Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Экспериментальное обоснование технологии изготовления пробиотика бифацидобактерина и его лечебно-профилактическая эффективность при колибактериозе телят

Р Г Б ой

3 О И В ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ «З^РАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ

МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ПРИКЛАДНОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 619:616.981.459

КАЛЬНИЦКАЯ Оксана Ивановна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРОБИОТИКИ БИМОДДОБАКТЕРИНА И ЕГО ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕХЗКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ПРИ К0ЛИБАКТЕРИ03Е ТЕШЯТ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени . кандидата ветеринарных наук

Москва 1995

Работе выполнена на кафедре микробиологии и биотехнологии Московской государственной академии прикладной биотехнологии в соответствии о темой 7-4-91, номер госрегистрации 0190049096 в период о 1991 по 1995 ГкГ,

Научные, руководителя - доктор ветеринарных: наук, профессор

□ЗДОРОВ М.А.

- кандидат ветеринарных наук, доцент

, СТЕПАНЕНКО П.П.

Официальные оппоненты - доктор ветеринарных наук, профессор

ИНТИЗАРОВ М.М. (ЫГАВМиБ)

- доктор ветеринарных наук ШУСТЕР Б.Ю. (ВГНКИ)

Ведущее предприятие - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ, г. Москва)

Защита состоится " .199 6~ года в /// час.

нч паседении диссертационного совета К.063.46.03 Московской госу-дярстрениой академии прикладной биотехнологии (МГАПБ) по адресу: ЮЙЛС Москва, ул.Талалихина, 33.

С диссертацией можно овнакомиться в библиотеке МГАПБ.

Автореферат разослан " '¿С У; /¿199 О г.

I ' /

Ученый секретарь специализированного'

Совета И.А.ЛОГИНОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЮ Та

Актуальность теми. Среди инфекционных желудочно-кишечных болезней особое место занимает колибактериоз новорожденных телят, регистрируемый на крупных молочных фермах многих хозяйств и наносящий значительный экономический ущерб.

Высокой заболеваемости телят способствует низкая резистентность их организма. Многие органы и системы еще не достигают

г

функциональной зрелости, и до приема молозива в крови и тканевых жидкостях новорожденных отсутствуют основные защитные вещества. Неправильное содержание и кормление телят приводит к нарушение становления нормальной микрофлоры, возникновению дисоакте-риоэа. Это открывает пути патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Многократные пассажи патогенных и условно-патогенных микроорганизмов через организм новорожденного приводят к нарушению их патогенности ( Я.Е.КЬляков и др., 1970; М.А.Сидоров, I960; М.М.Интиэаров, 1989).

I

Использование антибиотиков может привести к появлению штаммов микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам, отставанию в росте и развитии телят, иммунодефициту и другим нарушениям (А.И. Мартынова-и др., 1962; В. М. Коршунов, 1983; H.P.Hoenach et all, 1985 J.

В настоящее время одним из перспективных направлений в области профилактики болезней телят, вызываемых условно-патогенной микрофлорой, является применение пробиотиков - препаратов, приготовленных из живых микробов-антагонистов - представителей нормальной кишечной микрофлоры ( Ф.Л.Вильшанская, 1970; М.Т.КЬ-няев и др., 1974; О.В.Чахава и др., 1982; А.Т.Марчук и др., 1962; А.Г.Морозов, 1963 ).

Пробиотики обладают антибиотическим действием и стимулируют обменные процессы организма. Механизм Действия этих препяря-

I

•тон основан на заселении и регулировании нормальной кишечной микрофлор» микроэкологической ниши кишечника макроорганиэма. '

Основные преимущества пробиотиков перед антибиотиками -безвредность, возможность применения в любом возрасте, безопос ность для окружающей среди.

Вопросу борьбы с колибактериозом телят посвящено много ра бот. Однако, до настоящего времени нет надежных методов и средств борьбы с колибактериозом. Поиск таковых остается весь» актуальной задачей.

Цели и задачи исследований.. В соответствии с актуальное« вопроса о средствах и методах борьбы с колибактериозом телят, перед нами были поставлены следупчие задачи:

- изучить в сравнительном аспекте морфологические, культ; ральные и биохимические свойства коллекционных я свежевыделен них штаммов и отобрать наиболее пригодные для изготовления пр биотит,

- изучить антагонистические и адгезивные свойства ценных

данном отношении штаммов,

- изучить потребности полезных микроорганизмов в различи факторах роста ( аминный азот, углеводы; дрожжевой экстракт, сыворотка крови крупного рогатого скота, солянокислый цистеи» и определить оптимальное количество »тих добавок в среде, а 1 же подобрать условия культивирования, обеспечивающие наиболы бнход биомассы,

- экспериментально обосвотть состав ¡чидкой питательной да и апробировать ее при культивировании выделенных птамков,

- изучить в условиях хозяй 'тга проДмлакт«ч«ck»i1 л 'pmo-I эффективность бактериального препарата бифацидобактерин, и.зг тогленного па о с. но ей шделешшх штаммов.

Научная новизна. Изучены биологические свойства молочне

лих микроорганизмов и бифидобактерий с точки зрения их приживаемости в условиях желудочно-кишечного тракта. Установлен» оптимальные концентрации основных компонентов жидкой питательной среды для культивирования производственно-ценных штаммов Ь.асЫорПИив ЛГ-1 И В.а(1оХе8оепиа В-1 с целю изготовления пробиотического препарата бифацидобактерин против желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных. Дано научное обоснование показаний к применению препарата при колибактериозе новорожденных телят.

Практическая ценность работы.Данные по характеристике биологических свойств Ь.ас1<ЗорМ.1иа ЛГ-1 И В,а<1о1еасеп1;1а В-1 и технология их культивирования в жидких питательных средах с различными ростовыми добавками включены в "Инструкцию по изготовлению и контролю препарата бифацидобактерин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка животных ( утв. ГУВ МСХ РФ 06.05.1992 ) и используются при промышленном изготовлении препарата.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на заседаниях кафедры кикробиологии и биотехнологии МГАПБ в 1991 и 199? г.г., а также на научно-практической конференции профессорского Состава, научных сотрудников и аспирантов КПСХИ ( Каменец-Подольский. 1994г. ).

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемый.чя

защиты. Изучение биологических свойств молочно-кислих микроорга-

■

низмов й бифидобактерий о целью отбора наиболее пригодных штаммов для изготовления пробиотического препарата против колибак-терйоза молодняка сельскохозяйственных животных, а также обоснование потребности полезных микроорганизмов в различных факторах роста и условий их культивирования, обеспечивающих наибольший выход биомассы. Результаты влияния лечебных и профилакти-

. -3'

ческих доз пробиотика на гематологические показатели здоров и дольних колибактериозом телят.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликован] лве научные статьи.

Объем и структура работы. Работа изложена на 159 стран! машинописного текста и состоит из введения, обзора литерату] описания собственных исследований, обсуждения полученных ре: татов, выводов, практических предложений, списка литературы приложения. Диссертационная работа иллюстрирована 23 таблищ ми, Г2 рисунками, 3 фотографиями. Список литературы вклвчае: 156 наименовани , из них 59 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. При проведении исследований была и< пользовано 15 штаммов микроорганизмов семейств Streptococca

сеае » Lactobacillaceae И Actinomycetaceat.

Штаммы Streptococcus faeoium 74 и Lactobacillus buchn«

2 и 7 получены из ВГНКИ ветпре парато в, Streptocoocus faeciut штамм 1578, Lactobacillus plnritarum штамм !У78 И bactobaeJ lua helveticus штамм 114? получены из Всесоюзной коллекции кроорганизмов Института биохимии, и физиологии микроорганизме Lactobacillus acidophilus ЛГ-I И Bifidobacterium bifidum получены из коллекции кафедры микробиологии и. биотехнологии МГАПБ, Bifidobacterium adolescentis B-I получен из ШИКМИ, Streptococcus lactis . штаммы I, 7, 12.Streptococcus thermo luo штаммы I И 2, Lactobacillus acidophilus втамм 81 ввде; лпмостоятельно из молока и молочных продуктов.

В качестве питательных сред для культивирования микроо] мичмон использовали стерильное обезжиренное молоко, гидроли: обечж/генного молока С Л.А.Банникова, 1987 ), агар на гидро. чпадчном молоке с медом ( рН 7,0; ?% агара; 2% мела ), сред;

Блаурокк ( Л.А.Банникова, Г987 ).

Биохимические свойства штаммов оценивали по следующим тестам :

- активность свертывания молока ( методика ВНИМИ ) определяли по времени образования сгуотка в пробирке с обезжиренным молоком при внесении в нее одной бактериологической петли исследуемого штамма.

- кислотность сгустка определяли методом титрования 0,Гн раствором едкого натрия,

- способность к росту при различных значениях рН среды, устойчивость к натрия хлориду, желчи, фенолу определяли визуально по помутнению среды и контролировали микроскопированием окра-□енных мазков,

- образование аммиака из аргинина определяли по выпадению бурого осадка, используя синтетическую среду(рИ 6,8 - 7,0), содержащую на 100мл дистиллированной воды пептон ( 0,5г ), ортофос-фат калия ( 0,2г ), глюкозу ( 0,05г ), 1-аргинин ( О.Зг ), и реактив Несслера,

- способность сбраживать углеводы определяли, используя гидро-лизованное молоко ( рН 7,0 ) с добавлением индикатора Андредэ или среды с углеводами и индикатором ВР, по изменению окраски среды,

- обнаружение адгезивных антигенов проводили по методике, разработанной в лаборатории бактериологии ЕНИИЭВ и лаборатории по изучению болезней молодняка УНИИЭВ С 1969 ), адгвзинн определяли в реакции МРГА с эритроцитами животных,

- антагонистическую активность штаммов изучали, используя метод агаровых блочков по Н.А.Красильникову ( Н.С.Егоров, 1965 ),

- устойчивость к антибиотикам изучали с помощью бумажник дисков, пропитанных растворами различных антибиотиков.

В работе преследовалась цель отобрать штаммы, которые раз вивались бы в условиях желудочно-кишечного тракта, обладали антагонистическими свойствами по отопеико к нежелательной микрофлоре желудочно-кишечного тракта. По сумме свойств наиболее под копредъявленным требованиям отвечали втаммы ь.вс1<1орМ1иа ЛГ-1 В.айоХевсехгИа Ь-1.

Состав оптимальных сред и режим» культивирования штаммов ЛГ-1 и В-1 определяли по выходу бактериальной массы, подсчитыв общее количество бактериальных клеток С на фотоэдектрокалориме ре КЮ-130 ) и количество жизнеспособных клеток ( методом сери них раз ведений X В каждом опыте рассчитывали удельнуо скорост роста, продолжительность генерации и число генераций за один ч ( И.Д.Иерусалимский, 1963

Из штаммов Ь.ас1(ЗорМ1из ЛГ-1 и В.айогевоепЗДв В>1 из! томен опитный образец комплексного препарата под, условным на: ванием бифацидобактерин. Препарат представляет собой сухой ба термальный концентрат штаммов ЛГ-1 и В-1, смешанный с иосител С мука, отруби ) в соотношении 1:12.

Лечебное и профилактическое действие бифацидобактерина V чал и в опытах на телятах в неблагополучном по колибактериозу ЗРйстве ( колхоз "Весна", Хмельницкая обл. ). Было использов! № телят, которых объединили в три группы. Телятам первой гр; препарат не давали, в случае заболевания колибактериоэом их чили по схеме, принятой в хозяйстве. Телятам второй группы д ли препарат рег о а с профилактической цельо из расчета 0,2-С нп Г кг «той массн и выпаивали ежедневно в течение пяти дн< п?'-де рпвденкя и затем б той,,же дозе с десятидневного возра* один 13-> б яень иггть дней полрял,. Тояята, у которых в пертал .тичпн ч^блсдачопь расстройство пияеваречич, учащенная дефек -толу ' т.-."сня'-с Л'-^-чч- пгелар.тд. Течение никакими другими

ствами не проводилось.

Для изучения влияния препарата на биохимические свойства крови у телят из каждой группы через 15 дней после рождении брали на исследование кровь из яремной вены. В крсви определяли количество э; лтроцитов, лейкоцитов, гемоглобина по общепринятым методикам.

Для определения активности фагоцитирующих клеток крови к 1мл крови добавляли 1мл суспензии, содержащей 1млрд. бактериальных клеток E.coli, выдерживали 30 мин, готовили мазок и окрашивали по Романовскому-Гимза. При микроскопировании определили процентное отношение фагоцитирующих лейкоцитовк общему количеству лейкоцитов.

В сыворотке крови опытных телят определяли общее количество белка рефрактометрическим методом, количество альбуминов и гло-булино'в ( А.А.Кудрявцев, 1952 ), содержание кальция по Вичеву и Каракашову и фосфора по Коромыслоьу и Кудрявцевой ( Практикум по клинической диагностике с рентгенологией / Под ред. М.Н.КурзиноИ, 1992г ), концентрацию иммуноглобулинов-пробой с сульфитом натрия £ Система получения и сохранения новорожденных телят до 20-ти дневного возраста. I9Q8 ).

Биометрическую обработку данных с вычислением средней арифметической показателей, ошибки средней арифметической и критерия достоверности осуществляли по программе МБЮМ" на ЕЛ - КУЮ ( Г.ФЛакин, 1990 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Биологические свойства молочнокислых микроорганизмов и dii-фидобахте|>ий. _ Отбирая микроорганизмы для изготовления пробиоти-ка, кн изучали морфологические, культуральные, биохимические свойства как коллекционных, так и свежеввделенных штаммов.

Критериями'для отбора микроорганизмов служили активность .

7 '

кислотообразования и предельная кислотность сгустков,, поскольк, эти показатели свидетельствуют об интенсивности кислотообразо-вания и количестве образуемой кислоты, губительно действующей на гнилостную микрофлору. Наиболее активным кислотообразовате-лем является L.acidophilus штамм ЛГ-I. который образует сгусток в молоке в течение 4-5 ч культивирования, предельная кисло иость сгустка достигает 320°Т. Ъ.acidophilus штамм 81 также о разует сгусток в молоке через 4-5 ч, однако, предельная кисло» ность сгустка достигает только!70°Т. Достаточно активным кисло тообразователем является штамм S.thermophilus I и штаммы L.he veticue 1147, S.lactia 12, образующие сГусток в далоке через 12 ч. S.iaecium 74 и 1576 и L.plantarum 578 свертывают молоко через 20-24 ч и 50-56 ч соответственно, кислотность сгустков t превышает II0-I50°T. К микроорганизмам оо средней активностью кислотообразования можно отнести s.lactia штаммы I и 7, B.ado-lesceatio стамм B-I HB.bifidum, образующие сгустки в теченж Тб-18 ч, кислотность которых составляет II0-I20 и 180°Т соотв< ственно.

Устойчивость микроорганизмов в кислой и щелочной среде о рвделяет их способность развиваться в пищеварительном тракте ; котных. Кроме бифипобактерий, все изучаемые штаммы способны р ти .в ыелочпой среде, что делает их устойчивыми к действию под чулочного С рН 7,8 - 8,4 ) и кишечного соков ( рН 7,4 - 8,7 ) кислой среде способны развиваться бифидобактерии и штаммы 3,1 tin Т?. b.acidopMlus 81 и ЛГ-Г, что обеспечит этим микрс ганиямям проходимость через желудок животного, рН которого сс тсгляег - и приживаемость в слабокислой среде толстс киг'чннка.

Fuh-hw;.! критерием при отборе микроорганизмов для из го том (UO/'.nrtim ЯЧЛЯ91СЯ их устойчивость к различным, ингибиру!

' веществам - желчи, действии которой они подвергаются в то икр к отделе кишечника, фенолу, образующемуся в толстом отделе при гнилостном распаде белков. Высокой устойчивостью к ингибирую-щим факторам роста обладают штаммы S.faeciura 1578, L.acidophilus ЛГ-"1!, В. adolessentia B-I.

Наиболее широким спектром сахаролитических свойств, способствующих более полному всасыванию продуктов брожения из толстого кишечника в кровь, обладают 3,faecium штаммы 71» и 1973, S.thernophilua , L. acidophilus штаммы ЛГ-I и 81, при этом они не образуют углекислый газ. Из двух представителей бифидобакте-рий B.adolescentia B-I обладает более выраженной сахаролити-ческой активностью по сравнению с B.bifidum.

Анализируя полученные данные, оледует отметить, что наиболее полно требованиям,предъявляемым при изготовлении пробиоти-ческого препарата, отвечают штаммы L.aoidophilua ЛГ-I и B.ado-leacentie B-I.'

Изучение адгезивных свойств микроорганизмов. Исследованию были подвергнуты niTaMMbia.laetie 12, S.thermophllua 2, S.fae-cium 1573,; L.aoidophilua ЛГ-I, L.helTeticua 1Ш.' B.adoleeccn tie ' - B-I И' B.bifidum . . '

Постановка реакции гемагглютинации с эритроцитами крови разных видов животных, с различным разведением бактериальной суспензии, а также с присутствием в реакционной смеси 1,5%&-майнозы, позволила определить различную по степени выраженность и неоднородность адгезинов изучаемых мйкроорганизмов. Отмечено, iTo все нтаммы способны прикрепляться к поверхности эритроцитов крови, сднако наблюдается специфичность по отношению к эритроцитам крови разных видов «ивотных. Наиболее широкой тропностыя отличаются штаммы S.faecium 1578, L,acidophilus ЛГ-I и "B.ado-leacentia B-I, которые агглютинируют эритроциты барана, кроли--

9

ка и морской свинки. Другие штамма избирательно агглютинируют ■ эритроциты крови разных видов животных.

Мы предположили, что штаммы S.laotls 12, ¿.acidophilus ЛГ-I, B.adoleecentia B-I, B.bifidum , обладающие маннозоустой-чивыми вдгеэинами, по аналогии с эшерихиями, которые образуют скопления и целые слои на апителии кишечника и у которых особенно часто выявляют маннозоустойчивые антигены адгезии, будут наиболее конкурентно способными при фиксации на клетках-мшгенях макроорганизма.

Как отмечают D.Q.Eyaпи, D.J.Evans (1983), способность агглютинировать эритроциты крови не всегда обусловливает способ ность бактериальных клеток прикрепляться к различным клеткам жи вотного происхождения.

Для проверки способности изучаемых штаммов колонизировать биологические поверхности использовали эпителиальные клетки toi кого кишечника телят. Пооле совместного культивирования и центрифугирования суспензии бактериальных клеток и эпителиоцитов, каплю исследуемой жидкости наносили на предметное стекло, гото вили мазок, фиксировали, окрашивали краской Муромцева и проема ривали под микроскопом. При микроскопировании подсчитывали кол чество бактерий, прикрепившихся к поверхности одной эпителиал» ной клетки.

Результаты показали, что наиболее интенсивно, к зпителиош там прикрепляются клетки ацидофильной палочки l.acidophilus ЛГ-I ( 27Л+О.В бактерий ), >»енее интенсивно - B.adoleecentis B-I ( 20,1+1,15 ), c.bifiduift ( IB ,7+0,65 ) и s.faeciua ( 15 ^0,6*» ). Выраженность адгезивности одинахова у штаммов s.thei philus 2 ( IO.IiO.tll ) и L.helveticus Ш7 ( 10,3+0,^5 ), н oMi значительно ниже, чем у вышеназванных микроорганизмов. Не .„•• цел i<i№co4hwm V адгезии оказал--« ггам;'. S.l»ctis 12 С 6,СК

Резюмируя данные по Изучению биологических свойств и адгезивной. активности штаммов, можно констатировать, что наибольшим преимуществом при колонизации эпителия желудочно-кишечного тракта будут обладать микроорганизмы L,acidophilus ЛГ-1 й B.^dolea-centie B-I.

Антагонистические свойства штаммов L.acidophilus__ЛГ-1 и

B.adolesccntis__B-I. Антагонистическуо активность штаммов ЛГ-1 к

B-I изучали по отношение к следующим микроорганизмам: B.coli, Proteus vulgaris, Salmonella enterttidis, Bacillus aubtilin.

В своих исследованиях мы не касались природы выделяемых антибиотических веществ и ограничились только качественной стороной способности исследуемых микроорганизмов подавлять развитие других видов.

На начальном этапе изучали антагонистические свойства бактерий с помощыи метода штрихов. Однако среда, пригодная для развития тест-микроба, оказалась непригодной для культивирования ацидофильной палочки и бифидобактерий. Чтобы устранить этот недостаток, в дальнейшем использовали метод агаровых блочков Ui.C. Егоров, 1965).

Согласно* полученным результатам, выраженность антагонистической активности зависит от возраста культуры штамма и вида тест-микроба. Наибольшее накопление антибиотического вещества, выделяемого штаммом ЛГ-1 происходит на шестые сутки культивирования. К его предельной концентрации в среде наиболее чувствительны P.vulgaris и B.cubtilis , зона задержки роста которых вокруг блочка составляет 20-22 мм в диаметре. Менее чувствительным оказался вид 3.enteritidia - зона задеркки роста 18 мм.

Наибольшую устойчивость проявили клетки E.coli . Трехднеэ»' пая культура штамма ЛГ-1 не подавляла их развитие. Диаметр зоны задержки роста рокруг шестидневной культуры равнялся 12 мм.

3>ftdolescentiB B-I также выделяет антибиотическое вещест зо или вещества, оказывавшие бактериостатическое действие на • используемые тест-микробы. Двухдневная культура этого итамма не угнетает развитие E.coll , S.enteritidia й Pivulgaris , но задеркивает рост B.subtilie . Пятидневная культура задерживает рост всех тест-микробов. Зона отсутствия роста клеток в.со-li составляет 13 мм, s.enteritidia - 15 мм, P.vulgarie - 2Ь ь в.subtilis - 23 мм.

Используя ту же методику, изучали характер взаимоетновем между штаммами L.acidophilue ДГ-I и B.adoleacentia B-I при t совместном культивировании на чашках Петри. Отмечено, что иса дуемые штаммы не оказывают взеимоподавляюдего действия друг н( друга. По-видимому, при культивировании в смешанной культуре происходит резкое снижение рН среды обитания за счет кислотоо! разования, свойственного L.acidophilus , что служит предпосылкой для развития B.ndolescentis , который способен расти тод ко в кислой среде.

Для определения спектра действия наиболее часто применяв мых в животноводстве антибиотиков на штаммы ЛГ-I и B-I исполь зовали метод бумажных дисков, пропитанных растворами антибиотиков. Исследования показали, что штамм ЛГ-I устойчив к пенициллину и его синтетическим аналогам, штамм B-I обладает боле слабой устойчивостью. Оба штамма устойчивы к мономицину и ген тамицину, а штамм &-I и к стрептомицину. Рост штамма B-I не у нетается левомицетином, являющимся специфическим средством ле чения токсической диспепсии, дизентерии, брюшного тифа, а таи ае полимиксином, используемом при инфекциях дыхательных путей Однако оба штамма чувствительны к тетрациклину и антибиотика* тетрацикл«нового ряда,, которые представляют опасность для o6j гьтнбя v.i/.po^Jiopi» кикччника и способствуют развитию дисбакте]

альных состояний (М.А.Тимоико, 1990).

Подбор оптимальных питательных сред и режимов культивирования штаммов ЛГ-1 и B-I.

Изучение накопления биомассы l.acidophilua ЛГ-I при культивировании в бульоне Хоттингара и в гидролизованнои молоке. Исходя из литературных данных и экономических соображений в качестве основы питательной среды исшльзовали бульон Хоттингера С 100, 2D0, 400 и 800 мг% аминного азота ) и гидролиэованное молоко ( ISO wf аминного азота ).

Как в бульоне Хоттингера, так и в гидролизованнои молоке лаг-фаза развития штамма JIT-I длилась менее Зч, при культивировании более 6ч интенсивность роста снижалась и к 12ч культивирования количество жизнеспособных клеток начинало уменьшаться. Наибольший выход биомассы обеспечило культивирование в гвдроли-зованном молоке - 8,07 lg живых клеток/мл и в бульоне Хоттингера, содержащем 200 мг£ аминного азота - 7,94 lg клеток/мл. При повышении количества аминного азота в бульоне Хоттингера до 400 и 800 мг,2, показатели интенсивности роста культуры резко снижались.

Влияние сыворотки крови крупного рогатого скота на развитие штамма ЛГ-I. При добавлении в гидролиэованное молоко и бульоц Хоттингера С 200 нт$ ) I, 3 и 10$ сыворотки было установлено, что наибольший выход биомассы обесточивает среда на гидролизованнои молоке с добавлением 3% сыворотки крови, при атом удельная скорость роста составляет 0,81 lg клеток/мл в час , период генерации - 51,2 мин с числом генераций в час 1,17.

* Влияние дрожжевого; экстракта на развитие штамма ЛГ-I. Добавление в гидролиэованное молоко дрожжевого экстракта значительно увеличивает ужельнуп скорость роста популяции и сокращает период генерации. Оптимальным количеством дрожжевого экстракта

в среде считаем 102. Оно обеспечивает накопление 9,34 живых клеток/мл к концу фазы логарифмического роста. Увеличение концентрации до 20л незначительно увеличивает выход жизнеспособных клеток - до 9,40 1« клеюк/мл среды.

Влияние глбкозы и лактозы на размножение штамма ЛГ-1. Опытами установлено, что наиболее полно ростовые потребности штамма ЛГ-1 обеспечиваются при добавлении непосредственно перед засевом в жидкую питательную среду на основе гидролизованного молока, содержащую 3/ сыворотки крови крупного рогатого скота и 10£ дрожжевого акстракта, 2,5? лактозы. Концентрация микробных клеток в I мл оре;,ы увеличивается с 9,34 ( в среде без лактозы ) до 9,75 С в среде с 2,55» лактозы ), что объясняется доступностью лактозы, как источника углерода.

Влияние цистеина солянокислого на размножение штамма ЛГ-1. Добавление цистеина в количестве 0,3 - 0,5 г/л в среду позволило увеличить выход бакмассы по сравнению с контролем на (Ш. 1в клеток/мл, ускорить удельную скорость роста микроорганизмов, с 1,05 до 1,13 1£ клеток/мл в час, сократить период генерации с 39,4 до 36,6 мин. Стимулирующее действие цистеина объясняется тем, что он, кроме питательноЛ функции, выполняет функцию акцептора водорода в обменных процесах.

Влияние количества по сееного материала на инте и си вно сть размножения бактерии штамма ЛГ-1. Пр изучении влияния отдельных компонентов питательной .среды на скорость роста и деления клеток нами проведены опиты по определении рациональной посевной дозы. Полученные результаты свидетельствуют, что рациональной посевной дозой является доза 10 млн бактерий на I мл среды, поскольку при таком количестве посевного материала выявляются сравнительно высокие темпы развития культуры на более длительном отрезке времени.

На основании результатов исследования по определении оптимального содержания в питательно»} среде источников азота, анергии и факторов роста для культивирования штамма ЛГ-1 предложена среда следующего состава:

гидролизованное молоко - 150 мг$ а.а.,

лактоза - 2.5Í,

цистеин солянокислая - 0,3 - 0,5 г/л.

При культивировании ацидофильной палочки отмечено изменение рН среды в кислую сторону. Во избежание накопления кислых метаболитов в дальнейшем проводилась корректировка рН среды Ю%~ ным раствором /VaOH.

Влияние перемешивания среды на размножение штамма ЛГ-1 в условиях регулируемого рН. Перемешивание среды проводилось на магнитной мешалке ( 150 об./мин ) в двух режимах: непрерывное перемешивание и периодическое перемешивание каждые Зч в течение 5 мин. Результаты опытов свидетельствуют, что при периодическом перемешивании.в среде накапливалось 9.99 lg клеток/мл, тогда как при непрерывной перемешивании - 7,94 le клеток/мл, а при культивировании в среде без перемешивания - 9,64lg клеток/мл. По-видимому, периодическое перемешивание незначительно увеличивает аарацию среды и улучшает массообмен в системе.

Влияние состава питательной среды, количества посевного материала и условий культивирования на накопление биомассы B.ado-lescentla B-I. В опыте была использована готовая среда на основе гкдролиэованного молока с добавлением 2? глюкозы, 10£ дрожжевого экстракта и 0,3 - 0,5 г/л цистеина солянокислого. В колбы со средой вносили различные количества посевного материала ( I, 10 и ICO млч/мл бифидобактерий ) и культивировали в течение Йч в стационарных условиях и'при перемешивании ( каждые Зч в течение 5 мин ). 3 фазе логарифмического роста проводили корректи-

"ровку рН :реды Ш2~ным раствором у^аОН.

Опытами установлено, что наибольшее накопление биомассы достигается к 9ч культивирования. Рациональной посевной дозой можно считать 10 млн клеток/мл среды, оптимальным режимом культивирования - периодическое перемешивание среды каждые Зч в течение 5 мин и поддершние рН среды на постоянно заданном уровне.

Штамм и ЛГ-1 и В-1, оптимальный состав питательных сред и технология культивирования передана для изготовления опытного образца препарата бифицидобактерин.

Бифацадобактерин представляет собой сухой комплексный препарат из штаммов Ь.ас1(1орМ1и8 ЛГ-1 и В ас1о1е8оеп«8 В-1. Для получения бактериального концентрата жидкие культуры выращенных штаммов ЛГ-1 и &-1 концентрирует при помоии фильтрации или центрифугирования до получения суспензии, содержащей 5 млрд бактерий в I мл ( по оптическому стандарту мутности ГИСК ) и сманивает в равных объемах. В качестве носителя используют муку, отруби из расчета 12 частей носителя на I часть смеси концентрированных культур.

Профилактическая и лечебная эффективность препарата бифаци-добактерин. На кафедре микробиологии Московской Государственной академии прикладной биотехнологии отработаны дозы и кратность введения препарата бифацидобахтерин.

Рекомендуется с профилактической цель» препарат давать новорожденным животным с кормом или кипяченой водой из расчета 0,2 - 0,3 г на I кг живой массы ежедневно в течение 5 дней после рождения и затем в той же дозе с 12 - 15-ти дневного возраста один раз в день пять дней подряд. С лечебной целью дозу препарата удваивают.

Опыт проводился на новорожденных телятах хозяйства Хмельницкой области. За 1992 г в хозяйстве заболело 34? телят профи-

16

дакторного возраста, из них у 65,7л зарегистрирован, колибактери-оз. За этот же период падеж телят профилакторного возраста составил 13,3% от приплода, из них на основании анализа результатов бактериологических исследований патматериала в 73,Ъ% случаев установлен колибактериоз.

Для изучения эффективности препарата бифацидобактерин подопытных телят разделили на три группы. Телятам первой группа бифацидобактерин не давали, в случае заболевания колибактериозом их лечили по схеме, принятой в хозяйстве. Телятам второй группы давали препарат с профилактической целью, пользуясь инструкцией по применение препарата. Телят, у которых в первые дни жизни наблюдалось расстройство пищеварения, выделили в третью группу. Им давали удвоенную дозу препарата. Лечение никакими другими средствами не проводилось.

Установлено, что в группе телят, которые не получали бифацидобактерин ( контроль ), колибактериозом заболело 4С# животных, 30& из них переболело легко с повышением температуры до 40,4 -40,9°С, с понижением аппетита, выделением кала желто-белого цвета жидкой консистенции, 10$ телят переболело тяжело - с пониже-

♦

нием температуры,учащенной дефекацией; выделением зловонного кала. К концу периода наблюдения падеж по группа составил \С$. По результатам бактериологического исследования патматериала во всех случаях установлен колибактериоз.

В группе телят, получавших бифацидобактерин в профилактических дозах, не заболел ни один теленок. Случаев падежа также не было.

' Телята, которые получали бифацидобактерин в лечебных дозах, переболевали колибактериозом в легкой форме, благоприятный исход заболевания наблюдался в 100$ случаев.

При сравнении количества заболевших, павших и выздоровевших • ' 17

телят по дням исследования установлено, что диарея у телят кон- ' трольной группы проявлялась в основном в первые три дня жизни, падеж телят наблюдался на седьмой - девятый дни жизни, выздоровление - ни восьмой - одиннадцатый дни.

В группе телят, которым давали бифацидобактерии в лечебных дозах, случаев падежа не было, выздоровление начиналось с пятого дня жизни, пик выздоровления приходился на шестой - седьмой дни жизни.

Средняя продолжительность заболевания в контрольной группе составила 6,05 ♦ 0.32 дня, что на 2,29 дня больше, чем продолжительность болезни телят, получавших пробиотический препарат.

Ь исследуемых группах мы наблюдали диарею различную по тяжести течения, продолжительности и массовости. Поэтому, в оценке полученных результатов считали целесообразным введение теста -среднесуточный прирост кассы телят за первые 15 дней жизни.

Отмечена зависимость между заболеваемостью телят и их привесами. Наибольшие привесы получены от телят, получавших бифацидобактерии в профилактических дозах С 352,94 ♦ 6,14 г ). Наименьшие привесы наблюдались в контрольной группе, телят которой лечили по общепринятой в хозяйстве схеме ( 258,67 + 5,33 г ). •

В связи'с тем, что применение пробиотических препаратов оказывает влияние на бактерицидную активность сыворотки крови, на Функцию макрофагов и общую иммунобиологическую реактивность и резистентность организма животных, мы изучили гематологические и биохимические показатели крови опытных и контрольных телят. Для этого от животных каждой группы брали кровь из яремной вены по окончании курса профилактики или лечения. . .

Тенденция снижения количества эритроцитов отмечена у телят контрольной группы, которые заболели колибактериозом - 7,65 + + 0,12 млн/мм^.

7 телят, получавших препарат с лечебной цельи, зарегистрировано достоверное увеличение количества эритроцитов в крови до 8,22 + 0,06 млц/мм3 ( Р < 0,001 ).

I

Количество лейкоцитов в крови здоровых телят контрольной к профилактической групп не различалось и соответствовало 9,19 * + 0,03 и 9,13 + 0,03 тис/мм3 ( Р > 0,05 ). У больних телят контрольной группы наблюдался выраженный лейкоцитоз С 12.27 + 0,13 тыс/им3 ), тогда как у телят, лечившихся бифвцидобактерином , этот показатель был достоверно ниже ( 10,23 + 0,16 тыс/мм3, Р< 0,001).

Тенденция увеличения количества гемоглобина отмечена у телят, получавших препарат в профилактических дозах. К концу периода наблюдения этот показатель составил 11.55 + 0,09 т%, в контрольной груше - 11,30 ± 0,07 г% ( 0,1 > Р » 0,05 ).

Наиболее жфщктЯ величиной оказалась фагоцитарная активность клеток крови. Самый высокий процент фагоцитирующих клеток отмечен у телят, получаютх препарат с профилактической целью - 73,55 £ 1,0б2, тогда как в контроле - 56,5 + 1,16? ( Р< <0,001 ). 7 телят, получавиих лечебные дозы препарата, активность, фагоцитоза равнялась 65,25 * 0,93?, у телят, которых лечили по общепринятой схеме - 60,06 + 0,91/? ( Р < 0,001 ).

Определение содержания в крови опытных телят количества белка и его фракций, макроэлементов, иммуноглобулинов позволило установить влияние бифацчдобактерина на биохимические свойства крови.

Показатели общего белка сыворотки крови больных колибакте-риозом телят были существенно ниже нормы - 3,99 + 0,06 г%, тогда как у здоровых телят количество обцбго белка составило 5,10^ + 0,03 г%. Снижение происходило как за счет альбуминовой, так и за счет глобулиновой фракций.

В крови больных колибактериозои телят, которых лечили биф-ацкдобактерином, содержание общего белка и его фракций повышалось, но также оставалось ниже нормы. Применение препарата в профилактических дозах не влияло на содержание в сыворотке крови здоровых телят общего белка и его фракций.

При определении количественного содержания кальция и фосфора в крови телят, установлено, что применение пробиотического препарата существенно не вли ;т на ати показатели.

Используя метод осаждения сывороточных иммуноглобулинов раствором сернокислого натрия, мы установили, что бифацидобакте-рин способствует повышении уровня иммуноглобулинов в крови, которые выполняет в организм1: защитную функцию.

Таким образом, при колибактериозе белковая картина крови, о также клинические и гематологические показатели свидетельствуют об угнетении функции всех органов и систем и нарушении обменных процесов в организме новорожденных телят. Применение бифацидо-бактерина позволяет нормализовать нарушение функций организма.

Положительное влияние препарата на сохранность телят, на иммунологическую реактивность и факторы неспецифической резистентности новорожденных телят, безвредность препарата и выраженные антагонистические свойства, а также экономичность приготовления бакконцентрата, позволили рекомендовать бифацидобактерин для профилактики и лечения ашерихиозов новорожденных теля*.

ВЫВОДЫ

1. Изуче ны биологические свойства пятнадцати штаммов микроорганизмов, относящихся к родам Lactobacillus , Streptococcus и Bifidobacterium . Все штаммы по основным таксономическим признакам соответствуют видовому описанию в определителе бактерий Берги С 1964 ). *

2. Штаммы L.acidophilus ЛГ-I и B.odoleecentie B-I обла- ■ дают свойствами, необходимыми для развития в желудочно-гидачном траки и могут быть использованы для нормализации килечной мик-

I

рофдоры и профилактики дисбактериоза.

3. Штаммы ЛГ-1 и B-I обладают обвини и специфическими адге-зинами, способны агглютинировать эритроциты крови животных и прикрепляться к эпителиоцитам тонкого кишечника телят, создавая тем самым барьер для колонизации слизистой кишечника патогенной микрофлорой.

4. Штаммы ЛГ-I и B-I, ввделяя антибиотические вещества и молочную кислоту, способны в условиях in vitro подавлять развитие эверихий, сальмонелл, протея, микроорганизмов рода Bacillus.

5. В условиях контролируемого эксперимента определены основные показатели роста к размножения штаммов ЛГ-I и : в качестве источника азота можно использовать гидролизовагное молоко С 150 мг£ амин ного азота ), углеводов - лактозу ( 2,5iZ ) для культивирования штамма ЛГ-I и глюкозу ( 2% ) для культивирования штамма 3-1. В среду необходимо добавлять дрожжевого экстракта и 0,3 - 0,5 г/л цистеина солянокислого.

6. Культивирование штаммов ЛГ-I и B-I в жидкой питательной среде .в условиях регулируемого рН и периодического перемешивания обеспечивает более высокий выход бактериальной массы при сохранении штаммами основных культурально-морфологических свойств.

7. Штаммы ЛГ-I и B-I, технология их культивирования используются при приготовлении пробиотичвского препарата бифацидобактерии, пероральное применение которого способствует повышению сохранности телят до увеличению приростов живой массы, повышению иммунологической реактивности и не специфической резистентности организма телят.

Препарат не оказывает влияния на морфологические свойства крови, содержание гемоглобина, общего белка и его фракций, кальция и фосфора в ;срови здоровых телят и способствует нормализации показателей крови у больных ко .«бактериозом телят.

8. Бифацидобактерин, содержащий живые клетки Ь.ас1<1орЬ1-1ив ЛГ-1 и З.а<}о1оесепив Вт1, адсорбированные на естественном носителе ( мука, отруби ), обладает выраженной профилактической к лечебной эффективность!) при условии своевременного кормления телят молозивом в первые часы их жизни и строгого выполнения ве-теринарно-санитарных правил по приему и выращивание новорожденных телят.

Подобранные втаммы ацидофильных и бифидобактерий, разработанная жидкая питательная среда и режимы культивирования вклв-чены в "Инструкции по изготовление и контроле препарата бифацидобактерин для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодня. а животных" ( уть. ГУВ МСХ РФ 06.05.1992 г ).

СПИШК НАУЧНЫХ РАБОТ, О ПУБЛИЮ ВАННЫХ ГО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кальницкая Изучение биологических свойств молочнокислых микроорганизмов, которые используется для изготовления рробиотиков // Информационный научно-технический беллетень, посвященный 40-летие образования зоокженерного факультета, г. Каменец-Подольский, 1994г. '

2. Кальницкая 0.И. Изучение антагонистических и адгезивных свойств и таимо в ацидофильной палочки и бифыдо бактерий // Тезисы докладов научно-методической конференции профессорского и преподавательского состава, г. Каменец-Подольский, 1994г.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

гг