Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Экологическая валентность Mycobacterium bovis и Mycobacterium avium и ее эпизоотологическая роль

лПГ

о \ M

КИСЛЕНКО

BlIKTOp Никифоров!!1!

На правах рукописи

ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ВАЛЕНТНОСТЬ MYCOBACTERIUM BOVIS И MYCOBACTERIUM AVIUM И ЕЕ ЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

А В ТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Новосибирск - 1998

Работа выполнена в Новосибирском государственном аграрном университете МСХ и П РФ

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент Россель-хозакадемии , заслуженный деятель науки РФ A.C. Донченко

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор В.Г.Ощепков; доктор ветеринарных наук, профессор И.И.Гуславский; доктор ветеринарных наук, профессор Н.П.Овдиенко

Ведущее учреждение: Институт ветеринарной медицины Омского государственного аграрного университета

Защита диссертации состоится 5 октября 1998 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.020.23.01 в Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (633128, Новосибирская область, п. Краснообск, ИЭВС и ДВ). С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН Автореферат разослан "_"_1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор ветеринарных наук A.A. Самоловов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Важную роль в успешном развитии скотоводства и производстве молока и мяса играют ветеринарные мероприятия, обеспечивающие благополучие животноводства в отношении инфекционных болезней, в том числе туберкулеза.

Для ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота в неблагополучных пунктах применяется два метода: регулярное исследование поголовья с последующим убоем реагирующих на туберкулин животных и замена скомпрометированных по туберкулезу стад крупного рогатого скота здоровым поголовьем.

При любом методе оздоровления ветеринарно-санитариым мерам, направленным на санацию объектов внешней среды от микобактерий туберкулеза, придается серьезное значение.

Проблемы диагностики, профилактики и оздоровления неблагополучных стад крупного рогатого скота от туберкулеза, вопросы эпизоотологии и контроля эпизоотического процесса решались ведущими учеными нашей страны: П.П.Вышелесским, М.К.Юсковцом, В.П.Урбаном, И.В.Поддубским, Н.С.Щепиловым, А.С.Донченко, Н.П.Овдиенко,

A.Н.Шаровым, Ю.Я.Кассичем, Д.Д.Новаком, Н.А.Шкилем и многими другими.

Разработаны методы контроля качества дезинфекции животноводческих помещений (Н.М.Колычев, 1984; С.Г.Письменная, 1976).

Эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации остается в течение многих лет напряженной за счет его распространения в отдельных регионах страны, куда входит и Западная Сибирь. Реализация высокоэффективных противоэпизоогических мероприятий позволяла в регионе добиваться оздоровления или значительного сокращения заболеваемости скота туберкулезом. Но с течением времени в ряде районов, хозяйств, ферм болезнь получала вновь широкое распространение (В.М.Авилов,

B.Ф.Пылишш, Н.П.Овдиенко, В.А.Ведерников, 1997).

Видовое разнообразие патогенных микобактерий, их способность мигрировать среди множества видов животных и птиц, высокая устойчивость возбудителя к факторам защиты организма и воздействию неблагоприятных условий внешней среды создают трудности в профилактике и надежном оздоровлении стад от туберкулеза (М.А.Сафин, 1981; Н.А.Александров, 1973 и другие).

Стационарное течение туберкулеза крупного рогатого скота на определенных территориях, недостаточная изученность экологических особенностей возбудителя туберкулеза, неэффективность регламентированных ветеринарно-санитарных мероприятий в отдельных регионах определили основные направления наших исследований.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Изучить экологическую валентность Mycobacterium bovis и Mycobacterium avium и ее эпизоотологическую роль.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

- изучить распространение микобактерий туберкулеза в почвах пастбищ и в организме крупного рогатого скота на территориях с различной напряженностью эпизоотической ситуации;

- изучить экологическую валентность Mycobacterium bovis в почвах пастбищ с различными физико-химическими и биологическими свойствами;

-изучить экологическую валентность Mycobacterium avium в глубокой несменяемой подстилке;

- с учетом полученных результатов исследования научно обосновать эффективный способ санации пастбищ, обсемененных возбудителем туберкулеза.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Доказано на территориальном уровне, что показатели эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота находятся в зависимости от биогеохимических особенностей местности.

Установлено, что на неблагополучных по туберкулезу фермах крупного рогатого скота пастбища, обсемененные возбудителем туберкулеза, длительное время остаются контаминированными.

Впервые в условиях Западной Сибири обнаружено, что в естественно обсемененной почве микобактерии туберкулеза бычьего вида длительно сохраняют вирулентные свойства. Показана возможность естественного инфицирования крупного рогатого скота на пастбищах, обсемененных возбудителем туберкулеза.

Впервые в результате многолетних исследований доказано, что микобактерии туберкулеза в условиях Западной Сибири выживают в глубокой несменяемой подстилке птиц и почве, находящейся под подстилкой, до 10 лет.

Доказана зависимость сроков выживания возбудителя туберкулеза бычьего вида на пастбище от физических и биологических свойств почв. Определены некоторые механизмы существования патогенных микобактерий в почве.

В условиях эксперимента выявлена способность почв адсорбировать микобактерии туберкулеза в зависимости от реакции среды, температуры и гранулометрического состава почвы.

Научно обоснован способ санации пастбищ, обсемененных микобак-териями туберкулеза.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Результаты выполненных работ дополняют и уточняют новыми научными фактами теорию эпизоотического процесса туберкулеза.

Полученные данные об экологии патогенных микобактерий обогащают новыми данными теорию саморегуляции паразитарных систем и могут быть использованы для практической оценки и прогнозирования эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота.

Рациональный способ санации пастбищ, обоснованный результатами собственных исследований, дополняет имеющиеся положения по обеззараживанию почв, обсемененных возбудителем туберкулеза.

Полученные данные в совокупности с изысканиями других исследователей послужили материалом для учебного пособия, используемого в учебном процессе вузов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на: конференции молодых ученых Западной Сибири (Омск, 1969), Всесоюзном совещании-семинаре по борьбе с туберкулезом (Хмельницкий, 1972), научной конференции "Профилактика болезней животных в Сибири" (Новосибирск, 1973), региональных совещаниях исполнителей НИР по проблеме туберкулеза животных Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1982-1987), региональных научных и научно-практических конференциях (1986-1996), ежегодных научных и научно-практических конференциях преподавателей Новосибирского государственного аграрного университета (1971-1997), второй научной конференции Новосибирского отделения Паразитологического общества РФ (1997), Ученом Совете ИЭВС и ДВ СО РАСХН (1994,1998).

ПУБЛИКАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ. Основные научные положения и практические рекомендации изложены в 32 работах, опубликованных в сборниках научных трудов НГАУ, в журналах "Ветеринария", "Гигиена и санитария", "Проблемы туберкулеза", "Сибирский вестник сельскохозяйственной науки", "Земля сибирская, дальневосточная", материалах региональных научных конференций и других научно-производственных изданиях.

ОБЬЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 343 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и приложения. Работа иллюстрирована 48 таблицами и 6 рисунками. Список литературы включает 675 источников.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. Внедрен способ санации пастбищ, обсемененных микобактериями туберкулеза, утвержденный подсекцией "Проблемы инфекционной патологии животных в регионах Сибири и Дальнего Востока" Отделения ветеринарной медицины РАСХН. Результаты исследований учтены при разработке проекта Инструкции "О мероприятиях по профилактике и ликвидации туберкулеза животных" (1983г.) и использованы при реализации планов противотуберкулезных мероприятий в неблагополучных областях Сибири. Учебное пособие используется в учебном процессе сельскохозяйственных вузов. ОСНОВНЫЕ ВОПРОСЫ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: - результаты изучения экологической валентности Mycobacterium bovis и Mycobacterium avium и ее эпизоотологическая роль.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 1968-1997 гг. в Новосибирском государственном аграрном университете Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ и государственных ветеринарных учреждениях и сельскохозяйственных предприятиях Новосибирской области.

Предметом исследования была экологическая валентность Mycobacterium bovis в почвах пастбищ и Mycobacterium avium в подстилке птиц. В качестве модели для изучения распространения возбудителя в почвах, в организме крупного рогатого скота, его выживаемости в почвах пастбищ взята территория Чановского района Новосибирской области, неблагополучная по туберкулезу крупного рогатого скота в течение нескольких десятилетий .

Эпизоотическую ситуацию по туберкулезу крупного рогатого скота изучали путем анализа статистических материалов, данных журналов для записи эпизоотического состояния районов, отчетных данных районных станций по борьбе с болезнями животных, областного управления ветеринарии и собственных эпизоотологических обследований неблагополучных пунктов, лабораторных исследований биоматериалов и наблюдений за проведением комплекса оздоровительных и профилактических мероприятий. Полученные данные систематизировали и подвергали эпизоотологи-ческому анализу в сравнительно-историческом и сравнительно-географическом аспектах.

Оценку напряженности эпизоотической ситуации проводили по методике, рекомендованной М.Г.Таршис с соавторами (1972) и усовершенствованной А.С. Донченко и Н.А. Шкилем (1995).

Изучение влияния экологических факторов (свойств почв) на динамику и показатели проявления эпизоотического процесса провели сопоставлением общего балла бонитета почв разного вида сельскохозяйственного использования, процента площадей типовых разновидностей почв, содержания основных микроэлементов в почве и растениях, наличия некоторых микроэлементов и металлов в организме крупного рогатого скота с заболеваемостью, распространенностью, неблагополучием, индексом эпи-зоотичности и напряженностью эпизоотической ситуации в административных районах и сельскохозяйственных предприятиях Новосибирской области. Полученные в результате исследования данные подвергнуты статистической обработке (Г.Ф.Лакин , 1990).

Аллергическое исследование животных на туберкулез и бактериологическое исследование биоматериала от реагирующих на туберкулин животных проведено по общепринятым методикам. При посевах материала использовали среду Гельберга.

Для индикации микобактерий туберкулеза в почве брали почвенный столб высотой 0-10 см, массой 0,5 кг. Траву скашивали в разных местах с участков 100x100 м и брали для исследования 20 кг. Почву растирали, до-

водили физиологическим раствором до кашицеобразного состояния и обрабатывали 18% раствором серной кислоты.

Для экспериментального изучения экологической валентности мико-бактерий туберкулеза бычьего вида в почвах пастбищ использовали 12 свежевыделенных от крупного рогатого скота культур Mycobacterium bovis. Использованные в опытах культуры обладали основными свойствами, характерными для бычьего вида. Для сравнения выделяемых и используемых в опытах взят птичий вид №780 и вид Mycobacterium bovis var."Vallee", представленные нам из лаборатории туберкулеза ВИЭВ.

В лабораторных опытах по изучению выживаемости Mycobacterium bovis во влажных почвах и почвенных вытяжках использовано 7 типов почв (табл.1). В полевых опытах исследования проведены на пастбищных участках с тремя различными типами почв (табл.2).

Водные суспензии Mycobacterium bovis подвергали 28-кратному замораживанию и оттаиванию в течение 2,5 месяцев. Действие растворов хлорида натрия, сернокислого натра, карбоната кальция и гидрокарбоната натрия изучено методом посева по Прайсу и на среде Гельберга. В лабораторном опыте изучено влияние длительного ангидробиоза Mycobacterium bovis в почвах и в тканях органов в течение 4 месяцев.

В лабораторных опытах изучали выживаемость микобактерий туберкулеза бычьего вида в стерильных и нестерильных почвах семи различных типов при температуре 20 - 24° С и 37,5 - 38,5°С. Для этого наполняли по 4 большие бактериологические пробирки (2/3 объема) почвами семи типов (всего 28 пробирок). По 2 пробирки каждого типа почв стерилизовали в автоклаве при температуре 120°С в течение 1 часа. Стерильность проверяли посевом. Все образцы почв залили суспензией культур микобактерий туберкулеза бычьего вида в концентрации 1 мг в 1 мл стерильной дистиллированной воды так, чтобы над поверхностью полностью увлажненной почвы находилась суспензия высотой 2-3 см.

По одной пробирке каждого типа стерильных и нестерильных почв (14 пробирок) поместили в термостат с температурой 37,5 - 38,5°С, другую часть - в темный шкаф при температуре 20 - 24°С. В качестве контроля при таких же температурных условиях находились 2 пробирки, содержащие по 10 мг культуры в 10 мл дистиллированной воды и физиологического раствора. Пробки пробирок залили смесью парафина с воском.

В момент постановки опыта и ежемесячно проводили отсев в пробирки со средой Гельберга, обрабатывая по Гону пробы из нестерильных почв.

Для изучения выживаемости микобактерий туберкулеза бычьего вида в почвенных вытяжках использовали 6 культур. Вытяжки из 7 почв готовили путем настаивания 100 г почвы на 200-300 мл дистиллированной воды в течение 24 часов при температуре 4 - 8°С. Надосадочную жидкость разливали по 10 мл в бактериологические пробирки и стерилизовали при температуре 120°С 30 минут.

Из смеси 6 культур микобактерий туберкулеза готовили суспензии, содержащие в 1 мл дистиллированной воды 0,1 мг культуры. Суспензии в стерильных условиях наносили на стерильные предметные стекла по всей длине (по 4 стекла для каждого типа почвы) и после высушивания помещали в пробирки (по 2 стекла в 2 пробирках) с вытяжкой таким образом, чтобы половина стекла выступала над поверхностью вытяжки. Одну часть пробирок помещали в термостат (температура 37,5 - 38,5°С, другую - в темный шкаф при температуре 20-24°С (всего 28 пробирок).

Через 2, 4, 6 и 8 месяцев извлекали по одному стеклу, окрашивали и микроскопировали, сравнивая густоту и характер расположения микобактерий туберкулеза в части мазка, находившейся в жидкости, с частью мазка над поверхностью и подсчитывая количество микобактсриальных клеток в 50 полях зрения в двух частях препарата. Интенсивность роста определяли делением числа микобактсриальных клеток в почвенной вытяжки на их число над поверхностью жидкости.

Изучение адсорбции микобактерий туберкулеза на поверхности стекла, почвами и почвенными фракциями проведено по методике Е.В. Диано-вой и А.А.Ворошиловой (1925), Д.Г.Звягинцева (1973) в собственной модификации. В опыте использовано пять типов почв и шесть почвенных фракций различного гранулометрического состава. Изучение адсорбции Mycobacterium bovis var. BCG двумя почвенными горизонтами (А и В) проведено у 5 типов почв. Результаты исследования обработаны статистически (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962).

Для проведения части опытов в полевых условиях был заражен теленок внутривенно культурой Mycobacterium bovis. В крови, органах и фецес посевом обнаружена исходная культура (шт.№198).

В полевых условиях пастбищные участки обсеменяли микобактерия-ми туберкулеза бычьего вида в смеси с кровью, фекалиями, взятыми от трупа зараженного теленка. В почвы трех типов на глубину от 5 до 40 см помещали кусочки паренхиматозных органов от искусственно зараженного животного. Участки пастбищ орошали водными суспензиями микобактерий туберкулеза бычьего вида концентрацией 0,25 мг/мл и 0,2 мг/мл. В первом случае 200 мл суспензии орошены участки 20x20 см, во втором -100 мл на такую же площадь.

До обсеменения со всех опытных участков исследованы образцы почв на наличие патогенных микобактерий туберкулеза и получены отрицательные результаты.

Периодически со всех обсемененных участков брали пробы почв и их бактериологически исследовали для изоляции возбудителя туберкулеза.

Для изучения эпизоотической роли почв, обсемененных Mycobacterium bovis, проведены эпизоотологические наблюдения, обследования ферм крупного рогатого скота и поставлен опыт на пастбище с использованием телят.

Таблица 1

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЧВ

№ объекта Почва Глуби -на, см рН Гумус, % Сумма солей,0/» Химизм засоления Гранулометрический состав по Качинскому (расчет на сухую навеску)

Содержание частиц в % (диаметр, мм)

>0,25 0,250,05 0,050,01 0,010,005 0,0050.001 <0,001 Сумма <0,01

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1. Чернозем обыкновенный 0-10 7,7 6,88 0,137 сульфат. -содовый 4,4 46,6 19,4 6,5 10,8 12,2 29,6

2. Глубокостолб -чатый солонец 0-20 7,0 6,17 0,189 содово-сульфат. 2,0 24,1 44,8 7,9 9,7 11,5 29,1

3. Черноземно-луговая со, лонцевато-солончаковая почва 0-7 7,9 9,87 0,178 сульфат.-содовый 1,4 13,4 17,6 9,8 15,2 22.6 47,6

4. Луговой корковый солонец 0-7 8,5 3,0 0,496 сульфат.-содовый 17,5 20,9 26,6 7,7 11,6 16,7 36,0

5. Луговой солончак 0-10 9,6 3,92 1,486 содовый 11,2 26,5 23,7 9,0 12,9 22,6 44,5

6. Солодь 0-5 5,1 54,47 0,204 сульфат.-содовый 6,4 23,9 25,8 11,8 15,3 16,8 43,9

7. Торф 3-20 5,4 43,2 0,165 не определялся

Таблица 2

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЧВ, ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В ПОЛЕВЫХ ОПЫТАХ

№ объекта Почва Глубина, см рН Гумус % Сумма солей, % Химизм засоления Гранулометрический состав по Качинскому {расчет на сухую навеску)

Содержание частиц в % (диаметр, мм)

>0,25 0,250,15 0,050,01 0,010,005 0,0050,001 <0,00 1 Сумма <0,01

1. Глубокостолбчатый солонец 0-16 6,8 7,36 0,132 сульфат-но-содо-вый 1,7 42,6 34,6 19,0 1,9 3,2 21,1

2. Корковый солонец 0-6 9,5 3,58 0,766 содовый 1,2 22,7 34,8 14,9 17,6 8,8 41,3

3. Высокостолбчатый солонец 0-9 6,2 16,34 0,134 содово-сульфатный 1,8 38.8 32,6 10,8 11,2 4,8 26,8

Научное обоснование способа санации пастбищ, обсемененных ми-кобактериями туберкулеза, проведено в трех природных зонах Новосибирской области: Западная Бараба, Центральная Бараба и Левобережье При-обья. Объектом изучения выбрана численность основных групп почвенных микроорганизмов ( бактерии, растущие на МПА, в том числе споровые; бактерии, растущие на КАА; актиномицеты и грибы) и титр кишечной палочки в почвах пастбищ. В основном опыте изучена динамика численности названных групп микроорганизмов в почвах пастбищ трех типов окультуривания: естественные неулучшенные; улучшенные механической обработкой и посевом многолетних трав, орошаемые; улучшенные орошаемые с применением минеральных удобрений.

Пастбищные участки в основном опыте были расположены на сред-нестолбчатом солонце и черноземе выщелоченном.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Зависимость напряженности эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота от биогеохимических особенностей территорий

Напряженность эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в различных странах мира неодинакова. По степени распространения туберкулеза объекты Федерации в России разделяются на три категории: благополучная, с ограниченным распространением болезни и неблагополучная.

В Новосибирской области нами выявлена многолетняя связь показателей интенсивности проявления эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота с некоторыми свойствами природных зон. В области выявлено три природно-географические зоны, имеющие существенные различия по показателям проявления эпизоотического процесса, что мы связывали с преобладанием на этих территориях почв с различными свойствами. Выявленная зональная особенность эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота приводит к необходимости изучения причин такой закономерности.

Исходя из законов эпизоотологии (Бакулов, 1994), вторичными движущими силами эпнзоотологического процесса выступают, в том числе природные факторы. Из природных факторов, оказывающих влияние на интенсивность проявления эпизоотического процесса при туберкулезе крупного рогатого скота, многие исследователи отдают предпочтение почвенным условиям.

Сопоставление показателей бонитетной стоимости почвенного покрова сельскохозяйственных угодий административных районов Новосибирской области с показателями проявления эпизоотического процесса по туберкулезу крупного рогатого скота позволило установить обратную зависимость между уровнем бонитета почвенного покрова и распространенностью туберкулеза крупного рогатого скота и индексом эпизоотичности

(г=- 0,90 и г=- 0,50 соответственно). С уменьшением бонитетной стоимости почвенного покрова кормовых угодий увеличивалась напряженность эпизоотической ситуации (г=- 0,50).

По напряженности эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота территория Чановского района Новосибирской области, взятая в качестве модели, разделена нами на три подзоны: СевероВосточную, Центрально-Западную и Южную.

Подзоны характеризуются различными свойствами почвенного покрова, рельефа и отличались показателями проявления эпизоотического процесса (заболеваемостью, индексом эпизоотичности, распространенностью, напряженностью эпизоотической ситуации, продолжительностью неблагополучия).

Сведения по туберкулезу крупного рогатого скота из ветеринарной отчетности по хозяйствам Чановского района мы сопоставили с информацией о типах почв в этих хозяйствах. Установлена прямая зависимость между наличием в земельном фонде хозяйств комплекса солонцов, солончаков и солонцовых почв (в % к общей площади сельскохозяйственных угодий) и распространенностью (г= 0,82) и индексом эпизоотичности (г= 0,77). Обратная корреляция установлена между наличием в земельном фонде хозяйств Чановского района комплекса черноземов и луговых черноземных почв и распространенностью туберкулеза крупного рогатого скота (г=- 0,76) и индексом эпизоотичности (г=- 0,74).

Сопоставлением научных данных о содержании в растительных кормах биогеохимических провинций Новосибирской области меди, железа, кобальта и бора с показателями проявления эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота в административных районах области нами выявлена территориальная приуроченность туберкулеза к провинциям с низким содержанием в кормах меди, железа, кобальта и избытком бора.

В результате исследования волосяного покрова крупного рогатого скота на территориях с различной напряженностью эпизоотической ситуации по туберкулезу в Новосибирской области нами установлено, что на благополучной, сравнительно благополучной и стационарно неблагополучной территориях у крупного рогатого скота обнаружены различия в содержании цинка (Р<0,01), марганца (Р<0,001), свинца (Р<0,05), меди (Р<0,01) и кадмия (Р<0,01).

2. Распространение микобактерий туберкулеза в почвах пастбищ и биоматериале животных на территориях с различной напряженностью эпизоотической ситуации

Пробы из объектов внешней среды и от реагирующих на туберкулин животных взяты на территории хозяйств Чановского района Новосибирской области в Южной, Центрально-Западной и Северо-Восточной подзонах, имевших существенные различия по показателям проявления эпизоотического процесса. В хозяйствах Северо-Восточной подзоны заболеваемость крупного рогатого скота туберкулезом, напряженность эпизоотиче-

ской ситуации, индекс эпизоотичности и распространенность соответственно в 7, 40, 5 и 2 раза ниже аналогичных показателей в хозяйствах Южной подзоны.

При аллергическом исследовании 9614 голов крупного рогатого скота хозяйств Северо-Восточной подзоны выявлено 80 реагирующих на туберкулин животных (0,83%). При бактериологическом исследовании биоматериала от реагировавших животных изолировано 15 культур атипичных микобактерий. Бактериологическим исследованием проб фекалий (21 проба) от животных этой группы выделено 5 культур атипичных микобактерий.

На пастбищных участках трех населенных пунктов СевероВосточной подзоны, где выпасали коров, взята 51 проба почвы. В результате бактериологического исследования изолировано из проб почв 5 культур атипичных микобактерий.

Все культуры атипичных микобактерий, изолированные на территории Северо-Восточной подзоны, относительно благополучной по туберкулезу крупного рогатого скота, имели некоторые общие морфологические, тннкториальныс, культуральные, биохимические и биологические свойства. Они отличались средней скоростью роста на среде Гельберга (10-12 дней), авирулентностыо для морских спинок, слабой каталазной активностью, отсутствием зернистости у некоторых микробных тел, полиморфно-стыо.

Территория Северо-Восточной подзоны отличается пересеченным рельефом, наличием мелких ручьев, речек и пресных озер. Фермы расположены вдоль реки Омь. Характер рельефа обеспечивает быстрый сток талых вод и летних осадков. Почвенный покров представлен, в основном, черноземами с высоким содержанием песчаной фракции как в пахотном слое, так и в подстилающих породах, что приводит к быстрой фильтрации осадков.

На территории Южной и Центрально-Западной подзон нами взято и исследовано на туберкулез 183 пробы биоматериала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота и 8 проб от свиней. Из объектов внешней среды исследовано 121 пробы почвы и 3 пробы травы с пастбищ.

Из 191 пробы биоматериала изолировано 49 культур микобактерий, в том числе 24 бычьего вида (48,9%), 3-птичьего (6,1%), 9 атипичных (18,4%) и 13 неидентифицированных (26,6%).

Из 121 пробы почв с пастбищ изолировано всего 38 культур микобактерий, в том числе бычьего вида 12 (31,6%), 1-птичьего (2,6%) и 25 атипичных (65,8%). Из трех проб травы с пастбища выделен один штамм бычьего вида.

Микобактерии бычьего вида выделены из почв пастбищ с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу крупного рогатого скота VI через разные сроки после того, как пастбища оставались свободными от больного туберкулезом скота. В мае и начале июня изолировано 76,9%) всех микобактерий бычьего вида. Четыре культуры (31%) изолированы с пастбищ,

где в период отбора проб почвы выпасали реагировавших на туберкулин коров. Две культуры (15%) изолировано из почвы загона через один год после удаления с его территории реагирующих на туберкулин телят. Одна культура (8%) изолирована из травы пастбища, где в течение 8 зимне-весенних месяцев не было животных. Шесть штаммов (46%) изолировано из почв пастбищ по прошествии 8-10 зимне-весенне-летних месяцев.

Культуры Mycobacterium bovis, изолированные из почв пастбищ через 7-10 месяцев отличались сравнительно быстрой скоростью роста на среде Гельберга (8-17 дней у одних и 15-32 дня у других культур). Культуры с ранним сроком появления колоний имели, как правило, гладкую поверхность, плоский профиль, легко эмульгировались. Некоторые культуры вызывали атипичные патоморфологические изменения в печени морских свинок в виде единичных бледно-желтого цвета мелких узелков.

Таким образом, на территориях с высокой напряженностью эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в пробах материала от реагировавшего на туберкулин скота и в почвах пастбищ обнаружены микобактерии бычьего, птичьего видов и атипичные микобакте-рии.

Метод изоляции Mycobacterium bovis из почвы заражением первичным материалом морских свинок оказался в 2,3 раза эффективней метода посева на среду Гельберга.

В естественно обсемененных почвах возбудитель туберкулеза бычьего вида сохранял жизнеспособность в течение одного года (срок наблюдения).

Роль пастбищ, обсемененных возбудителем туберкулеза, в заражении здорового поголовья туберкулезом мы выясняли методом наблюдения и в эксперименте.

За период с 1967 г по 1978 г в Чановском районе методом полной замены поголовья оздоровлено 17 ферм. Повторные вспышки туберкулеза среди завезенного поголовья отмечены через 1 год в 3 случаях, через 2 года- в 5, через 3 года- в 2, через 5-8 лет в 2 случаях. Анализируя уровень проводимых ветеринарно-санитарных мер, степень изоляции завезенных животных от местного скота, мы пришли к выводу, что в 47 % случаев инфицирование завезенных животных произошло на пастбище, о чем свидетельствовала массовость проявления реакций па туберкулин (до 7,4%), выпас животных на обсемененных пастбищах и содержание животных во вновь отстроенных помещениях на новых территориях. Наши данные согласуются с результатами анализа повторных вспышек туберкулеза крупного рогатого скота других авторов .

Для изучения роли обсемененных микобактериями туберкулеза бычьего вида пастбищ в распространении туберкулеза среди крупного рогатого скота был поставлен опыт. На благополучной ферме взято три бычка в возрасте 13 месяцев, живой массой по 170 кг. Двукратными (через месяц) аллергическими исследованиями исключено их спонтанное заражение туберкулезом. Исследования фекалий посевом на предмет обнаружения мед-

ленно растущих микобактерий с каталазной активностью дали отрицательный результат. Биологическая проба первичного материала на морских свинках была отрицательной. В феврале 1970 года-бычков одновременно заразили алиментарно, однократно, в дозе по 50 мг культуры микобактерий туберкулеза бычьего вида. С момента заражения животных содержали в изолированном помещении. Через 9,30,62 и 82 дня после заражения проведено аллергическое исследование на туберкулез, взяты пробы фецес из прямой кишки и моча при мочеиспускании для бактериологического исследования. Результаты аллергических исследований на 62 и 82 сутки были положительными. Исследованиями фекалий во все сроки отбора проб выделена исходная культура микобактерий туберкулеза бычьего вида. Исследования мочи в 15% случаях дали положительный результат. Биологическая проба первичного материала на морских свинках положительная. Через 3 месяца после заражения бычков убили и подвергли пата-логоанатомическому и бактериологическому исследованию на туберкулез. Результаты этих исследований дали положительный результат. У всех животных на вскрытии обнаружены характерные для туберкулеза изменения в бронхиальных, мезентериальных лимфатических узлах и в печени. Исследованиями биоматернала биопробой на морских свинках выделены культуры микобактерий бычьего вида, аналогичные исходной.

Фекалии и мочу от бычков после заражения вывозили в течении 3 месяцев на пастбищный участок площадью 1800 кв.м. и равномерно на нем распределили. Участок изолировали изгородью, и он оставался незанятым до 8 сентября

Почвенный покров земельного участка представлен корковым солонцом, имеющим тяжелосуглинистый гранулометрический состав, небольшое количество гумуса. Химизм засоления- содово-сульфатный.

С зараженного объекта в течение лета брали пробы почвы с глубины 0-10 см и пробы травы. Пробы почвы исследовали посевом на среду Гель-берга и заражением морских свинок. Трава скормлена 4 морским свинкам и 4 кроликам.

На зараженный участок 8 сентября в помещена телочка с благополучной по туберкулезу крупного рогатого скота местности. Предварительными бактериологическими исследованиями фекалий у нее исключен туберкулез. Туберкулиновая проба проведенная дважды через месяц, дала отрицательный результат.

Животное постоянно содержалось на этом участке до 2 ноября текущего года. Через 20,40 и 52 дня после ввода телочки на зараженный участок ее исследовали внутрикожной туберкулиновой пробой, а мочой и материалом фекалий от нее заражали морских свинок.

Аллергическая проба дала положительный результат на 40 и 52 день. Исследования мочи посевом не дали положительного результата. Фекалии во всех трех случаях содержали патогенные микобактерии туберкулеза.

Таким образом, после четырехмесячной летней санации пастбища, обсемененного микобактериями туберкулеза бычьего вида, не произошло естественного самоочищения, почвы пастбища.

Паталогоанатомическое исследование трупа телочки 2 ноября подтвердило выводы. У телочки в бронхиальных и заглоточных лимфатических узлах были обнаружены характерные для туберкулеза изменения. Посевом биоматериала на среду Гельберга выделена патогенная культура ми-кобактерий туберкулеза.

Наблюдениями и в эксперименте показано, что на обсемененных микобактериями туберкулеза бычьего вида пастбищах происходит заражение крупного рогатого скота туберкулезом.

В течение одного летнего периода не происходило естественного обеззараживания целинного участка пастбища на корковом солонце от возбудителя туберкулеза, внесенного на поверхность почвы с фекалиями и мочой от больных туберкулезом телят.

Таким образом, методом эпизоотологического наблюдения и анализа эпизоотического состояния неблагополучных и благополучных по туберкулезу ферм крупного рогатого скота выявлены случаи заражения на пастбищах завозимого для замены скомпрометированного по туберкулезу поголовья.

В течение одного летнего периода в условиях Барабинской низменности не происходило естественного обеззараживания пастбищ, расположенных на корковом солонце, обсемененных микобактериями туберкулеза бычьего вида.

Эпизоотологическим наблюдением и в эксперименте с использованием молодняка крупного рогатого скота было показано, что при выпасе животных на пастбищах, где ранее находились реагирующие на туберкулин или больные туберкулезом животные, происходило заражение здорового крупного рогатого скота. За один летний период в условиях Западной Сибири на пастбищах с солонцовыми почвами не происходило надежного обеззараживания пастбищ от микобактерий туберкулеза бычьего вида.

3. Экологическая валентность Mycobacterium bovis в почвах пастбищ

Лабораторные исследования. В лабораторных опытах культивированием Mycobacterium bovis на МПГБ и среде Гельберга с содержанием хлорида натрия и сернокислого натра от 1 до 10% установлено, что при концентрации NaCl 6% уменьшалась интенсивность роста возбудителя, в культурах формировались гетероморфные клетки. При содержании в питательных средах 8% солей не среде Гельберга обнаруживались мельчайшие •полупрозрачные колонии. В мазках из таких культур преобладали шаровидные или удлиненные, беззернистые, тонкие клетки.

Пересев культур со сред с солями на обычные МПГБ и среду Гельберга приводил к реверсии основных морфологических и культуральных свойств Mycobacterium bovis.

Карбонат кальция в концентрациях от 0,05 до 2,0 процентов и гидрокарбонат натрия в концентрациях от 0,5 до 4,0 мг-экв на 100 г вышеназванных питательных сред заметного влияния на интенсивность роста и морфологию Mycpbacterium bovis не оказывали.

Высушивание при температуре 40-45°С почв и проб патологического материала, содержащих Mycobacterium bovis, и выдерживание опытных образцов при комнатной температуре в течение 4 месяцев не приводило к утрате возбудителем культуральных и вирулентных свойств.

28-кратное замораживание и оттаивание Mycobacterium bovis в течение 2,5 месяцев не привело к утрате возбудителем культуральных свойств.

Исследование экологии Mycobacterium bovis во влажных почвах и почвенных вытяжках (по Прайсу) показало, что в почвенных вытяжках при температуре 20-24°С происходило увеличение числа микобактериаль-ных клеток в отдельных зонах поверхности стекла.

При температуре 20-24°С в почвенных вытяжках обнаружено удлинение (до 8 месяцев) экспоненциальной фазы роста микобактериальных культур. При температуре 37,5-38,5°С интенсивность роста культур в почвенных вытяжках выше, экспоненциальная фаза короче (до 4 месяцев).

Изучение адсорбции трех видов микобактерий (М .bovis var.BCG, M.avium, M.fortuitum), проведенное на предметных стеклах, показало, что с увеличением температуры от 20 до 40°С увеличивается число адсорбированных клеток (г= 0,81). Между активностью адсорбции микобактерий на поверхности стекла и увеличением рН среды обнаружена обратная зависимость (г=- 0,78). Наибольшей способностью адсорбироваться на поверхности стекла обладал Mycobacterium bovis var.BCG (r= 0,75).

В опытах с почвенными частицами различных размеров и при разном значении рН оказалось, что наибольшей адсорбционной способностью обладали частицы размером менее 0,001 мм при рН 5,0 .

При изучении уровня адсорбции Mycobacterium bovis var.BCG почвенными столбцами горизонтов А и В пяти типов почв нами установлено, что наибольшей способностью адсорбировать возбудителя обладали луговой корковый солонец и луговой солончак при общей влажности 50%.

Эти же типы почв обладали в горизонтах А и В наименьшей водопроницаемостью по сравнению с черноземом выщелоченным, черноземом обыкновенным и глубокостолбчатым солонцом. В горизонте В адсорбция Mycobacterium bovis var.BCG во всех вариантах опыта происходила активней.

В результате лабораторных исследований экологической валентности Mycobacterium bovis под влиянием замораживания и высушивания, при действии адсорбции почвами, действия солей и относительно низких температур (20-24°С) получены данные, которые позволяют сделать вывод о широкой экологической валентности возбудителя в почвах.

Полевые опыты. Изучение выживаемости Mycobacterium bovis в полевых условиях проведены на трех открытых участках пастбищ фермы 1 Отреченского совхоза Чановского района Новосибирской области.

Почвы опытных объектов были представлены глубокостолбчатым солонцом (объект 1), высокостолбчатым солонцом (объект 2) и корковым солонцом (объект 3). Заражение опытных объектов проведено трижды, но в каждом случае обсеменяли отдельный участок почв пастбищ. Свойства почв представлены в таблице 2.

Отбор проб кусочков легких и трупа проводили в мае, июне, сентябре и октябре. Пробы почвы с глубокостолбчатого солонца, обсемененного кровью брали для исследования с глубины 0-2 и 2-10 см через 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 19, 20, 21, 22 и 23 месяца, а с политого суспензией фецес - с глубины 0-10 см в эти же сроки.

С участков, обсемененных суспензиями культур 21 октября, пробы почвы исследовали в мае, июне, июле, августе, сентябре и октябре следующего года с глубины 0-10 см, а с участков, обсемененных 15 мая, отбор проб проводили с глубины 0-2 и 2-10 см ежемесячно до октября.

От всех морских свинок, инфицированных материалом от исследованных проб почв, материал из паренхиматозных органов высевали на среду Гельберга. Критерием жизнеспособности Mycobacterium bovis в почвах считали рост их на указанной среде из органов инфицированных морских свинок.

В течение опыта в полевых условиях ежемесячно определяли максимальную температуру почв на глубине 10 см, влажность горизонта 0-10 см и численность почвенных микроорганизмов посевом на МПА, КАА и среду Чапека. Температура воздуха, количество осадков, ясных, пасмурных и с переменной облачностью дней учитывали по данным Чановской метеорологической станции.

В результате исследования выживаемости Mycobacterium bovis в почвах пастбищ в полевых условиях установлено, что в кусочках легких и трупе возбудитель сохранял вирулентность 8-12 месяцев (срок наблюдения). В почве, обсемененной кровью, Mycobacterium bovis сохранял вирулентность 9-10 месяцев, жизнеспособность 23 месяца (срок наблюдения). В почве, орошенной суспензией фекалий от больного туберкулезом теленка, Mycobacterium bovis сохраняли вирулентность 8 месяцев, жизнеспособность - 19 месяцев.

С участка орошенного кровью, скошена трава 27 мая и скормлена морской свинке. При аллергическом, патологоанатомическом и бактериологическом исследованиях у подопытного животного установлен туберкулез.

В корковом солонце, обсемененном суспензиями культур Mycobacterium bovis осенью, возбудитель не утрачивал вирулентности в слое 0-10 см 13 месяцев (срок наблюдения), в глубокостолбчатом и высокостолбчатом солонцах - соответственно 9 и 10 месяцев.

При исследовании проб почв с пастбищ, обсемененных суспензиями Mycobacterium bovis, использовано по 16 морских свинок для заражения их первичным материалом. Сравнивая в зависимости от объекта степень туберкулезного процесса у морских свинок и время их гибели, нами обнару-

жено, что в корковом солонце условия для сохранения основных свойств возбудителем были более благоприятные, чем в глубокостолбчатом и высокостолбчатом солонцах.

У штаммов, выделяемых из обсемененной кровью и фецес почвы, периодически (через 8,12,19 и 21 месяц) изучали вирулентные свойства, для чего заражали изолированными культурами морских свинок и кроликов.

Вирулентные свойства возбудителя, находящегося в почве, снижались, но не утрачивались полностью. Наблюдалось уменьшение сроков появления первичныхых колоний на среде Гельберга с 35 до 17-21 дня. Изменялся характер колоний, отмечен гетероморфизм микобактериальных клеток.

В результате определения численности основных групп почвенной микрофлоры в трех типах почв и максимальной температуры на глубине 10 см установлено, что взятые в опыт почвы отличаются по биологической активности и гидротермическому режиму.

Глубокостолбчатый солонец был менее увлажнен, больше прогрет, имел больше бактерий, грибов и актиномицетов. Наименьшая численность микрофлоры обнаружена в корковом солонце.

4. Выживаемость мнкобактерий туберкулеза птичьего вида в глубокой несменяемой подстилке птиц

В неотапливаемом помещении с дощатыми стенами непосредственно на почве с опилочной подстилкой содержали и кормили уток, искусственно зараженных птичьим видом возбудителя туберкулеза. Еженедельно подстилку обновляли и за 10 месяцев накопился слой опилок, смешанный с фекалиями уток, высотой около 100 см. Помещение в последующие годы оставалось незанятым и доступ животных и птиц был исключен. Первое бактериологическое исследование проб подстилки на предмет обнаружения жизнеспособных микобактерий туберкулеза проведено через 4 года.

Материал периодически в последующие годы передавали для исследования на кафедру микробиологии Омского ветеринарного института, в лабораторию Казахского НИИ ветеринарии, в лабораторию туберкулеза ИЭВСиДВ. Во всех случаях исследователи выделили жизнеспособные ми-кобактерии туберкулеза.

Обсемененная подстилка в зимнее время промерзала по всему горизонту, и нижний слой ее оттаивал в конце мая. Летом температура верхних слоев находилась в пределах наружного воздуха, а на глубине 40-100 см -не выше 24° С. Верхний слой до 15 см - рыхлый сухой, опилки с серым налетом. Слой от 15 до 30 см - слежавшийся, влажный, и ниже 30 см - плотный, влажный коричневого цвета. Трехкратно проведен агрохимический анализ проб подстилки по следующим показателям: влажность (%), азот (%) по Къельдалю, хлорид натрия (%), рН. В пробах подстилки содержалось азота от 1,4 до 1,2%, натрия хлорида от 0,17 до 0,26%,рН проб глубокой несменяемой подстилки колебался от 5,8 до 6,2, влажность от 16,8 до 40%.

Микрофлора глубокой несменяемой подстилки исследована в те же сроки и с тех же горизонтов. Количество бактерий на МП А в 1 г сухой подстилки колебалось от 14903 тыс.м.т. до 6350 тыс.м.т. Споровые бактерии составляли до 41%. Грибов обнаружено от 0,3 до 0,6%. Актиномицеты обнаружены, в основном, в нижних слоях подстилки в количестве от 30 до 130 м.т. в 1г почвы или 0,5-0,9%.

Почва, на которой находилась подстилка среднесуглинистого гранулометрического состава. Гумусовый горизонт 12 см. Количество гумуса 8,9%, рН 6,5. Общее количество микроорганизмов в гумусовом горизонте (2-15 см) достигала 10254 м.т. в 1 г сухой почвы, в том числе бактерий на МП А 88,2%, споровых 23,7%, актиномицетов 16% и грибов 1,2%.

Бактериологическому исследованию на туберкулез подвергалось 94 пробы глубокой несменяемой подстилки с различных горизонтов и 12 проб почвы. Всего изолировано и подробно изучено 30 штаммов микобактерий из подстилки и 5 штаммов из почвы (табл. 3). Количество выделенных штаммов не зависело от числа исследованных проб. В среднем из каждых 3 исследованных проб подстилки выделяли один штамм микобактерий.

Культуральные свойства выделенных штаммов микобактерий изучали на плотных и жвдких питательных средах при температуре 22-24° С, 38,5°С и 45°С, Определяли каталазную и формалидазную активность микобактерий, чувствительность к стрептомицину, ПАСК и тубазиду.

Патогенные свойства микобактерий определяли заражением кроликов и кур. В опытах использовано 37 кроликов и 18 кур. Часть кур содержали на пробах исследуемой подстилки в клетках в течение 3 недель.

Таблица 3

Количество выделенных штаммов микробактерий _по периодам исследования_

Сроки в годах Глубина,см

0-2 10 20 40 60 80 0-80 почва всего

4 1 2 3 2 8

5 1 1

6 1 ■ 1

8 1 1 1 3

9 1 1 1 3

9,5 8 3 И

10 1 1 1 1 1 2 8

Итого 3 4 4 3 3 5 8 5 35

У штаммов микобактерий с верхнего (до 10 см) слоя рост на элективных средах обнаруживали на 6-12 день. Колонии мелкие, влажные, множественные, легко эмульгируются. На МПГБ на 6-7 день появляется хлопьевидный осадок. В слое 20-80 см штаммы микобактерий давали рост на элективных средах на 7-18 день. Характер роста идентичен вышеописанным штаммам. Из почвы выделены штаммы с ростом на элективных сре-

дах к шестому дню в виде мелких гладких колоний или обильного белого налета, образующегося в результате слияния мелких, влажных колоний. 33 культуры росли на элективных питательных средах в температурных'пределах 37,5-45°С, а 2 штамма-при комнатной (20-24°С) температуре с образованием мельчайших колоний на 20-21 день.

В мазках из культур первой генерации, выделенных с верхних слоев, преобладали короткие формы, располагавшиеся одиночно, попарно и скоплениями, наблюдались гантелевидные, булавочные и коккоподобные формы. Морфология микобактерий с глубины 20-80 см представлена преимущественно удлиненными формами.

Ферментативная активность и лекарственная чувствительность определена у 14 патогенных культур микобактерий, выделенных из подстилки и почвы. Культуры обладали каталазной активностью в два плюса и негативной формамидазной активностью. Устойчивость к стрептомицину и ту-базиду выявлена у 8 культур, к ПАСК и тубазиду-у 4-х. Две культуры оказались чувствительными к трем указанным туберкулостатикам.

Как следует из таблицы 4, внутривенное введение 19 суспензированных культур вызвало гибель 11 кроликов из 37 зараженных. Остальные кролики были убиты. При паталогоанатомических исследованиях у 27 кроликов обнаружены в легких, печени, селезенке, у некоторых в почках единичные и множественные очаги различных размеров. У 5 штаммов обнаружена патогенность для кур. Инокуляция штаммов курам вызывала сенсибилизацию птиц к туберкулину и либо местный туберкулезный процесс, либо очаговые изменения в органах у 8 из 10 зараженных кур.

С учетом кур, содержавшихся на пробах подстилки, всего заражено 18 голов. Подстилка, взятая с горизонта 0-80 см шестилетнего хранения, использована для аллиментарного заражения птиц. С этой целью на каждый кв.м. площади пола 4-х клеток равномерно рассеивали по 1 кг подстилки. В каждой клетке размещали по 2 курицы, которые содержались на подстилке из горизонтов 0-2, 10, 40 и 80 см. Птица в возрасте 150-160 дней взята из благополучных по туберкулезу стад, подвергнута аллергическому исследованию на туберкулез.

В течении 3-х месяцев после прекращения опыта у кур наблюдали реакции на туберкулин. Характерные для туберкулеза изменения после убоя обнаружены у одной курицы. Посевом выделена культура птичьего вида. У других кур через 4 месяца с начала опыта реакции на туберкулин выпадали.

Птица убита через 5 месяцев после начала опыта. Посевом из органов культур птичьего вида не выделено.

У 16 из 18 зараженных кур наблюдали реакции на туберкулин для птиц. Патологоанатомические изменения, свойственные туберкулезу, обнаружены у 9 из 18 зараженных кур. Диагноз подтверждали гистологическим исследованием.

Как видно из таблицы 4, жизнеспособные и вирулентные штаммы микобактерий туберкулеза были изолированы из подстилки в течение все-

го периода исследования. По мере увеличения срока выживания микобак-терий в подстилке отмечено усиление вирулентности выделяемых штаммов по отношению к кроликам и ее ослабление по отношению к птице.

Таблица 4

Биологические свойства культур микробактерий _по периодам исследований_

Кролики Куры

Сроки количество пало убито количество пало убито

в годах культур жив 0-тны X аллергия до 50 дней > 50 > 50 вскрытие культур кур аллергия до 50 дней > 50 > 50 вскрытие

4 3 6 1 3 2 4 5 1 4 8 6 2 8 6 2

5 1 1 1 0 1 0 1 1 2 2 0 1 1 2 0

6 1 4 2 0 1 1 2 2 2 Подстил. 0-80 8 8 0 8 1 • 7

8 2 2 Не исс лед 1 1 0 2 Не заражали

9 4 8 Не исс лед 1 7 5 3 Не заражали

9,5 2 4 4 0 1 3 4 0 Не заражали

10 6 12 отр 12 11 1 Не заражали

Всего 19 37 8 3 5 6 26 27 10 5 18 16 2 1 17 9 9

ПРИМЕЧАНИЕ: 1. Аллергия: числитель - количество животных, реагировавших на птичий туберкулин; знаменатель - количество не реагировавших животных. 2. Вскрытие: числитель - животные, имевшие патоморфологические изменения; знаменатель - животные, не имевшие изменений. 4 контрольные курицы содержались в отдельном помещении. Опытное поголовье кур кормили в клетках с пола зерном в течении 3-х недель. Затем их исследовали аллергической пробой на туберкулез туберкулином для птиц.

Из поверхностного слоя почвы, находящейся под подстилкой, изолировано всего 5 культур: 3 через 9,5 лет и 2 через 10 лет. Культуры обладали

каталазной активностью и устойчивостью к туберкулостатическим препаратам. Формамидазная активность отсутствовала. На элективных средах отмечался характерный для микобактерий туберкулеза рост.

Биологическая проба на кроликах дала следующие результаты: у кроликов обнаруживали узелковые поражения печени. При гистологическом исследовании в печени зафиксированы очажки некроза пролифера-тивного типа с единичными гигантскими клетками. Посевом материалов из паренхиматозных органов всех подопытных животных выделены исходные культуры.

5. Изменчивость микобактерий туберкулеза в почвах пастбищ н глубокой несменяемой подстилке птиц

Изменение генотипического состава микробной популяции в ответ на действие факторов отбора происходит не только в лабораторных культурах и макроорганизме, но и в объектах внешней среды, где эти изменения чаще остаются вне поля зрения. Во многих случаях в основе изменчивости патогенных микроорганизмов лежит накопление спонтанно возникающих мутантов, обладающих в изменившихся условиях селективным преимуществом.

При изучении выживаемости микобактерий туберкулеза в различных объектах внешней среды исследователи, как правило, фиксируют сохранение возбудителем вирулентных свойств. И в основу разделения туберкулезных микобактерий положена степень патогенности для человека, животных и птиц. Многие исследователи отмечают, что у большинства культур микобактерий туберкулеза под воздействием различных факторов как в естественных, так и в экспериментальных условиях вирулентность значительно колеблется при сохранении стабильности других свойств .

Из естественно обсемененной почвы нами изолировано 13 культур микобактерий туберкулеза бычьего вида, один - птичьего и 30 атипичных. Из несменяемой подстилки, обсемененной больными туберкулезом утками, выделено 35 культур микобактерий в различные периоды исследования.

При изучении выживаемости микобактерий бычьего вида в почвах пастбищ изолирована 91 культура микобактерий бычьего вида. Всего выделено из почвы и несменяемой подстилки и изучено 104 культуры бычьего вида микобактерий, 36 - птичьего и 30 атипичных микобактерий.

У выделенных культур изучены сроки первичного роста, его интенсивность, рост при температуре 22-24°С; 37,5-38,5°С; 43-45°С на среде Гель-берга и МПА. У культур определяли пигментообразование (на свету и в темноте), катализнуго и формамидазную активность. У части культур изучены вирулентные свойства и чувствительность к туберкулостатическим препаратам.

С увеличением срока пребывания микобактерий туберкулеза в почве, снижались их вирулентные свойства. Изолированные в различные сроки культуры отличались от свежевыделенных из материала от животных морфологическими, культу ральными и биохимическими свойствами.

Культуры, выделенные из почвы через 7 осенне-зимних месяцев, не имели существенных различий от взятых в опыт. Первичный рост появлялся через 28 и 34 дня. Колонии Я-формы выпуклые, шероховатые, матового цвета, с трудом эмульгировались. Каталазная и формамидазная активность положительная. Морфология клеток типичная для микобактерий бычьего вида.

Культуры, изолированные из почвы загона через 12 месяцев дали первичный рост на среде Гельберга через 15 и 19 дней. Колонии плоские, гладкие, слизистые, легко эмульгировались. Клетки тонкие, некоторые из них без зерен. Каталазная проба отрицательная. При последующих пересевах рост колоний появлялся на 12, 15 день.

При исследовании изменчивости основных свойств микобактерий туберкулеза, изолированных в течение 10 лет из глубокой несменяемой подстилки, обнаружено снижение и полная утрата вирулентности и изменение других свойств возбудителя.

В глубокой несменяемой подстилке возбудитель туберкулеза птичьего вида в течение многолетнего выживания изменил культуральные свойства. Первичный рост через 6 лет появлялся из поверхностных слоев через 6-12 дней, с глубины 20-80 см - на 7-18 день. Через 10 лет первичный рост наблюдали через 4-8 дней с поверхностного и через 6-10 дней с глубоких слоев. Обнаруживался рост пигментированных (скотохромогенных) колоний. По мере увеличения срока выживания обнаруживали большую долю полиморфных микобактерий: коротких, коккоподобных, утолщенных и нитевидных, аморфных и гранулоподобных тел.

Культуры, выделенные с глубины 80 см через 9 и 10 лет, отличались сравнительно медленным первичным ростом (через 10-14 дней), меньшим полиморфизмом, каталазной активностью и сохранением вирулентности.

У некоторых изолированных из искусственно обсемененной почвы пастбищ культур возбудителя туберкулеза бычьего вида также изучены вирулентные свойства заражением морских свинок и кроликов.

По мере увеличения сроков выживаемости изолированных культур сокращался срок первичного роста от 20-28 дней к 9 месяцу до 14-22 дней к 12 месяцу. У культур, выделенных через 19 и 23 месяца, первичный рост обнаруживали через 12-18 дней. В посевах обнаруживали колонии Б-форм, скотохромогенные культуры. В культурах при длительном пребывании в почвах у микобактерий туберкулеза были выявлены полиморфные клетки: удлиненные, тонкие и коккоподобные, укороченные, беззернистые и толстые микобактерии.

Таким образом, при длительном выживании в почвах пастбищ и несменяемой подстилке у микобактерий туберкулеза птичьего и бычьего видов наблюдалось изменение ряда свойств, в частности, снижение вирулентности. Утраты патогенности не отмечено. Изменение культуральных свойств проявлялось коротким периодом появления первичных колоний, преобладанием Б-форм, хромогенностью. У выделенных из объектов внешней среды культур микобактерий отмечался полиморфизм.

6. Научное обоснование способа санации пастбищ, обсемененных микобактериями туберкулеза

Исследование по санации пастбищ, обсемененных возбудителем туберкулеза, проведено в трех зонах Новосибирской области: Западная Ба-раба (совхоз "Отреченский"), Центральная Бараба (совхоз "Сарыбалык-ский") и Левобережье Приобья (ОПХ "Боровское") в течение 2 лет (схема опыта).

Улучшение естественных пастбищ проводили глубоким рыхлением, дискованием, посевом многолетних трав, щелеванием. Орошение проводилось из стационарных или передвижных установок по 300-400 м3/га воды до наименьшей влагоемкости почвы равной 70-80%. В среднестолбчатый солонец вносили азотные удобрения в дозе 180 кг действующего вещества на 1 га пастбища, в чернозем выщелоченный - комплексное удобрение с содержанием 180 кг азота, 90 кг фосфора и 120 кг калия на 1 га пастбищ.

Всего в опыте было 10 пастбищных участков: в Западной Барабе - неулучшенные пастбища на солонце среднестолбчатом и черноземе обыкновенном, улучшенное неорошаемое пастбище на солонце среднестолбчатом и черноземе обыкновенном; в Центральной Барабе - неулучшенное, улучшенное орошаемое и улучшенное орошаемое с применением минеральных удобрений пастбища на солонце среднестолбчатом; в Левобережье Приобья - неулучшенное, улучшенное орошаемое и улучшенное орошаемое с применением минеральных удобрений пастбища на черноземе выщелоченном.

СХЕМА ОПЫТА

Отреченский совхоз

1.Целинное неулучшенное пастбище

Среднестолбчатый Чернозем солонец обыкновеный

2. Улучшенное пастбище Среднестолбчатый Чернозем

солонец обыкновеный

Сарыбалыкский совхоз (<среднестолбчатый солонец)

1. Целинное неулучшенное

пастбище.

2. Улучшенное орошаемое

пастбище З.Улучшенное орошаемое с применением минеральных удобрений пастбище

ОПХ "Боровское " (чернозем выщелоченный)

1. Целинное неулучшенное пастбище.

2. Улучшенное орошаемое пастбище.

3.Улучшенное орошаемое с применением минеральных удобрений пастбище

Опытные делянки 60x60 м для отбора образцов почв были расположены в центре и по диагоналям в количестве не менее 5 на каждом пастбище. Пробы почвы отбирали с глубины 0-10 см ежемесячно с мая по август и исследовали одну среднюю пробу массой 10 г с каждой опытной делянки.

Среднее арифметическое число микроорганизмов во всех исследованных пробах почвы с одного пастбищного участка считали его численностью микроорганизмов в данный момент исследования.

Для определения коли-титра почв пастбищ пробы почв отбирали в загороженных квадратах 2,5x2,5 м. За 15 дней до первого отбора проб ежегодно каждый квадрат орошали фекалиями крупного рогатого скота, разбавленными водой в соотношении 1:5, в количестве 10 л на 1 м.кв. поверхности почвы. С каждого пастбищного участка одномоментно исследовали 5 средних проб почвы массой по 100 г, определяя среднее арифметическое значение по отдельному пастбищному участку. Исследования коли-титра почв проводили в трех зонах области в течение двух лет. Определение коли-титра осуществляли посевом на среду Кесслера с поплавками с последующим пересевом на среду Эндо и вторичной бродильной пробой.

Как показали исследования, механическая обработка и посев многолетних трав способствовали повышению численности всех изучавшихся групп микроорганизмов в солонце среднестолбчатом и черноземе обыкновенном на пастбищах Западной Барабы. При этом соотношение бактерий, растущих на КАА/МПА, не превышало 1,0 , что говорит о низких процессах минерализации в этих почвах.

В солонце среднестолбчатом естественного неулучшенного пастбища в Центральной Барабе изменения численности основных групп исследованных микроорганизмов не имели места за 2 года изучения. Улучшение пастбища (механическая обработка, посев многолетних трав и орошение) привело к росту численности бактерий, использующих органические и минеральные источники питания. Численность бактерий, грибов и актиноми-цетов возросло почти вдвое по сравнению с вариантом на естественном неулучшенном пастбище этой же зоны. Внесение удобрения на улучшенное орошаемое пастбище повысило общую численность микрофлоры еще на 19,6%, значительно усилило процессы минерализации в почвах.

Улучшение естественных пастбищ, расположенных на черноземе выщелоченном в Левобережье Приобья, привело к увеличению численности всех групп изучавшихся микроорганизмов и возрастанию соотношения бактерий, растущих на КАА/МПА, до 1,41.

Дополнительное внесение комплексного минерального удобрения значительно повышало численность бактерий на КАА, и соотношение бактерий, растущих на КАА/МПА, возросло с 1,57 до 2,24.

Как показали исследования, биологическая активность почв пастбищ находилась в зависимости от степени окультуривания пастбищ. Улучшение, орошение и внесение минеральных удобрений оказывало максимальный эффект на биологическую активность солонца среднестолбчатого и чернозема выщелоченного (табл. 5).

В результате проведенных исследований по изучению влияния окультуривания пастбищ на их санитарное состояние получены данные, позволяющие говорить о прямой зависимости между уровнем окультуривания и санитарным состоянием почв пастбищ. В почвах естественных неулучшен-

пых пастбищ всех трех зон и трех типов почв в среднем за 2 года в августе коли-титр составил 10"3. При орошении улучшенных пастбищ коли-титр снижался за летний период до 102. Внесение минеральных удобрений доводило санитарное состояние почв пастбищ до уровня чистых почв (коли-титр 101)-

Таблица 5

Зависимость самоочищения пастбищ от уровня окультуривания

Уровень окультурива-рия пастбищ Солонец среднестолбчатый Чернозем выщелоченный

общее число микрооганиз-мов (тыс.м.т. в г почвы) в среднем за 2 года коли-титр в конце опыта общее число микроорганизмов (тыс.м.т. в г почвы) в среднем за 2 года коли-титр в конце опыта

Естественное неулучшенное 4783 Ю-3 7416 ю--1

Улучшенное орошаемое 7281 Ю-2 9842 io-J

Улучшенное с применением минеральных удобрений 8630 10« 10116 Ю'

На основе результатов ретроспективного изучения эпизоотической ситуации, а также собственных исследований были проведены мероприятия по профилактике и ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота на территориях с высокой напряженностью эпизоотической ситуации в Новосибирской и Кемеровской областях.

Основные положения мероприятий состоят в следующем:

- выяснение границ территорий с высокой напряженностью эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота и длительно неблагополучных пунктов;

- эпизоотическое обоснование метода оздоровления каждой в отдельности неблагополучной фермы с учетом конкретных условий.

В дальнейшем при оздоровлении неблагополучных пунктов, находящихся на территориях с высокой напряженностью эпизоотической ситуации, методом систематических аллергических исследований и удаления реагирующих на туберкулин животных, различия в проведении мероприятий заключались в том, что на эти фермы для пополнения стада поставляли нетелей, выращенных в этом же хозяйстве с соблюдением правил изолированного выращивания. Замена неблагополучных стад проводилась целыми гуртами, размещенными в летнее время на благополучных пастбищах, а зимой - во вновь отстроенных или подвергнутых санитарному ремонту отдельных помещениях.

В остальном оздоровительные мероприятия проводились по общей схеме как на фермах, оздоравливаемых методом систематических аллергических исследований, так и методом полной замены скомпрометированных по туберкулезу стад здоровыми животными:

- подготовка здоровых животных в хозяйствах (фермах)-поставщиках длительно благополучной местности с гарантированием и комплексом диагностических исследований;

- механическая обработка почвы и посев многолетних трав на пастбищах, обсемененных возбудителем туберкулеза; создание культурных пастбищ;

- соблюдение специальной технологии замены неблагополучных стад;

- меры общей профилактики туберкулеза в оздоравливаемых хозяйствах, в том числе регулированием химического состава рациона.

При сложной эпизоотической ситуации надежное оздоровление было возможно лишь методом полной замены неблагополучного поголовья здоровыми животными из благополучной местности.

Реализация вышеприведенного перечня оздоровительных мероприятий, разработанных для неблагополучных ферм с невысокой интенсивностью проявления эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота, позволила оздоровить с 1975 по 1997 год в Новосибирской и Кемеровской областях 53 неблагополучные по туберкулезу крупного рогатого скота фермы, расположенные на территориях с высокой напряженностью эпизоотической ситуации.

За период с 1972 по 1996 год методом полной замены скомпрометированного по туберкулезу поголовья здоровыми животными с соблюдением профилактических мер на пастбищах и использованием в рационах крупного рогатого скота экологического дефицита микроэлементов было оздоровлено 38 неблагополучных ферм в Чановском, Усть-Таркском районах Новосибирской и Топкинском районе Кемеровской областей.

Таким образом, оздоровление неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота пунктов, проведенное с учетом уровня напряженности эпизоотической ситуации на конкретной территории с учетом выживаемости возбудителя туберкулеза на пастбищах и пополнением рациона животных микроэлементами является эффективным и надежным методом борьбы с этой болезнью.

выводы

1. В почвах Mycobacterium bovis обладает широкой экологической валентностью, а длительность выживания возбудителя находится в зависимости от физико-химического состава и биологического состояния почв. В естественных условиях в глубокостолбчатом солонце на пастбище, обсемененном кровью и фекалиями больных туберкулезом животных, Mycobacterium bovis выживают 23 месяца (срок наблюдения) и сохраняют вирулентность 8-10 месяцев. При искусственном обсеменении почв пастбищ жизнеспособность Mycobacterium bovis сохраняется 13 месяцев (срок наблюдения). При этом сохранение вирулентности возбудителя в почвах пастбищ зависит от типа почвы и глубины залегания патогена. На глубине до 2 см коркового солонца вирулентность возбудителя сохраняется 4 месяца, в высокостолбчатом и глубокостолбчатом солонцах - 2; на глубине до 10 см - 12 месяцев, в глубокостолбчатом солонце -9, а в высокостолбчатом -10 месяцев.

Из естественно и искусственно обсемененной почвы Mycobacterium bovis выносится произрастающими на ней растениями. Установлено, что на пастбищах, обсемененных возбудителем туберкулеза бычьего вида происходит заражение крупного рогатого скота туберкулезом.

2. В глубокой несменяемой подстилке птичника возбудитель туберкулеза птичьего вида сохраняет жизнеспособность ¡0 лет (срок наблюдения). По мере переживания возбудителя в его популяции постепенно отмечается потеря вирулентности большинством культур микобактсрий.

Возбудитель туберкулеза птичьего вида в течение многолетнего выживания изменяет культуральные свойства, что проявляется уменьшением сроков появления колоний. По мере увеличения срока выживания обнаруживаются полиморфные микобактерии( короткие, коккоподобные, утолщенные и нитевидные, аморфные и гранулоподобные ) и резистентные к туберкулостатическим препаратам культуры. Культуры, выделенные с глубины 80 см через 9 и 10 лет, отличались сравнительно меньшим полиморфизмом, каталазной активностью и сохранением вирулентности.

3. При длительном переживании возбудителя туберкулеза в почвах и глубокой несменяемой подстилке происходят изменения морфологических, культуральных, биохимических свойств, сопровождающиеся полиморфизмом, диссоциацией, снижением вирулентности, появлением пигментированных и резистентных к туберкулостатическим препаратам культур.

4. В почвах пастбищ, естественно обсемененных Mycobacterium bovis, они сохраняют жизнеспособность и вирулентные свойства в течение одного года (срок наблюдения). При исследовании проб почвы на предмет об-семенсниости возбудителем туберкулеза биологический метод с использованием морских свинок в 2,3 раза эффективнее метода посева на среду Гельбсрга.

5. Рост Mycobacterium bovis в стерильных почвенных вытяжках подтверждает эпизоотическое значение почвы пастбищных участков в распространении туберкулеза крупного рогатого скота.

Адсорбция Mycobacterium bovis почвами зависит от температуры, рН, влажности и гранулометрического состава почвы. Возбудитель активно адсорбируется в верхних слоях почвы тяжело-суглинистого гранулометрического состава при влажности 50%. Повышение температуры от 20 до 40°С приводит к активизации адсорбции Mycobacterium bovis на твердой поверхности. Наиболее активно они адсорбируются почвенными частицами величиной менее 0,001 мм в кислой среде (рН 5,0).

Жизнеспособность Mycobacterium bovis не утрачивается при крайней степени засоления питательных сред (8-10% хлорида натрия и сернокислого натрия, 2% карбоната кальция и 4 мг-экв на 100 г питательной среды гидрокарбоната натрия), 28-кратном замораживании и оттаивании. В высушенном состоянии в почве они сохраняют вирулентность 3-4 мес. (срок наблюдения).

6. Распространенность атипичных и патогенных микобактерий в почвах пастбищ и в организме крупного рогатого скота находится в зависимости от уровня напряженности эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота. Из почв естественных пастбищ благополучных по туберкулезу хозяйств изолировано 62,5% атипичных и 37,5% не-идентифицированных культур микобактерий. Из почв территорий со значительной заболеваемостью животных туберкулезом изолировано 26,6% культур бычьего вида, 2,0 птичьего видов, 51,0 атипичных и 20,4% неиден-тифицированных микобактерий.

Из биоматериала, реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота благополучных хозяйств, выделено 71,4% атипичных культур микобактерий. Из биоматериала больных туберкулезом животных изолировано 48,9% бычьего, 6,1 птичьего видов, 18,4 атипичных и 26,6% неидентифи-цированных микобактерий.

7. Напряженность эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в определенной мере связана с биогеохимической характеристикой почв территорий. Установлена обратная зависимость между бо-нитетной стоимостью почвенного покрова сельскохозяйственных угодий и распространенностью туберкулеза крупного рогатого скота (г= -0,90), а также индексом эпизоотичности (г= -0,50).

Выявлена корреляция между показателями относительного наличия (%) в земельном фонде сельскохозяйственных угодий комплекса солонцов, солончаков и солонцовых почв и распространенностью туберкулеза (г= 0,82); обратная - между относительным содержанием (%) комплекса черноземов обыкновенных и луговых черноземных почв и распространенностью туберкулеза крупного рогатого скота (г= -0,76). Отмечена зависимость между уровнем содержания в естественных кормах железа, меди, кобальта, бора и распространенностью туберкулеза крупного рогатого скота. В биогеохимических провинциях с содержанием в кормах избытка бора

и недостатка меди, железа, кобальта установлена высокая заболеваемость крупного рогатого скота туберкулезом.

8. Широкая экологическая валентность Mycobacterium bovis в верхнем слое почвы указывает на необходимость искусственной санации почв пастбищ, обсемененных возбудителем туберкулеза. Механическая обработка (дискование, щелевание, глубокое рыхление), посев многолетних трав, орошение и применение жидких минеральных удобрений при окультуривании естественных целинных пастбищ приводит к повышению биологической активности почв, которая зависит от способа окультуривания . Максимальная численность основных групп микроорганизмов наблюдается в улучшенных орошаемых и окультуренных почвах пастбищ с применением жидких минеральных удобрений.

9. В почвах окультуренных пастбищ титр кишечной палочки снижается за летний период на 5-6 порядков и достигает уровня чистой почвы (10"'). На пастбищах, улучшенных механической обработкой и посевом многолетних трав, за летний период титр кишечной палочки в почве снижается на 4-5 порядков и составляет 10_3-10'2.

10.Применение научно обоснованного способа санации пастбищ, обсемененных возбудителем туберкулеза, в комплексе с другими противотуберкулезными мероприятиями повышает эффективность профилактики и оздоровления крупного рогатого скота от туберкулеза. Число неблагополучных пунктов с 1971 по 1997 годы в Новосибирской области снизилось в 2,8 раза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты научных исследований по изучению экологической валентности Mycobacterium bovis и Mycobacterium avium и ее эпизоотологи-ческой роли учтены:

- при разработке проекта Инструкции "О мероприятиях по профилактике и ликвидации туберкулеза животных" (1983);

- при разработке рекомендации "Санация объектов внешней среды, инфицированных микобактериями туберкулеза (утв. подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" Отделения ветеринарной медицины РАСХН, 1997);

- при планировании и проведении мероприятий по профилактике и оздоровлению хозяйств ряда областей Сибири от туберкулеза крупного рогатого скота;

-в учебном процессе сельскохозяйственных вузов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щепилов Н.С., Кисленко В.Н., Львова Г.Ф. Экспериментальные данные по выживаемости микобактерий туберкулеза в глубокой несменяемой подстилке, в условиях Сибири// Профилактика заболеваний с.-х. животных и птиц: Сб.тр./ Новосиб. с.-х. ин-т.-1971.-Т.45.-С.9-12.

2. Кисленко В.Н. О выживаемости микобактерий туберкулеза бычьего типа в почве и на пастбище.// Профилактика заболеваний с.-х. животных и птиц: Сб.тр./Новосиб. с.-х. ин-т.-1971.-Т.45.-С.13-17.

3. Щепилов Н.С., Коган И .Я., Кисленко В.Н., Матросов Н.Д., Щербакова А.Н., Козлов И.Р. Из опыта ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота в Чановском районе Новосибирской области.//Профилактика заболеваний с.-х. животных и птиц: Сб.тр./Новосиб. с.-х. ин-т.-1971.-Т.45,-С.17-21.

4. Кисленко В.Н. Выживаемость микобактерий туберкулеза бычьего типа в почве пастбищ Барабинской низменности: Автореф. дисс. ... канд. вет. наук.-Троицк, 1971.-21 с.

5. Щепилов Н.С., Кисленко В.Н., Львова Г.Ф. К вопросу выживаемости микобактерий туберкулеза в глубокой несменяемой подстилке птиц, больных туберкулезом // Проблемы туберкулеза, 1971.-№ 8.-С.78-81.

6. Кисленко В.Н. Возбудитель туберкулеза на пастбище // Земля Сибирская, Дальневосточная. -1971. -№ 1 .-с. 31.

7. Кисленко В.Н. Некоторые вопросы эпизоотологии туберкулеза крупного рогатого скота в Чановском районе Новосибирской области // Биологические основы повышения продуктивности с.-х. животных в Западной Сибири: Сб.тр./ Новосиб. с.-х. ин-т.-1972.-т.59.-с.83-85.

8. Щепилов Н.С., Кисленко В.Н., Львова Г.Ф. Выживаемость возбудителя //Земля Сибирская, Дальневосточная.-1973.-№4.-С.27-28.

9. Щепилов Н.С., Кисленко В.Н. Выживаемость возбудителя туберкулеза во внешней среде// Сибирский вестн. с/х науки, 1973.-№5.-С.74-79.

10. Эпизоотическая оценка и обеззараживание пастбищ, зараженных возбудителем туберкулеза /Н.С. Щепилов, В.Н.Кисленко, Н.Д. Матросов / Информационный листок № 109-73.-Новосибирск-.Межотраслевой территориальный центр научно-технической информации и пропаганды, 1973.-3 с.

11. Щепилов Н.С., Кисленко В.Н. Выживаемость возбудителя туберкулеза птиц в глубокой несменяемой подстилке и почве птичника// Гигиена и санитария, 1973.-№5.-С.110-111.

12. Щепилов Н.С., Львова Г.Ф., Кисленко В.Н. Некоторые вопросы эпизоотологии и борьбы с туберкулезом сельскохозяйственных животных в Западной Сибири//Ветеринарная профилактика болезней с/х животных в Сибири: Методические рекомендации. -Новосибирск: СО ВАСХНИ Л, 1973 .-С.78-83.

13. Щепилов Н.С., Кисленко В.Н. Проблемы ветеринарной нозогео-графии в Новосибирской области // Сибир. Вест. С.-х. науки, 1975.-№4.-С.48-52.

14. Кисленко В.Н. Некоторые вопросы экологии возбудителя туберкулеза в Новосибирской области // Тр. ин-та/ Новосибирский с.-х. инт, 1975.-Т. 87.-С. 125-128.

15. Щепилов Н.С., Кондюрин Н.Г., Львова Г.Ф., Кисленко В.Н., Письменная С.Г. Выживаемость возбудителя туберкулеза птиц в глубокой несменяемой подстилке и почве птичника// Пути увеличения продуктов животноводства в Западной Сибири: Сб. научн. тр./ Новосибирский с.-х. ин-т, 1975.-С.142-147.

16. Щепилов Н.С., Кисленко В.Н., Львова Г.Ф. Результаты десятилетних экспериментальных исследований по выживаемости возбудителя туберкулеза во внешней среде в условиях Западной Сибири //Тр. ин-та/ Новосибирский с.-х. ин-т,1976.-Т.95.-С.19-24.

17. Кисленко В.Н. Зональные особенности туберкулеза крупного рогатого скота в Новосибирской области. //Тр. ин-та/ Новосибирский с.-х. ин-т, 1976.-Т.95.-С.25-29.

18. Кисленко В.Н. Распространение микобактерий туберкулеза на пастбищах и в скотных дворах, неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота. //Тр. ин-та/ Новосибирский с.-х. ин-т, 1976.-Т.95.-С.30-32.

19. Кисленко В.Н., Чернобай Т.Н. Санитарная оценка пастбищ Новосибирской области //Тр. ин-та/ Новосибирский с.-х. ин-т.-1980,-Т. 134.-С.48-52.

20. Кисленко В.Н._ Санитарная оценка пастбищ Новосибирской области: Отчет о НИР(заключительный)/ Новосибирский с.-х. ин-т № ГР 78002862; Инв.№ Б 921468.-Новосибирск.-1980.-21 с.

21. Кисленко В.Н. Экологические аспекты ветеринарной микробиологии и иммунологии // Ускорение научн.-техн. прогресса в сельском хозяйстве в свете решений 27 съезда КПСС: Тез. докл. науч.-практ. конф. (Новосибирск,19-20 мая 1986 г.).-Новосибирск.-1986.-С.53-54.

22. Кисленко В.Н. Методические аспекты инфекции и иммунитета сельскохозяйственных животных II Философско-методические, социально-экономические проблемы устойчивости сельскохозяйственного производства: Тез. докл. науч.-практ. конф. 22-23 ноября 1989 г./ Новосиб. с-х. ин-т,-1989.-С.40-41.

23. Кисленко В.Н. Роль возбудителя в понимании причинности инфекций // Проблемы науки и производства в условиях аграрной реформы: Тез. докл. научн,'-практ. конф. профессорско-преподавательского состава НГАУ / Новосибирск, апрель. 1993 г. / Новосиб. гос. аграрн. ун-т.-Новосибирск. -1993.-С.227-228.

24. Кисленко В.Н. Методология нозогеографических исследований в ветеринарии II Проблемы АПК в условиях рыночной экономики: Тез. докл. регион, научн.-практич. конф. (Новосибирск, май 1996 г.). Новосибирск.-! 996.-С. 150-151.

25. Кисленко В.Н. К вопросу о патогенности микобактерий // Паразиты и вызываемые ими болезни в Сибири: Тез. докл. 2 науч. конф. Ново-сиб. отд-ния Паразитолог, общ-ва РАН, 15 апреля 1997 г./ Новосибирск.-1997.-С.53.

26. Шкиль H.A., Кисленко В.Н., Мартынова В.В. Особенности эпи-зоотологического процесса туберкулеза крупного рогатого скота в Новосибирской области // Актуальные вопросы ветеринарии: Тез.докл.1-й на-учн.-практич. конф. фак-та вет. мед. НГАУ/ Новосиб. гос. аграрн. ун-т,-Новосибирск.-1997.-С.55-57.

27. Кисленко В.Н. Роль почвы в эпизоотическом процессе туберкулеза крупного рогатого скота. //Актуальные вопросы ветеринарии: Тез.докл.1-й научн.-практич. конф. фак-та вет. мед. НГАУ/ Новосиб. гос. аграрн. ун-т.-Новосибирск.-1997.-С.83-84.

28. Кисленко В.Н. Адсорбция почвой патогенных микобактерий.// Актуальные вопросы ветеринарии: Тез.доклЛ-й лаучн.-практич. конф. фак-та вет. мед. НГАУ/ Новосиб. гос. аграрн. ун-т.-Новосибирск.-1997,-С.93-94.

29. Кисленко В.Н. К вопросу об экологии патогенных микобактерий.// Актуальные вопросы ветеринарии:Тез.докл.1-й научн.-практич. конф. фак-та вет. мед. НГАУ/ Новосиб. гос. аграрн. ун-т.-Новосибирск,-1997.-С.96-97.

30. Кисленко В.Н. Санация объектов внешней среды, инфицированных микобактериями туберкулеза: Рекомендации - Новосибирск /ИЭВСиДВ РАСХН, 1997.-24 с.

31.Основы географической эпизоотологии: Учебное посо-бие/В.Н.Кисленко, Н.А.Шкиль, С..К.Димов, А..А.Колосов, С.А.Юрик/Под редакцией А.С.Донченко/ МСХиП РФ. РАСХН.Сиб. отделение. ИЭВС и ДВ.-Новосибирск, 1997.-84 с.

32. Донченко A.C., ШкильН.А., КисленкоВ.Н. Роль природных факторов в эпизоотическом процессе туберкулеза крупного рогатого скота// Материалы науч.-практ. Российско-Монгольской конференции по проблемам развития АПК Монголии/ РАСХН. Сиб. Отд-ние.-Новосибирск,1998.-С.66-67.