Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Локальный иммунный ответ в ткани легких мышей с высокой и низкой чувствительностью к инфекции, вызванной Mycobacterium avium
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.03.09
Автореферат диссертации по медицине на тему Локальный иммунный ответ в ткани легких мышей с высокой и низкой чувствительностью к инфекции, вызванной Mycobacterium avium
На правах рукописи
004600095
Кондратьева Елена Валерьевна
ЛОКАЛЬНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ В ТКАНИ ЛЕГКИХ МЫШЕЙ С ВЫСОКОЙ И НИЗКОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ MYCOBACTERIUM AVIUM
14.03.09. - Клиническая иммунология, аллергология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
- 1 АПР 2010
МОСКВА-2010
004600095
Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Центральном научно-исследовательском институте Туберкулеза РАМН. Научный руководитель: доктор медицинских наук
Авербах Михаил Михайлович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Ярилин Александр Александрович
доктор медицинских наук, профессор Владимирский Михаил Александрович
Ведущая организация: ФГУН ГИСК им. Л. А. Тарасевича
Защита состоится « 23 » апреля 2010г. в 11 часов на заседании Диссертационного совета ДОО 1.007.01 в НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва, ул. Гамалеи, 18).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.
Автореферат разослан « 22 » марта 2010г.
Ученый секретарь Диссертационного совета д. м. н., профессор
Актуальность темы. Mycobacterium avium — это широко распространенные в окружающей среде микобактерии, которые становятся внутриклеточными патогенами человека в отсутствии нормального Т-клеточного иммунитета [Horsburg, 1991; Inderlied, 1993]. Они выявляются приблизительно у 70% пациентов со сформировавшимся СПИД и считаются главной причиной смерти таких больных [Nightingale, 1992]. На фоне частично ослабленного иммунитета, например, у пожилых людей и детей, М. avium может вызывать хронические заболевания легких [Benson, 1994; Griffith, 1997; Nolt, 2003]. При моделировании инфекции на мышах В6 и производных от нее линий, несущих нокаут-мутации существенных для иммунитета генов, было показано, что Т-клеточный иммунный ответ на М. avium играет как защитную, так и патогенетическую роль. Так, IFN-y, продуцируемый лимфоцитами CD4+, совершенно необходим для защиты от быстрой гибели, но одновременно вызывает дегенеративные процессы в ткани легких и некроз гранулем [Ehlers, 2001]. Аналогично, экспрессия рецепторов к TNF-a необходима для поддержания целостности гранулем, однако процесс некротизации гранулем запускается именно TNF-a [Benini, 1999; Ehlers, 2000]. Баланс между защитным иммунным ответом и патологическими процессами в легочной ткани при этой инфекции во многом напоминает патогенез туберкулеза [Rook, 1996; Schluger, 1998; Benini, 1999]. Иммунные и генетические механизмы, лежащие в основе этого баланса, требуют дальнейшего изучения.
Ранние исследования генетической чувствительности к инфекции, вызванной М. avium, основывались на традиционном сравнении бактериальной нагрузки в органах после внутривенного введения М. avium мышам различных инбредных линий [Appelberg, 1990; Orme, 1986; Stokes, 1986]. Было показано, что чувствительность или устойчивость зависит от носительства резистентного (г) или чувствительного (s) аллеля гена Beg (ранее - Nrampl, по новой номенклатуре - Slcllal.nалее в тексте Nrampl) хромосомы 1. Зависимость чувствительности к инфекции от этого гена была подтверждена на конгенных по Beg линиях мышей и на модели заражения М. avium макрофагов in vitro [de Chastellier, 1993; Nakamura, 1992]. Тем не менее, остается неизвестным, представляет ли собой Nrampl «главный ген», который в основном определяет последствия инфекции, или от него зависит лишь часть фенотипа. Априори, последнее предположение кажется более реалистичным, поскольку контроль инфекции, вызванной M.tuberculosis и другими внутриклеточными паразитами, у мышей носит полигенный характер [Kramnik, 2000; Mitsos, 2000; Roberts, 1997; Roberts, 1999; Sanchez, 2003]. Однако прямой сегрегационный генетический анализ для доказательства или опровержения данной гипотезы пока не проводился. Кроме того, в генетических исследованиях до сих пор не применялась «естественная» модель заражения М. avium через респираторный тракт, хотя иммунологически она хорошо охарактеризована [Ehlers, 2001].
В данной работе мы сравнивали чувствительность нескольких инбредных линий мышей к штамму М. avium 724R. После того, как было
установлено, что мыши I/St устойчивы к инфекции по таким фенотипам как размножение бактерий в органах, степень легочной патологии и продолжительность жизни после заражения, мы провели сегрегационный генетический и сравнительный иммунологический анализ проявлений инфекции, вызванной М. avium, на мышах этой линии и чувствительной к инфекции линии В6.
Цель работы: исследование особенностей иммунного ответа и морфологических изменений в легких при развитии воспалительного процесса у мышей, отличающихся по генетической восприимчивости к Mycobacterium avium, и анализ генетического контроля данной инфекции.
Были поставлены следующие задачи:
• Определить панель инбредных линий мышей с генетическими отличиями по чувствительности к Mycobacterium avium.
• Охарактеризовать динамику размножения Mycobacterium avium в легких и морфологические изменения ткани легких у мышей этих линий.
• Охарактеризовать характер инфильтрации легочной ткани иммунокомпетентными клетками (Т- и В-лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы) при заражении Mycobacterium avium.
• Определить в легочной ткани чувствительных и резистентных мышей профиль экспрессии генов, кодирующих основные цитокины, при ответе на инфекцию.
• Провести генетический анализ возможного сцепления восприимчивости к инфекции с геном Nrampl.
Научная новизна.
• Впервые проанализирована сравнительная динамика патологического процесса, сопровождающего инфекцию М. avium, у чувствительных и резистентных мышей.
• Показано, что у чувствительных мышей В 6 наблюдается быстрое развитие легочной патологии, сопровождаемое массивной инфильтрацией ткани легкого лимфоидными клетками, возникновением очагов деструкции ткани и зон гипоксии, а также усиленной продукцией цитокинов воспаления. Патологический процесс у резистентных животных коренным образом отличается от фатальной патологии чувствительных животных и завершается самоизлечением.
• Впервые установлено, что даже на фоне расщепления множества генов, генетический контроль инфекции, вызванной М. avium, осуществляется преимущественно геном Nrampl, что существенно отличает эту инфекцию от туберкулеза.
Практическая значимость. Хотя работа носит экспериментальный характер и посвящена выяснению фундаментальных механизмов контроля инфекции, вызванной заражением генетически чувствительных и резистентных мышей М. avium, полученные результаты могут оказаться важными для понимания легочной патологии и динамики воспаления у больных с иммунодефицитами, у которых часто развивается такая инфекция. В докладах, сделанных на научно-практических конференциях в ЦНИИТ
РАМН и Московском Центре по борьбе с туберкулезом, была подчеркнута необходимость обращать особое внимание на нейтрофильный компонент воспаления в клинических анализах. Это может помочь принятию решений по назначению местной или системной противовоспалительной терапии. Важное практическое значение имеют результаты, показывающие, что картина патологии, сходная с той, что возникает у больных, развивается у животных генетически чувствительных к конкретной микобактериальной инфекции, но не у резистентных мышей. Этот вывод диктует необходимость учитывать генетику хозяина и обращать внимание на правильный выбор объекта при разработке экспериментальных моделей заболеваний человека.
Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов, ординаторов и слушателей курсов по повышению квалификации ЦНИИТ РАМН.
Положения, выносимые на защиту.
1. Неблагоприятное течение заболевания, вызванного Mycobacterium avium, сопровождается характерным типом инфильтрации легочной ткани: массивным притоком нейтрофилов, образованием В-клеточных фолликулов и ранним транзиторным пиком общего лейкоцитарного воспаления.
2. Как при туберкулезе, так и при заболевании, вызванном Mycobacterium avium, у высоко чувствительных, но не у резистентных, мышей образуются некротические гранулемы легких, окруженные областями гипоксии.
3. Генетический контроль восприимчивости хозяина к Mycobacterium avium существенно отличается от контроля инфекции, вызываемой М. tuberculosis, и в большой степени определяется геном Nrampl.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 10 декабря 2009 года на научной конференции отдела иммунологии ЦНИИТ РАМН. Основные положения диссертации были доложены на IX Всероссийском Форуме «Дни Иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2006, 2009.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 4 в рекомендованных ВАК РФ журналах.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 73 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, 15 рисунков и 1 таблицу, заключение, выводы и список цитируемой литературы, состоящий из 145 ссылок.
Материалы и методы Экспериментальные животные
В работе были использованы самки линий A/SnEgYCit (A/Sn), BALB/cJCit (BALB/c), C3H/SnYCit (C3H), I/StSnEgYCit (I/St), C57BL/6YCit
(В6), и гибриды (I/St X B6)F1 и F2 весом 20-25 г, в возрасте 3-4 месяца. Линии поддерживаются братско-сестринскими скрещиваниями в питомнике Центрального НИИ туберкулеза РАМН в обычных условиях, с доступом к корму и воде ad libitum.
Микобактерии
В работе использовали Mycobacterium avium штамм 724R, описанный J. Pedrosa [Pedrosa, 1994]. Микобактерии культивировали в жидкой среде Дюбо (Dubos broth, Difco, США), содержащей 0,5% БСА и олеиновую кислоту в течение двух недель, а затем замораживали при -70°С для дальнейшего хранения. В экспериментах были использованы две дозы микобактерий: 105/мышь для внутритрахеального заражения и 2 х 103/мышь для аэрозольного заражения.
Заражение животных
Подопытных животных заражали внутритрахеально в дозе 0,5 х Ю6КОЕ в 50 мкл/мышь в физиологическом растворе либо аэрозольно в дозе 2 х 103 КОЕ/мышь.
Определение количества микобактерий в органах
На разные сроки после заражения определяли количество микобактерий в органах. Для этого стерильно выделяли легкие и селезенки зараженных животных, гомогенизировали, готовили серийные десятикратные разведения гомогенатов органов и высевали на чашки Петри с агаром Дюбо (Difco). Через 21 день подсчитывали количество макроколоний М. avium на чашке и пересчитывали их количество на орган (КОЕ/орган).
Получение суспензии клеток легкого
Использовали модифицированную методику Holt и соавт. [Holt et al., 1985]. Легочную ткань измельчали ножницами и переваривали в присутствии ферментов: коллагеназы (150 ед/мл, Sigma) и ДНКазы (50 ед/мл, Sigma). После окончания периода ферментативного расщепления суспензию клеток тщательно пипетировали и отмывали.
Проточная цитофлуориметрия
Для характеристики иммунного ответа исследовали субпопуляции клеток легкого в динамике через 3, 8 и 16 недель после аэрозольного заражения. Исследуемые клетки инкубировали с меченными моноклональными антителами (Pharmingen) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя. Анализ клеток проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Beckton Dickinson, San Diego, CA). Полученные данные обрабатывали с помощью программ BD-CellQuestPro (Beckton Dickinson) и FlowJo 4.5.9 (Tree Star, Inc., San Carlos, CA).
Гистологические исследования
Для исследования динамики патологических изменений в легких подопытных мышей, ткань замораживали в режиме температурного градиента от -60°С до -20°С в течение 1часа в электронном криотоме
(ThermoShandon, Великобритания). Получали срезы толщиной 8 мкм. Срезы высушивали на воздухе, фиксировали в метаноле и окрашивали гематоксилином и эозином.
Иммуногистохимическин анализ
Часть срезов окрашивали мечеными моноклональными антителами к поверхностным маркерам CD4, CD8, CD 19, Ly6G и МасЗ. Иммуногистохимическую окраску препаратов проводили согласно рекомендации фирмы-производителя.
Для визуализации структуры легочной ткани препараты докрашивали гематоксилином, после чего срезы заключали в HyperMount под покровные стекла.
Определение продукции цитокинов
Продукцию цитокинов определяли методом ELISA в супернатантах гомогенатов легких мышей, зараженных М. avium. Содержание цитокинов в образцах определяли методом ELISA с помощью наборов OptEIA Set (PharMingen) для IL-6, IL-10, IL-12, IFN-y и TNF-a в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя.
Результаты оценивали, определяя оптическую плотность с помощью прибора EIA Multiwell Reader (Sigma). Для построения калибровочной кривой титровали рекомбинантные факторы в известных концентрациях.
Определение экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени
Суммарную РНК из легкого вьщеляли с помощью коммерческого набора SV Total RNA Isolation System (Promega). Для получения кДНК проводили обратную трнскрипцию 2 мкг тотальной ДНК с помощью обратной транскриптазы M-MLV (Promega, США). Для того, чтобы обратная транскрипция проходила только с мРНК, в качестве праймеров использовали oligo(dT)15. С помощью полуколичественного метода ПЦР в реальном времени (TaqMan с использованием зондов, несущих двойную метку) оценивали транскрипцию генов цитокинов, хемокинов и транскриптационных факторов в популяциях клеток легкого, для чего использовали различные праймеры (ABI) 2xPCR Master Mix Probe Assay (EGT Group). Уровень экспрессии сравнивали с экспрессией housekeeping-генов с постоянным уровнем экспрессии - GAPDH и актина. Анализ проводили на приборе iCycler (Bio-Rad).
Выявление гипоксии в ткани легкого
Для выявления гипоксии в ткани легких мышей I/St и В6 использовали иммуногистохимический метод с Hypoxyprobe™-1 Plus Kit (Chemicon int. Cat. No. HP2-100). Для этого мышам вводили внутрибрюшинно препарат Hypoxyprobe™-1 (Pimonidazole Hydrohloride). Через 40 мин. извлекали легкие, замораживали их в криотоме и готовили срезы толщиной 6-8 мкм, которые помещали на стекла, обработанные поли^-лизином. Срезы хранили в морозильной камере при -20° С. Окраску препаратов проводили в
соответствии с рекомендациями фирмы-производителя и заключали в HyperMount под покровные стекла.
Определение аллелей гена Nrampl
ДНК из хвостов мышей выделяли с помощью набора Wizard Genomic DNA Purification Kit фирмы Promega (США) по протоколу фирмы-производителя.
Для полимеразной цепной реакции использовали Native Pfu Polimerase фирмы Stratagene (США) по протоколу фирмы-производителя.. Праймеры для фрагмента гена Nrampl: прямой- 5'CCCCACCCCCATCTATGTTATCA3\ обратный- 5' CCCTGCCTACTTTTATCCCCCAA 3'. ПЦР-продукты гидролизовали рестриктазой BsmF I (New England Biolabs, США), распознающей сайт мутации G169D. Продукты гидролиза разделяли путем электрофореза в 4% агарозном геле в буфере ТАЕ.
Статистическая обработка результатов.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью метода Стьюдента (t-тест). Достоверными считали различия при р<0,05. Полученные данные обрабатывали с помощью программы БИОСТАТ (Практика, Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Определение восприимчивости к заражению М. avium мышей инбредных линий
Ранее в нашей лаборатории было показано, что мыши I/St чрезвычайно чувствительны к М. tuberculosis [Nikonenko et al., 2000; Eruslanov et al., 2004; Radaeva et al., 2005]. Чувствительность не зависит от гена Nrampl (мыши I/St несут аллель резистентности Nrampl' [Lavebratt, 1999]) и контролируется несколькими взаимодействующими QTL, локализованных в хромосомах 3, 9, 17 и X [Lavebratt et al., 1999; Sanchez et al., 2003]. Мыши I/St также оказались восприимчивы к вирулентным штаммам Chlamydia pneumoniae и Salmonella enterica Typhimurium [Nesterenko et al., 2006]. Было разумно предположить, что линия I/St представляет интересный пример А/гатр/-независимой чувствительности к широкому спектру внутриклеточных инфекций. Ранее уровень восприимчивости этой линии мышей к М. avium не исследовался.
В первой серии экспериментов мышей различных инбредных линий -В6 (Nrampl*), BALB/c (Nrampl'), СЗН (Nrampl'), A/Sn (Nrampl'), и I/St (Nrampl') - заразили внутривенно M. avium в дозе 107 КОЕ. Количество бактерий в легких оценивали через 3 и 8 недель после заражения. Различия в количестве микобактерий между линиями Nrampls и Nrampl' составляли от 1,5 до 2 порядков (данные не приводятся). К нашему удивлению, мыши I/St, чувствительные и к М. tuberculosis, и к таксономически отдаленным внутриклеточным бактериям, оказались резистентны к заражению М avium.
Для подробного анализа причин этого неожиданного ответа на инфекцию на следующем этапе мы оценили степень чувствительности при заражении через респираторный тракт, чтобы воспроизвести «естественный» способ заражения этим агентом. Мышей заражали микобактериями либо внутритрахеально (Рис. 1А), либо аэрогенным путем (Рис. 1В). Оказалось, что при заражении через респираторный тракт характер генетической восприимчивости не меняется, а различия по количеству М. avium в легких мышей В6 и I/St достигают 4 порядков на поздних стадиях заболевания.
недели после заражения недели после заражения
Рис. 1. Количество колониеобразующих единиц Mycobacterium avium в легком через 3, 8 и 16 недель после внутритрахеального (A, 105 КОЕ на мышь) н аэрозольного (В, 2 х 103 КОЕ на мышь) заражения.
На модели аэрозольного заражения было проведено сравнение двух линий мышей по выживаемости и оказалось, что чувствительный и резистентный фенотипы мышей В6 и I/St воспроизводятся и по этому параметру: через 7 месяцев после заражения М. avium все мыши линии В6 пали, тогда как все мыши I/St были живы до 11-го месяца (время прекращения эксперимента).
Таким образом, мыши I/St эффективно сопротивляются заболеванию, вызванному введением М. avium, что разительным образом контрастирует с их чувствительностью к заражению М. tuberculosis и другими видами внутриклеточных бактерий.
Характер легочной патологии определяется чувствительностью к
инфекции
Заражение мышей М. avium используют для моделирования патологического процесса, наблюдаемого у человека при туберкулезе, при этом часто не принимая во внимание генетические особенности хозяина [Benini, 1999, Ehlers, 2001]. В этой связи, мы решили выяснить, насколько различия в скорости размножения микобактерий в легких и продолжительности жизни мышей находят отражение в патологических
изменениях в легких. К 8-й неделе после заражения в легких мышей Вб наблюдалось большое количество гранулем различного размера, инфильтрация перибронхиальных и периваскулярных зон, а также сильная гиперемия и существенное утолщение межальвеолярных перегородок (Рис. 2А). Гранулемы состояли из макрофагов и эпителиоидных клеток, окруженных лимфоцитами.
А. В.
Рис. 2. Патологические изменения в легких мышей В6 (А) и инфильтрация альвеолярных перегородок в легких мышей I/St (В) через 8 недель после аэрогенного заражения М. avium. Окраска гематоксилин-эозин (х 150).
Тяжесть легочной патологии у мышей I/St была существенно ниже: мы наблюдали лишь умеренную инфильтрацию и утолщение межальвеолярных перегородок при отсутствии отграниченных очагов воспаления (Рис. 2В).
К 16-й неделе после заражения между мышами В6 и I/St нарастали. У мышей В6 наблюдались тяжелые патологические изменения - выраженный ателектаз, гиперемия, отек и формирование очагов некроза. Были выявлены многочисленные диффузные и компактные клеточные инфильтраты, а также крупные очаги, представленные центральной зоной некроза, окруженной хорошо просматриваемым кольцом из гибнущих нейтрофилов, отграниченных от остающейся функционирующей дыхательной ткани широким слоем мононуклеаров (Рис. 3). Наблюдаемая картина полностью согласуется с результатами Ehlers и соавт. [Ehlers, 2001], полученными при аэрогеном заражении мышей В6 более высокой дозой М. avium 724. Напротив, патологические изменения у мышей I/St были выражены в гораздо меньшей степени и представляли собой небольшие или среднего размера гранулемы, содержащие в центральной зоне живые макрофаги и эпителиоидные клетки, при отсутствии признаков некроза ткани (Рис. 4А). Более того, у этих мышей происходила постепенное рассасывание легочной патологии на поздние сроки после заражения (Рис. 4В), несмотря на то, что культивируемые, то есть не латентные, микобактерии полностью не выводились (~105 КОЕ на легкое).
Различия в интенсивности развития легочной патологии отражаются и на таком показателе как вес легких. Через 8 и 16 недель после заражения hi. avium средний вес легких мышей В6 в несколько раз выше, чем у мышей I/St (Рис. 4С), что свидетельствует о сильном отеке ткани.
Принято считать, что индуцированные М. tuberculosis казеозные гранулемы в легких больных содержат пониженное количество кислорода, и что выживание М. tuberculosis в этих зонах обусловлено альтернативными путями окисления [Tsai, 2006; Aly, 2006]. Различия в степени развития гипоксии в легочной ткани между человеком и мышью при туберкулезе долгое время считалось принципиальным и послужило основой для серьезной критики моделирования туберкулеза на мышах. Tsai и соавторы и Aly и соавторы [Tsai, 2006; Aly, 2006] не обнаружили зон гипоксии в легких зараженных М. tuberculosis мышей В6. Напротив, хроническое заражение мышей В6 М. avium приводило к формированию образований, в которых кольцо гипоксии окружало некротизированный центр гранулемы. [Ehlers,
Рис. 3. Легкие мышей В6 на 16 неделе после заражения М. avium. Показана центральная зона некроза (зеленая стрелка), ограниченная валами гибнущих нейтрофилов (красная стрелка) и мононуклеаров (желтая стрелка) от функционирующих альвеол.
неделя после заражения
Рис. 4. Легкие мышей I/St через 16 недель (А) и 11 месяцев после заражения (В) и изменение веса легких (мг) мышей I/St и В6 (С).
2001]. Убедившись в принципиально разном характере патологического процесса у генетически резистентных и чувствительных мышей, мы решили оценить степень развития гипоксии у животных двух линий. А Б
?fv
......
« 'Л ,
-i .■:■: ■ -. j'. j; ,■;• v ч
Рисунок 5. Легкие мышей линии I/St (А) и В6 (Б) через 16 недель после инфицирования М. avium. Многочисленные обширные зоны гипоксии у мышей В6, окрашенные Hypoxiprobe обозначены стрелками.
Многочисленные обширные зоны гипоксии были обнаружены в легких мышей В6 при практически полном отсутствии гипоксии в легких мышей I/St. К 16 неделе у мышей В6 наблюдаются крупные и мелкие очаги деструкции, ткань легких находится в состоянии выраженной гипоксии (рис. 5Б). У резистентной линии явления гипоксии незначительны и специфический гранулематозный процесс течет более благоприятно (рис. 5А). Важно отметить, что заражение мышей этих же линий М. tuberculosis приводит к прямо противоположной картине: формированию некротических гранулем с гипоксией у мышей I/St [Radaeva, 2008]. Таким образом, оказалось, что точность моделирования патологического процесса в первую очередь зависит от того, на какой линии животных проводятся эксперименты - генетически чувствительной или резистентной. Сопоставление патологии между генетически чувствительными людьми (другие не заболевают микобактериальными инфекциями) и резистентными мышами представляется некорректным. Эти вопросы были подробно рассмотрены в недавнем обзоре [Apt, 2009], авторы которого подчеркнули важность генетики хозяина для корректного планирования экспериментальных моделей различных типов патологии.
Наши результаты перекликаются с данными, полученных Florido и Appelberg, которые наблюдали формирование некротических гранулем у мышей В6, но не у мышей линий BALB/c и DBA/1, несмотря на одинаковую скорость размножения М. avium в легких этих мышей [Florido, 2006].
Клеточная инфильтрация и архитектура патологии легких
Для изучения динамики воспалительного процесса в легких мы провели цитологический анализ переваренной ферментами ткани легкого на
различных стадиях заболевания, определив динамику инфильтрации ткани легкого лимфоидными клетками методами проточной цитофлуориметрии и иммуногистохимии. К 8-й неделе после заражения М. avium количество Т-клеток CD4+ и CD8+, В-клеток CD19+ (Рис. 6), а также макрофагов F4/80+ и нейтрофилов Ly-6G+ (Рис. 7) в легких мышей В6 увеличилось в 5-20 раз, что свидетельствует о быстром развитии воспалительного процесса в легких.
A: CD4
20
СП
J 15
£.10 (Л
I 5 * О
B.-CD8
С: CD19
3wk 8wk 16wk
3wk 8wk 16 wk
8wk 16wk
Рис. 6. Динамика инфильтрации ткани легкого мышей Вб (квалраты) и I/St (треугольники) лимфоцитами после заражения М. avium. Приведены средние значения для групп (млн/орган ± SD).
D: Ly-6G
Е: F4/80
3wk 8wk 16 wk
Рис. 7, Динамика инфильтрации ткани легкого мышей В6 (квадраты) и I/St (треугольники) нейтрофилами (D) и макрофагами (Е) после заражения М. avium.
К 16-й неделе после заражения количество В- и Т-лимфоцитов в легких мышей В6 резко падало, в то время как продолжалась массивная инфильтрация макрофагами и нейтрофилами. Напротив, у резистентных мышей I/St наблюдалось очень медленное нарастание инфильтрации ткани легкого всеми типами лимфоцитов и макрофагами, при очень слабом нейтрофильном компоненте воспаления.
Рис. 8. Инфильтрация легочной ткани лимфоцитами через 8 недель после заражения мышей В6 (левая колонка) и I/St (правая колонка). А, В - Т-клетки CD4+; С, D - Т-клетки CD8+; Е, F - В-клетки CD19+. Пероксидаза, увеличение х 150.
Весьма серьезные различия между резистентными и чувствительными мышами были выявлены при исследовании клеточной архитектуры ткани легкого. Для легких мышей В6 на 8-ю неделю после заражения была характерна интенсивная инфильтрация гранулем и межальвеолярных перегородок клетками CD4+ и, в несколько меньшей степени, CD8+ (Рис. 8 А, С). Наряду с этим, наблюдалось формирование В-лимфоцитами CD19+ крупных скоплений по типу фолликулов (Рис. 8Е). В легких мышей I/St на 8-ю неделю после заражения отмечалась незначительная инфильтрация зачаточных гранулем Т-лимфоцитами CD4+ и CD8+ (Рис. 8, B,D) и В-лимфоцитами CD19+ (Рис. 8F).
Рис. 9. Инфильтрация легочной ткани лимфоцитами через 16 недель после заражения мышей Вб (левая колонка) и I/St (правая колонка). А, В - Т-клетки CD4+; С, D - Т-клетки CD8+; Е, F - В-клетки CD19+. Пероксидаза, увеличение х 150.
Через 16 недель после заражения межлинейные различия становились еще заметнее. В легких мышей Вб Т-лимфоциты CD4+ и CD8+ располагались в валах клеток, окружающих очаги некроза (Рис. 9А, С), а также, в небольшом количестве, в гранулемах. В легких мышей линии I/St Т-лимфоциты обоих классов располагались в некрупных сформированных гранулемах, а также периваскулярно и перибронхиально (Рис. 9 В, D). В легких мышей Вб В-лимфоциты CD19+ образовали крупные и плотные клеточные скопления по типу фолликулов, а у мышей I/St они продолжали сохранять диффузное расположение. В целом, картина соответствует интенсивному Т-клеточному ответу у мышей резистентной линии, который
захватывает практически всю легочную ткань и не встречает препятствий в виде крупных изолированных некротических образований.
Еще значительнее выглядят различия между резистентными и чувствительными мышами по характеру инфильтрации легочной ткани нейтрофилами.
Рис. 10. Расположение нейтрофилов в легочной ткани у зараженных мышей В6 (А) и I/St (В). Антитела анти-Ly-öG, пероксидаза, х 150.
В то время как у мышей В6 нейтрофилы располагались преимущественно в областях некроза в центрах гранулем и в зонах слитого массивного воспаления (Рис. 10А), у мышей I/St они располагались диффузно, в перегородках альвеол, и не становились компонентом некроза (Рис. 10В).
Важно отметить, что в отличие от воспалительного процесса, вызванного заражением М. tuberculosis [Eruslanov, 2005], заражение мышей I/St М. avium не ведет к массированному притоку нейтрофилов в легкие в течение всего периода наблюдения. Отсутствие некроза и невысокий приток нейтрофилов в легкие являются признаками эффективного контроля микобактериальных инфекций резистентным хозяином, как было ранее показано для М. tuberculosis [Eruslanov, 2005; Pan, 2005] и в данной работе для М. avium. Кроме того, при туберкулезе у мышей наблюдается характерная патология легочной ткани в виде богатых В-клетками фолликулов [Yan, 2006; Tsai,2006], лишь недавно описанная для больных с развитым туберкулезным процессом [Ulrichs, 2004]. В нашем случае такие фолликулы образуются у восприимчивых к М. avium мышей В6 и отсутствуют у резистентных мышей I/St.
Продукция цитокинов в легких
Принято считать, что при микобактериальных инфекциях от уровня цитокинов, локально продуцируемых клетками иммунной системы, зависит уровень протекции и/или иммунной патологии легких; это касается и М. avium [Ehlers,2001], и М. tuberculosis [North,2004]. В этой связи, мы провели сравнение между мышами двух линий по способности продуцировать
ключевые эффекторные и регуляторные цитокины в легких вскоре после заражения (3-я неделя) и на фоне прогрессирующего воспалительного процесса (8-я неделя), используя для анализа гомогенаты цельных органов.
Таблица 1. Продукция цитокинов в легких резистентных мышей I/St и чувствительных мышей В6 через 3 и 8 недель после заражения М. avium"
Цитокин (пкг/мл) 3 недели 8 недель
B6 I/St В6 I/St
IFN-y 1688± 162" 25± 4 2541 ±275" 38 ±6
TNF-a 432 4 58" <31* 793 ± 114" 51 ±20
IL-12 6481 ±550" 278 ±31 >12,000"" 1105 ±528
IL-6 128 ±22" <16' <16' <16'
"Мышей заражали в дозе 2 х 103 КОЕ/мышь. Через 3 и 8 недель после заражения легкие гомогенизировали в 2 мл стерильного физиологического раствора. Гомогенаты центрифугировали для осаждения клеточных остатков и измеряли содержание цитокинов методом ELISA. В таблице представлены среднее ± SD. Данные для IL-10 не приводятся, т. к цифры ниже чувствительности метода.
Ь-Р< 0,001
* - ниже чувствительности метода
** - выше чувствительности метода-титрование не закончено.
Как показано в Таблице 1, в легких мышей В6, по сравнению с мышами I/St, уже через 3 недели после заражения существенно повышены уровни IFN-y, TNF-a IL-6 и IL-12. На этой стадии заболевания количество микобактерий в легких, размер органов и их клеточное содержание у мышей В6 и I/St одинаково (см. выше), поэтому скорее всего здесь наблюдаются генетические различия в продукции провоспалительных цитокинов в ответ на стимуляцию М avium. Этот вывод представляется важным, поскольку различия в уровне цитокинов способны оказывать существенное влияние на прогрессирование легочной патологим. В то время как продукция цитокинов IL-12 - IFN-y необходима для формирования протективного иммунитета [Appelberg, 2006; Florido, 2006; Florido, 2004], ранняя гиперпродукция этих медиаторов в легких мышей В6, по всей вероятности, ведет к избыточной воспалительной реакции в легких, а может быть и к некрозу, что полностью согласуется с результатами и концепцией Ehlers и соавторов [Ehlers, 2001]. Через 8 нед. после заражения межлинейные различия в содержании цитокинов могут зависеть и от различий в содержании клеток-продуцентов на орган, и от антигенной стимуляции, поскольку оба показателя достигают существенных различий у мышей двух линий.
Регуляция миграции нейтрофилов: экспрессия генов хемокинов
Как было показано выше, у чувствительных мышей В6 ярко выражен нейтрофильный компонент воспаления легочной ткани в ответ на инфекцию и массивное скопление нейтрофилов в очагах некроза. В этой связи было интересно выяснить, как эта реакция регулируется у чувствительных и резистентных мышей на уровне экспрессии генов, кодирующих факторы миграции нейтрофилов, непосредственно в легочной ткани. Мы провели сравнительный анализ уровней мРНК в легких мышей В6 и I/St для трех важнейших регуляторов нейтрофилов: G-CSF, MIP-2 и КС, а также рецептора Xcrl, одного из основный рецепторов хемокинов группы CXCL1, экспрессированном на нейтрофилах.
Результаты этих экспериментов суммированы на Рис. 11. У чувствительных мышей линии В6 к 8-й неделе после заражения, во-первых, было обнаружено резкое нарастание экспрессии генов, кодирующих фактор размножения нейтрофилов G-CSF и рецептор для хемокинов Xcrl, по сравнению с незараженным контролем. Во-вторых, у этих мышей постепенно нарастал уровень экспрессии генов, кодирующих главные аттрактанты нейтрофилов - MIP-2 и КС, который к 13-й неделе повышался до 3-кратного.
А: В6
В: I/St
О 3 I 13
неделя после заражения
о з а 13 неделя после заражения
Рис. 11. Динамика экспрессии в легочной ткани генов, кодирующих факторы размножения и миграции нейтрофилов. Каждая точка соответствует измерению методом количественной ПЦР в реальном времени количества мРНК в легких трех мышей (смешанный гомогенат) в двух независимых экспериментах.
Напротив, у мышей 1/81 уровень экспрессии исследуемых генов повышался незначительно и только на ранней фазе инфекции, в ответ на первичный стимул, а затем быстро возвращался к норме. Эта картина вполне
совместима с морфологическими и цитологическими данными (см. выше), и показывает, что эффективная защитная реакция на инфекцию обеспечивается подавлением экспрессии генов, стимулирующих нейтрофильное воспаление. Если же такой контроль нарушен, развивается неконтролируемое воспаление, приводящее к гибели организма-хозяина.
Nrampl - основной ген, определяющий чувствительность к М.
avium
Несмотря на то, что мыши I/St несут аллель резистентности Nrampl', они очень восприимчивы к заражению тремя различными видами внутриклеточных бактерий, чье взаимодействие с организмом хозяина (мыши) находится под полигенным контролем [Lavebratt et al., 1999; Nesterenko, 2006]. С другой стороны, давно показано, что ген Nrampl играет важную роль в контроле микобактерий, менее вирулентных, чем М tuberculosis [Vidal, 1995]. Чтобы понять, насколько велик вклад этого гена в контроль заболевания, вызванного М. avium, мы провели сегрегационный генетическии анализ на мышах (В6* х I/Str/r)F2, определяя полиморфизм продукта Nrampl (генотип) методом ПЦР и псдсчитывая КОЕ в легких через 10 недель после заражения (фенотип). Мы предполагали, что расщепление многочисленных генетических локусов, участвующих в регуляции инфекции, даст континуум фенотипов без очевидного сцепления с аллелями Nrampl, по крайней мере, в небольших выборках.
Р<0.05_
РО 05
NS
s.'s ris
Генотип Slc11a1
s/s r/s r/r
Рис. 12. Чувствительность к инфекции, вызванной М. avium, регулируется геном Nrampl. Было проведено типирование зараженных мышей (I/St х В6) F2 по аллелям г и s гена Nrampl. Через 10 недель после заражения подсчитывали КОЕ в легком. Достоверность различий между группами s/s и г/~ указана на рисунке.
К нашему удивлению, мы получили достаточно простую картину расщепления у мышей F2: у животных с генотипом Nramplss количество КОЕ в легких было достоверно (от Р<0,01 до Р<0,05) выше (Рис. 15). Чувствительность к заражению М avium наследовалась как единичный
рецессивный менделирующий признак (j£2=l,39; и'=2). Не было выявлено различий между группами резистентных мышей, имевших генотип Nrampí/r или Nrampí/S, что подтверждает доминантную природу аллеля г [Skamene, 1982]. Значительный разброс показателей в обеих резистентных группах позволяет предположить, что «резистентность» регулируется более сложно чем «чувствительность», и другие локусы способны модулировать действие Nramp I.
Продукт этого гена представляет собой насос, выкачивающий из эндосом железо и, вероятно, другие двухвалентные катионы [Forbes, 2001; Kuhn, 2001]. Соответственно, можно предположить, что различия между инфекциями, вызванными М. avium и М. tuberculosis, заключаются в разной зависимости их метаболизма внутри эндосом от наличия двухвалентных катионов.
Таким образом, в результате проведенных исследований были выявлены две оппозитные по чувствительности к заражению М. avium линии мышей: чувствительная В6 и резистентная I/St. Было показано, что чувствительность или резистентность животных не зависит от способа заражения -внутривенного, интратрахеального или аэрогенного. При аэрогенном способе заражения чувствительные мыши В6 погибали уже через 7 месяцев после заражения, в то время как резистентные мыши I/St жили свыше 11 месяцев. Диссеминация М. avium в селезенку отмечалась уже через 3 недели после заражения, и к 16-й неделе различия высеваемости микобактерий из легких между линиями достигали 4 порядков. Агрессивное течение инфекции у чувствительных мышей В6 характеризовалось быстрым развитием легочной патологии на фоне усиленной инфильтрации ткани легкого клетками иммунной системы и повышения продукции провоспалительных цитокинов IFN-y, TNF-a, IL-6 и IL-12. Патологические изменения ткани легкого чувствительной линии мышей В6 заключались в выраженной очаговой инфильтрации паренхимы нейтрофилами и возникновении очагов деструкции ткани, окруженных зонами гипоксии. В итоге, в нашей экспериментальной модели наблюдалась отчетливая корреляция двух параметров чувствительности к заражению: более быстрый рост М. avium в легких и большая выраженность легочной патологии у мышей чувствительной линии В6 по сравнению с резистентными мышами I/St. Наряду с этим, нами было показано, что в легких чувствительных мышей В6 на периферии очагов некроза и в перибронхиальных областях образуются В-клеточные фолликулы - своеобразная структура, не развивающаяся у резистентных животных. Важно отметить, что в отличие от воспалительного процесса, вызванного заражением М tuberculosis [Eruslanov, 2005], заражение мышей I/St М. avium не ведет к массированному притоку нейтрофилов в легкие в течение всего периода наблюдения. Похоже, что отсутствие некроза и невысокий приток нейтрофилов в легкие являются признаками эффективного контроля микобактериальных инфекций резистентным хозяином, как было ранее показано для М. tuberculosis
[Eruslanov, 2005; Pan, 2005] и в данной работе для М. avium. При этом, генетический контроль инфекции, вызванной М. avium, осуществляется в первую очередь геном Nrampl, что существенно отличает эту инфекцию от туберкулеза, который контролируется полигенно.
Выводы
1. Мыши чувствительной к М. avium линии В6 достоверно быстрее погибают после заражения и не контролируют размножение М. avium в легких в отличие от мышей резистентной линии I/St..
2. У чувствительных мышей быстро развивается легочная патология, сопровождающаяся обильной инфильтрацией ткани легкого клетками иммунной системы и усиленной продукцией цитокинов воспаления IFN-y, TNF-a, IL-6 и IL-12.
3. Патологические изменения ткани легкого чувствительной линии мышей характеризуются выраженной очаговой и диффузной инфильтрацией паренхимы нейтрофилами и появлением обширных зон гипоксии, предшествующих возникновению некротических очагов.
4. В легких чувствительных мышей на периферии очагов некроза и в перибронхиальных областях образуются B-клеточные фолликулы -своеобразная структура, не развивающаяся у резистентных животных.
5. Генетический контроль инфекции, вызванной М. avium, во многом определяется аллельными вариантами гена Nrampl (Sic Hal),' что существенно отличает эту инфекцию от туберкулеза, который контролируется полигенно. Линии мышей в В6 и I/St представляют уникальный инструмент для анализа, демонстрируя зеркальную генетическую чувствительность к М. avium и М. tuberculosis и зеркальное развитие легочной патологии на фоне разного генетического контроля двух инфекций.
Список печатных работ по теме диссертации:
1. Нестеренко JI.H., Балунец Д.В., Романова Ю.М., Аляпкина Ю.С., Зигангирова H.A., Капина М.А., Кондратьева Е.В., Майоров К.Б., Пичугин A.B., Апт A.C. Восприимчивость NRAMP1r мышей инбредной линии I/St к инфекциям, вызываемым таксономически не родственными видами бактерий с внутриклеточным типом паразитизма (Mycobacterium tuberculosis, Salmonella typhimurium и Chlamydia pneumoniae) II Материалы X Всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, Россия. Медицинская иммунология. -2006.-№2-3 .-стр. 161-162.
2. Авербах М.М., Кондратьева Е.В., Мищенко В.В. Морфологическая характеристика хронического гранулематозного воспаления в ткани легких инбредных мышей, вызванного M.avium/I Материалы X Всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-
Петербурге», Санкт-Петербург, Россия. Медицинская иммунология-2006.-№2-3.-стр.113-114.
3. Кондратьева Е.В., Мищенко В.В., Пичугин А.В., Авербах М.М. Иммунный ответ в легких мышей генетически чувствительных и резистентных к заражению M.aviumll Материалы X Всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», Санкт-Петербург, Россия. Медицинская иммунология.-2006.-№2-3.-стрЛ46-147.
4. Кондратьева Е.В., Мищенко В.В., Авербах М.М. Морфологическая характеристика инфекционного процесса, вызванного M.avium на инбредных мышах.//Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких.-Москва.-2006. 54-55.
5. Кондратьева Е.В., Мищенко В.В., Пичугин А.В., Авербах М.М. Иммунный ответ в легких мышей генетически чувствительных и резистентных к заражению Mycobacterium avium.// Актуальные проблемы туберкулеза и болезней легких.-Москва.-2006.-55-57.
6. L. N. Nesterenko, D. V. Balunets, A. S. Tomova, J. M. Romanova, J. S. Alyapkina, N. A. Zigangirova, M.A. Kapina, E.V. Kondratieva, A.V. Pichugin, K.B. Majorov and A.S. Apt. Mycobacterium Tuberculosis-susceptible I/St mice develop severe disiese following infection with taxonomically distant bacteria, Salmonella enterica and Chlamidia pneumoniael/Clinical and Experimental Immunology.-2006.-l46:93-100.
7. E. V. Kondratieva, V. V. Evstifeev, Т.К. Kondratieva, S. N. Petrovskaya, A. V. Pichugin, E. I. Rubakova M. M. Averbakh, Jr., and A. S. Apt. I/St Mice Hypersusteptible to Mycobacterium tuberculosis Are resistant to M. avium!I Infection and Immunity.-0ct.2007, p.4762-4768.
8. Mischenko V.V., Kapina M.A., Eruslanov E.B., Kondratieva E.V., Lyadova I.V., Young D.B., Apt A.S. Mycobacterial dissemination and cellular responses after 1-Iobe restricted tuberculosis infection of genetically susceptible and resistant mic ell J. Infect Dis.-Dec. 15; 2004, l90(12):2I37-2145.
9. М.М. Авербах, E.B. Кондратьева, A.C. Апт. Иммуноморфологическая характеристика экспериментального грануломатозного воспаления, вызванного Mycobacterium avium. Туберкулез и болезни легких. 2009. №8, с.38-41.
/0.М.М. Авербах, Е.В. Кондратьева. Различия в течение специфического воспаления легочной ткани, вызванного Mycobacterium avium, у мышей оппозитных линий I/St и C57BL/6. Сборник научных трудов МНПЦБТ и ЦНИИТ РАМН к 85-летию со дня рождения профессора М.М. Авербаха. Под ред. акад. В.И.Литвинова. Москва 2010 г., стр. 18-25.
Подписано в печать:
17.03.2010
Заказ № 3406 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Оглавление диссертации Кондратьева, Елена Валерьевна :: 2010 :: Москва
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.
1.ВВЕДЕНИ Е.
Актуальность проблемы.
Цель и задачи исследования.
Научная новизна.
Пракшческая значимость исследования.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
2.1 Общая характеристика нетуберкулезных патогенных микобактерий.
2.2 Экспериментальные модели инфекции, вызванной М. avium.12.
2.3 Ранние взаимодействия М. avium с клетками хозяина.
2.4 Адаптивный иммунный ответ на М. avium.
2.4.1 .Молекулы.
2.4.2. Клетки.
2.4.3. Ткани.
2.5. Генетический контроль инфекции, вызванной М. avium.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Экспериментальные животные.
3.2. Микобактериальная культура.
3.3. Заражение животных.
3.4. Определение количества микобактерий в органах зараженных животных.
3.5. Получение суспензии клеток легкого.
3.6. Проточная цитофлуороиетрия.
3.7. Гистологические исследования.
3.8. Иммуногистохимический анализ.
3.9.Определение продукции цитокинов.
3.10. Определение экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени.
3.11. Выявление гипоксии в ткани легких.
3.12. Определение аллелей тепа Nramp 1.
3.13. Статистическая обработка.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Определение восприимчивости к заражению М. avium в панели инбредных линий мышей.
4.2. Характер легочной патологии определяется чувствительностью мышей к инфекции.
4.3. Клеточная инфильтрация легких мышей, зараженных М. avium, и общая картина патологии.
4.4. Продукция цитокинов в легочной ткани.
4.5. Регуляция миграции нейтрофилов: экспрессия генов хемокинов.
4.6. Nrampl- основной ген, определяющий чувствительность к М. avium.
Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Кондратьева, Елена Валерьевна, автореферат
Глава 1. Введение 1.1. Актуальность темы
Mycobacterium avium - это широко распространенные в окружающей среде микобактерии, которые становятся внутриклеточными патогенами человека в отсутствии нормального Т-клеточного иммунитета [Horsburg, 1991; Inderlied, 1993]. Они выявляются приблизительно у 70% пациентов с сформировавшимся неизлечимым СПИД и считаются главной причиной смерти таких больных [Nightingale, 1992]. На фоне частично ослабленного иммунитета, например, у пожилых людей и детей, М. avium может вызывать хронические заболевания легких [Benson, 1994; Griffith, 1997; Nolt, 2003]. При моделировании инфекции на мышах линии C57BL/6 (В6) и производных от нее линий, несущих нокаут-мутации существенных для иммунитета генов, было показано, что Т-клеточный иммунный ответ на М. avium играет как защитную, так и патогенетическую роль. Так, IFN-y, продуцируемый лимфоцитами CD4+, совершенно необходим для защиты от быстрой гибели, но одновременно вызывает дегенеративные процессы в ткани легких и некроз гранулем [Ehlers, 2001]. Аналогично, экспрессия рецепторов к TNF-a необходима для поддержания целостности гранулем, однако процесс некротизации гранулем запускается именно TNF-a [Benini, 1999; Ehlers, 2000]. Баланс между защитным иммунным ответом и патологическими процессами в легочной ткани при этой инфекции во многом напоминает патогенез туберкулеза [Rook, 1996; Schluger, 1998; Benini, 1999]. Иммунные и генетические механизмы, лежащие в основе этого баланса, требуют дальнейшего изучения.
Ранние исследования генетической чувствительности к инфекции, вызванной М, avium, основывались на традиционном сравнении бактериальной нагрузки в органах после внутривенного введения М. avium мышам различных инбредных линий [Appelberg, 1990; Orme, 1986; Stokes, 1986]. Было показано, что чувствительность или устойчивость зависит от носительства резистентного (г) или чувствительного (s) аллеля гена Beg (ранее — Nrampl, по новой номенклатуре — Slcllal, далее в тексте Nrampl) хромосомы 1. Зависимость чувствительности к инфекции от гена Nrampl была подтверждена на конгенных по данному гену линиях мышей и на модели заражения М. avium макрофагов in vitro [de Chastellier, 1993; Nakamura, 1992]. Тем не менее, остается неизвестным, представляет ли собой Nrampl «главный ген», который в основном определяет последствия инфекции, или от него зависит лишь часть фенотипа. Априори, последнее предположение кажется более реалистичным, поскольку контроль инфекции, вызванной M.tuberculosis и другими внутриклеточными паразитами, у мышей носит полигенный характер [Kramnik, 2000; Mitsos, 2000; Roberts, 1997; Roberts, 1999; Sanchez, 2003]. Однако прямой сегрегационный генетический анализ для доказательства или опровержения данной гипотезы пока не проводился. Кроме того, в генетических исследованиях до сих пор не применялась «естественная» модель заражения М. avium через респираторный тракт, хотя иммунологически она хорошо охарактеризована [Ehlers, 2001].
В данной работе мы сравнивали чувствительность нескольких инбредных линий мышей к штамму М. avium 724R. После того, как было установлено, что мыши I/St устойчивы к инфекции по таким фенотипам как размножение бактерий в органах, степень легочной патологии и продолжительность жизни после заражения, мы провели сегрегационный генетический и сравнительный иммунологический анализ проявлений инфекции, вызванной М. avium, на мышах этой линии и чувствительной к инфекции линии В6.
1.2. Цель и задачи исследования
Целью нашей работы было исследование особенностей иммунного ответа и морфологических изменений в легких при развитии воспалительного процесса у мышей, отличающихся по генетической восприимчивости к Mycobacterium avium, и анализ генетического контроля данной инфекции.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
• Определить панель инбредных линий мышей с генетическими отличиями по чувствительности к Mycobacterium avium,
• Охарактеризовать динамику размножения Mycobacterium avium в легких и морфологические изменения ткани легких у мышей этих линий. .
• Охарактеризовать характер инфильтрации легочной ткани иммунокомпетентными клетками (Т- и В-лимфоциты, макрофаги и нейтрофилы) при заражении Mycobacterium avium.
• Определить в легочной ткани чувствительных и резистентных мышей профиль экспрессии генов, кодирующих основные цитокины, при ответе на инфекцию.
• Провести генетический анализ возможного сцепления восприимчивости к инфекции с геном Nrampl.
1.3. Научная новизна
• Впервые проанализирована сравнительная динамика патологического процесса, сопровождающего инфекцию M.avium , у чувствительных и резистентных мышей.
• Показано, что у чувствительных мышей В6 наблюдается быстрое развитие легочной патологии, сопровождаемое массивной инфильтрацией ткани легкого лимфоидными клетками, возникновением очагов деструкции ткани и зон гипоксии, а также усиленной продукцией цитокинов воспаления. Патологический процесс у резистентных животных коренным образом отличается от фатальной патологии чувствительных животных и завершается самоизлечением.
• Впервые установлено, что даже на фоне расщепления множества генов, генетический контроль инфекции, вызванной М. avium, осуществляется преимущественно геном Nrampl, что существенно отличает эту инфекцию от туберкулеза.
1. 4. Практическая значимость
Хотя работа носит экспериментальный характер и посвящена выяснению фундаментальных механизмов контроля инфекции, вызванной заражением генетически чувствительных и резистентных мышей М. avium, полученные результаты могут оказаться важными для понимания легочной патологии и динамики воспаления у больных с иммунодефицитами, у которых часто развивается такая инфекция. Это может помочь принятию решений по назначению местной или системной противовоспалительной терапии. Важное практическое значение имеют результаты, показывающие, что картина патологии, сходная с той, что возникает у больных, развивается у животных генетически чувствительных к конкретной микобактериальной инфекции, но не у резистентных мышей. Этот вывод диктует необходимость учитывать генетику хозяина и обращать внимание на правильный выбор объекта при разработке экспериментальных моделей заболеваний человека.
Материалы диссертации используются в курсе лекций для аспирантов, ординаторов и слушателей курсов по повышению квалификации ЦНИИТ РАМН.
Глава 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Заключение диссертационного исследования на тему "Локальный иммунный ответ в ткани легких мышей с высокой и низкой чувствительностью к инфекции, вызванной Mycobacterium avium"
Выводы
1. Мыши чувствительной к М. avium линии Вб достоверно быстрее погибают после заражения и не контролируют размножение М. avium в легких в отличие от мышей резистентной линии I/St.
2. У чувствительных мышей быстро развивается легочная патология, сопровождающаяся обильной инфильтрацией ткани легкого клетками иммунной системы и усиленной продукцией цитокинов воспаления IFN-y, TNF-a, IL-6 и IL-12.
3. Патологические изменения ткани легкого чувствительной линии мышей характеризуются выраженной очаговой и диффузной инфильтрацией паренхимы нейтрофилами и появлением обширных зон гипоксии, предшествующих возникновению некротических очагов.
4. В легких чувствительных мышей на периферии очагов некроза и в перибронхиальных областях образуются В-клеточные фолликулы — своеобразная структура, не развивающаяся у резистентных животных.
5. Генетический контроль инфекции, вызванной М. avium, во многом определяется аллельными вариантами гена Nrampl (Sicllal), что существенно отличает эту инфекцию от туберкулеза, который контролируется полигенно.
6. Линии мышей в В б и I/St представляют уникальный инструмент для анализа, демонстрируя зеркальную генетическую чувствительность к М. avium и М. tuberculosis и зеркальное развитие легочной патологии на фоне разного генетического контроля двух инфекций.
Глава 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенных исследований были выявлены две оппозитные по чувствительности к заражению М. avium линии мышей: чувствительная В6 и резистентная I/St. При этом было показано, что чувствительность или резистентность животных не зависит от способа заражения - внутривенного, интратрахеального либо аэрогенного. При аэрогенном способе заражения чувствительные мыши В6 погибали уже через 7 месяцев после заражения, в то время как резистентные мыши I/St жили свыше 11 месяцев. Диссеминация М. avium в селезенку отмечалась уже через 3 недели после заражения, и к 16-й неделе различия высеваемости микобактерий из легких между линиями достигали 4 порядков. Агрессивное течение инфекции у чувствительных мышей В6 характеризовалось быстрым развитием легочной патологии на фоне усиленной инфильтрации ткани легкого клетками иммунной системы и повышения продукции провоспалительных цитокинов IFN-y, TNF-a, IL-6 и IL-12. Патологические изменения ткани легкого чувствительной линии мышей В6 заключались в выраженной очаговой инфильтрации паренхимы нейтрофилами и возникновении очагов деструкции ткани, окруженных зонами гипоксии. Таким образом, в нашей экспериментальной модели наблюдалась отчетливая корреляция двух параметров чувствительности к заражению: более быстрый рост М. avium в легких и большая выраженность легочной патологии у мышей чувствительной линии Вб по сравнению с резистентными мышами I/St. Народу с этим, нами было показано, что в легких чувствительных мышей В6 на периферии очагов некроза и в перибронхиальных областях образуются В-клеточные фолликулы — своеобразная структура, не развивающаяся у резистентных животных. Важно отметить, что в отличие от воспалительного процесса, вызванного заражением М. tuberculosis [Eruslanov, 2005], заражение мышей I/St М. avium не ведет к массированному притоку нейтрофилов в легкие в течение всего периода наблюдения. Похоже, что отсутствие некроза и невысокий приток нейтрофилов в легкие являются признаками эффективного контроля мико бактериальных инфекций резистентным хозяином, как было ранее показано для М.tuber culosis [Eruslanov, 2005; Pan, 2005] и в данной работе для М. avium. Пр и этом генетический контроль инфекции, вызванной М. avium, осуществляется в первую очередь геном Nrampl, что существенно отличает эту инфекцию от туберкулеза, который контролируется полигенно. Этим, вероятно, и обусловлен генетически зеркальный характер восприимчивости к двум инфекциям у мышей.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Кондратьева, Елена Валерьевна
1. Апт А.С., Кондратьева Т.К. Туберкулез: патогенез, иммунный ответ и генетика хозяина. Мол. Биол. 2008. 42(5): 880-890.
2. Aly S., Wagner К., Keller С., Malm S., Malzan A., Brandau S., Bange F.-C., Ehlers S,. Oxygen status of lung granulomas in Mycobacterium tuberculosis-infected mice. J. Pathol. 2006. 10:98-305.
3. Amfah G., Bonsu F., Tetteh C. E.a. Buruli ulcer in Ghana: results of national case search. Emerg. Infect. Dis. 2002. 8:67-170.
4. Appelberg R, Orme IM. Effector mechanisms involved in cytokine-mediated bacteriostasis in Mycobacterium avium infections in murine macrophages. Immunology. 1993. 80:52359.
5. Appelberg R., and Silva M.T. T cell-dependent chronic neutrophilia during mycobacteria infection. Clin.Exp. Immunol. 1989. 78:478-483.
6. Appelberg R., Castro A., Gomes S., Pedrosa J., Silva M. Susceptibility of Beige Mice to Mycobacterium avium: Role of Neutrophils. Infect Immun. 1995. 63(9):3381-3387.
7. Appelberg R., Leal I.S., Pedrosa J., Florido M. Differences in resistance of C57BL/6 and C57BL/10 mice to infection by Mycobacterium avium are independent of gamma interferon. Infect. Immun. 2000. 8:9-23.
8. Appelberg R., and A. M. Sarmento. The role of macrophage activation and of 5cg-encoded macrophage function(s) in the control of Mycobacterium avium infection in mice. Clin. Exp. Immunol. 1990. 80:324-331.
9. Appelberg R. Pathogenesis of Mycobacterium avium infection: typical responses to an atypical mycobacterium? Immunol. Res. 2006. 35:179-190.
10. Apt A, Kramnik I. Man and mouse ТВ: contradictions and solutions. Tuberculosis. 2009. 89(3): 195-198.
11. Bafika A, Scanga CA, Feng CG, Leifer C, Cheever A, Sher A. TLR9 regulates Thl responses and cooperates with TLR2 in mediating optimal resistance to Mycobacterium tuberculosis. J Exp Med. 2005. 202:1715-1724.
12. Benini, J., E. M. Ehlers and S. Ehlers. Different types of pulmonary granuloma necrosis in immunocompetent vs. TNFRp55-gene-deficient mice aerogenically infected with highly virulent Mycobacterium avium. J. Pathol. 1999. 189:127-137.
13. Benson, C. A. Disease due to the Mycobacterium avium complex in patients with AIDS: epidemiology and clinical syndrome. Clin. Infect. Dis. 1994. 3: 218-222.
14. Bermudes L., Petrovsky M. Host defense against Mycobacterium avium does not have an absolute requirement for major histocompatibility complex class-I-restricted T cells. Infect. Immun. 1999. 67:3108-3111.
15. Bermudes LE, Petrofsky M, Goodman J. Exposure to low oxygen tension and increased osmolarity enhance the ability of Mycobacterium avium to enter intestinal epithelial (HT-29) cells. Infect Immun. 1997. 65:3768-3773.
16. Bermudes LE, Young LS, Enkel H. Interaction of Mycobacterium avium complexwith human macrophages: roles of membrane receptors and serum proteins. Infect. Immun. 1991. 59:1696-1702.
17. Bermudez L.E.M. & Young L.S. Oxidative and non-oxidative intracellular killing of Mycobacterium avium complex. Microb Pathog. 1989. 7: 289-298.
18. Bermudez LE. Differential mechanismsof intracellular killing of Mycobacterium avium and Listeria monocitogenes by activated human and merine macrophages. The role of nitric oxide. Clin Exp Immunol. 1993. 91:277-281.
19. Bohlson SS, Strasser JA, Bower JJ, Schorey JS. Role of compliment in Mycobacterium avium pathogenesis: in vivo and in vitro analyses of the host response to infectionin the absence of complement component C3. Infect Immun. 2001. 69:7729-7735.
20. Chiodini R.J., Buergelt C.D. Suscetibility of BALB/c, C57BL/6 and C57BL/10 mice to infection with Mycobacteriunparatuberculosis. J. Сотр. Pathol. 1993. 109: P. 309-319.
21. Crowl AJ, Dahl R, Ross E, May MH. Evidence that vesicles containing living, virulent Mycobacterium tuberculosis of Mycobacterium avium in cultured human macrophages are not acidic. Infect Immun. 1991. 59:1823-1831.
22. Dannenberg A.M. Delayed-type hypersensitivity and cell-medieted immunity in the pathogenesis of tuberculosis. Immunol. Today. 1991. 12:228-233.
23. Denis M., Forget A., Pelletier M., Skamene E. Pleotro effects of the Beg gene. III. Respiratory burst in Beg congenic macrophages. Clin Exp Immunol. 1988. 73:370-375.
24. Dheda K, Booth H, Huggett JF, Johnson MA, Zumla A, Rook GAW. Lung remodeling in pulmonary tuberculosis. JernlnfDis. 2005. 192:1201-1210.
25. Eaton Т., Falkinham J.O., and von Reyn C.F. Recovery of Mycobacterium avium from cigarettes. J Clin Microbiol. 1995. 33:2757-2758.
26. Ehlers S., Kurtsch S., Ehlers E.M., Benini J., Pfeffer K. Lethal granuloma disintegration in mycobacterial-infected TNFp55/" mice is dependent on T cell and IL-12. J. Immunol.2000. 165:483-492.
27. Falkinham J.O., Norton C.D. and LeChevallier M.W. Factors influencing numbers of Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellular, and other mycobacteria in drinking water distribution systems. Appl Environ Microbiol. 2001. 67:1225-1231.
28. Falkinham J.O.III. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 1996. 9:177-215.
29. Fattorini L, Xiao Y, Li B, Santoro C, Ippoliti F, Orefici G. Induction of IL-15, IL-6, TNF-a, GM-CSF, and GCSF in human macrophages by smooth transparent and smooth opaque colonial variants of Mycobacterium avium, J Med Microbiol. 1994. 40:129-133.
30. Fattorini L., Nisini R., Fan Y., Li Y., Tan D., Mariotti S., Teloni R., Iona E., and Orefici G. Exposure of BALB/c mice to low doses of Mycobacterium avium increases resistance to a subsequent high-dose infection. Microbiology. 2002. 148:3173-3181.
31. Fenton MJ, Riley LW, Schlesinger LS. Receptor-mediated recognition of Mycobacterium tuberculosis by host cells. In: Cole S et al. (eds.). Tuberculosis and the Tubercle Bacillus. ASM Press, Washington DC. 2005. 405-426.
32. Florido M., Appelberg R., Orme I.M., Cooper A.M. Evidence for a reduced chemokine response in lungs of beige mice infected withM avium. Immunology. 1997. 95:600-605.
33. Florido M., Appelberg R. Genetic control of immune-mediated necrosis of Mycobacterium avium granulomas. 2006. 118:122-130.
34. Florido M., Cooper A.M., Appelberg R. Immunological basis of the development of necrotic lesions following Mycobacterium avium infection. Immunol. 2002. 106:590-601.
35. Florido M., Correia-Neves M., Cooper A.M. The cytolytic activity of natural killer cells is not invoved in the restriction of Mycobacterium avium growth. International Immunology. 2003. 15:895-901.
36. Florido M., Appelberg R. Granuloma necrosis during Mycobacterium avium infection does not required tumor necrosis factor. Infect.I mmun. 2004. 72:6139-6141.
37. Florido Manuela, Pearl John E., Solache Alejandra, Borges Margarida, Haynes Laura, Cooper Andrea M., and Rui Appelberg. Gamma Interferon-Induced T-Cell Loss in Virulent Mycobacterium avium Infection. Infect Immun. 2005.73(6):3577-3586.
38. Florido, M., A. S. Goncalves, M. S. Gomes, and R. Appelberg. CD40 is required for the optimal induction of protective immunity to Mycobacterium avium. Immunology. 2004. 111:323-327.
39. Flynn J. L. Lessons from experimental Mycobacterium tuberculosis infections. Microbes Infect. 2006. 8:1179-1188.
40. Forbes, J. R., and P. Gros. Divalent-metal transport by NRAMP proteins at the interface ofhost-pathogen interactions. Trends Microbiol. 2001. 9:397-405.
41. Forget A., Skamene E., Gros P., Miaithe A., Turcotte R. Differences in response among inbred mouse strain to infection with small doses of Mycobacteriun bovis BCG Infect Immun. 1981. 32:42-47.
42. Fortin A., Abel L., Casanova J. L., Gros P. Host genetics of mycobacterial diseases in mice and men: forward genetic studies of BCG-osis and tuberculosis. Ann. Rev. Genomics Hum. Genet. 2007. 8:163-192.
43. Frehel C, de Chastellier C, Lang T, Rastogi N. Evidence for inhibition of fusion of lisosomal and prelisosomal compartments with fagosomes in macrophages infected with pathogenic Mycobacterium avium. Infect Immun. 1986. 52:252-262.
44. Frehel C., de Chastellier, C., Offredo, C. & Berche, P. Intramacrophagic wrowth of Mycobacterium avium during infection of mice, Infect Immun. 1991. 59:2207-2214.
45. Furney S.K., Roberts A.D., Orme I.M. Effect of rifaburin on disseminated Mycobacterium avium infections in thymectomased, CD4 T-cell-deficient mice. Antimicrob. Agents Chemother. 1990. 34:16-29-1632.
46. Furney SK, Skinner PS, Roberts AD, Appelberg R, Orme IM. Capacity of Mycobacterium avium isolates to grow well or poorly in murine macrophages resides in their ability to induce secretion of tumor necrosis factor. Infect Immun. 1992. 60:4410-4413.
47. Gilbertson В., Germano S., Steele P., Turner S., Fazekas de St Groth В., Cheers C. Bystander actovation of CD8+ T lymphocytes during experimental Mycobacterium infection. 2004. 72:6884-6891.
48. Gomes M.S., Appelberg R. Evidence for link between iron metabolism and NRAMP11 gene function in innate resistance against Mycobacterial avium. Immunology, 1998. 95: 165-168.
49. Gomes MS, Appelberg R. Evidence for a link between iron metabolism and Nrampl gene function in innate resistance against Mycobacterium avium.1 mmunology. 1998. 165-168.
50. Gomes MS, Appelberg R: NRAMP1- or cytokine-induced bacterio stasis of Mycobacterium avium by mouse macrophages is independent of the respiratory burst .Microbiology. 2002.3155-3160
51. Gomes Ms, Florido M, Cordeiro JV, et al: Limited role of the Toll-like receptor-2 in resistance to Mycobacterium avium. Immunology. 2004. 111:179-185.
52. Goswami Т., Bhattacharjee A., Babal P., Searle S., Moore E., Li M., Blackwell J.M. Natural resistance-associated macrophage protein 1 is an H+/bivalent cation antiporte. Biochem J. 2001. 354:511-519.
53. Griffith D.E. Nontuberculous mycobacteria. Curr. Opinion Pulm. Med. 1997. 3:139-145.
54. Gruenheid S., Gros P. Genetic susceptibility to intracellular infections: NRAMP1, macrophage function and divalent cations transport. Curr Opin Microbiol. 2000. 3:43-48.
55. Guerin I, de Chastellier C. Pathogenic mycobacteria disrupt the macrophage actin filament network. Infect Immun. 2000. 68:2655-2662.
56. I-Iansch HC, Smith DA, Mielke ME, Hahn H, Barcroft GS, Ehlers S. Mechanisms of granuloma formation in murine Mycobacterium avium infection: the contribution of CD4+ T cells. Int Immunol. 1996. 8(8): 1299-1310.
57. Harshan К. V. Gangadharam P.R. In vivo depletion of natural cell activity leads to enchanced multiplication of Mycobacterium avium complex in mice. Infect Immun. 1991. 59:2818-2821.
58. Heifets L. Mycobacterial infections caused by nontuberculous Mycobacteria. Sem. Respir Crit Care Med. 2004. 25:283-295.
59. Horsburgh C.R., Jr. Epidemiology of mycobacterial diseases in AIDS. Res. Microbiol. 1992. 143:372-377.
60. Horsburgh C.R., Jr. Mycobacterium avium complex infection in the acquired immunodeficiency syndrome. N.Engl. J. Med. 1991. 324:1332-1338.
61. Hubbard R.D., Collins F.M. Immunomodulation of mouse macrophage killing of Mycobacterium avium in vitro. Infect. Immun. 1991. 59:570-574.
62. Inderlied, С. В., С. A. Kemper, and L. E. Bermudez. The Mycobacterium avium complex. Clin. Microbiol. Rev. 1993. 6:266-310.
63. Kalich R., Kappler W., Fischer P., Vandra E., Kozma D. Lung diseases caused by non-tuberculous mycobacteria in East Germany and Hungary. Pneumology. 1989. 43:169-172.
64. Kelley VA, Schorey JS: Mycobacterium "s arrest of phagocome maturation in macrophages requires Rab5 activity and accessibility to iron, olec Biol Cell. 2003. 14:3366-3377.
65. Kondratieva EV, Evstifeev VV, Kondratieva TK, Petrovskaya SN, Pichugin AV, Rubakova EI, Averbakh MM Jr, Apt AS. I/St mice hypersusceptible to Mycobacterium tuberculosis are resistant to M. avium. Infect Immun. 2007. 75(10):4762-4768.
66. Kramnik, I, W. F. Dietrich, P. Demant, and B. Bloom. Genetic control of resistance to experimental infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. 97:8560-8564.
67. Kuhn D.E., W. P. Lafuse, and B. S. Zwilling. Iron transport into Mycobacterium avium-containing phagosomes from an Nrampl(Glyl69)-transfected RAW264.7 macrophage cell line. J. Leuk. Biol. 2001. 69:43-50.
68. Lavebratt, C., A. S. Apt, В. V. Nikonenko, M. Schalling, and E. Schurr. Severity of tuberculosis in mice is linked to distal chromosome 3 and proximal chromosome 9. J. Inf. Dis. 1999. 180:150-156.
69. Livak K.J., and Schmittgen, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods.2001. 25,402 -408.
70. Lousada S, Florido M, Appelberg R: Regulation of granuloma fibrosis by nitric oxide during Mycobacterium avium experimental infection. Int J Exp Pathol. 2006. 87:307-315.
71. Malo D., Vidal S. M., Hu J., Skamene E., Gros P. High resolution linkage map in the vicinity of the host resistance locus Beg. Genomics. 1993. 16:655-663.
72. Mitsos, L.-M., L.R. Cardon, A. Fortin, L. Ryan, R. LaCrouse, R. J. North, and P. Gros. Genetic control of susceptibility to infection with Mycobacterium tuberculosis in mice. Genes Immun. 2000. 1: 467-477.
73. Nakamura R.V. Effect of natural resistance gene on the immune response against Mycobacteriun avium complex infection. Kekkaku. 1992. 67:41-46.
74. Nakamura RM. Effect of natural resistance gene on the immune response against Mycobacterium avium complex infection. Kekkaku. 1992. 67(1): 41-46.
75. Nathan C, Xie Q. Nitric oxide synthases:roles, tolls, and controls. Cell. 1994. 78:915-918.
76. Nightingale, S. D., L. T. Byrd, P. M. Southern, J. D. Jockusch, S. X. Cal, and B. A. Wynne. Incidence of Mycobacterium avium-intracellulare complex bacteremia in human immunodeficiency virus-positive patients. J. Infect. Dis. 1992. 165:1082-1085.
77. Nikonenko, В. V., M. M. Averbakh, Jr., C. Lavebratt, E. Schurr, and A. S. Apt. Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice. Tubercle Lung. Dis. 2000. 80:15-25.
78. Nolt D., Michaels M.G., Wald E.R. Intrathoracic disease from nontuberculous mycobacteria in chidren: two cases and a review of literature. Pediatrics. 2003. 112:434444.
79. North, R. J, and Y.-J. Jung. Immunity to tuberculosis. Ann. Rev. Immunol. 2004. 22:599623.
80. Oh YK, Straubinger RM. Intracellular fate of Mycobacterium avium: use of dual-label spectrofluorometry to investigate the influence of bacterial viability and opsonization on phagosomal pH and phagosome-lysosome interaction. 1996. 64:319-325.
81. Orme I., Stokes R.W., Collins F.M. Genetic control of natural resistance to nontuberculous mycobacterial infections in mice/ Infect Immun. 1986. 54:56-62.
82. Orme I.M. Effect of rifaburin on disseminated Mycobacterium avium infections in thymectomased, CD4 T-cell-deficient mice. Antimicrob. Agents Chemother. 1990. 34:1629-1632.
83. Orme I.M. Furney S.K., Roberts A.D. Dissemination of enteric Mycobacterium avium infections in mice renderd immunodeficient by thymectomy and CD4 depletion or by prior infection with murine AIDS retroviruses. Infect. Imuun. 1992. 60:4747-4753.
84. Orme I.M., The immunopathogenesis of tuberculosis: a new working hypothesis. Trends Microbiol. 1998. 6:94-97.
85. Pais TF, Appelberg R: Induction of Mycobacterium avium growth restriction and inhibition of phagosome-endosome interactions during macrophage activation and apoptosis induction by picolinic acid plus IFNy. Microbiology. 2004. 150:1507-1518.
86. Pan., II., B. S. Yan, Y. V. Shebzukhov, H. Zhou, L. Kobzik, D. E. Higgins, M. J. Daly, B. R. Bloom, and I. Kramnik. Iprl gene mediates innate immunity to tuberculosis. Nature. 2005. 434:767-772.
87. Pedrosa J, Florido M, Kunze ZM, Castro AG, Portaels F, Mc Fadden S, Silva MT, Appelberg R. Characterization of the virulence of Mycobacterium avium complex (MAC) isolates in mice. Clin Exp Immunol. 1994. 98(2):210-216.
88. Petrofski Mary and Bermudes Luiz E. CD4+ T Cells but Not CD8+ or y5+ Lymphocytes Are Required for Host Protection against Mycobacterium avium Infection and Dissemination through the Intestinal Route. Infect Immun. 2005. 73(5):2621-2627.
89. Polotsky VY, Belisle JT, Mikusova K, Ezekowitz AB, Joiner KA. Interaction of human mannose-binding protein with Mycobacterium avium. Jern Infect Dis. 1997. 175:11591168.
90. Radaeva Т. V., Kondratieva E. V., Sosunov V. V., Majorov К. В., Apt A. S. A human-like ТВ in genetically susceptible mice followed by the true latency in a Cornell-like model. Tuberculosis; 2008. 88(6):576-585.
91. Roberts, L. J., Т. M. Baldwin, J. M. Curtis, E. Handman, and S. J. Foote. Resistance to Leishmania major is linked to the H2 region on Chromosome 17 and to Chromosome 9. J. Exp. Med. 1997. 185:1705-1710.
92. Roberts, L. J., Т. M. Baldwin, T. P. Speed, E. Handman, and S. J. Foote. Chromosomes X, 9, and the H2 locus interact epistatically to control Leishmania major infection. Eur. J. Immunol. 1999. 29:3047-3050.
93. Rook, G.A.W., and R. Hernandez-Pando. The pathogenesis of tuberculosis. Ann. Rev. Microbiol. 1996. 50:259-282.
94. Russel DJ, Dant J, Sturgill-Koszycki S. Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis-containing vacuoles are dynamic, fusion-competent vesicles that areaccessible to glicosphingolipids from host cell plasmalemma. Jern Immun. 1996. 156:4764-4773.
95. Russell D. G. Who puts the tubercle in tuberculosis? Nat. Rev. Microbiol. 2007. 5:39-47.
96. Sanders B.M., Cheers C. Inflammatory response following intranasal infection with Mycobacterium avium complex: role of T-cell subset and gamma interferon. Infect. Immun. 1995. 63:2282-2287.
97. Sarmento AM, Appelberg R. Involvement of reactive oxygen intermediates in the tumor necrosis factor-dependent bacteriostasis of Mycobacterium avium. Infect Immun. 1996. 64:3224-3230.
98. Sarmento AM, Appelberg R: Relationship between virulence of Mycobacterium avium strains and induction of tumor necrosis factor alpha production in infected mice and in vitro-cultured mouse macrophages. Infect Immun. 1992. 3759-3764.
99. Saunders B.M., Frank A.A., Cooper A.M., Orme I.M. Role of y5 T cells in immunopathology of pulmonary Mycobacterium avium infection in mice. Infect Immun 1998. 66:5508-5514.
100. Saunders BM, Frank AA, Orme IM. Granuloma formation is requared to contain bacillus growth and delay mortality in mice chronically infected with Mycobacterium tuberculosis . Immunology. 1999. 98:324-328.
101. Schluger, N. W., and W. N. Rom. The host immune response to tuberculosis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998. 157: 679-691.
102. Searle S.,Bright N.A., Roach T.I., Atkinson P.G., Barton C.H., Meloen R.H., Blackwell J.M. Localisation of NRAMP1 in macrophages: modulation with activation and infection. J Cell Sci. 1998. 111:2855-2866.
103. Shiratsuchi H, Toossi Z, Mettler MA, Ellner JJ: Colonial morphotype as a determinant of cytokine expression by human monocytes infected with Mycobacterium avium. J Immunol 1993. 150:2945-2954.
104. Shiratsuchi U, Ellner JJ. Expression of IL-18 by Mycobacterium avium-infected human monocytes; assotiation with M. avium virulence. Clin Exp Immunol. 2001. 123(2): 203209.
105. Silva M.T., M.N.T. Silva, and R. Appelberg. Neutrophil-macrophage cooperation in the host defence against mycobacterial infection. Microb. Pathol. 1989. 6:369-380.
106. Skamene, E., P. Gros, A. Forget, P. A. Kongshavn, C. Charles, and B. A. Taylor. Genetic regulation of resistance to intracellular pathogens. Nature. 1982. 297:506-508.
107. Staats, J. Standardized nomenclature for inbred strains of mice: Sixth listing. Cancer Res. 1976. 36:4333-4377.
108. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R.G., Silverman R.H., Schreiber R.D., How cells respond to interferons Annu. Rev. Immunol. 1998. 67:227-239.
109. Stokes R.W., Collins F.M. Growth of Mycobacterium avium in activated macrophages harvested from inbred mice with differing innate susceptibility to mycobacterial infection. Infect Immun. 1998. 56:2250-2254.
110. Stokes R.W., Orme I., Collins F.M. Role of mononuclear phagocytes in expression of resistance and susceptibility to Mycobacterium avium infections in mice. Infect. Immun. 1986. 54:811-819.
111. Sturgill-Koszycki S, Schaible UE, Russel DJ. Mycobacterium-containing phagosomes are accessible to early endosomes and reflect a transitional state in normal phagosome biogenesis. EMBO J. 1996. 15:6960-6968.
112. Sturgill-Koszycki S, Schlesinger PH, Chacraborty P. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 1994. 263:678-681.
113. Tanaka S., Sato M., Taniguchi Т., Yokomizo Y. Relationship of acid phosphatase activity to ultrastructural feachers in mice inoculated with Mycobacterium paratuberculosis. Comp Pathol. 1996. 114:81-91.
114. Thoma-Uszynski S, Stenger S, Takeuchi O, et al: Induction of direct antimicrobial activity through mammalian Toll-like receptors, Science. 2001. 291:1544-1547.
115. Vidal, S. M., D. Malo, K. Vogan, E. Skamene, and P. Gros. Natural resistance to infection with intracellular parasites: isolation of a candidate for Beg. Cell. 1993. 73:469-479.
116. Wallace R.J., Glassroth J., Griffith D.E., Oliver K.N., Cook J.K., Gordvin F. Diagnosis and treatment of disease caused by nontubeculous mycobacteria (Americam Thoracic Society Statement). Am J. Respir Crit Care Med. 1997. 56:1-25.
117. Wolinsky E. Nontuberculous mycobacteria and associated diseases. Am. Rev. Respir. Dis. 1979. 119:107-159.
118. Yan B. S., Kirbi A., Shebzukhov Y. V., Dali M. J., Kramnik I. Genetic architecture of tuberculosis resistance in a mouse model of infection. Genes Immun. 2006.7:201-210.
119. Zwilling B.S., Kuhn D.E., Wikoff L., Brown D., Lafuse W. Role of iron in NRAMP1-mediates inhibition of mycobacterial growth. Infect Immun. 1999. 67:1386-1392.