспериментов все контрольные и экспе-

риментально зараженные животные регулярно подвергались обследованию клиническими, гематологическими, иммунологическими, вирусологическими и молекулярно-биологическими методами, а при забое или падеже животного также и патомор-фологически.

Все вирусологические и молекулярно-биологические исследования были выполнены в Институте вирусологии АМН СССР.

Перед заражением было проведено клиническое, гематологическое и иммунологическое обследование телят и их матерей. На момент начала опытов возраст подопытных животных колебался от 5 до 39 дней.

Все опыты по экспериментальному воспроизведению лейкоза КРС проводились на опытной базе группы по изучению лейкозов ЭСХА.

С целью исключения заноса инфекционного агента с кормом в молочный период кормления телят использовали молочный порошок из цельного молока и обрата.

Все подопытные и контрольные животные на протяжении всего эксперимента содержались в отдельных изолированных помещениях, отвечающих санитарно-гигиеническим и вете-ринарно-зоотехническим требованиям.

Для экспериментального заражения животных были использованы следующие материалы:

1. Препарат онкорнавируса, выделенный из краткосрочных культур лейкоцитов и клеток лимфатических узлов, почек и селезенки с гематологически и гистологически установленным диагнозом лейкоза. Препарат онкорнавируса представлял собой концентрат культуральной жидкости вышеназванных культур клеток, очищенный и сконцентрированный в 2.000—5.000 раз методом дифференциального и градиентного центрифугирования (100 тыс. g.). Количество онкорнавируса, вводимого подопытным животным, устанавливали по количеству белка, определяемого спектрофотометрически. В 2 мл препарата (предварительно установленная максимально переносимая доза для телят) содержалось 35 мг белка. Препарат получен от профессора М. И. Пар-фанович (Ин-т вирусологии им. Д. И. Ивановского АМН СССР, директор академик В. М. Жданов).

2. Онкорнавируссодержащая культуральная жидкость (освобожденная от клеток центрифугированием при 10 тыс. g. в течение 30 минут) от перевиваемых культур клеток селезенки (FLS) и почек (FLK) эмбриона овцы, постоянно продуцирующих BLV (культуры любезно представлены доктором Van der Maaten, National Animal Diseases Center, Ames, IOWA, USA). Культуральная жидкость была введена 11 новорожденным телятам (в объеме от 150 до 260 мл) и 5 овцам (по 250 мл).

3. Кровь коровы № 1216 (совхоз «Трийги») с клинически и гематологически установленным (лейкоцитоз 179.000 в мм3 крови, лимфоцитоз 96%), а в последующем патоморфологически

подтвержденным диагнозом лимфолейкоза была введена 2 телятам.

4. Фракция лейкоцитов, обладающая обратно-транскриптаз-ной активностью, выделенная из периферической крови больной лимфолейкозом коровы № 1216, была введена 1 теленку.

5. Клетки, выделенные из молока больных лимфолейкозом коров, были введены 2 телятам. Препарат получен от профессора Л. И. Нагаевой (Ин-т микробиологии им. А. Кирхенштейна Латв. ССР, директор академик Р. А. Кукайн).

6. Плазма крови больной спонтанным хроническим лимфолейкозом коровы № 1216 была введена 1 теленку.

2.1.1. Экспериментальная трансмиссия лейкоза крупного рогатого скота телятам очищенным препаратом онкорнавируса

В первом опыте, начатом в марте 1974 года, было И подопытных и 3 контрольных животных. Подопытным животным был введен препарат онкорнавируса: внутрикостно (3 телятам по 1,0, 2,0 и 2,5 мл), внутримышечно (3 телятам по 0,5 мл), подкожно (4 телятам по 0,8 мл), внутривенно (1 теленку 4,0 мл).

Три теленка пали в день заражения, а два были забиты через 1 и 9 месяцев и исследованы на наличие признаков онкорнавирус-ной инфекции.

Во втором опыте, заложенном в декабре 1974 года, было 11 подопытных и 3 контрольных животных. Из них 8 телятам был введен препарат онкорнавируса следующими методами: внутрикостно (3 телятам по 2 мл), внутримышечно (2 телятам по 2 мл), в предлопаточный лимфатический узел (3 телятам по 2 мл).

Кроме того, двум телятам внутримышечно (по 50 мл) ввели кровь больной лимфолейкозом коровы № 1216, а одному теленку в предлопаточный лимфатический узел ввели 2 мл препарата микоплазмы.

Один теленок, из числа получивших препарат онкорнавируса, был забит через 5 месяцев после заражения, а другой пал через 7 месяцев после начала опыта.

В третьем опыте, начатом в апреле 1975 года также было 11 подопытных и 3 контрольных животных. Из этих 11 телят 6 получили препарат онкорнавируса; внутривенно (I теленку 1 мл), в предлопаточный лимфатический узел (5 телятам по 1,0—1,5 мл).

За период с 1974 по 1979 годы в разные сроки после инокуляции были забиты все экспериментальные животные, что позволило нам провести ретроспективный анализ результатов комплексных обследований, включая патоморфологическое заключение (табл. 1).

Исследование основных белков лейкоцитов периферической крови у большинства телят методом электрофореза в полиакрил-

Результаты обследования экспериментально зараженных телят в опыте по воспроизведению лейкоза крупного рогатого скота очищенным онкорнавирусом, выделенным от больного лейкозом крупного рогатого скота

Материал, использованный для заражения животных

- онкорнавирус лейкоза крупного рогатого скота онкорнавирус лейкоза крупного рогатого скота, инактивированный нагреванием при 60 °С

Количество учтенных животных Результаты исследований: клинических гематологических 22 1 + ;4± 2 ± 3 1 ± 1 ±

лейкоцитарных культур: наличие структур с плотностью 1,14—1,17 г/смЗ обратнотранскриптазная активность антигенная идентичность с ВЬУ 12 + ;3± 4 + 7 + 1+;2± Н 1 +

сывороток крови на наличие: антигена ВЬУ антител к ВЬУ патологоанатомических гистологических Диагноз на лейкоз крупного рогатого скота 12 + ;6± 12-Ь ;2± 5 ± 4 + ;2± 5 + ;5± 1 + 1 +

Н •— не исследованы

амндном геле выявило изменения, характерные для протепно-граммы лейкоцитов больных лейкозом коров.

По результатам экспериментов, проведенных к моменту настоящего анализа можно сделать вывод, что все три использованные породы эстонского крупного рогатого скота (аборигенная, красная и черно-пестрая) одинаково чувствительны к онкор-навнрусу лейкоза крупного рогатого скота при экспериментальном введении.

Все животные I и II опытов (из 19 голов, 4 пали, а 3 были забиты с диагностической целью) после 1271 и 986 дней наблюдения и регулярных всесторонних исследований были забиты комиссионно.

При гистологическом исследовании лимфатических узлов, селезенки, печени, почек и сердечной мышцы у 6 из 16 исследованных животных из I п II опытов был подтвержден диагноз лпмфолейкоза.

В опыте по экспериментальному заражению инактивирован-ным онкорнавирусом 3 телят были получены следующие результаты (табл. 2).

Через три года после инокуляции материала у одного животного клинико-гематологическими исследованиями выявлены изменения, подозрительные на лейкоз крупного рогатого скота, а в краткосрочных культурах лейкоцитов периферической крови обнаружены структуры, характерные для онкорнавирусов. При исследовании сыворотки крови методом иммунодиффузии в геле был выявлен специфический антиген ВЬУ.

При клиническом обследовании подопытных животных уже через полгода после заражения наблюдалось отставание в росте по сравнению с контрольными телятами.

У ряда животных (8 голов) наблюдалось некоторое увеличение лимфатических узлов: заглоточных, шейных, околоушных, подчелюстных, предлопаточных, надвыменных и других. У некоторых из них отмечался двухсторонний экзофтальм различной степени выраженностн.

При аналогично проведенных обследованиях 9 контрольных животных признаков онкорнавнрусной инфекции и лейкозного процесса выявлено не было.

Таким образом, положительные результаты наших опытов по экспериментальной трансмиссии лейкоза крупного рогатого скота телятам очищенным препаратом ВЬУ явились прямым доказательством вирусной этиологии данной болезни и показали возможность горизонтальной передачи вируса (рис. 1.).

Р и с. 1. Вирионы ВЛ КРС п межклеточном пространстве (биоптат селезенки подопытного животного № 34). Ун. 55000X.

Результаты обследования экспериментально зараженных телят, комиссионно забитых через 1271 и 986 дней после заражения

Материал, использованный для заражения

в я К К

« К

м

а Ч

Результаты исследований

лейкоцитарных культур

2 и

с —'

к £

У а о о в * ь. Ч-)

в и КИ

03 в

О- Ь к а

А м

в !-

Ё5 к 0) о

£ Я ь- О

5 в в в

а Й н СР

ю Я я в

о ь я н

сывороток крови на наличие специфического антигена ВЬУ (АГ) и антител к нему (АТ) методом иммуно-диффузии в геле (ИД) и в реакции связывания комплемента (РСК)

через 17 месяцев

АГ АТ

ИД ИД

через 25 месяцев

АГ АТ

ИД ИД

через 30 месяцев

АГ

АТ

ИД ИД/РСК

через 35 месяцев

АГ

АТ

ИД ИД/РСК

В !-

Онкорнавирус 1 + + + + н + + — + — + -/+ + +/+

лейкоза круп- 4 + + + + + + + — + + + -/+ +

ного рогатого скота очищенный и 11 — + + + н + + — н н + + +/+

16 — + + + + и + — н н н н н н

концентриро- 20 — + + + + н + — + + +/+ — +/+

ванный 6 — — — — + — + — н н + -/- —

8 — — — + + + + — + — + +/+ — +/+

9 + + + + + + — + — — +/+ + -/+

21 — — — — н — + — — — — -/+ — -/+

23 — — ± и + + — и н — — -/-

24 — — + + + + + — + — — +/+ — +/+

25 — — — н — + — — — — +/+ — -/+

Н — не исследованы

2.1.2. Экспериментальная трансмиссия лейкоза крупного рогатого скота телятам и овцам бесклеточной, онкорна-вируссодержащей культуральной жидкостью

В опытах с использованием для экспериментального воспроизведения лейкоза очищенного онкорнавируса, развитие лейкоз-ного процесса происходило не ранее, чем через 5 лет и не у всех инокулированных животных, что, по-видимому, связано с разрушением вируса в процессе очистки и потерей им ряда биологических свойств. Поэтому в последующих опытах по экспериментальному воспроизведению лейкоза, для экспериментального заражения была использована содержащая вирус лейкоза крупного рогатого скота культуральная жидкость культуры клеток РЬБу+ и

Эти опыты были начаты в мае 1976 года и в июне 1977 года на 11 телятах эстонской красной и черно-пестрой пород. (КЭП и ЧЭП).

Исследование развития инфекции ВЬУ и лейкозного процесса у зараженных телят приведено в таблице 3.

Таблица 3

Результаты обследования телят, экспериментально зараженных вируссодержащей културальной жидкостью клеток или

с "с % % Инвентарный № Возраст в момент заражения, дни Кол-во введенного материала, мл Результаты исследований

лейкоцитарных культур сывороток крови гематологических изменений характерных для лейкоза

обнаружение структур с плотностью 1,14—1,18 г/мл антигенно идентичных ВУЬ и обладающих обратнотранск-риптазной активностью наличие антител к ВЬУ

1. 48 16 240 + (8 мес.) + (12 мес.) 4- (24 мес.)

2. 49 20 260 + (5 мес.) + (12 мес.) + (30 мес.)

3. 53 15 230 + (3 мес.) + (4 мес.) + (6 мес.)

4. 59 34 250 + (18 мес.) + (3 мес.) 4- (5 мес.)

5. 60 39 200 4- (18 мес.) 4- (18 мес.) 4- (72 мес.)

6. 61 33 160 + (3 мес.) 4- (7 мес.) + (24 мес.)

7. 62 30 150 + (3 мес.) 4- (7 мес.) 4- (27 мес.)

8. 63 25 200 + (18 мес.) 4- (18 мес.) 4- (60 мес.)

9. 64 39 150 4- (7 мес.) + (18 мес.) 4- (24 мес.)

10. 65 38 250 + (18 мес.) 4- (8 мес.) 4- (25 мес.)

И. 66 29 170 + (18 мес.) + (5 мес.) + (30 мес.)

Тримечания «+» — положительный результат, «.. .мес.» — срок начала появления данного признака в месяцах.

В 1981 году (срок наблюдения 4 года и 5 месяцев) 2 животных (№№ 59 и 66) с клиннко-гематологическп подтвержденным диагнозом на лимфолейкоз и 2 животных (№№ 60 и 63), имевших только некоторые признаки развития онкорнавирусной инфекции, были забиты и первично-трипсинизированные культуры клеток селезенки, почек и лимфатических узлов этих животных исследовались на наличие ВЬУ. Во всех изученных культурах клеток были обнаружены структуры с плавучей плотностью 1,14—1,18 г/мл, антигенно идентичные ВЬУ и обладающие обратно-транскриптазной активностью.

Остальные животные были забиты в 1985 году (у особей №№

48, 49 и 53 срок наблюдения составил 8 лет и 5 месяцев, у №№ 61, 62, 64, 65 — 7 лет и 4 месяца) с диагностической целью.

Результаты патологоанатомического вскрытия и гистологического исследования материала подопытных животных №№ 48, 61, 63 и 66 были сходны. Установлено незначительное увеличение селезенки, подчелюстных, заглоточных, медиастинальных и глубоких паховых лимфоузлов. В препаратах селезенки выявлено увеличение лимфатических фолликулов с сильно расширенной периферической В-зависимой зоной. На срезах измененных лимфоузлов отмечено нарушение структуры. В кортикальной и паракортикальных зонах поверхностных шейных лимфоузлов наблюдалось увеличение объема лимфатических фолликулов со светлыми центрами, которые местами сливались. В препаратах медиастинальных лимфоузлов поля пролиферации лимфоцитов выявлялись в паракортикальной зоне вдоль трабекул. Синусы медуллярной и паракортикальной зон были наполнены незрелыми лимфоидными клетками: Мелкие очаги лимфоидных клеток обнаружены в кортикальном слое почек и печени.

При патологоанатомическом исследовании у животных №№

49, 53, 64 и 65 установлены изменения, характерные для лейкоза. Обращало на себя внимание множество увеличенных лимфоузлов. Селезенка увеличена, края закруглены, капсула напряжена (у животного №53 размеры органа 67X17X5 см, вес 5,9 кг). На разрезе пульпа селезенки рыхлая, фолликулы увеличены, цвет серо-красный. Печень увеличена, край закруглен, под капсулой видны множественные белесоватые очажки до 1 см в диаметре. У животного № 64 стенка сычуга местами утолщена до 4 см. Все лимфатические узлы как поверхностные, так и внутренние увеличены: поверхность гладкая, консистенция тестоватая, на разрезе саловидная.

В мазках-отнечатках лимфоузлов и селезенки основную массу клеток составляли пролимфоциты с нуклеолями в ядрах и лим-фобласты, количество малых лимфоцитов было значительно уменьшено. На основании результатов патологоанатомнческого и цитоморфологического исследования у животных №№ 49, 53, 59, 64 и 65 поставлен диагноз: хронический лимфолейкоз.

Таким образом, результаты опытов показали, что заражение

Р н с. 2. Вирионы ВЛ КРС в межклеточном пространстве (биоптат селезенки подопытного животного №53). Ув. 55000X.

телят впруссодержащей культуралыюй жидкостью клеток РЬ5У+. и РЬКу+ вызывает развитие инфекции ВЬУ (рис. 2.) и лейкоз-ного процесса. Серологический ответ после инкубационного периода от 3 до 18 месяцев регистрируется у подопытных животных в течение 5—8 лет.

Помимо крупного рогатого скота представлялось важным исследовать возможность использования в качестве экспериментальной модели других, менее дорогостоящих животных, а именно овец.

С этой целыо, начиная с января 1979 года нами был поставлен опыт по экспериментальному воспроизведению лейкоза крупного рогатого скота на овцах. В опыте было 6 овец эстонской черноголовой породы (из них 1 контрольная), которые были получены из хозяйства, благополучного по лейкозу. Возраст овец при инокуляции — 12 месяцев.

Для заражения животных использовали впруссодержащую культуральную жидкость культуры клеток РЬКу;- Вирусную суспензию вводили животным внутрибрюпппшо.

Определение различных характеристик экспериментальной инфекции овец и ягнят начинали по прошествии 1—2 педель с момента постановки опытов, затем пробы брались еще через 2 недели, а в последующем — с интервалом 2—4 месяца.

Пяти животным внутрпбрюшиино ввели по 250 мл впруссодержащей культуралыюй жидкости клеток РЬКу-. Одна овца осталась не инфицирована в качестве контроля.

Результаты изучения экспериментальной онкорнавирусной инфекции на овцах, зараженных культуральной жидкостью клеток постоянно продуцирующих ВЬУ

Е- X

О О) Я £

О

т

я : о.;

§

Результаты исследований

<и о ч а,

п. к

>>«

н о

£ * Ч о

>. а ^ £ и

й а.

О. О

° с о м

^ а о

О-ьГ

>.—. о- I И I

^ о о о о. к С н о са ч

в —

н Н

н ч в \о СО о

сывороток крови в

РИД

РСК

1. 30

2. 31

3. 32

4. 33

5. 34

6. 35

12 250

12 250

12 250

12 250

12 250

12 250

4- (1,5 мес.) 4- (1,5 мес.) + (3 мес.) 4- (3 мес.) + (3 мес.)

4- (3 мес.) 4- (3 мес.) 4- (3 мес.) 4- (3 мес.) 4- (3 мес.)

4- (3 мес.) 4- (3 мес.) 4- (3 мес.) + (3 мес.) 4- (3 мес.)

4- (45 мес.)

4- (45 мес.)

' Обратно-транскриптазная активность

Результаты опыта (табл. 4) по экспериментальному заражению овец внруссодержащей культуральной жидкостью и клетками РЬКу+ позволили придти к заключению, что инфицирование животных приводит к развитию у них инфекции ВЬУ и лей-козного процесса. При этом у всех подопытных овец была выявлена онкорнавирусная инфекция ВЬУ и серологический ответ после инкубационного периода от 7 недель до 5 месяцев, определяемые на протяжении всего опыта.

Развитие лейкозного процесса наблюдалось у 4 из 5 зараженных овец.

Гематологические изменения, характерные для лимфолейкоза, наблюдались у 2 овец спустя 40 месяцев после заражения.

Показано, что для индукции инфекции у зараженных овец хватает введения 250 мл культуральной жидкости клеток РЬКу+, содержащей ВЬУ. Минимальный срок наблюдения за инфицированными животными должен составлять не менее 2 лет.

2.1.3. Экспериментальная трансмиссия лейкоза телятам кровью больных спонтанным хроническим лимфолей-козом коров

Согласно опубликованным до 1970 года результатам, ряду исследователей удалось индуцировать лейкоз у телят кровью и клеточными суспензиями органов и опухолей больного лейкозом крупного рогатого скота, но эти опыты проводились вне изучения связи развития лейкозного процесса и вирусной инфекции.

Опыт по экспериментальному воспроизведению лейкоза кровыо больной хроническим лимфолейкозом коровы был поставлен в декабре 1974 года.

Схема опыта приведена в табл. 5.

Таблица 5

Схема постановки опытов по инокуляции телят цельной кровью доноров

Инвентарный № телят

ш й

К ч

Клинико-гематологический диагноз донора

су ^ а и д хё ° -

о =

18 11 1216 лимфолейкоз (179 тыс. 50 внутримышечно

22 17' 1216 лейкоцитов в 1 мкл, 96% лимфоцитов) 50 >•

Конт- 1 12 594 здоров (7,1 тыс. лейкоци- 50

рольный 2 14 594 тов 1 мкл, 57% лимфоци- 50 „

тов)

Ретроспективный анализ результатов комплексного исследования подопытных животных, с учетом патоморфологического заключения показал, что у телят, инфицированных цельной кровыо больной лейкозом коровы, удалось индуцировать лейкоз-ный процесс.

У контрольных животных, инокулированных кровыо здорового донора, не было установлено характерных для заболевания лейкозом изменений клинико-гематологических показателей и развития онкорнавирусной инфекции.

Через 5 лет и 2 месяца после инокуляции крови донора животные Лп°№ 18 и 22 были забиты с диагностической целью.

На основании результатов патологоанатомического, цитомор-фологического и гистологического исследований материала у экспериментальных животных №№ 18 и 22 поставлен диагноз: хронический лимфолейкоз.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о воспроизведении лейкозного процесса в эксперименте у телят, инокулированных кровью больных спонтанным лимфолейкозом коров.

Отсутствие развития онкорнавирусной инфекции и заболевания у телят при введении крови здоровых доноров, свободных от ВЬУ инфекции, и обязательное наличие инфицированности ВЬУ у заболевших телят свидетельствовало о причинно-след-ственпой взаимосвязи между ВЬУ и заболеванием и о содержании вируса в цельной кровн больного лейкозом крупного рогатого скота.

2.1.4. Экспериментальная трансмиссия лейкоза телятам лейкоцитами крови больных спонтанным лимфолейкозом коров

Наряду с опытами по изучению лейкомогенных свойств цельной крови больного лейкозом крупного рогатого скота мы провели также опыт по изучению лейкомогенных свойств выделенных лейкоцитов. Опыт поставлен в мае 1976 года.

В опыте использован один теленок № 56, которому в 11 дневном возрасте трехкратно, с интервалами в 7 дней интраперито-неально было введено 2,7X 1010 лейкоцитов (20+10+10 мл) больного лимфолейкозом донора № 517 (84 тыс. лейкоцитов в 1 мкл крови, 95% лимфоцитов). Параллельно для контроля теленку № К по такой же схеме инокулировано 2,5хЮ10 лейкоцитов здорового донора № 1716 (6,9 тыс. лейкоцитов в 1 мкл крови, 53% лимфоцитов).

Комплексным исследованием, проведенным в динамике опыта, показано, что лейкоциты крови больного лейкозом крупного рогатого скота индуцируют развитие онкорнавирусной инфекции и лейкоза у телят (табл.6).

Таблица 6

Результаты комплексного исследования подопытного крупного рогатого скота, ннокулированного лнмфоциталш крови

Инвентарный № животного

56

контрольные

Срок наблюдения Гематологический диагноз РИД

4 года и 9 месяцев + —

антител ВЬУ

+ +

антител р24 ВЬУ РИД на р24 ВЬУ

осадки кудьтуральной среды

+ — + —

лимфолейкоз отрицателен на лейкоз

экстракт культивированных лейкоцитов Патоморфологический диагноз

У телят, инокулнрованных лейкоцитами здорового крупного рогатого скота, свободного от ВЬУ инфекции, не было выявлено развития онкорнавируснои инфекции и лейкозного процесса, что подтверждено результатами патоморфологического исследования.

Через 4 года и 9 месяцев после инокуляции животное было забито.

В мазках-отпечатках лимфоузлов и селезенки отмечалось значительное увеличение количества пролимфоцитов и лнмфо-бластов, малые лимфоциты были единичны. В препаратах печени и почек среди клеток паренхимы органов наблюдалось большое число лимфоидных клеток разной степени дифференциации.

На основании данных патологоанатомического вскрытия и результатов цитоморфологнческого и гистологического исследований постморталыюго материала у животного № 56 подтвержден диагноз — хронический лимфолейкоз.

Параллельно из нативных тканей селезенки, лимфоузлов и лейкоцитов крови были приготовлены экстракты и изучены в РИД на наличие в них р24 антигена ВЬУ. Результаты реакции были положительны во всех исследованных препаратах.

2.1.5. Экспериментальная трансмиссия лейкоза телятам клетками, выделенными из молока больных спонтанным лимфолейкозом коров

Для изучения возможности передачи лейкоза соматическими клетками, содержащимися в молоке больных лейкозом коров, нами в мае 1976 года поставлен опыт на телятах. Четырем телятам, рожденным от здоровых матерей, свободных от инфекции ВЬУ, был введен парентально пул клеток, выделенных из молока больных лейкозом (доноры №№ 996, 5756) и здоровой коровы (№ 369).

Количество соматических клеток в 1 мл молока составляло в среднем: у коровы № 996 — 35,71 ±2,74 тыс., у донора № 5756 — 74,86±3,22 тыс., у здоровой коровы — 10,2±2,42 тыс. Морфология клеток в мазках, приготовленных из осадка молока, была различной, но отмечалась примесь форменных элементов крови.

У контрольных животных (срок наблюдения 3 года), инокулнрованных клетками молока здоровой коровы, не выявлено онкорнавирусной инфекции и развития лейкозного процесса.

У животного № 50 регулярным вирусо-иммунологпческнм исследованием через 3 месяца после инокуляции установлена инфекция ВЬУ — антитела к ёр70 антигену ВЬУ в сыворотках крови. Через 10 месяцев в краткосрочных культурах лейкоцитов выявлены внрноны типа С и антигены ВЬУ. В этот же период определены антитела к р24 антигену ВЬУ.

С трех до пяти лет наблюдения у животного сохраняласьсуб-лейкемическая картина крови. Колебания количества лейкоци-

тов в 1 мкл крови составляли 17,0—29,0 тыс. В лейкоцитарной формуле лимфоидные клетки составляли 81,90±2,2%, из них пролимфоциты и лимфобласты — 5,73±0,43%. Антитела к gp70 антигену ВЬУ с помощью РИД определялись в сыворотках крови постоянно. В то же время антитела к р24 антигену с помощью данной реакции регулярно выявлять не удавалось.

В течение шестого года эксперимента проявился совершенно иной характер течения лейкозного процесса у данного животного по сравнению с животным № 55. Количество лейкоцитов в I мкл крови увеличилось до лейкемического уровня (70 тыс.). В лейкоцитарной формуле лимфоидные клетки составили 90,55± 1,86%, с колебаниями 86,0—95,0%, из них пролимфоцитов и лимфо-бластов 3,0—15,0%.

Через шесть лет и 4 месяца после инокуляции животное № 50 было забито. Диагноз — хронический лимфолейкоз.

У животного № 55 выявлена совершенно иная картина течения заболевания. Развитие онкорнавирусной инфекции предшествовало выявлению характерных для лейкоза изменений крови. Антитела к gp70 антигену ВЬУ определены через 2 месяца после введения клеток молока, к р24 антигену — через шесть месяцев и определялись постоянно.

Увеличение подкожных лимфатических узлов обнаружено у животного через 3 месяца после инокуляции.

Через четыре года и 8 месяцев после инокуляции отмечено резкое ухудшение общего состояния животного, что проявлялось в резком снижении упитанности, диарее, нарушениях сердечного ритма. Анализ крови на этот период показал, что количество лейкоцитов снизилось до 7,2 тыс./мкл. В лейкограмме увеличился процент нейтрофильных лейкоцитов (18,5%) и снизилось число лимфоидных клеток (70,0%). Одновременно в мазках крови стало насчитываться до 6,5% опухолевых, лимфосарком-ных клеток.

Через четыре года и 9 месяцев животное было забито.

На основании данных патологоанатомнческого вскрытия и результатов цитоморфологического исследования постморталь-ного материала животного № 55 поставлен диагноз: лимфосар-кома.

Таким образом, клетками молока больных хроническим лим-фолейкозом коров гемобластоз удалось индуцировать у иноку-лированных телят, что подтвердило возможность передачи заболевания и онкорнавирусной инфекции молоком больных животных. Учитывая положительные результаты наших опытов по трансмиссии лейкоза телятам цельной кровью и лейкоцитами больных лимфолейкозом коров, можно предположить, что источником инфекции в данном опыте явились лимфоциты крови, примесь которых в молоке была довольно значительной.

2.1.6. Экспериментальная трансмиссия лейкоза телятам плазмой крови больных спонтанным хроническим лим-фолейкозом коров

В опыте по изучению лейкомогенпых свойств плазмы больного лейкозом крупного рогатого скота использован один теленок № 51, которому в 26-дневном возрасте трехкратно, с интервалами в 7 дней внутривенно было введено 165,0 мл плазмы больного лейкозом донора № 2013 (97 тыс. лейкоцитов в 1 мкл крови, 95% лимфоцитов). Параллельно для контроля теленку № К по такой же схеме инокулировано 165,0 мл плазмы здорового донора № 1446 (7,8 тыс. лейкоцитов в 1 мкл крови, 54% лимфоцитов).

Опыт начат в мае 1976 года.

За четыре года наблюдения у контрольного животного не было выявлено ни характерных для лейкоза изменений крови, ни инфекции ВЬУ. Животное забито практически здоровым, что подтверждено результатами гистологического исследования постмортального материала.

В то же время, у животного № 51 уже через два месяца после инокуляции в сыворотке крови были выявлены антитела к гликопротеидному антигену ВЬУ в РИД, через пять месяцев при клиническом обследовании установлено увеличение подкожных лимфатических узлов. Гематологические показатели животного в течение первого года опыта были подозрительны на лейкоз.

Через 10 месяцев после инокуляции в сыворотке крови наряду с антителами к £р70 антигену ВЬУ были выявлены антитела и к р24 ВЬУ. С указанного времени антитела к обоим антигенам ВЬУ определялись постоянно.

Через четыре года и 9 месяцев после инокуляции животное было забито.

В мазках-отпечатках селезенки и лимфоузлов преобладающими клеточными элементами являлись пролимфоциты с нук-леолями в ядрах.

На основании результатов патологоанатомического вскрытия и выявленных цитоморфологических изменений в лимфоузлах и селезенке животного установлен диагноз: хронический лимфо-лейкоз.

Таким образом, нам удалось индуцировать инфекцию ВЬУ и лейкозный процесс у теленка введением плазмы больной спонтанным лимфолейкозом коровы, что, вероятнее всего, свидетельствовало о наличии инфицирующего вируса в этой составной части крови. Признаки онкорнавируспой инфекции у животного установлены задолго до гематологического проявления заболевания, которое характеризовалось хроническим течением.

2.2. Изучение иммунного ответа на введение инактивиро-ванного аминометилольными соединениями ВЬУ крупному рогатому скоту и овцам

После того, как были получены положительные результаты в опытах по экспериментальному воспроизведению лейкоза КРС очищенным вирусом, в 1981 г. нами было начато исследование возможности иммунопрофилактики данной болезни.

С этой целью поставлено два опыта. В ходе первого опыта иммунизировали 8 овец и 10 телят, а во втором — 8 телят. Иммунизацию проводили приготовленным в Институте вирусологии АМН СССР препаратом ВЬУ, инактивированным аминометилольными соединениями, в дозе 700 мг белка. Инактивнро-ванный вирус вводили животным внутримышечно с гидратом окиси алюминия, используемым в качестве адъюванта.

Для определения протективного действия иммуногена в первом опыте половину иммунизированных животных (4 овцы и 5 телят) на высоте иммунного ответа заразили кровью больной лейкозом коровы (80 тыс. лейкоцитов в 1 мм3, 82% лимфоцитов) в объеме 100 мл. Остальных животных (4 и 5 соответственно) заразили вируссодержащей культуральной жидкостью.

Во втором опыте вакцинацию выполняли дважды (интервал около месяца) с контрольным заражением через 2,5 месяца кровью лейкозной коровы.

В исследование были включены также две контрольные группы, в одной из которых содержались интактные животные, а во вторую входило 11 телят и 5 овец, экспериментально зараженных вируссодержащей культуральной жидкостью без предварительной вакцинации.

2.2.1. Результаты исследований

Проведенные исследования показали, что внутримышечное введение телятам и овцам вируса лейкоза КРС, инактивирован-ного аминометилольными соединениями, с адъювантом через две недели после вакцинации вызывало появление иммунного ответа, который усиливался в случае ревакцинации.

Специфические антитела к ВЬУ были обнаружены у всех иммунизированных животных. В то же время у них отсутствовали структуры вируса в краткосрочных культурах лейкоцитов, гематологические изменения и опухоли.

В первом опыте, после разрешающего введения иммунизированным телятам и овцам ВЬУ или крови больной лейкозом коровы у всех животных по-прежнему сохранялись антитела. Репродукция вируса в лейкоцитарных культурах наблюдалась только у 2 из 10 телят, один из которых был заражен ВЬУ, а другой — кровью. У этих же двух животных через два года

после контрольного заражения были отмечены характерные для лейкоза гематологические изменения.

Ни у одной из 8 иммунизированных и зараженных овец в первом опыте и ни у одного из 8 телят во втором опыте репродукции вируса в лейкоцитах, гематологических изменений или опухолевого процесса установлено не было.

Кроме того, через два месяца после контрольного заражения от телят второго опыта брали кровь, которую ввели овцам (от каждого — двум овцам). Результаты биопробы оказались положительными с кровью от 3 телят, т. е. в 5 из 8 случаев вирус лейкоза КРС был элиминирован из организма или утратил инфицирующую способность уже через два месяца после его инокуляции вакцинированным животным.

В отличие от опытных (вакцинированных) групп, экспериментальное заражение ВЬУ животных контрольной группы привело к развитию онковирусной инфекции у всех 11 телят и 5 овец.

Лейкоз гематологически диагностировали у 3 овец; у 2 овец заражение привело к образованию опухолей. У 6 телят были установлены гематологические изменения, характерные для лейкоза (лейкоцитов 25—30 тыс. в 1мм3, лимфоцитов 80—90%); еще у 5 телят наблюдались гематологические изменения подозрительные на лейкоз.

Как видно из представленных данных, у контрольных животных картина экспериментального заражения ВЬУ была совершенно иная, чем у предварительно иммунизированных, причем эти различия были достоверными (р<0,05).

Таким образом, полученные нами результаты, свидетельствуют о протективном действии инактивированного аминомети-лольными соединениями ВЬУ в отношении онковирусной инфекции, при его внутримышечном введении с гидратом окиси алюминия телятам и овцам.

2.3. Изучение поверхностной архитектоники лимфоцитов периферической крови при лейкозе КРС

В настоящее время исследованию поверхностной архитектоники клеток удаляется большое внимание. Сканирующая электронная микроскопия используется в биологических исследованиях около 10—14 лет. Вначале это были немногочисленные наблюдения, а в последние годы количество исследований с привлечением сканирующей электронной микроскопии значительно возросло.

Сейчас уже можно говорить о том, что при различных патологических процессах изменение клеток зависит от особенностей их поверхности. Поэтому становится понятен интерес исследователей найти отличительные характеристики в структуре поверх-

ностой мембраны патологических клеток с их нормальными аналогами.

Задачей настоящего исследования было изучение архитектоники клеточной поверхности лимфоцитов периферической крови крупного рогатого скота больных спонтанным, хроническим лим-фолейкозом и экспериментальным лимфолейкозом. Контролем служили лимфоциты периферической крови здоровых коров.

Электронно-микроскопически были исследованы лимфоциты от 9 здоровых коров, от 8 — спонтанных лимфолейкозных и от 12 — экспериментальных лимфолейкозных животных.^

Суспензию лейкоцитов фиксировали в пробирке 2,5% раствором глютарового альдегида на фосфатном буфере в течение 45 минут с последующей промывкой в фосфатном буфере при рН 7,2—7,4. Допольнительную фиксацию проводили в 1% растворе четырехокиси осьмия на основном буфере в течение 1 часа. Затем материал промывали фосфатным буфером. Обезвреживание материала проводили в серии этанола нарастающей концентрации. Суспензию клеток наносили тонким слоем на медную или латунную пластинку, высушивали на воздухе и напыляли слоем золота. Напыление осуществлялось в вакуумной напыли-телъной установке.

Препараты просматривались в сканирующей приставке к электронному микроскопу JEM—100С.

Данные исследования выполнялись нами в Центральном Институте гематологии и переливания крови Минздрава СССР совместно с профессором Г. И. Козинцом.

2.3.1. Результаты исследования

Исследование периферической крови здоровых коров с помощью сканирующего электронного микроскопа показало, что лимфоциты по морфологии клеточной поверхности представляют неоднородную группу клеток. Встречались клетки с относительно гладкой клеточной поверхностью (рис. 1 и 2). Поверхностная мембрана этих клеток была совершенно гладкой или с небольшой волнистостью (рис. 3 и 4).

Встречались также клетки, поверхность которых выглядела довольно рельефней (рис. 4). Клеточную мембрану сплошь покрывали многочисленные короткие, довольно широкие выросты, а иногда и отдельные тонкие длинные отростки в виде ворсинок. Количество ворсинок варьирует от клетки к клетке. Проведенный нами количественный подсчет лимфоцитов периферической крови здоровых коров показал, что 64—70% лимфоцитов является гладкими или относительно гладкими, а 30—• 36% лимфоцитов имеют ворсинки.

В результате исследования лимфоцитов крови коров, больных спонтанным хроническим лимфолейкозом, установлено, что в периферической крови встречаются в основном лимфоциты с

*' кС> ' • .7'

Рис. 1. Лимфоциты периферической крови здоровой коровы. Относительно гладкие лимфоциты. Ув. 6000X.

Р и с. 2. Лимфоциты периферической крови здоровой коровы. Гладкий лимфоцит с ровной поверхностью. Ув. 7000Х.

1

ЙпУ.* \ I „

V-

5 и с. 3. Лимфоциты периферической крови ■*'<, • ' доровой коровы. Гладкие лимфоциты с со- г/ / ' ¡ершенно ровной поверхности и ворсинчатый 1 .-'•'••¿-Ъ.

лимфоцит. Ув. 5000Х. ;;

Р и с. 4. Лимфоциты периферической крови здоровой коровы. Гладкие, относительно гладкие и ворсинчатые лимфоциты. Ув. 3000Х.

Р и с. 6. Лимфоциты периферической кров! коровы, больной спонтанным хронически» лимфолейкозом. Поверхность клеток неров ная с небольшими короткими выростами Ув. 4000 X.

Р и с. 7. Лимфоциты периферической крови коровы, больной спонтанным хроническим .лимфолейкозом. Поверхность клеток неровная с небольшими короткими выростами. Ув. 4000 X.

А Лг.

Р н с. 8. Лимфоциты периферической кроЕ коровы, больной спонтанным хронически лимфолейкозом. На поверхности имект многочисленные цитоплазматические о ростки. Ув. ЗОООХ.

4\ Чг- • - ' ^ •V »г

■Л

ШШЯь «ж**»«*. •

• <4 Ч Л

■ММвИм?

9. Лимфоциты периферической крови >вы, больной спонтанным хроническим фолейкозом. Поверхность клеток неров-с выростами, отдельными ворсинками и -очисленными цитоплазматическими отростками. Ув. 7000Х. Рис. 10. Лимфоциты периферической крови

крупного рогатого скота, больного экспериментальным лимфолейкозом. Лимфоциты на поверхности имеют различное количество-многочисленных ворсинок. Ув. 7000Х.

:. 11. Лимфоциты периферической крови того рогатого скота, больного экспери-"альным лимфолейкозом. Ворсинчатые ¡юциты имеют многочисленные густо 'асположенные ворсинки. Ув. 7000х.

Рис. 12. Лимфоциты периферической крови крупного рогатого скота, больного экспериментальным лимфолейкозом. Поверхность, клеток с многочисленными ворсинками. Ув. 7000X.

Рис. 13. Лимфоциты периферической крови крупного рогатого скота, больного экспериментальным лимфолейкозом. Поверхность клеток неровная с небольшими короткими выростами в виде ворсинок и имеются от ростки различной длины. Ув. ЗОООх.

а:т

Рис. 14. Лимфоциты периферической кров крупного рогатого скота, больного экспер] ментальным лимфолейкозом. Поверхност клеток неровная с выростами и отдельным ворсинками. Ув. 5000Х.

Р и с. 15. Лимфоциты периферической крови крупного рогатого скота, больного экспериментальным лимфолейкозом. Поверхность клеток неровная с выростами. Ув. 6000Х.

Р и с. 16. Лимфоциты периферической крм крупного рогатого скота, больного экспер ментальным лимфолейкозом. Поверхнос клеток неровная с отростками в виде во сипок. Ув. 5000X.

выраженным рельефом клеточной поверхности. Многочисленные широкие небольшой длины складки и отростки равномерно распределены по всей поверхности клетки (рис. 5 и 6). Кроме того, на клеточной поверхности встречаются многочисленные длинные отростки в виде ворсинок (рис. 7 и 8), причем количество этих ворсинок варьирует на видимой поверхности. Иногда количество ворсинок из-за обилия и компактного расположения подсчитать довольно трудно.

При экспериментальном лимфолейкозе крупного рогатого скота лимфоциты периферической крови имеют хорошо развитую рельефную поверхность клетки (рис. 9 и 10). Клеточная мембрана вся покрыта многочисленными складками и отростками небольшой длины (рис. 11—14). Встречаются также длинные выросты в виде ворсинок. На поверхности находятся также крупные пузыревидные структуры (рис. 15 и 16).

В результате исследований на сканирующем электронном микроскопе можно сделать вывод, что лимфоциты периферической крови здоровых коров представляют собой неоднородную группу клеток. По морфологии клеточной поверхности выделяли два типа лимфоцитов: клетки с относительно гладкой поверхностью и ворсинчатые.

В первых исследованиях с применением сканирующей электронной микроскопии было высказано предположение, что Т- и В-лимфоциты могут различаться по их поверхности (A. Polliack, et al., 1973, 1975). Многие исследователи пришли к выводу, что у некоторых Т-лимфоцитов имеются на поверхности ворсинки, а некоторые В-лимфоциты имеют гладкую поверхность (М. J. Alexander et al., 1978; D. G. Nevel et al., 1983).

В общем можно сказать, что комплексное использование сканирующей электронной микроскопии и иммунологических данных позволило достоверно показать, что В-лимфоциты имели комплекс волосков на поверхности и Т-лимфоциты имели относительно гладкую или слегка неровную клеточную поверхность. Часть Т-клеток, имеющих промежуточную поверхностную морфологию, возможно и составляет маленькую субпопуляцию с более сложной поверхностной архитектоникой. Однако трудно исключить возможность, что они являются действительно небольшой группой В-клеток, с относительно меньшим количеством выпячиваний и микроворсинок, чем в среднем у В-клеток.

Но и различная поверхностная морфология некоторых Т-лимфоцитов и тимусных клеток соответствует субпопуляции Т-клеток различной стадии дифференциации.

Подытоживая можно сказать, что при спонтанном хроническом лейкозе и особенно при экспериментальном лимфолейкозе крупного рогатого скота клетки с выраженным рельефом поверхности встречаются значительно чаще, чем у здоровых животных. .

2.4. Усовершенствованные рекомендации по диагностике и мерам борьбы с энзоотическим лейкозом крупного рогатого скота

Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота многие годы является одной из главных ветеринарных проблем в республике. За 1981 —1990 гг. болезнь была диагностирована у 0,5—1,7%, дойных коров, а вирусом лейкоза КРС заражено в среднем 25—■ 30% молочного скота Эстонии. Первоначально (1982) свободными от инфекции ВЬУ являлись стада лишь 4 хозяйств, что составляло только 1% от всех стад КРС Эстонии (табл. 1, рис. 1, 2, 3).

Таблица I

Распространение энзоотического лейкоза КРС в Эстонии по зонам разведения в 1988 г.

Зоны разведения Кол-во гема- тол. ИССЛ. животн. 1 Гематол. лей-| козн. животн. % лейкозн. животн. из исследованных Граница достоверности ра

Ра = 2,5 % Ра = 97,5 % Ра = 0,5 % —Р о— « с В0! с. о

чэп 14 747 18 0,122 0,077 0,193 0,064 0,27

кэп 80 711 1641 2,033 1,938 2,133 1,908 2,164

обеих пород 70 167 568 0,809 0,746 0,879 0,726 0,900

165 625 2227 1,345 1,290 1,401 1,273 1,419

С 1982 года в противолейкозный комплекс для выявления инфицированных ВЬУ животных нами был внедрен серологический метод диагностики — реакция иммунодиффузии в геле (РИД). На протяжении ряда лет разрабатывались новые эффективные мероприятия для борьбы с болезнью, которые оказались более приемлемыми для использования в крупных животноводческих комплексах.

Работа была проведена в 60 стадах КРС, что составляет примерно 20% всех стад республики. Стада отличались различной степенью инфнцированности ВЬУ — вирусоносителей выявили 0,9—85% от общего числа молочных коров (рис. 4 и 5).

Общий принцип оздоровления стад от энзоотического лейкоза заключается в выявлении инфицированных ВЬУ животных и, в зависимости от распространения инфекции среди поголовья, в устранении их из стада или изолировании на отдельных фермах. При сильном поражении (более 80% особей) оздоровление стада начинали путем постепенной замены инфицированных животных или оздоровленным молодняком самого хозяйства,

Рис. л. Динамика распространенна

энзоотического лейкоза КРС Ь Эстонии

ЦИФРЫ ПОКАЗЫВАЮТ ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬ НА 100 ООО ГОЛОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

'^ХАРЬЮСКИЙ =

-Л

162 I 599 /

ХИ1 /1 ХАЛПСАЛУСКИУеРДПЛДСКИТ^

/

255

■1667

^ПАИДеский| 329

-ИЫГЕВДСКИИ'-■" 517'

пярнускмй /бильяндискш

(■■:■ 1549 ТАРУУСКИЙ: 780

•■ВМГАСКИИ ,-78о:

| ПЪ\ЛЬАСКИ№

ш

зона разведения черно-пестрои эстонской породы скота зона ра1в>ед.£н1ля краской хгонской породы скога зонд разведения об£м

:-.0ЫРУСКИИ :

л 514-: '

I_I Э(ТОМСКИХ ПОРОД СКОТА

ЭДС.2.3АБОЛЕ&АЕМОСТЪ ЭНЗООТИЧЕСКИМ ЛЕЙКОЗОМ КРУПНОГО РОГАТОЮ СКОГА б ЭСТОНСКОЙ ССР

Б 1955 ГОДУ

ЦИФРЫ ПОКАЗЫВАЮТ ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬ НА 100000 голое КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

зона газбеде- 1^/ния черно-пестрои эстонской породы скота

зона раэьеде.ния красной эстонской порода! скота

ЗОНА РАЭЙЕДЕНИЯ ОЬЕИХ ЭСТОНСКИХ ПОРОД СКОТА

РИС.3. К4РТ0ГРДАША РАСПРОСТРАНЕНИЯ ЭНЗООТИЧЕСКОГО ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА 5 ЭСТОНСКОЙ ССР Ь1986 Г.

или животными, купленными из свободных от лейкоза хозяйств.

Изолированные сероотрицательные животные подвергались повторным серологическим исследованиям 2—4 раза в год с интервалами в 3—7 месяцев. Вновь выявляющиеся сероположи-тельные особи были элиминированы сразу же после установления диагноза.

Для диагностирования инфекции BLV использовали диффу-зионно-преципитационный метод с гликопротеидным антигеном (Курская биофабрика) по общепринятой методике.

В 1990 году были начаты опыты для внедрения в противо-лейкозный комплекс энзиматического метода (ELISA) с моно-клональными антителами к гликопротеидному антигену BLV (Пылваский биоцентр в Эстонии).

2.4.1. Результаты исследований

Результаты оздоровления некоторых в различной степени неблагополучных по инфекции BLV хозяйств изображены на рис. 7.

Из представленного рисунка следует, что при безоговорочном выполнении разработанных нами схем оздоровления удалось уже в течение 1—1,5 года уменьшить количество животных виру-соносителей до минимума как при умеренном (хозяйства IV и V), так и при сильном (хозяйства I, II, III) первоначальном поражении стада.

Положительные результаты наиболее выражены при проведении серологических исследований с интервалами в 3 месяца и при немедленной изоляции вновь выявляемых сероположитель-ных особей.

Рис. Показатели интенсиЬности случаеЬ опихолеЬого лейкоза КРС «а ^ооооо короЬ ь 190СГг. ьзстонии

не ЬыясНен ШНЯВ ■< -100 -100 < -140 < ЕЯШ 300 <

-ж данные отсутстЬумт

Рис. 5. Распространение В/1 КРС Ь Эстонии (1990)

Итоги многолетней работы по оздоровлению 43 стад представлены в таблице 2 и на рисунке 6.

Об эффективности применяемых мероприятий свидетельствует обстоятельство, что на протяжении 4—8 лет, т. е. в период, когда хозяйства вели оздоровительную работу по инфекции ВЬУ 2/3 стад оказались либо оздоровленными (30,2%), либо находятся в последней стадии санации (30,2%). Умеренно (5—20% серопозитивных животных) инфицировано к настоящему времени 23,3% этих стад и только в 8 стадах (16,3%) уровень инфицированное™ превышает 20%.

Таблица 2

Результаты оздоровления стад КРС от инфекции вирусом лейкоза

Уровень инфицированностн ВЛ КРС, % Кол-во (%) инфицированных ВЛ КРС стад

Группы до начала оздоровления в конце 1990 г.

I

II

III

IV

V

0

0,1—5,0 5,1—20,0 20,1—50,0 50 <

0 6 15 14

8

(14,0) (34,9)

(32.5)

(18.6)

13 (30,2) 13 (30,2) 10 (23,3) 7 (16,3) 0

Всего

43 (100,0)

43 (100,0)

до начала о^дороЬленя Ь конце 4990 года

УроЬень инфицироЬанности;%

о

0,-1 -5,0 5/1 -20,0

20,1-50 >50

Рис. в. Распределение стад 43 хозяйстЬ Эстонии по инсрицироЬанности БД КРС

СЕРОЛОГИЧЕСКИ РЕАГИРУЮЩИЕ ПОЗИТИВНО

....... I ХОЗЯЙСТВО

-----II //

-'-'•III //

- IV //

---у //

2,5 годы

?ИС. г ОЗДОРОВЛЕНИЕ О ТА А В РАЗЛИЧНОМ СТЕПЕНИ ИНОЗИЦИРОВАННЫХ В/1КРС

Итак, количество свободных от инфекции ВЬУ хозяйств составляет около 30%, более, чем в два раза увеличилось число' слабо пораженных хозяйств. В то же время количество стад со средней инфицированностыо уменьшилось в 2 раза, а среди сильно пораженных стад 2 оказались оздоровленными, а в остальных стадах количество вирусоносителей существенно снизилось. Результаты оздоровления в значительной степени зависели: от регулярности и тщательности проведенной работы, профессиональной культуры ветврачей и зооинженеров.

Некоторые стада оказывались оздоровленными уже в течение 3-х лет. Это свидетельствует о том, что хотя используемый нами: метод диагностики (РИД) по своей чувствительности уступает нескольким другим серологическим методам (энзиматический, радиоиммунологический), он является результативным в комплексе противолейкозных мероприятий. Внедрение энзиматичес-кого метода, особенно в конечной стадии санации, по всей вероятности должно ускорить ликвидацию энзоотического лейкоза КРС.

Предполагаемого снижения годового удоя молока из-за перегруппировки животных в хозяйствах не наблюдалось. Наоборот, в годы проведения оздоровительных мероприятий по лейкозу в одном племенном хозяйстве средний годовой удой увеличился за 6 лет с 4500 кг до 6500 кг, в другом за 4 года с 5100 кг до 6200 кг. Можно предполагать, что наряду с селекционной работой в этом определенную роль сыграло и оздоровление стад от энзоотического лейкоза (рис. 6, 8).

В заключение можно сказать, что учитывая конкретные возможности хозяйств нами разработана: комплексная схема проти-

-1982 1983 198^ 1935 1986 1987 1988 • 1982 1983 1984 1985 «86 1987 1988 ТОЛЫ

РИС.8. ОЗДОРОВЛЕНИЕ СТАДА ОДНОГО ХОЗЯЙСТВА ОТ ИНФЕКЦИИ Б/1 КРС ПО ЭТАПАМ

волейкозных мероприятий по ликвидации болезни с минимальным экономическим ущербом. При строгом выполнении разработанной схемы оздоровления удалось в течение 1—2 лет уменьшить количество вирусоносителей до минимума как при умеренной, так и при сильной первоначальной пораженности. Схема оздоровления стад от ЭЛ КРС позволяет успешно бороться с болезнью в условиях концентрированного содержания животных даже в хозяйствах, находящихся в зоне высокой интенсивности экологических факторов риска.

Зарубежные схемы-аналоги предусматривают единовременную замену всего поголовья стад, инфицированных вирусом лейкоза КРС, что в условиях крупных ферм связано с большими экономическими затратами.

ВЫВОДЫ

1. Развитие эпизоотии лейкозов крупного рогатого скота в Эстонии с нарастанием заболеваемости в шестидесятые годы обусловлено интенсивным внутрихозяйственным перемещением скота, концентрацией поголовья, изменением технологии выращивания и содержания животных.

2. Экспериментально доказано, что вирус лейкоза крупного рогатого скота является этиологическим агентом лейкоза крупного рогатого скота и развитие лейкозного процесса происходит только при участии ВЬУ.

3. Доказана возможность горизонтальной трансмиссии лейкоза крупного рогатого скота в эксперименте различным натив-ным вируссодержащим клеточным материалом от больного спонтанным лимфолейкозом крупного рогатого скота.

4. Очищенный вирус лейкоза крупного рогатого скота и на-тивный вируссодержащий материал вызывают при экспериментальном заражении животных развитие различных форм лейкоза — хронический лимфолейкоз и лнмфосаркому, которые по своему течению и исходу аналогичны таковым при спонтанном заболевании животных, причем форма лейкоза реципиента не зависит от формы лейкоза донора.

5. Воспроизведение лейкозов в эксперименте обусловлено переносом вируса, а не является только следствием трансплантации опухолевых клеток, что доказывается положительными результатами опытов по индукции заболевания и телят и овец бесклеточным материалом — плазмой и очищенным препаратом вируса лейкоза крупного рогатого скота.

6. Введение телятам и овцам ВЬУ, инактивированного ами-нометилольными соединениями, с адъювантом, вызывает иммунный ответ и обеспечивает защиту 80—90% животных от развития онкорнавирусной инфекции при последующем заражении вирусом или кровью больной лейкозом коровы.

7. В результате исследования крови крупного рогатого скота на сканирующем электронном микроскопе установлено, что в периферической крови здоровых коров встречаются два типа лимфоцитов — гладкие (64—70%) и отростчатые (30—36%), а при спонтанном хроническом лимфолейкозе и экспериментальном лимфолейкозе крупного рогатого скота в крови преобладают клетки с выраженным рельефом поверхности и эти клетки имеют на своей поверхности небольшие складки, отростки и ворсинки.

8. Доказательство вирусной этиологии лейкозов крупного рогатого скота и возможности экспрессии инфекции ВЬУ в организме крупного рогатого скота позволяет сделать заключение о необходимости изоляции инфицированных ВЬУ животных, как источника вирусной инфекции и делает возможным разработку специфических средств профилактики.

9. Комплекс проведенных эпизоотологических исследований дает основание считать, что при лейкозах крупного рогатого скота имеются все звенья эпизоотической цепи: источник возбудителя, болезни, механизм передачи и восприимчивое животное.

10. Эффективность оздоровительных мероприятий в неблагополучных по лейкозу хозяйствах зависит от уровня инфици-рованности и заболеваемости скота лейкозом, своевременности постановки первичного диагноза, регулярности проведения и полноты охвата поголовья серологическими исследованиями, жесткости выбраковки животных, выявляемых по диагностическим тестам и изолированного выращивания молодняка.

11. Оздоровительные мероприятия в зависимости от эконо-мическо-организационных возможностей хозяйств следует проводить либо в целом стаде одновременно, либо по этапам, т. е. начиная с отдельных ферм и включая постепенно целое стадо в оздоровительный процесс.

12. Разработанные нами схемы оздоровления стад от ЭЛ КРС позволяют успешно бороться с болезнью: ликвидировать ее в условиях концентрированного содержания животных.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ, ВНЕДРЕННЫЕ В ПРАКТИКУ

На основе результатов исследований, включавших доказательство вирусной этиологии энзоотического лейкоза крупного рогатого скота и возможности горизонтальной трансмиссии данной инфекции, разработаны рекомендации и предложения, отраженные в следующих документах:

1. Временная инструкция о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота (Утверждена ГУВ МСХ СССР 4 июня 1969 г.).

2. Инструкция по борьбе с лейкозами крупного рогатого скота (Утверждена ГУВ МСХ СССР 14 ноября"1973 г.).

3. Методическое руководство «Диагностирование лейкоза крупного рогатого скота и мероприятия противолейкозной борьбы в Эстонской ССР» (Одобрено НТС МСХ ЭССР 4 февраля

1983 г.).

4. Методические рекомендации по эпизоотологическому исследованию при лейкозах крупного рогатого скота (Утвержденные отделением ветеринарии ВАСХНИЛ 30 декабря 1981 г.).

5. Постановление Совета Министров Эстонской ССР № 114 от 15 декабря 1984 г. «О мероприятиях по совершенствованию профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Эстонской ССР».

6. Инструкция о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота (Утверждена ГУВ МСХ СССР 29 декабря

1984 г.).

7. Программа борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Эстонии на 1986—1990 гг. (Утверждена НТС Агропрома ЭССР 31 октября 1985 г.).

8. Комплексный план борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в СССР (Одобрен секцией ветеринарии НТС Госагропро-ма СССР, протокол № 1 от 30 нюня 1986 г.).

9. План основных мероприятий по оздоровлению крупного рогатого скота от лейкоза в СССР на 1987—1990 гг. (Утвержден Зам. председателя Госагропрома СССР 19 марта 1987 г.).

10. Инструкция о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота (Утверждена ГУВ Госагропрома СССР 9 августа 1990 г.).

11. Дополнения к «Инструкции по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота» от 9 августа 1989 г. (Утверждена Зам. министра СХ Эстонской Республики 14 декабря 1990 г.).

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Симоварт Ю. А. О диагностике лейкоза крупного рогатого скота // Тр. III Всес. конф. по патол. анатомии животных. — Л., 1967. — С. 302—305.

2. Симоварт Ю. Диагностика и дифференциальная диагностика лейкоза крупного рогатого скота // Мат. научной конф., посвященной 120-летию деятельности высшего ветеринарного учебного заведения в г. Тарту. — Тарту, 1968. — С. 8—10.

•3. Симоварт Ю. А. О патоморфологии лейкоза крупного рогатого скота // Маг. конф. вет. врачей Прибалт, респ. — Рига, 1968. — С. 117—119.

4. Simovart J. Patomorfoloogiliste ja histokeemiliste uurimiste tulemusi veiste leukoosi puhul // Teaduslik-tehniHse informatsiooni kogumik. Veterinaaria. Tallinn, 1969. — Kd. 8. — Lk. 56—61.

Симоварт Ю. Результаты патоморфологических и гистохимических исследований при лейкозе крупного рогатого скота (на эст. яз.).

5.'Симоварт Ю. А., Пракс Я- О. Картина крови при лейкозе и бабезиозе крупного рогатого скота // Мат. докл. Всес. науч.-практ. конф. терапевтов и диагностов, посвящ. 100-летию проф. Н. П. Рухлядева. — Казань, 1969, — Т. I. — С. 105—107.

6. Simovart J. Veiste leukoosi patomorfoloogiast ja diagnoosimismeetodite vórdlevast uurimisest Eesti NSV tingimustes Ц Teaduslik-tehnilise informatsiooni kogumik. Veterinaaria. — Tallinn, 1970. — Kd. 9. — Lk. 22—28. Симоварт Ю. О сравнительных исследованиях диагностических методов и патоморфологии лейкоза крупного рогатого скота в условиях Эстонской ССР (на эст. яз.).

7. Симоварт Ю. Лейкоз крупного рогатого скота в Эстонской ССР // Сборник научных трудов Эстонской с/х. академии, посвященный 100-летию со дня рождения В. И. Ленина. — Тарту, 1970. — Вып. 69. — С. 269—282.

8. Simovart J. Patoloogilismorfoloogiliste muutuste osatiihtsusest veiste leukoosi diagnostilises kompleksis // Veiste leukoosialase II sümpoosioni materjalid. — Tin., 1971. — Lk. 77—88.

Симоварт Ю. Значение патоморфологических изменений в диагностическом комплексе при лейкозе крупного рогатого скота (на эст. языке, резюме на русском и английском языках).

9. Simovart J. Veiste leukoosi diagnoosimine histoloogiliste ja tsütoloogi-liste uurimiste abil // Veterinaaria probleeme. — Tartu, 1972. — Lk. 128—138.

Симоварт Ю. Диагностирование лейкоза крупного рогатого скота при помощи гистологических и цитологических исследований (на эст. языке, резюме на русском, финском и английском языках).

10. Simovart J. Tsütokcemiliste uurimiste tulemusi veiste leukoosi puhul // Teaduslik-tehniHse informatsiooni materjalid. Veterinaaria. — Tallinn, 1972. — Kd. 11. — Lk. 27—31.

Симоварт Ю. Результаты цитохимических исследований при лейкозе крупного рогатого скота (на эст. языке).

11. Нымм Э., Симоварт Ю. Опыт диагностирования лейкоза крупного рога-

того скота и совершенствование мероприятий по борьбе с ним // Всес.. симпозиум по пробл. лейкозов с.-х. животных. — М., 1972. — С. 136—137,

12. Симоварт Ю. Исследование биоптата печени и селезенки здорового и лейкозного крупного рогатого скота // Сб. тр. Эст. с.-х. академии. ■— Тарту, 1973. — Т. 84. — С. 65—60.

13. Nomm Е., Simovart J. Veiste leukoos ja seile törje // Tartu, 1973. — 60 lk.

Нымм Э., Симоварт Ю. Лейкоз крупного рогатого скота и борьба с ним-(на эст. яз.).

14. Simovart, J. Veiste leukoosi horisontaalsest ja vertikaalsest ülekandmisest// Sotsialistlik P511umajandus. — Tin., 1973. — Nr. 7. — Lk. 315—316. Симоварт Ю. О горизонтальном и вертикальном переносе лейкоза крупного рогатого скота (на эсг. яз.).

15. Симоварт Ю. А. О направлениях и результатах научных исследований по лейкозу крупного рогатого скота в Эстонской ССР // Достижения' науки и практики в области микробиологии и эпизоотологии. — Тарту,-1973. — С. 21—24.

16. Симоварт Ю. А. Нормальная картина крови у крупного рогатого скота эстонских пород н использование ее при диагностировании лейкоза // Достижения науки и практики в области микробиологии и эпизоотологии. — Тарту, 1973. — С. 84—87.

17. Симоварт Ю. Основные показатели нормальной картины крови у крупного рогатого скота эстонской красной и черно-пестрой пород // Теор. и практ. вопр. ветеринарии. — Тарту, 1974. •— С. 40—45.

18. Нымм Э. М., Симоварт Ю. А. Опыт диагностирования лейкоза крупного' рогатого скота и совершенствование мероприятий по борьбе с ним // Лейкозы с.-х. животных. — М.: Колос, 1975. — С. 217—220.

19. Simovart J. Verenäitajad onkornaviiruste ja mükoplasmadega nakatatud laboratoorsetel katseloomadel // Vet. teor. ja prakt. küsimusi. Tartu, 1975.

— Lk. 23—26.

Симоварт Ю. Показатели крови у лабораторных животных, зараженных-онкорнавирусами и микоплазмами (на эст. яз.).

20. Жданов В. М., Парфанович М. И., Нымм Э. М., Шишков В. П., Симоварт Ю. А. и др. Экспериментальное введение новорожденным телятам-онкорнавируса, выделенного из первичных культур органов больных лейкозом коров // Вирусы рака и лейкоза. — М., 1975. ■—■ С. 123—125.

21. Симоварт Ю. Анализ лейкозных ключей и первоначальный проект лейкозного ключа для эстонских пород крупного рогатого скота // Теор. и практ. вопр. ветеринарии. — Тарту, 1975. — С. 14—17.

22. Симоварт Ю. Проект лейкозного ключа для эстонских пород крупного рогатого скота и его использование // Теор. н практ. вопр. ветеринарии.

— Тарту, 1976. — С. 48—50.

23. Парфанович М. И., Баранов А. Е., Напастникова Т. Л., Нымм Э. М., Симоварт Ю. А. и др Выделение онкорнавируса из первичных культур клеток от больных лейкозом коров, исследование его молекулярно-биоло-гических свойств и возможности экспериментального воспроизведения лейкоза на новорожденных телятах очищенным препаратом вируса // Молекулярная биология вирусов. — М., 1976. ■— С. 87—90.

24. Кукайн Р. А., Нагаева Л. И., Чапенко С. В., Куделева Г. В., Рун-цис А. Я-, Осе В. П., Ильинская Т. Н., Симоварт Ю. А. и др. Лейкомо-генные свойства некоторых фракций молока и периферической крови лейкозных коров // Теорет. и практ. вопр. ветеринарии. — Тарту, 1976. •— С. 37—43.

25. Жданов В. М„ Парфанович М. И., Нымм Э. М., Азимов Ш. А., Шишков В. П., Симоварт Ю. А. н др. Опыты по экспериментальному воспроизведению лейкоза очищенным препаратом онкорнавируса, выделенным, от больного лейкозом крупного рогатого скота // Вирусы рака и лейкоза. — М., 1976. — С. 70—72.

26. Jdanov V. М., Cliichkov V. P., Parfanovitch М. I., Koukaine R. А.,. Nagaeva L. I., Valikhov А. F., Nadtochei G. A., Nymm E. M., Simovart J. A.

et al., Isolement du virus oncotique de type С chez les bovins atteints de leucose et étude de ses propriétés physico-chimiques et de son rôle dans l'étiologie de la maladie // Bull. Off. Int. Epiz. — 1976. — Vol. 85. — N 3—4. — P. 259—268.

27. Simovart J. Veiste leukoos ja selle tôrje tàiustamine // Sotsialistlik Pôllu-majandus. — Tallinn, 1977. — Nr. 16. — Lk. 739—742.

Симоварт Ю. Лейкоз крупного рогатого скота и совершенствование борьбы с ним (на эст. яз.).

28. Хуссар Ю. П., Симоварт Ю. А. Проблема биологии лимфоидной ткани в эксперименте и патологии // Мат. VI Всес. конф. по патол. анатомии животных. — Тарту, 1977. — T. I. — С. 73—80. .

29. Парфанович М. И„ Нымм Э. М., Симоварт Ю. А. и др. Опыты по экспериментальному воспроизведению лейкоза на новорожденных телятах очищенным онкорнавирусом, выделенным из первичных культур органов от больных лейкозом коров // Мат. VI Всес. конф. по патол. анатомии животных. — Тарту, 1977. — T. I. — С. 250—255.

.30. Парфанович М. И., Ван дер Маатен М., Нымм Э. М., Симоварт Ю. А. и др. Исследование культуры клеток, продуцирующих онкорнавирус крупного рогатого скота методами молекулярно-биологического анализа // Вирусы рака и лейкоза. — М., 1977. — С. 69—72.

.31. Жданов В. М., Парфанович М. И., Нымм Э. М., Симоварт Ю. А. и др. Положительные итоги многолетнего опыта по экспериментальному воспроизведению лейкоза крупного рогатого скота на телятах очищенным онкорнавирусом и другими онкорнавируссодержащими материалами // Теор. и практ. вопр. ветеринарии. — Тарту, 1978. — С. 35—44.

32. Чапенко С. В., Куделева Г. В., Нагаева Л. И., Кукайн Р. А., Симоварт Ю. А. и др. Развитие онкорнавирусной инфекции у телят, инокули-рованных клетками и вируссодержащими молоком больных лимфолей-козом коров // Теорет. и практ. вопр. ветеринарии. — Тарту, 1978. — С. 44—46.

:33. Парфанович М. И., Коломиец А. Г., Бусол В. А., Симоварт Ю. А. и др. О возможной роли молока в горизонтальном пути передачи лейкоза крупного рогатого скота (обнаружение онкорнавирусной инфекции в лейкоцитах молока больного лейкозом крупного рогатого скота) // Теор. и практ. вопр. ветеринарии. — Тарту, 1978. — С. 66—72.

.34. Симоварт Ю. О первоначальных результатах определения антител при лейкозе крупного рогатого скота в Эстонской ССР // Теор. и практ. вопр. ветеринарии. — Тарту, 1978. — С. 80—82.

.35. Жданов В. М., Парфанович М. И., Нымм Э. М., Шишков В. П., Симоварт Ю. А. и др. Итоги опытов по экспериментальному воспроизведению лейкоза крупного рогатого скота препаратом онкорнавируса, выделенным от больного лейкозом крупного рогатого скота и различными материалами от больных животных // Вирусы рака и лейкоза. — М., 1978. — С. 89—94.

:36. Parfanovich M. I., Zhdanov V. M., Kolomiets A. G., Nômm E. M., Simovart J. A. et al. Leukogenic properties of purified BLV and possible routes of its transmission with blood cells present in milk // Ann. rech. Vet. — 1978. — Vol. 9. — N 4. — p. 782—796.

.37. Парфанович M. И., Нымм Э. M., Симоварт Ю. А. и др. К вопросу онкорнавирусной этиологии и методах молекулярно-биологического диагноза онкорнавирусной инфекции при лейкозе крупного рогатого скота // Пробл. эксперим. онкологии и лейкозов человека и животных. — М., Колос, 1979. — С. 200—205.

:38. Simovart J. Vciste leukooside uurimisest ja torjest Eesti NSV-s // Teaduse saavutusi ja eesrindlikke kogemusi pôllumajanduses, — Tin., 1979. — Nr. 6. — Veterinaaria. — Lk. 3—10.

Симоварт Ю. Об исследованиях лейкозов крупного рогатого скота и о борьбе с ними в Эстонской ССР (на эст. яз.).

39. Шишков В. П., Кукайн Р. А., Кумков В. Т., Крикун В. А., Чапенко С. В., Куделева Г. В., Симоварт Ю. А. и др. Иммунология лейкоза крупного

рогатого скота // Пробл. эксперим. онкологии и лейкозов человека и животных. — М.: Колос, 1979. — С. 261—264.

40. Нымм Э. М., Симоварт Ю. А., Аарт X. К. и др. Первоначальные результаты воспроизведения лейкоза у эстонского крупного рогатого скота // Этиология и иммунодиагностика лейкоза крупн. рог. скота. — Рига: Зинатне, 1979. — С. 46—54.

41. Парфановнч М. И., Коломиец А. Т., Лазаренко А. А., Нымм Э. М„ Симоварт Ю. А. Лейкозогенные свойства очищенного вируса лейкоза крупного рогатого скота и возможности его передачи с лейкоцитами молока больных животных // XXI Всемирный ветеринарный конгресс. — М„ 1979. — Т. 3. — С. 11—12.

42. Kukaine R. A., Nagajeva L. I., Cliapenko S. V., Kudeleva G. V., Ilins-kaja T. N„ Shishkov V. P., Itkin B. Z„ Kounakov V. Т., Krikun V, A., Petrovsky Q. S., Nymrn E. M., Simovart J. A. ct al. Formation of immunity to BLV in cattle and sheep in the process of immunization with various immunogenous compounds // Advances in Comparative Leukemia Research 1979. Moscow, 1980. — P. 396—398.

43. Parfanovich Al. I., Nymrn E. M., Simovart J. A., Kolomiets A. G., Laza-renko A. A., Zhdanov V. M. Leukopenic properties of purified BLV and possible routs of its transmission with leukocytes present in milk // Advances in Comparative Leukemia Research 1979. — Moscow, 1980. — P. 640—648.

44. Kukain R. A., Nagajeva L. I., Chapenko S. V., Kudeleva G. V., Ilins-kaya T. N., Shishkov V. P., Itkin B. Z„ Kumkov V, T„ Krikun V. A., Pet-rovski G. S., Nymrn E. M., Simovart J. A. et al. Development of immunity to BLV in cattle and sheep during their immunization with different immunogenic preparations // Advances in Comparative Leukemia Research 1979. — New York: Elevier, 1980. — P. 293.

45. Parfanovich M. I., Nymm E. M., Simovart Y. A. et al. Leukemogenicity of purified oncornavirus isolated from leukemic cattle and possible ways of transmission through milk cells // Advances in Comparative Leukemia Research 1979. — New York: Elevier, 1980. — P. 467.

46. Parfanovich M. I., Numm E. M., Simovart J. A. et al Some aspects on bovine leukosis specific immunoprophylaxis // Fourth Intern. Symp. on Bovine Leukosis. — Bologna, 1980. — P. 23—24.

47. Симоварт Ю. А., Парфановнч M. И., Коломиец А. Г. и др. Молекулярно-биологическое и иммунологическое исследования при экспериментальной онкорнавирусной инфекции крупного рогатого скота // Сб. науч. тр. Эст. с.-х. акад. — 1980. — Т. 125. — С. 82—96.

48. Парфановнч М. И., Жданов В. М., Лазаренко А. А., Нымм Э. М., Симоварт Ю. А. и др. Опыты по экспериментальному воспроизведению и иммунопрофилактике ретровирусной инфекции лейкоза и овец при использовании ретровнруса лейкоза крупного рогатого скота // Изучение лейкоза круп. рог. скота. — Персиановка, 1980. — Т. 15. Вып. 4. — С. 9—И.

49. А. с. 820015 (СССР). Способ получения вакцины против лейкоза крупного рогатого скота / Кукайн Р. А., Нагаева В. И., Шишков В. П., Симоварт Ю. А. и др. / Опубл. в В. И. 1980, №12.

50. Парфановнч М. И., Поверенный А. М., Нымм Э. М., Лемеш В. М., Жданов В. М., Лазаренко А. А., Семин Ю. А., Симоварт Ю. А. и др. Исследование возможности иммунопрофилактики ретровирусной инфекции и лейкоза крупного рогатого скота при использовании ретровнруса, инактивлрованного аминометилольнымя соединениями // Вирусы рака и лейкоза. — М., 1980. — С. 122—124.

51. Simovart J. Veiste leukoosi seroloogiline diagnoosimine // Sots. Pollu-majandus, 1982. — Nr. 7. — Lk. 8—9.

Симоварт Ю. Серологическое диагностирование лейкоза крупного рогатого скота (па эст. яз.).

52. Симоварт Ю. А., Аарт X. К. Об устойчивости эстонских пород крупного рогатого скота к ретровирусной инфекции и лейкозу // XXXII ежегодная

конф. Европ. Ассоц. по животноводству 16—19 августа 1982 года: Генетика. — Л., 1981. — С. 1—5.

53. Симоварт Ю. А. Клинико-гематологические и патоморфологические особенности течения лейкозов крупного рогатого скота в Эстонской ССР. — Рига: Зинатне, 1982. — С. 81—87.

54. Симоварт Ю. А., Козинец Г. И. Поверхностная архитектоника лимфоцитов в норме и при лейкозе крупного рогатого скота // Сб. науч. тр. Эст. с.-х. академии. — 1982. — Т. 136. — С. 41—46.

55. Simovart J. Yeiste leukoosi patogeneesist // Teaduse saavutusi ja eesrind-likke kogemusi pdllumajanduses, 1982, — Nr. 9. Veterinaaria. — Lk. 11—15. Симоварт Ю. О патогенезе лейкоза крупного рогатого скота, (на эст.яз.).

56. Simovart J. Veiste leukoosi seroloogilisest diagnoosimisest // Teaduse saavutusi ja eesrindlikke kogemusi pöllumajanduses, 1982, — Nr. 9. Veterinaaria. — Lk. 15—24.

Симоварт Ю. О серологическом диагностировании лейкоза крупного рогатого скота (на эст. яз.).

57. Нымм Э. М., Симоварт Ю. А., Аарт X. К- и др. Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота и основы борьбы с ним // Теорет. и пракг. вопр. ветеринарии. — Тарту, 1983. — Т. 3. — С. 38—45.

58. Симоварт Ю. А., Лахт Т. И., Марран X. Э. и др. Первоначальные данные опыта по оздоровлению хозяйств от инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота с использованием серодиагностики // Теор. и практ. вопр. ветеринарии. — Тарту, 1983. — Т. 3. — С. 115—123.

59. Аарт1 X. К., Симоварт Ю. А., Нымм Э. М. О влиянии экологических факторов на распространение лейкоза крупного рогатого скота // Теорет. и практ. вопр. ветеринарии. — Тарту, 1983. — Т. 3. — С. 182—192.

60. Симоварт Ю. А., Парфанович М. И., Жданов В. М. ц др. Установление этиологической роли вируса, выделенного от больного лейкозом крупного рогатого скота и исследование возможности иммунопрофилактики энзоотического лейкоза // Сб. науч. тр. Эст. с.-х. акад. ■— Тарту, 1983. — Т. 141. — С. 58—68.

61. Симоварт Ю. А., Нымм Э. М., Аарт X. К. и др. Диагностирование лейкоза крупного рогатого скота и мероприятия противолейкозной борьбы в Эстонской ССР (Методическое руководство). — Тарту, 1983. — 53 с.

62. Симоварт Ю. А., Лахт Т. И., Нымм Э. М Иммунологическая диагностика и аспекты специфической профилактики энзоотического лейкоза крупного рогатого скота // Тр. ВИЭВ. Лейкозы с.-х. животных. — М., 1983. — Т. 59. — С. 67—70.

63. Симоварт Ю. А., Бурба Л. Г., Лахт Т. И., Валихов А. Ф. Инфицирован-ность коров вирусом лейкоза крупного рогатого скота // Труды ВИЭВ / Лейкозы с.-х. животных. — М., 1983. — Т. 59. — С. 87—91.

64. Parfanovich М. I., Zhdanov V. М., Lazarenko А. А., Nömm Е. М., Simovart J. А. et al. The passility of specific protection against bovine leukemia virus infection and bovine leukemia with inactivated BLV // Br. Vet. J. — 1983. — Vol. 139. — P. 137—139.

65. Nömm E., Simovart J. Pollumajandusloomade leukoosid. — Tallinn: Valgus, 1983. — 116 lk.

Нымм Э., Симоварт Ю. Лейкозы сельскохозяйственных животных (на эст. яз.).

66. Симоварт Ю. А., Лахт Т. И., Марран X. Э. и др. О возможностях оздоровления хозяйств от инфекции ВЛ КРС с использованием серодиагностики // Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных. — Ташкент, 1984. — С. 162—163.

67. Козинец Г., Симоварт Ю. Поверхностная архитектоника клеток периферической крови в норме и при заболеваниях системы крови. — Таллинн: Валгус, 1984. — 115 с.

68. Симоварт Ю. А., Лахт Т. й., Марран X. Э. Результаты опыта по оздоровлению хозяйств от инфекции, вызываемой вирусом лейкоза крупного рогатого скота // Оздоровление промышленных ферм от лейкоза крупн. рог. скота. — Новосибирск, 1985, — С. 17—21.