Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Дифференциация перекрестных серологических реакций, обусловленных Yersinia enterocolitica сероварианта 0:9 при диагностике бруцеллеза животных

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им. Я. Р. КОВАЛЕНКО

(ВИЭВ)

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

(РАСХН)

ОД

-not; Яд правах рукописи

ЕФРЕМОВ Валерий Станиславович

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПЕРЕКРЕСТНЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ, ОБУСЛОВЛЕННЫХ YERSINIA ENTEROCOLITICA СЕРОВАРИАНТА 0:9 ПРИ ДИАГНОСТИКЕ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

16.00.03 = ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва — 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я- Р. Коваленко.

Научные руководители:

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник В. А. Ромахов доктор биологических наук Н. Д. Скичко Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор ветеринарных наук, профессор К. В. Шумилов (ВГНКИ)

кандидат ветеринарных наук С. В. Родионов (ВИЭВ)

Ведущее учреждение — Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии (ЦНИИЭ).

Защита диссертации состоится Х995 г.

в -М' часов на заседании Диссертационного совета К 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко. Адрес: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ. Автореферат разослан « Ю > яр>1995 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В Российской Федерации и других странах проводится больпая работа по профилактике инфекционных болезней, являющихся общими для человека и животных (зооалтропонозы), к которым относится и бруцеллез.

Для диагностики бруцеллеза у животных используют бактериологический, серологические и аллергический методы исследований с учетом клинических признаков болезни и эпизоотодогических данных. Серологические методы являются основным, а иногда и единственным критерием оценки благополучия животных по бруцеллезу, так как при проведении бактериологического исследования от больных не всегда удается выделить культуры возбудителя.

В то и? вреыя в сыворотке крови отдельных дивотных из благополучных по бруцеллезу хозяйств нередка выявляют антитела, вступающие во взаимодействие с бруцеллезным антигеном. В работах Mal lman V. J., 1930, Ciosrlla Z. ,1948, Пашкова Т. а, 19Б0, Орлова Е. С., 1954, Вегшэп D.f. ,1966, Иванова И.К ,1959,Гупаленко А.М., 1967, Feeley ас. ,1968, Сафронова М.В. ,1971,Ohara S. et al. 1974, Ээванника НЕ ,1075, Nielsen К., 1980, Касьянова A.R , 1982, Corbel М. Gl .1985, Косилова И. А., 1992, Сочнева RR , и др. »механизм возникновения такого феномена получил различную интерпретацию. К причинам, способствующим возникновению этих реакций, относят нарушения физиологического состояния организма животных. повыиеиие уровня "нормальных" антител, различные патологические процессы в организм? животного, несоблюдение сроков проведения исследований после иммунизации скота и сенсибилизация ан-тигеннородственными бруцемам микроорганизмами. В большинстве случаев такие реакции, проявляются в низких титрах, но при инфицировании яивотных Y.enterocolttica, перекрестные реакции к антигенам бруцелл

- к -

отвечают в высоких титрах (6-ой доклад комитета экспертов по бруцеллезу ФЛО/ВОВ, 1986).

Роль бактерий вида У. ег^егосоИНса е патологи сельскохозийст-венных кивотных и их 8качение в возникновении перекрестных серологических реакций, при исследовании сыворотки крови животных на бруцеллез изучена крайне недостаточно. Неполное освеерние получили также вопросы эпизоотологии керсиниозов, клинического проявления и иатодов диагностики болезни. В связи с этим важное научное и практическое значение приобретает исследования, направленные на разработку эффективных методов дифференциация перекрестных серологических реакций и оценка специфичности традиционных методов диагностики бруцеллеза при сенсибилизации животных аятигеннородственными микроорганизмами.

{¡ель и задачи работы. Целью наши исследований явилась разработка метода, поэволяодэго дифференцировать реакции, вызываемые У. еп-ЬегосоНЬЮа при проведении диагностических исследований на бруцеллез у кивотных. На разрешение были поставлены следующие задачи:

- изучить биологические свойства тоаммов У. егЛогосо!111са, виде ленных от животных, в сравнении с референтами шташгши иерсиний серо вариантов: 0:9;0:3;0:6Б;0:6 и отработать методику бактериологической диагностики иерсиниозов у яивотньос;

- разработать методику изготовления антигенов для выявления антител к иерсинияи различных серовариантов в реакции агглютинации и подучить гипериммунные специфические антисывороткн;

- изучить в сравнительном аспекте антигенные свойства кишечных иерсиний различных серовариантов и степень их антигенного родства с бруцеллами в прямой и перекрестной реакции агглютинации, РСК (РДСК). РБП и КР.

- разработать методику серологической дифференциации неспецифических реакций при исследовании кивотных на бруцеллез;

- провести сравнительное изучение возможности использования аллергенов из Б- и й- форм бруцелл для дифференциальной диагностики бруцеллеза от кишечного иерсиниоза, вызываемого серовариантом 0:9;

- разработать метод дифференциации перекрестных серологических реакций, в том числе обусловленных У. сп'егосоПИса сероварианта 0:

в благополучных по бруцеллезу хозяйствах.

Научная новизна Установлена циркуляция У. епЬегосоХШса у крупного рогатого скота и лошадей в хозяйствах ряда областей Нечерноземной зоны РФ.

Изучены биологические свойства вуделенных культур в сравнен;™ с референтными штаммами иерсиний серовариантов 0:3; 0:55; 0:6; 0:8; 0:3. Показано,что антигенное родство иерсиний с бруцеллами выражено только у сероварианта О: 9.

Б экспериментальных и производственных условиях установлены перекрестные серологические реакции к бруцеллезному антигену в диагностических титрах (50-400 МЕ/мя), вызванные инфицированием янвотних У. е^егосоИНоа 0:9.

Разработан метод комплексной дифференциации перекрестных серологических реакций, в том числе обусловленных У. егЛегасоН1:1са 0:9. возникающих при исследовании нивотных на бруцеллез в благополучных хозяйствах.

Установлено, что у искусственно зараженных и естественно инфицированных иерсиниями животных реакция гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ) при исследовании с бруцеллезным аллергеном -"бруцеллином ВИЗ»'- не проявляется (авт. свидетельство Н 1567984 от 29.01,87г), что позволяет использовать ей для дифференциации бруцеллеза и иерсиниоза

Практическая ценность. Внедрены в практику ветеринарных лабораторий России и других стран СНГ экспресс-метод дифференциации неспе-

цифических показаний РА при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез, методика дифференциации бруцеллеза и кишечного иерсинио-аа, Еывзиваемого возбудителем Y. entarocolitica сероварианта 0:9 и методика бактериологического исследования животных ка иерсшшоз, наведшие отражение в методических рекомендациях.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и одобрены ка научной конференции посвяп^нной, 40-летию победы в Великой Отечественной войне (1985), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным", Новосибирск (1889), на научных конференциях молодых ученых БЙЭВ (1987,1989,1990),на научной конференции"Проблемы изыскания синтеза и производства новых препаратов для ветеринарии", Самарканд (1994), на заседаниях методических комиссий и Ученого Совета ВИЭВ (1986-1994), на мемабораторном совещании сотрудников ВЙЭВ (1994).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе одна брошюра и авторское свидетельство на изобретение.

ffe ващиту выносятся:

- материалы сравнительного изучения свойств кишечных нерсиний различных серовариантов;

- результаты изучения роли перекрестных серологических реакций, вызываемых Y. enterooolltlca серовара 0:9 при диагностике бруцеллеза;

- метод дифференцин перекрестных серологических реакций, обусловленных антигеннородственными бруцеллод микроорганизмами, в том число Y. enterocolítlca сероварианта 0:9, регистрируемых в благополучных по бруцеллезу животноводческих хозяйствах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, методической части, собственных исследований. обсуждения полученных результатов, выводов, практических пред-

лояений, списка использованной лотературы и приложения. Библиография содержит 106 отечественных и 170 иностранных источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. Работа выполнена в 1985-1991 гг. в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики бруцеллеза, лаборатории молекулярной биологии и биохюаш ВКЭВ и в кивотноводчесгапс хозяйствах благополучных по бруцеллезу областей РФ.

Изучение биологических свойств 9 штаьмов бруцедл проводили согласно рекомендациям Комитета экспертов по бруцеллезу ФА0/ВС9 (1986).

Свойства штаммов Y.enterocolltica изучали по морфологическим, тиккториальным и культурально-биохимическим показателям. Дифференциацию Y.enterocolltica от других видов иерсиний проводили путем изучения их свойств с использованием дифференцирующих тестов, систем индикаторных бумажных (СКВ) и пластин биохимических дифференцирующих для энтеробактерий (ПЦДЭ).

Степень подобия нуклеотидных последовательностей ДНК бруцелд и иерсиний определяли в реакции ДНК-ДНК гибридизации на нитроцэллюлоз-ных фильтрах (совместно с С. К. Арткшпшм, А. Л. Коноровой и ЕЕМэль-яиченко).

Для определения степпенн антигенного родства штаммов Y. entero-col i tica о бруцеллами ка кроликах получали специфические сыворотки к серовариантаы иерсиний: О: Э; 0:8; 0:6В и 0:9. Опытные серия антигенов для РА готовили из биомассы иерсиний указанных сероваркаитов. Для консервации препаратов применяли формалин и фенол в концентрациях 0,1X; О, ЗХ; 0,62; 1, 0Z; 1, 6Х и 2Х, а тага» использовали антигены из не ¡«активированных и инактивнроваяных прогреванием иерсиний. Стандартизацию препаратов осуществляли на фотоэяекгроколоршетре KSR-2-УХЛЧ, при этом концентрацию иерсиний приводили в соответствие с концентра-

шей микробных клеток в биофабричнм едином бруцеллезном антигене.

Статистическую обработку полученных результатов проводили на програыируемом шкрокалькудяторе UK-56 и на PC At 286 с использованием программы "STATGRAF."

Препараты кз игах&а Y. enterocolitloa серовариаита 0:9, приготовленные по методикам изготовления бруцеллезного антигена, испыш-ва ли в сравнении с единым бруцеллезным антигеном в РСК f РДСК) и РЕП. Дополнительно оценивали антигены, приготовленные путем ультразвуковой дезинтеграции бактериальной массы перс ни ий с последующе обработкой дезинтеграта этанолом или кислотам!.

Для .выяснения роли перекрестных серологических реакций,вызванных иерсиниями, исследовали в динашке 62 пробы сыворотки крови от 8 голов крупного рогатого скота с бруцеллезными (гетерологичньми) и иарсиниозными антигенами. Секрет шлочкой железы 3 коров исследовали в динамике с бруцеллезным и керсиниовным (гомологичным) диагноотику-юы, приготовленным по методике бруцеллезного антигена для КР.

Наряду о традиционными методами серологической диагностики бруцеллеза. изучали возможность использования для дифференциации неспецифических реакций РА с бруцеллезным антигеном, обработанным хелато-ром - двунатриевой солью этилен-диамнн-тетраукоусной кислоты (ЭДГА На или "Трилон Б"). При изучении эффективности данного метода была исследована 2931 проба крови животных разных видов кз 88 благополучных по бруцеллезу хозяйств Архангельской, Липецкой, Шсковской, Шн-зекской, Тверской- и Тульской областей,а также 1433 пробы сыворотки крови в динашке от 60 телок, иммунизированных вакцинами из штаммов В. abortus 82; 104-М; 19. 27 проб сыворотки крови от больных бруцеллезом животных из неблагополучных по этой инфекции хозяйств.108 проб с? 10 телок и 3 бычков, инфицированных Y. enterooolittca 0:9. В контроле использовали сыворотки крови интактных животных.

С цзлыэ изучения возможности дифференциации перекрестных р&ак ций, обусловленных иерсннипмя, использовали аллергический метод. Для этого изучали препараты, приготовленные кз бруцелл (штамш 19 и 54) н иероиний сероварианта 0:9, выаусенные ацетоном о последующей солевой экотракцией, а таю® бруцэллин ВКЗЗ. В опытах было использовано 56 морских свинок, инфицированных Y.entorooolltlca 0:9 и 44 свинки, иммунизированные вакциной т штамма В. abortus 19 или зараяеннда вирулентной культурой 8. abortus Б4, 21 кролик, инфицированный Y. ente-rooolltlca сероварнантов: 0:ББ.0:8.0:3 и 0:9, 12 гол. крупного и 6 гол. мелкого рогатого скота, инфицированных Y. enterocolltlca 0:9, а таю® б овец, вакцинированных В. ¡relitensls Рев-1, 9 овец, зараженных В. те Иtensis 102 П и 15 коров, инфицированных нлн ишуннякрованних культурами R abortus 54, 104 U и 82. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах, где регистрировали случаи позитивных реакций о бруцеллезными днагкоотшуиамя, последовали аллергическим методом 2555 животных резных видов с бруцеллшоы В,'1Э&

Для подтверждения наличия перекрестных серологических реакций, обусловленных Y.enterocolltlca серовариант 0:9, в благополучных по бруцеллезу хозяйствах исследовали бектериодогичеаскы методом пробы кала. мочи, секрета молочной железы, влагалищной слизи, а таккэ смывов о вева и о кормов. Бактериологические исследования на нерсиниоэ проводили в соответствии о рекомендация®! "Дифференциальная диагностика бруцеллеза и иероинноаа и мэры по их профилактике" (1991), а на бруцеллез - в соответствии о "Наставлением по диагностике бруцеллеза животных" (1982). В 16 хозяйствах 10 районов йэсковской, Тверской и Курской областей было исоледовано бактериологически на иерсиниоз 130 проб биологического материала от 130 лошадей и 357 проб от 48 коров, реагирущих при исследовании на бруцеллез. В том чюзлэ в 5 хозяйствах Иэсковской области, о целью уточнения зпизоотн-

чеокой ситуации по бруцеллезу, провели диагностический убой 8 коров о последующим бактериологическим исследованием на бруцеллез и иерси-нио8 лимфатических узлов, паренхиматозных органов, коотного мозга, плодов н содержимого полостей организма. Биологические овойства 30 полевых культур иерсиний, выделенных от животных, изучали в сравнении о референтными штаммами. Дополнительно изучали овойства 14 культур референтных штаммов Yersinia enterooolltloa сероварианта 0:9, полученных при их пассировании через организм сельскохозяйственных животных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культурально-корфологичеокив, тинкториальные, биохимичео-кие и генотшзические свойотва Yersinia enterooolltloa Изучение 30 полёвых изолятов нероиннй и 14 культур, ввделеных от экспериментально инфицированных животных, в сравнении о референтными штаммами: Y. enterooolltloa N-My-0 (серовариант OG); N-P-311 (0:8); N-P-77 (0:ББ); К-My 79В (0:9); N-P-219 (0:6) показало,что все они обладает типичными для данного вида бактерий свойствами. На плотных питательных средах, через 24 часа инкубации при 22-28*С вырастали прозрачные колонии, иыеюцие округлую форму о ровными краями диаметром 0,6-1,6 мм. В косом проходяпэм свете колонии имели голубоватый оттенок. При продолжении культивирования округлость и прозрачность терялиоь. На среде Эндо через 24-36 часов вырастали блестящие, шлкиэ, выпуклые колонии, в последующи увеличвавдиося в размере до 2,0 мм и приобретающие розоватый оттенок. При росте на ШБ через 84 часа отмечали равномерное помутнение среды с выпадением осадка в после душие сроки. Еатаерни окрашивались всеми анилиновыми красителями. по Граму не окрашивались. При микроскопии мазков из агаровых

культур бактерии имели вид палочек длиной от 0,7 до 1,4 мкы. Подвия-нооть бактерий определяли по характеру роста на n/д агаре и методом

о

фазово-контрастной микроскопии. При температуре 37 С бактерии теряли подвижность, а при 40°С и низа 4*С их рост прекращался. При 43 С и вше наблюдали отмирание иерсиний. Идентификацию бактерий рода Yersinia и дифференциацию микроорганизмов вида Y. entorooolitlca от микроорганизмов других родов я видов оеиейства Enterobaaterlaosaa проводили по гсультураяьио-биохкшческим свойствам.

ПЬ результата}-! исследований совместно о сотрудниками ИИ Нечерноземной зоны РФ н ЮиКШ УААН разработана схеш идентификации родов и видов выделенных иерсиний по методике, включающей следувэдо тесты: теот на оксидазу, сероводород, индол, уреаву, определение подвнкнооти бактерий, посев на ореды о глюкозой, мальтозой, ракно-зой. лактозой, сорбитом, сахарозой, рафинозой, субстраты, оодержедке ливин,орннтнн, фенилаланин на среду Кларка (для поотановкн реакции о метиловш краснш и пробы Фогео-Лроскауера) и теот на определение утилизации цитрата Na на среде Симмоноа.

Результаты, полученные при использовании СИВ н ПЗДЭ, не кнели отличий от результатов, получанных при использовании дифференциальных сред в пробирках, что позволило в последующих исследованиях широко попользовать данные системы и сократить' время затрачивавдае на проведение идентификации микроорганизмов.

Таким образом было установлено окодотво некоторых фенотипи-ческия овойств мккроорганивыов рода бруцелл и иероиний. В то ш время по генотипическим признакам отпечено, что бруцеляы и иерогегаи не имеют обвдх нуклеотидных последовательностей ДНК и, следовательно, могут быть дифференцированы друг от друга в реакции ДНК -ДНК гибридизации (степень подобия ДНК бруцелл и иерсиний 0,4- 0,62, Р <0,05).

- 10 -

Характеристика антигенов, приготовленных на бактерий вида У. егЛегоооПиоа и их свойства Сравнительная оценка антигенов, содерязгцнх У.впЫгоооНЫса 0:0 в концентрациях 0.5х1СР: 1х109; 1,5x10^, 2х109: Зх1§ и 6х109 к к.

показала, что наиболее активным в РА является препарат о концептра-

ч ч

цкей 2x10 3 м. к. /ил. Повышение концентрации бактерий до 6x10 и. к.

существенно не влияло на качество проявления реакции

Результаты исследования гиперишунных сывороток к иерсиниям се-ровариантов: 0:9, 0:3; О: 6Б и 0:8 в РА О гошлогичньш И бруцеллезным антигенами представлены в табл. 1.

Таблица 1

Титр антител в РА о бруцеллезным и иероиниозными антигенами

.......1...........—1......... | Серова-1 Титр агглхтгинняов с иерсиниоаньш алтю^аш:_ С единым

Ш !рианты | | | 1 бруцел-

п/п|У. епЬе- |<$ормали-1 карболк- { кнактиви- | живая куль- лезным

|гооо11-|низнро- | низиро- I рован про-) щ« антиге-

| иоа ¡ванный | ванный | | 1 л .......... 1. греванием |10 оут. |2 оут. ....... 1, . 1 ном

1 0:9 1:3200 1:1600 1 800 1:3200 1 3200 1: 1600

0:0 1:25600 1:6400 1 200 1:6400 1 12800 1: 1600

2 0:9 1:6400 1:800 1 100 1:3200 1 6400 1: 800

3 0:9 1: 3200 1:800 1 1600 1:3200 1 3200 1: 800

5 0:8 1:25600 1:3200 1 1600 1:3200 1 25600

6 0:8 1:25600 1:400 1 1600 1:200 1 1600 -

гу Г 0: БВ 1:12800 1:6400 1 3200 1:12800 1 25600 -

0 0-.БВ 1:1600 1:3200 1 3200 1:1600 1 12800 -

9 0:3 1:6400 1:800 1 1600 1:3200 1 6400 -

10 0:3 1:3200 1:3200 1 1600 1:1600 1 3200 -

йз представленных результатов видно, что несмотря на разницу в уровне агглютининов при постановке РА о гомологичными к гетерологич-ным антигенами, высота титров иерсиниозных (серовариант 0:9) антител, перекрестно взаимодействующих о бруцеллезный дкагностнсу;,:ом значительна (1:800 - 1:1600). При статнотичеокой обработке установлено, что разница в титрах агглютининов к антигену иа У. еп1егооо1 оа сероварианта 0:9 и бруцеллезному диагностику^ била ке достоверной (Р>0,06). Это указывает, на возможность возникновения оакбок пр^отаиовлзяян диагноза ка бруцеллез. 1Ъ данным наши иоследовагасй антигенное родство кврсиикй с бруцедлами было выракеио только у се-роварнвнта 0:9, у других (0:6В; 0:3 и 0:8) перекрестных реакций с бруцеллезным антигеном нами не установлено. Испытание опытных серий антигенов показало, что корпускулярный иерснниозные антигены из нен-нактивированных клеток иерскний и бактерий, кнактквированных формалином, обладает болео внсоиоЯ чувствительность» по отнотангаэ к гомологичным сывороткам по сравнению о антигенами, инактнвированнкми прогреванием или консервированными фенолом. Однако о увеличением срока хранения неинактивкрованньи антигенов от 2-х до 10 сут. их активность значительно снижается.

Изучение специфичности опытных • серий кёронниозных антигенов, приготовленных по различным методикам, о бруцеллезной и иероинкозной сыворотками, в сравнении о единым бруцеллезный антигеном в РДСК, показало, что препарат оерии N1-2 взаимодействует о гомологичной сывороткой, разведенной 1: Б, в то время как о бруцеллезной оывороткой в том яе разведении реакции отшчено ие было. Антигены других серий (1-1; 2-1; 2-2; 3-1 и 3-2), невавиоиш от споооба инакгнвацн, проявляли выраяеннуп активнооть как о гомологичной так л о гетерологичной сыворотками.

Установлено, что дифференциация перекрестных реакций, вызванных

Y. enterocolltloa оероварканта 0.9 от реакций, обусловленных бруцел-даш методом РБП, таrase как и в РА не возможна.

Гааработка серологического метода • дифференциации перекрестных реакций Результатупервого опита по изучению сроков персиотенцни антител в сыворотке крови экоперишнтально зараженных иерсинкями бычков к бруцеллезному и иерснннозноыу антигенам, показали, что реакции о го-шлогичным антигеном сохраняются в 2 раза длительнее, чем с гетеро-логичнш. Перекрестные реакции в диагностических тиграх £00-800 Ш/т наблюдаетоя в течение месяца. При исследовании на 45 день выявлены сомнительные реакции (25-50 ИЕ/мд), а в последующе сроки (до 105 дня вклишгтелъно) реакции о бруцеллезным антигеном бьда отрицательными. Полученные данные свидетельствует о наличии антигеннородотвен-г:ых детерминант у возбудителей бруцеллеза и кнвечного керсшшоаа, аызываеыого Y. enteroooütlca сероварианта 0:9.

При поотановке РА о 92 пробами сыворотки крови, полученными от . 2 бычков, 3 телок олучного возраста и 3 нетелей в равные сроки лее экспериментального зараденния Y. enterooolitioa сероварианта 0:9 (опыт 2) было установлено, что в 79,3% случаев в РА выявляются антитела, вступавдге в реакцию о бруцеллезным антигеном. При зтом 38% (35 проб) ла них выявляли в титрах 100 Ш/цл и вьееэ, и 28% (26 проб) - в титре 50 13/ид. Кошлементсвя8Ывавдиэ антитела в РДОК с бруцел-яееиын антигеном, выявляли в 32,6% проб,а с иерсиниоаным - в 44.5%. 1&ЛИЧ}» антител, вступающих в перекрестное взаимодействие о бруцел-дэвеыы диагностикумоы в РШ, отмечали в 41,3% случаев. Исследования G0 сывороток крови от иммунизированного против бруцеллеза крупного рогатого скота также показало, что антитела к бруцеллам вступают во взаимодействие с мерсиниоэнш антигеном. Так, 58,3% из исследованных проб реагировало в равведенях от 1:50 до 1:200, в то время как реак

цию в тех 2® разведениях, но о гомологичным антигеном наблюдали в 31,6Х случаев. В разведении 1:400, как о бруцеллезным так и о иерок-нноэным антигенами реагировало 10 сывороток крови (16,б X от числа исследованных проб).

Последодвание сывороток крови животных в динамике показало, что агглютинины, образующиеся на введение Y. enterooolitioa оероварианта 0:9, выявляются в РА о бруцеллезным диагностикам в течение 2 шс., а о иероиниозным - до 4 нес. Исходя из данных экспериментальных доследований можно сделать заключение, что в случае заражения скота возбудителем Y.enterooolitioa оероварианта 0:9 исследование общепринятыми серологическими методами тхет привести к постановке ошибочного диагноза на бруцеллез.

Результаты исследования в динамике проб молока от коров, эapare иных Y. enterooolitioa оероварианта 0:9, такие показал! наличие перекрестно реагирующих антител в КР.

Таким образом, ни один из испытанных нами серологических методов для проведения дифференциальной диагностики не пригоден. Поэтому на следующем этапе работы мы изучали возможность использования для этой цели модифицированной РА о бруцеллезным антигеном, обработанным ЭДТЛ Na из расчета 10 мкмоль/л антигена

Проведенное исследование 1433 проб сыворотки крови, полученных от 60 телок в различные сроки после иммунизации противобруцеллезнымя вакцинами, показало идентичность титров агглютининов в РА со стандартным и обработанным ЭДТА антигенами. При исследовании сывороток крови от 27 больных бруцеллезом коров и 108 проб от И голов крупного рогатого окота, взятых в разные сроки после заралзения Y. enteroco-lítioaO:S, были получены аналогичные результаты. Следовательно, специфические антитела, содержащиеся.в сыворотке крови иммунизированного противобруцеллезными вакцинами,инфицированного Y. enteroooli-

tica 0:9 или больного бруцеллезом окота, является устойчивыми к воздействию ЭДТА. В то же время у животных из 9 благополучных по бруцеллезу ферм, в которых регистрировали положительные или сомнительные результаты в ГА о бруцеллезным антигеном (от £5 до 200 ЫЕ/мл), при повторном исследовании в РА с антигеном, обработанным ЭДТА неспецифические антитела утрачиЕалноь. Таким образом, перекрестные показания РА при «следовании животных в благополучных по бруцеллезу хозяйствах шкно устранить, используя в реакции антиген, обработанный ЗДТА, за исключением случаев, когда животные сенсибилизированы Y. enterooolitica оероварнанта 0:9.

Результаты комиссионного испытания метода (табл. 2), проведен-

Таблица 2

Результаты комиссионного испытания сывороток крови крупного рогатого окота в стандартной РА и в РА с бруцеллезным антигеном, обработанный ЭДТА

| Результаты исследования в РА

Количество |Со стандартным нтигенои| С антигеном + ЭДТА

проб I—-1-1-(-,-1-

|отриц. |соынит. |пололят. |отриц. |сомнит. ¡положит.

__I-1_I_I_1_1_

Сыворотка крови здоровых коров и телок 14 проб 14 0 0 14 О О Сыворотки крови коров, вакцинированных против бруцеллеза или варакэнньк культурой шт. Bruoella abortus 54 29 проб 11 27 1 1 27

Сыворотка крови от коров иа хозяйств Тверской области, благополучных по бруцеллезу 8 проб 0 8 ' 0 8 0 0

ного ка базе Тверской облветлаборатории о участием представителей ВГНКЙ и ЦЕЛ , показали, что специфические антитела в сыворотке крови животных, иммунизированных или зараженных бруцеллами,являются устойчивыми к воздействию ЭДТА, а в случаях выявления неспецифических антител в РА, при перестановке реакции о антигеном, обработанным ЭДТА наблюдается их блокирование. По результатам испытания диагностической ценности РА о ЭДТА комгаокя рекомендовала Главному управлению ветеринарии с Государственной Комиссией Совета Инниотров СССР по продовольствию и закупкам внедрить метод в ветеринарную практику.

Разработка аллергического метода дифференциации перекрестных серологических реакций, обусловленных Y. enterooolltloa сероварианта 0:9 Учитывая, что серологическими методами дифференцировать реакции, вызванные сенсибилизацией или инфицированием организна животных Y. enterooolltloa сероварианта 0:9 не удается, мы изучили возможность использования для этой цели реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) путем исследования животных аллергенами из бруцелл и иероиний.

Сравнительное испытание бруцеллина ВЮВ о опытными сериями аллергенов, приготовленья методом солевой экстракции из S- форм бруцелл (штаммы В. abortus 19 и 64) и Y.enterooolltloa сероварианта 0:9), вью утаенных ацетоном покавало, что на введение опытных серий аллергенов морским свинкам, зараженным иерсиниями или бруцеллаш, проявлялась реакция ГЗТ, в то время как на бруцеллин ВИЭВ (R- форма) реакции отмечали только у животных, зараженных или иммунизированных бруцеллами, а свинки, иммунизированные Y. enterooolltloa сероварианта 0:9, на введение этого препарата не реагировали. Результаты, полученные при нопытанин аллергенов из R- или S-форм бруцелл на модели

Морских свинок, в последующем были подтверждены в опытах на крупном рогатогом скоте. Так у 6 коров, вакцинированных культурой штамма В. abortus 19 или 104 Ы, имели место положительные реакции на оба диагностику ма У 6 гол., зараженных иерсиннями, аллергическая реакция на введение бруцеллина ВИЭВ отсутствовала, в то время как на аллерген из S-форм бруцелл (медицинский диагностикум) реагировали две головы крупного рогатого окота (ЗЗ.ЗХ). У здоровых коров контрольной группы реакций на введение аллергенов не отмечали.

При введении бруцеллина ВИЭВ разными методами б овцам, 6 коровам, 21 кролику и Б6 морским свинкам, инфицированным Y. enterocolttl-оа сероварианта .0:9, развитие реакции ГЗТ не наблюдали ни в одном случае. В качестве контроля использовали 16 овец, 1Б коров и 44 морских свинки,зараженных или иммунизированных бруцеллами. Исходя из подученных данных нами было сделано заключение, что на бруцеллин ВИЭВ у животных, вараяэнных иерсиннями, перекрестных аллергических реакций не возникает, и этот препарат может бить использован для диф-ференциациальной диагностики перекрестных серологических реакций, обусловленных Y. enterooolitioa оероварианта 0:9. На основании результатов комиссионного испытания аллергический метод дифференциации-был рекомендован для внедрения в практику.

Положительные результаты экспериментальной проверки РА о ЭДГА и аллергического метода получили подтверждение и в производственных условиях. Так, при исследовании 89 проб сыворотки крови крупного рогатого окота из хозяйотв Тверокой, Мооковокой и Магаданской облаотей антитела в РА о бруцеллезным антигеном регистрировали на уровне 50-400 ME/wl При повторном исследовании этих кв оывороток о бруцел-лезньа! антигеном, обработанным ЭДГА, реакции выпали в 84 случаях,

о

что соотавило 91 Z от числа иооледованннх прб, реагирующих в стандартной РА. Исследование в РА о ЭДТА 324 проб сыворотки крови от ко-

ров из б хозяйств Архангельской и Липецкой областей показало, что неспецифическая агглютинация, наблюдаемая в 20 случаях со стандартным антигеном, полностью утрачивалась при использовании хелатора.

В ряде благополучных по бруцеллезу животноводческих хозяйств, где регистрировали олучаи перекрестных реакций о бруцеллезным антигеном, было проведено иопытание комплексного серо-аллергического способа дифференциальной диагностики перекрестных серологических реакций о использованием бруцеллезного антигена,обработанного ЭДТА и бруцеллина ШЭВ (табл. 3)

Таблица 3

Результаты испытания комплексного метода дифференциации перекрестных оерологических реакций при исследованию! животных в производственных условиях

i |Коли- ...... 1 Вид | 1 Всего | Из них реагировало 1 |Результат

Область чество |живот-| иссле-| положитель но |РГЗТ(гол)

|хозяй- ных | дован- | РА |РА с | РБП | РДСК, |-- -т-

| отв 1 1 но проб| | 1ЭДГА! 1 1 1 1 РСК (пол. |отр. 1 1

псковская 3 к. р. с. 606 16 3 7 3 0 606

Тверская 3 к. р. с. 412 29 12 1 0 0 412

Ивановская 1 лошади 239 22 16 5 18 0 239 .

Курская 1 лошади 130 8 3 2 3 О 130

ВСЕГО: 8 1387 75 34 16 24 О 1387

Из представленных в таблице данных видно, что у отдельных животных. с сывороткой крови которых были получены положительные реакции с бруцеллезным антигеном, при повторном исследовании с антиге-

ном,обработанным ЭДГА, результаты РА оставались неизменными, а паль-пебрадьная аллергическая проба о бруцеллином ВИЭВ во всех случаях бша отрицательной. Следовательно неспецифические показания ГА, наблюдаемые в ряде случаев при исследовании животных в благополучных хозяйствах, могут быть устранены путем повторного иооледования оыво-роток крови в ГА с ЭДГА, а при необходимости - аллергической пробой с бруцеллином ЕИЭВ.

Для подтвержден;« того, что в случаях, когда положительные показания РА с антигеном, обработанным ЭДГА сохраняются, а результаты аллергического исследования с бруцеллином ВИЭВ отрицательные, с целью установления причин их возникновения в 15 благополучных по бруцеллезу хозяйствах, провели бактериологическое исследование на нероиниоэ биологического материала, отобранного при жизни животных. В некоторых из этих хозяйств проводили диагноотичеокий убой окота и исследование материала на бруцеллез и иероиниоз. Всего последовало бактериологическим методом 487 проб от 178 кивотньсс (табл. 4).

35з данных табл. 4 следует, что причиной перекрестных серологических реакций с бруцеллезным диагноотикумом в хозяйствах данных областей явились в основном бактерии вида Y. enterocolttioa свровариак-. та 0:9. Культура бруцелл ни в одном случае выделена не была.

Таким образом, использование разработанной методики позволило исключить бруцеллез в животноводческих хозяйствах, сохранить поголовье продуктивного скота и предотвратить неизбежные затраты на проведение мероприятий, предуоиотренных действующэй инструкцией.

На основании данных, полученных в экспериментальных и производственных условиях была разработана методика .дифференциации перекрестных серологических реакций, в том числе обусловленных Y. entero-oolitioa еероварианта 0:9 в хозяйствах, благополучных по бруцеллезу животных.

Таблица 4

Результаты бактериологического исследования на иерсинкоэ бкоматериала от животных, реагирующих в РА с бруцеллезным антигеном, обработанным ЭДТА . при отрицательной аллергичеокой пробе

Количество| Результаты исследования *

-1-(-1-1-1--

Рай-|Хозяй|йсследо-|Кол-во|Кол-во вы} Из них по видами

онов| отв I вано | проб |деленных |Y. enterojY. inteHY. ICrls-| Y. frlde-I |животных| I культур |oolitioa|iredla Isenil Irlcsenii

--1--1-J-1-1-1-1-1-

Московская область (крупный рогатый окот) 7 11 36 284 19 15 2 1 1

Тверская область (крупный рогатый окот) 23 12 73 8 8 0 0 О

Курская облаоть (лошади) 1 1 130 IX 3 3.0 0 О

10 15 178 487 30 26 2 1 1

* - Примечание: от отдельных зшвотных наряду с У. еп^,егосо11иса были выделены культуры нерсиний других видов

вывода

1. Разработана схема бактериологической диагностики иерсиниозов и идентификации культур иерсиний различных видов. Уотановлено, что бруцеллы и иерсннии не имеют общих нуклеоткдных последовательностей ДПК и обладают низкой степенью гомологии (0,4 - 0,5%), в связи с чем

реакция ДНК - ДШ гибридизации рекомендуется нами для дифференциации микроргшшзмов рода Bruoella и Yersinia

2. Антигены из неинактивировакньк клеток иерсииий или инакгиви-рованньи и консервированных формалином обладают 'более высокой чувствительностью по отношении к гомологичным сывороткам, по сравнению о антигенами инактивированными прогреванием или консервировании ш фенолом. Активность антигенов кз неинактивировакньк. клеток в процессе хранения быстро снижется.

3. Антигенное родство Y.enterooolitioa с бруцеллами выражено только у сероварианта 0:0,у других (0:8;0:5В; 0:3 и О. б) перекрестных реакций о бруцеллезным антигеном в проведенных опытах не установлено.

4. У крупного и мелкого рогатого скота, экспериментально а араке иного Y.enterooolitioa сероварианта 0:9, при исследовании сыворотки крови в РА, РСК, РДСК, РЕП и молока в КР наблюдаются перекрестные реакции в диагноотичеоких титрах как с гомологичным, так и о бруцеллезным антигенами, что может привести к постановке ошибочного диагноза на бруцеллез и, как следствие, вызвать неоправданные экономические затраты на организацию и проведение противобруцеллеаных ме- ■ ропрнятий.

5. Шопецифические показания РА к бруцеллезному антигену при исследовании животных в благополучных хозяйствах могут быть устранены путем использования в реакции антигена, обработанного двунатрие-вой солью этилен-диамин-тетраукоусной кислоты.

6. Поверхностные антигены (ПА) из S- формы бруцелл или иерси-ний, полученные методом солевой экстракции и медицинский аллерген (S-), при введении животным, сенсибилизированным бруцеллами или иерсинияии, вызывает перекрестную аллергическую реакцию. В связи о этим, указанные препараты не пригодны для проведения дифференциал*-

ной диагностики бруцеллеза и кишечного иерсиниоза, вызываемого У. еп-1егосо1ИЛоа оероварианта 0:0.

7. Еруцеллин ВЖВ (аллерген из из й-формы бруцелл), не вызывает аллергических реакций у животных, варалзнных нерсиниями и в следствие своей специфичности рекомендован наш для дифференциальной диагностики бруцеллеза от иерсиниоза.

8. Данные о том. что при исследовании сывороток крови .'жвотных, у которых в РА о ЭДГА реакции не устранялись, а результат аллергической пробы о бруцеллином ВИЭВ был отрицательным, подтверждены выделением на биоматериала от этих животных культур У. «п1егоооПиоа оероварианта 0:9 в экспериментальных и производственных условиях.

9. Разработана методика, позволящая проводить дифференциацию песпецифическнх серологических реакций, в том числе обусловленных У. ег^егоооПИоа 0:9, выявляемых при исследовании животных на бруцеллез в благополучных хозяйствах, включачиая проведение комплексного серологического (РА и РА с ЭДГА) и аллергического (бруцеллином Е5ИВ) методов исследования.

10. Применение разработанной методики дифференциации перекрест: ных серологических реакций при исследовании животных на бруцеллез, в ранее благополучных хозяйствах позволило исключить данную болезнь и установить циркуляцию У. егАегоооШлса оероварианта 0:9.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Внедрена в практику ветеринарных лабораторий и хозяйств методика дифференциации неспецифических реакций при исследовании животных на бруцеллез.

2. Материалы исследований использованы при разработке научно-обоснованной системы мероприятий по профилактике и оздоровлению поголовья сельскохозяйственных животных от бруцеллеза {Утверждены

ВАСЯИЛ, 1890г.)

3. Рекомендации " Дифференциация неспецифических показаний ое-рологических реакций на бруцеллез при исследовании животных в благополучных хозяйствах"- одобрены Ученым Советом ВИЭВ (1.08. 89г. .протокол N17), Бюро рабочей комиссии "Профилактика бруцеллеза и туберкулеза животных" ОПКВет БЛСХНИЛ (18. 08. 89 г. , протокол N3) и утверждены директором ВИЗВ (24.08. 89г.).

4. "Штодические рекомендации по дифференциации неспецифических серологических реакции (РА) при бруцеллезе животных в благополучных хозяйствах"- (утверждены Главным управлением ветеринарии láCX и продовольствия СССР. 22.10.91г,).

5. Рекомендации "Дифференциальная диагностика бруцеллеза и ' нерсиниоза и меры по юс профилактике"- (одобрены Научно-техническим

ооветом Гсюагропрома ^черноземной зоны PCSCP, протокол N5 от 23.04.1990 г.).,

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Конорова A. JL .Ефремов ВС. Сравнительное изучение ДНК микроорганизмов рода бруцелла и иерсиния //Бюд. ВИЭВ Вып. 61. 1987 г. -• С. 61-62.

2. Ефремов В. С., Касьянов A. IL , Бабкин А. Ф. Авторское свидетельство на изобретение "Способ дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза"// N 1667984, от 29.01.87 г.

3. Ефремов В. С. Шявление антител к бруцеллезному антигену у животных, экспериментально зараженных Y. enterooolitioa 0:9// Материалы Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным" (тезисы докладов). Новосибирск, 1989 г. - С. 226.

4. Ефремов В. С. Перекрестные серологические реакции к бруцел-

лезному антигену у животных, экспериментально зараженных йерсиния эн-тероколитика серовара 0:0 // Пал. ИЮЕ Вып. 63. 1989 г. - С. £7-32.

5. Ефремов В. С., Касьянов А. Н. , Бабкин А. Ф. Дифференциация перекрестных серологических реакций,обусловленных Yersinia enteroooll-tioa 0:9, при диагностике бруцеллеза //Вол. ВИЗЕ Вып. 73-74.1989 г. - С. 89-93.

6. Роиахов В. А., Ефремов В. С. , Касьянов А. ¡1, Тягуннна Е. А. Применение антигена, обработанного ЗДТА, о целью устранения неопеци-фических показаний РА при исследовании крупного окота на бруцеллез // Ветеринария. N 3- 1990 г. - С. 25-27.

7. Рекоь«ядации "Дифференциальная диагностика бруцеллеза и нерсиниоза и меры по их профилактике". Брошюра, 28 стр. ,!<£. .Рооагроп-ромнэдат, 1991г. .тираж 10000 экз. (в соавт.).

0. Мельниченко В. И., Кувьмиченок А. Е , Ефремов R С., Ромахов R А., Артюшин С. К. , Коромыслоа Г. Ф. ДНК гкбридизационный зонд для идентификации бруцелл // Материалы научной конференции "Проблемы изыскания синтеза и производства новых препаратов для ветеринарии" (тезисы докладов) Самарканд. 1994 г. - С. 66-67.

9. Ефремов Е С., Ромахов В. А., Мельниченко Е И. Дифференциация неспецифических реакций при исследовании животных на бруцеллез в благополучных хозяйствах // Материалы научной конференции "ПроОлеыу изыскания оинтеза и производства новых препаратов для ветерина-рии"(тезисы докладов) Самарканд. 1994 г. - С. 33-34.