Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические свойства авиреовирусов диагностика вызываемого ими заболевания

Государственная комиссия Совета Министров СССР по продовольствию и закупкам

Украинская ордена Трудового Краспого Знамени сельскохозяйственная академия

На правах рукописи АБДИЛАЗИЗ ФАХИМ АЛИ

УДК 619:616.988:636.5

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДВИРЕОВИРУСОВ, ДИАГНОСТИКА ВЫЗЫВАЕМОГО ИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Авторе ¡5) ерат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Киев — 1990

Работа выполнена в лаборатории изучения болезней птиц Украинского ордена Трудового Красного Знамени научно-нсследовательского института экспериментальной ветерннарии.

Научный руководитель — д о к т о р ветеринарных наук,

старшин научный сотрудник

B. В. Герман.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук,

проф., член-корр. ВАСХНИЛ А. И. Собко;

старший научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук

C. В. Миськевич.

Ведущая организация — Сумской сельскохозяйственный институт.

Защита диссертации состоится Л Л 1990 года

в /V часовминут на заседании Специализированного Совета К 120.71.05 в Украинской ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственной академии по адресу: 252127, Киев-127, ул. Полковника Потехина, 16, учебный корпус № 12, аудитория 412.

Просим принять участие в заседании Совета или выслать отзыв на автореферат в 2-х экз., заверенный печатью по адресу: 252041, Киев-41, ул. Героев обороны, 15, УСХА, секретариат специализированных советов.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан „ ^ " »с-с^^Л-_1990 г.

Ученый секретарь специализированного Совета

В. А. Бортничук

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность те.та

Птицеводство - вачснайшая отрасль животноводства, дащая високоценяне продукты для питания человека.Повшение продуктивности а сохранности дтицн,спасение потерь и улучшение качества яиц я мяса во многом обусловлено успехами науки я,прежде всего, ветеринарной.Однако различные заболевания продолжают сникать продуктивность птицы,отрицательно влияют на ее сохранность и более того,сдерживают развитие племенного дела в целом по отрасли.Поэтому ,профилактика и борьба о заболеваниями птиц,б том числе с медленными,латентно-пероастирущями инфекциями сохраняет свою актуальность.

В последние годи в СССР,как а в других странах мира,наблюдается некоторая рост распространения авиреовирусного заболевания,© котором первые сведения в литература появились во второй половине пятидесятых годов,хотя вирус бил идентифицировал значительно позднее.а его этиологическая причастность к заболеванию доказана лишь в семидесятых годах.

Авярео'вярусное"заболевание до настоящего времени остается ыалоязучеяяыи яз-за весьма разнообразного течения болезиз, зарьирукщих изменений выявляемых при патологоанатогачесном доследования птицы п трудностей при доказательстве этиологической роли авиреовирусов.Позтому.ещо сегодня в разннх странах, заболевание первоначально получает названа о по доиинирувдим признакам а только позднее,на основании изучения этиологии и свойств вируса,болезнь относят к реовирусной" инфекции.

В СССР аввро оварусн впервые выделены от индеек в начале 70-х годов Германом В.В.,который изучил вх свойства и осуществил идентификацию возбудителя.В эта же годы были выделены реовирусн от гусей Л.М.Коятрамавячуо я изучены вх свойства,Однако в целом остаются нензученныыз аэяреовярусы.внделэшше о? кур, отсутствуют данные об антигенной в-гриабальностя шташов вируса,их биологичосклх овэЙотзах.ТрэЙуег созерагвйстасванш диагностика заболевания, меры профилактики я борьба.

Цель исследованяя. Целью яастеяшях исследования бнло:

- выделить о® кур. я еидеок реовярусы и ивучять вх основные сзФЗсгва^

- разработать. метода ЗДау во/этик а реоввруснсго заболевания У кур;

- обосновать рациональную систему мер профилактики и борьбы о реовирусной инфекцией у кур.

Основные задачи исследований. Для достижения намеченных целей били поставлены следующие задачи:

- провести обследование птицеводческих хозяйств в выделить реовяруоы от кур и индеек;

- изучить основные физико-химические и биологические свойства реовирусов выделенных от кур я яндеек;

- изучить серологическое родство штаммов авиреовярусов выделенных от кур и индеек;

- изучить методы серологической диагностики авиреовярусно-го заболевания;

- дать оценку эффективности мер борьбы с авиреовирусным заболеванием.

Научная новизна. Впервые в СССР проведено изучение реови-русной инфекции у кур,получены сравнительные данные о физико-химических и биологических свойствах авиреовирусов выделенных от кур и индеек.

Установлено,что для очистки вируса могут быть использованы органические растворатели;вирус .лишенный липидной оболочки устойчив к поверхностной денатурации л максимально накапливается в водном слое при центрифугировании.

. Разработана эффективная схема иммунизации для получения специфической к авяреовирусам сыворотки крови на кроликах и козах.

Не выявлено антигенных и серологических различий меаду штаммами авиреовирусов выделенных от кур и индеек.

Предложена методика получения эратроцитарного препарата для выявления и идентификации авиреовирусов в РИГА. ■

. Практическая ценность работы. Установлено широкое распространение авиреовирусов в птицеводческих хозяйствах,показана целесообразность организации мер профилактики и борьбы с вызываемыми имя заболеваниями молодняка и взрослой птицы кур яичных и мясных пород.

Разработаны методы и средства диагностики авиреовярусчзого заболевания у кур.Для ветеринарной практики предложены Методические указания по лабораторной диагностике реэвирусного заболевания сельскохозяйственных птиц.Рассштрены и одобрены Методической комиссией УНШЭВ (протокол 16 от 13.10.90 г.) и

аетодяческяе рекомеядацв- по диагностике,профилактике и мерам борьбы с реовирусншя! згоолеваляям:! сельскохозяйственной пищи. Рассмотрены и одобрена Главный Управлением ветеринарии с Госу- ■ дарственной ветеринарной инспекцией при Совете Министров СССР по продовольствии и закупкам 11.04.00,15 043-6/4.08.

Апробация. Материалы диссертация доложены и одобрены:

- на заседаниях .1 отчетных сессиях ученого Совета и проблемного Совета УН1ШВ 1988-1950;

- 8-й научно-практической конференция молодых ученых и специалистов,посвящгяной 70-а.годоЕЩше Великой Октябрьской Социалистической революции (г.Харьков, 1987 г.);

- республиканской научной конференция молодых ученых (г.Харьков,1988 г.);

- республиканской научной конференции молодых ученых (г.Харьков,1930 г.);

- конференции национального отделения СССР Всемирной научной ассоциации по.птицеводству ( Рига, 1980 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, одна в печати.

Положения выносимые на защиту.

- результаты исследований по выделению авиреовирусов от кур а индеек п изучение их физико-химических д биологических свойств;

- усовершенствование диагностики авиреовирусного заболевания у кур я индеек;

- обоснование к системе мер борьбы о авиреовирусным заболеванием,

Обьем и структура.работы. Диссертация изложена на Юб страницах машинописного, икота и-включает: общая характеристика работы,обзор литературы,собственные исследования,обсуждение результатов исследований,вывода,практические предложения, список литературы,приложение.

Работа иллюстрирована 20 таблицами,2 риоуякамя.Список использованной литературы включает 121 ниточников из них 110 иноохранных»

2. СОБСТВЕННЫЕ ШЖДОЗАЮЯ Материал*; и методы

Работа выполнена в течение I987-ISS0 гг в лаборатория изучения болезной птиц Украинского научно-исследовательского института экспераыентальной ветеринарии (УН1ГЛЭ5).

Вирусы. В работе использовали полевые эпизоотические штаммы оЕиреовирусов выделенных при выполнении работа "BSQ", "ВЕ-88", "IIT-88", "3-8Б", "Т.ш-88", "Ш-8Э", "Ж-89".Эталонный штамм авиреовяруса"С13-?3",выделенный и идентифицированный Герман В.В. я эпизоотические штамма авирсовирусов хранящиеся в банке лаборатории - 'Т-65", 'Tß-S4", "K3-S6", "КН-Б6".3 работе были использованы и другие вирусы - вакцинный La-Sota ,варус инфекционного ларянготрахеита (ИДТ),болезни Марека,аденовирус первого серотипа.

Куриные эмбтюнк, цыплята я др.животине. Куриные эмбрионы в цыплят, получала вз благополучных по реовирусной инфекции хозяйств.Всего в работе использовали 2000 эмбрионов,300 цыплят, 30 петухов,30 индеек,25 кроликов и 3 козы.

Вирусологические я'ооле додан ¡'я. Вирусы выделяли от павшей и больной ппщы, используя средние пробы тканей д органов,а так же отдельные органы .Подготовка материала к заражения .велась общо приняты!,а методами в вирусожзгиз.Исследуемый материал ино-куляровали в хораоналлантоясную полость разваваэдимся куриным эмбрионом II-дневного. возраста.Эмбрмны после заражения инкубировали при +37°С 5 суток.енедневно овоскопаровала,удаляли павших, а оставшихся в живых размещала на 10-12 часов в холодильнике при +4°С.Затем их вскрывали в исследовали.

Калдая исследуемая проба патологического .материала проходила не менее 3 пассааей.

Титрование вируса проводили на куриных змбрионах.Титр вируса расчитывала по кегЬегг (1931)и модификаций Акмарина П.И (1961) а выражали в £ИД50/0,2 пл.

'. Идентификация вирусных изолятов. Для идентификации изоля-тов изучали.их основные физико-химические свойства,определяли тип. нуклеиновой кислоты и чувствительность к хлороформу по методу Майера А. и др.' (1977),чувствительность иsoлятез к дей-

0ТВ5ГО эфира и температуры определяли по методу Гобоso Г.С., ¿ерку С.Н.(1973) в ыедяфикации УНИИЭВ.

Серологически вирусные изоляты идентифицировали в ЕГА,

. жа.рдп.

Изучение биологических свойств штамноз авиреовирусоа.Проводили на куриных эмбрионах 11-дневного возраста,введением ви-руссодершцего материала в титре Ю-^ или в разведении 10"^ и объеме 0,2 мл в аллантоаснув полость.

%тогешость авиреовирусов для куриных эмбрионов определяли п(№абели,в течение 5 суток,токсичность вируса оценивали по выводимости зараженных эмбрионов. • ••

При изучении патогегчооти выделенных штампов азиреовиру-сов для суточных цыплят использовали два метода заражения: -оральный и подкоаннЗ;подкокнн!! и введением в подушечку стопы. Вируссодеркащпй материал в титре 10вводили в объеме 0,2мл в разведение Ю-4.Наблюдение за цыплятами продолжалось 30 дней. Серологические исследования провели на 10,20,30 дней.Опыт проводили в двух повторностях.

Павших в ходе опыта эмбрионов и цыплят исследовал;! бактериологически я патологоанатомически.

Очистка и концентрация авиреовируса. Очистку авиреовируса проводили методом удаления йалласишх веществ с использованием органического растворителя 20$ хлороформа Poison, a., Seizer и, (1954).Концентрацию вируса.осуществляли по методу Leberman к. (1966) осаждением ПЭГ-6000.

Хроматографию вируса вели на сефадекоеОленина Н,В.,Буи-' тедт Д.ВД1967), Sekiguohi К. ,Koide F.,Ka«amura Н. (1988),).

Получение гипериммунных сывороток к авяреовдрусу. Для получения специфической сыворотки крови.к авиреовдрусу иммунизировали птицу по схеме Усманходжаева А,.Закстельокой ¿,,(1965).

Были испытаны схемы- иммунизации- кроликов 2 яозЛТмггуняза-цию кроликов проводили, введением вируссо держащего' материала в объеме 0,25 ш 2 дня подряд в третье веко а последующую инъекцию подкошу в области шеи.Цикл повторили через 14 дней,кровь брали на 18 день.

Иммунизацию коз проводили внутривенно.введением вируса 3 дня подряд в дозах1.и 5 .мл.Курс повторяла через 14 дней, кровь брали через 18 дней.

Серологические исследования» Реакцию гемагглютинации. ставили на предметных стеклах и плексигласовых пластинках с использованием эритроцитов петуха 1,5$ и 1%.

Реакцию непрямой гемагглютинации РИГА,ставили микро и макрометодом с использованием эритроци тарного диагностикума для выявления специфических антител в сыворотке крови больной и переболевшей птицы,иммунизироЕааных. животных.Исполъзовали также эритроцитарннй препарат для обнаружения и идентификации авирео-вирусов в Хк оболочках куриных эмбрионов и в органах больных птиц.

Реакцию диффузионной преципитации (РДП) ставили в агаровом геле в чашках Петри и на предметных стеклах по методу oucthter (1548).ИспользоЕали 1% раствор агара Дихко и 9% агара УШЙЭБ приготовленные на:

а/ 8^-ном растворе хлористого натрия РН-7,2; б/ фосфатно-буфериом растворе,содержащем 0,85 хлористого натрия РН-7,2;

. в/ забуференном растворе содержащем дистиллированную воду; I. 25,155 г/л Jfagffi^ 2,9,073 г/л дисг.юдн КН4Р04

3,8,5 г 1;а01 на 726 мл пешого р.от£ора+ второго

раствора.

Диаысгр луво-К 5-8 т расстояние мездт лунками 3-6 мм.

Изготовление эритроци тарного бнтптельного препарата.

Пря разработке средств и йзгсйо® серологячеоной диагностики авлреоьирусного заболевания йш выполнены йссдедсаакая ко изготовлению антительного препарата й оегя&уаат? его использования в РИГА.

В основу игготоайФйие йыла положена методика воуцеп s.v. (IS5I) в Цазурлноц !Л.Г.(1971), я УНЖВ (IS80).

Хе^ш^отая изготовления препарата Еклотала следущае этапы:

I .Получение специфической иммунной сыворотки к авиреови-

руоу.

2.Праготовление кснсервирОЕанных эритроцитов барана (фор— малинизация-танизация эритроцитов).

3.Сенсибилизация, приготовленных эритроцитов иммунной сывороткой.

4.РссуспензяроЕаиие сенсибилизированных эритроцитов б 0,5£ глицерлкззирова^шо-м физрастворе (РН-7,2-7,4) в 10% концентрацш

' 5.Испытание специфичности я активности препарата. 6.Хранение и лиофилизацяя препарата.

2.2.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение штатов авиреовирусоа

Авиреовирусы были выделены при соответствующем исследовании проб патологического. материала отобранного из органов павших и вынуждено убитых кур и индеек птицефабрики "Заря" (3-88), Болчанокая (В-88).Введенская (ВЕ-88),Токаревская (т.ин-88),Пятигорская (ПТ-88),Петропавловская (1ГО-89),Енакиевская (ЕК-89) и других.Характерастика птицы и исследованного на авиреовирусы патологичеокого материала представлена в таблице I,

Таблица I

Характеристика птицы и патологического материала исследованного на авиреовирусы......

Изоляты Вйд лтищ! РНГА на Клинячео- Патолого- Иссле-

авирво- кие приз- анатомиче- дуеше

вируо наки окие из- органы, менения

I. В-88 Куры без клиника' • нефрит,ан- почка,

яичные терит,пери- сердце,

кардит яитечники

2. ВЕ-88 я * ' отставание нефрит,энте- почка,кв-

в росте,. рит лечник

еэъерошен-

нооть опе-

реная

3. 3-88 я + без кдвр^ки гепатит,холи- печень,

цистьт,небрит почки

4. ПТ-88 и • + авитаминоз теносиаовит акоудат

А(Б,Д,увели- иа суо-

чение суста- тавов

вов •

б. Т.ин-88 индейка + хромо та, уг- артрит эксудат

нетение из суста-

вов

6. ПП-89 бройлеры + угнетение некроз го- сустава

ловка бадр«н'

7. ЕН-89 й + ной костя П

Из данных таблиц!! следует,что основным ориентиром для вирусологических исследований служили данные, подученные при поло-ительном ретроспективном исследовании сывороток крови от птицы с признаками нехарактерного заболевания или без него.

Более .определенные данные о возможном развл таи реоБпрусноИ инфекции ш получили при патологоанатомическом исследовании птицы.Ориентиром для отбора на вирусологическое исследование па ' тологяческого материала было выявление у павшей ила вынужденно убитой птицы увеличенных почек,антерита,миодистрофии,теносинови та,некроза головка бедренной коо.тв.В. результате лабораторных исследований наш была выделены от.кур яичных и мясных пород штаммы авиреовирусов В-88,ВБ-88,3-88,ЦТ-а8,Ш-89,ЕН-в9 и от индеек Т.ин-88.

Изучение источи, реовирусной инфекции, характера течения этого заболевания показало,что вероятнее всего вирус распространялся с инкубационными яйцами от кур неблагополучных хозяйств Его циркуляции в хозяйствах способствовали технологические связи в обслуяшваадяй персонал.

Идентификация выделенных штаммов авиреовирусов. На основании изучения основных физико-химических свойств штатов вирусов, определения типа их нуклеиновой кислоты м серологических свойств было установлеяо.что а се язучазюе штаммы обладала устойчивостью к действию ингибитора ДНК:5 бром,2-дезукспуредина, 20$ хлороформа,20$ эфира и к воздействию температуры.+58°С в течение 30 минут «Вирусы сохранили способности к репродукции на куриных эмбрионах.Результаты идентификации штаммов авиреовирусов приведены в таблице 2.

Биологические свойства штаммов авиреовирусов.

Размножение,культивирование штаммов авиреовирусов на КЭ.

При заражении П-дяевных куриных эмбрионов вируссодержащим материалом в аллантоисную полость характерные изменения на ХАО эмбрионов наблюдали на 4-5 сутки при введении 0,2 мл вируссо-дершцего материала в разведении 10 при татре вируса 10" . Типичные изменения для авиреовирусов на ХАО куриных эмбрионов были в виде 1-2 массивных бляшек диаметром 1-2 мм преимущественно в области пути.

Результаты . ; последовательных пассажей авиреовирусов показали различие в интенсивности развития поражения ХА оболоче!

некоторых штаммов от пассажа к пассажу .Количество бляшек на ХА

ободочке варьировало ах размеры также.Некоторые штаммы сохранили способность вызывать поражения ХА оболочек во веек последовательных пас.саках (ЗЕ-88,Т.ин-£6,Т-85,СП-73), количество пораженных оболочек было 70.14,7$, 75'£з,8#, 68^2,-7£, 65^3,4^ соответственно,а в меньшей степени штаммы В-88,Г8-84,НВ я количество пораженных оболочек 42^3,2^, 55^2$, 58^2соответственно,

Таблица 2

Данные идентификации вирусных изолятов

Вирусные

отойчлвость вирусных язолятов к 1 Результаты

язоляты ингибитору! Хдог эформу! К/, V „ { 5 I Эф. 1ру г -гоьии1 1 ■ 1 ! 1 ЕГА ! РДП .спен.рео • ГЛГп.

1.3-88 ■ + + + + - +

¿.В2-83 + + + + - +

3.3-88 + + + + - +

4.111-83 + + + + - - +

5.Т.ИН-88 + + + + _ +

*.пи-еэ + + + + -

7.ЕН-89 + + + + - 4-

£.СП-73 + + + + - +

9.Г8-84 + + + + - +

Ю.Т-85 + + + + - +

И.НВ-85 + + + +

12.КН-66 + + + + 1- '

13.Контроль ИДФ (-) ШЙ- идт - Ад^ко(-) Ш+ -

Патогенно с ть жташов авиреовируссэ для П-дновнкх куриных эмбрионов варьировала в широком диапазоне.Отход эмбрионов в течение 5 суток наблюдался от 10 до 40!,1 при выводе - в пределах 10-90?.

Белее патогенный итаьыом оказался 1-65,который к 5 суткам после заражения вызывал.отход 4<&а на выводе Меаез патогенными были ихамш Кй-66 Г8-84,которые вызывала смертность эябггго-вов в течение 5 оутояв 10_,2-12, а" при выводе до 2СХ. .

Во всех группах гибель эмбрионов идростала в последних стадиях инкубации,что в целом характеризовала гот яли аноР- штаим.

Коэффициент корреляции +1 между отходом змбряснсв на 5 сутки я при выводе цыплят свидетельствует о высокой степени еаяэи

по критерию патогенности штаммов авареовирусов в различные периоды инкубация.

При визуальном исследовании по своему развитию зараженные эмбрионы не отличались от контрольных незасаженных эмбрионов.

При патологоанатомическом вскрнтял у 16-ти дневных зараженных эмбрионов была отмечены кровоизлияния во внутренних органах, а у 20-21-дненных задохликов наблюдала увеличение желчного пузыря,кровонаполиеяную печень и почка,дистрофию желудочно-кишечного тракта,нерассосавшиеся желток с кровенаполнениями сосудами.

Изучение патогенности выделенных штаммов авиреовв-ртсов для суточных цыплят

Для изучения патогенности выделенных штаммов авиреоБиру-сов заражали суточных цыплят одновремегшо подкокко а перораль-но,подкоано я в подушечку стопы вируссодаржащим материалом.

В таблице.3 показана патогенность штаммов авареовирусов при соответствующих методах заражейпя.В опытных группах у цыплят зараженных подкожно и перорально штаммами ВЕ-88,3-88,1-85, НВ-86,клинические симптома проявилась у 14-24$ на 7-20 день, падеж в течение опыта варьировал от 10 до 30%.

У заболевших цыплят отмечали угнетение,отказ от корма б течение 1-2 дней,хромоту.Цыплята всех групп отстали в рсте и развитии,в течение всего опыта у них было взъерошенное оперени

Из таблицы 3 ьидно.что наиболее патогенным оказался штамм Т.пн-68 при заражении цыплят подкожно я в подушечку стопы одно времекно.Яркуы клиническую картину наблюдали в группах цыплят зараженных авиреовярусоы штамма В-88,ВГ*-88,Т-85,у 11-42$ заболевших отмечали хрошту и припухшие подушечки с топы, падеж цып ллт варьировал от II до 50%.

Пря вскрытия лавлях цыплят было выявлено,в разной степени выраженности катаральное воспаление тонкого отдела кишечника, увеличенные .желчный пузырь и почки,у некоторых дряблое сердце, подагра и провентрякулит.

У цыплят,у которых при жизни отмечала пряпухание подушечки стопы на вскрытии наблюдали б этоЯ области серозный эксудат

Разработка схемы получения иммунной сыворотки к штаммам авиреовирусов

В связи с длительностью иммунизации по временя и не стабильностью результатов получения специфической к авиреовярусу

сыворотки на петухах по г.згоду Усманнодтаева А.,Застельской Л.Я нами были испытаны другие виду животных а схеш иммунизации.

Таблица 3

Патогенность штаммов авлреовирусов для цыплят, •Штаммы \_Метол, введения вируса

ависео- ■ подкоуио+пеоорэльно_! подконяо+в подупечку стопы

! шкубацион-! забо- !п , !яяк.тбацион-! эабо- ! .. вирусов ,лш?1 дарвод (дало IПсЛо !внй период !лело . пало

• > ' (дней) ' '

¡(дней)

1.В-88 - 20 15-17 II II

2.ВЕ-88 7-10 20 30 15-17 16 50 3.3-88 7-10 20 30 - 20

4.ПТ-88 - - 10 - - • -

5.Т.ИН-88 - 30 15-17 42 50

6.СП-73 - - -

7.Г8-84 - - - -

8.Т-85 18-20 24 28 17-18 25 30

9.НЗ-86 18-20 14 28 15-17 20 20 Контроль ' - - - -

В результате проведенной работы установлено,что использование для иммунизации кроликов я коз позволило в 2-3 раза сократить общее время на иммунизацию,количество их циклов и сэкономить а несколько раз- объем вируссодершаего материала. Серологические исследования показали,что слеш^ическяе антитела и преципитшш в сыворотке крови накапливались в продолах 8-9 в течение 30 дней.

• Оценка методоз очистки и концентрации авиреовипусов

На оснований литературных данных ¿1 изучения физико-химических свойств авиреовирусов для получения концентрированного вируссодержащего материала без балластных компонентов,мн испытали следующие методы:

1.Хлороформенкый метод удаления балластных веществ.

2.ПолиэтиленгликолеБкВ метод концентрации вируса.

3.Хроматографию вируса.

Обрабатывался вируссодеркащий материал штамма авиреовиру-са СП-73 и в аналогичных условиях,отрабатывали контрольный материал веема названными методами.

На стадиях очистки пираым и третьим методами проверяли содержание белка биуретоЕой и робой, с учетом Цветной реакция на фотоэлектроколориметре (ФЭК),

После хроматограф вируса,лолучеяяые фракции спектрофо-тометрировали йа спехтро тометре СФ-26 при длине волны 260 и 280 нм.Одноврзменно в кагдо!! фракции проверяли количество белка.

При сравнении спектрофотометраческой динамики видно ее разный характер в опыте и контроле .В опыте-пик спектрофотомет-ричесжой активности приходится на 5-6 фракцию, а в контроле да 3-4 фракции,В опыте,во фракциях 4-6 при наибольшей оптической активности выходит однородный нуклеопротеид (коэффициент 280/ 260=1,4).В контроле а наиболее активных фракциях - 3-.5 выходит разнородный материал ('коэффициент 280/260=1,0-1,4).Сравнивая очистку на колонке с оефадексом 200 опытного и контрольного материала, мы обнаруживали,что наибольшая активность этих материалов проявляется в разных фракциях,следовательно - наиболее очищенный .вирус'получала из колонки ео фракциях 4-6.Это подтверждается -также сравнением концентрации белка и нуклеопротеи-дов в разлачнкх фракциях опытного и контрольного материала. ■

Для оценка репродуктивных свойств вируса,степени его очистки и концентрация,при выполнении трех методов,использовали куриные омЗрпош (заражение ссотаетствудаим аируссодержащям материалом). Материал использовали также для постановки РЛП . как антигена .13 качестве индикатора,при исследования в динамике очищаемого вирус-содершащего материала в РДП,слунила специфическая иммунная сыворотка к аэиреовврусу.

У куриных эмбрионов,которым вводили очищенный материал с вирусом фиксировала наличие характерных иглененяй на ХАО.

При постановке РДП,получали положительную реакцию с мате-.р'оалом обработанным ^дореформенным методом .Титр очищенного пи-' руса был 1:64 ( 1£1.8062).

Отрицательные результат! были получены с материалами обработанными полаэтяленгликолем в хр жгографаческам методом (твбл.4). '

Таблица 4

Оценка выживаемости вируса, степени его «пястки и концентрации при разных методах

Методы

Изменение на ХАО Результаты РДП

' Обработка хлороформом

1:64

Обработка ПЭГ-6000

отрицательная

Хроматография 4-6 фракция

+

отрицательная

Модификация реакции диффузионной преципитации как метод серологической идентификация и диагностики авиреовиттусов

Как известно из литературных данных для успешного использования РДП с целью лабораторной диагностики вирусных заболеваний необходимо иметь активные антигены и специфические пре-цяпитирувдие сыворотки.О учетом этих условий мы предприняли соответствующие исследования^ которых изучили оптимальные условия постановки РДП,методы очистки вируса я получения специфической сыворотки.

Изучение оптимальных условий постановки РДП. Испытание сред,приготоБленных по различным прописям показало,что наиболее оптимальной была среда,полученная яз 1% агара Дифно на забуфереяном физрастворе 0,85$ хлористого натрия РН-7,2. В этом геле линии преципитации появлялись через 12<-14 часов, если толщина агаровой пластинки была 3-4 мм,а оптимальное расстояние между лунками с антигеном и антителом было 3-4 мм.При увеличении расстояния мевду лунками 6 ш наблюдалось значительное запаздывание в проявлении реакции.

С целью выявления оптимального температурного режима при постановке РДП чашки Петри или предметные отекла выдерживали при температуре +4°С,+20-22°С и пря +37°0.В результате было установлено,что наиболее быстрое формирование прециплтирующих

линий идет при температуре +3?°С

' При постановке реакции в чашках Петри или на предметных стеклах мы установила,что условия для реакции в чашках Петра более благоприятные,так как агаровая среда и компоненты реакций (антиген-сыворотка) лучше сохраняют активные диффузионные свойства,что способствует ускорению образования полоо преципитации.

" Антиген для РДП получали при очистке я концентрации авя-реовирусов.Нами установлено,что для выявления преципитярующих антител в сыворотке кров»! необходимо готовить антиген,обрабатывая вирусррдержащий материал хлороформом.Преципитирущую сыворотку к авиреовирусу можно получать на кроликах по охеме И№-мунизедии УНИИЭВ,

Изучение родства дтаммов авиреовирусов выделенных от кур и индеек в РИГА и РДП. При выполнении серологических исследований использовали 5 штаммов авиреовирусов из которых 2 куриных 3-88.ВЕ-86 и 3 индюшиных Тин-88,Т-85,в т.ч. эталонный штамм авяреовируса СП-7-З.На базе перечисленных штаммов готовилась соответствующие эритроцитарше и очищенные антигены,специфические к ним снво ро.тки. Для контроля специфичности антигенов были иопользованы коммерческие диагностякума (диагностический набор ньшаслской болезни .гриппа птиц и инфекционного бронхита).

При выполнении перекрестных серологических доследований е авиреовирусными антигенами в РИГА № установили,что все образцы .вритроцитарных препаратов из куриных и индюшиных штаммов авиреовирусов выявляли антитела в нейтрализируюцем титре в сыворотках крови кроликов иммунизированных к аналогичным в гет&~ рологичным штаммам.

Таблица б

Уровень серологического родства штаммов авиреовирусов выделанных от кур я индеасв РИГА 1 -

Антигены 1 Снвоооекя

» ОП-73 ' , Т-85 3-88 Т.ин-68

ОП-73 ? ' . I ' 0,9 0,9 '

1-85 I I . 0,9 0,9

3^88 0,7 0,7 I 0,8

Т.ин-88 0,9 I 0,8 I '

ВЕ-88 0,6 0,7 0,9 ' 1,06

При постановке перекрестных РДП,авиреовирусов СП-73,Т*85,

Г.ин-88 и 3-88 с гомологичными и гетерологичннми сыворотками оказалось,что они способны выявлять специфические преципитины на гомологичные и испытуемые штаммы авиреовируса (табл.6).

На основании результатов исследований »ложно о читать, что реовирусы выделение с?кур я индеек не отличались друг о> друга ни в антигенном ни в серологическом отношении.Они обладала общими серологическими и антигенными свойствами.

Таблица

Изучение родства итаммов авиреовирусов в перекрестных РДП

! Сыворотки Антигены !--:-

! СП-73 Т-85 Т.ин-88 3-88 кон НБ

СП-73 ++++ ' ++++ +++

Т-85 ++ ++++ +++ - -

г.йн-88 +-И- ++-Н- - -

3-88 +-н- ++++ +++ +++ - -

КОН - - - - -

НБ - — - - - ++++

Примечание: КСН - контроль-нормальная-сыворотка - антиген незараженных оболочек КБ - ньшаслская болезнь + - похохстельяая реакция - - отрицательная реакция

Использование методов лабораторной дзагяостинп реови-русного заболевания сельскохозяйственных птиц, ¿зйораторную диагностику авяреовирусяого заболевания сельскохоа^стаешшх птиц осуществляли,основываясь на выделении,идентификации возбудителя и выявлении специфических антител.

Выделение авиреовирусов осуществляли от птицы хозяйств, где серологически в (РНГА) еыяеляли специфические антитела. Для идентификации выделенного вируса использовали РДП в агаровом геле с ирименением антисквороток к эталонному штамму авиреовируса энтеронефрита индеек "011-73".

- FHTA была использована также для выявления специфических антител к авиреовярусу в сыворотках крови птиц при естественной и экспериментальной реовирусаой инфекции.

При выполнений работы исследовали материалы,накопленные в лаборатории изучения болезней птиц УШИЭВ, указывающие на возмои ную этиологическую роль авиреовирусов при отдельных случаях •> трудно днференцируемых заболеваний птиц.

В лабораторий были исследованы материалы (больная и павшая цтяца,пробы сывороток),подученных из различных областей УССР и других регионов СССР.

Проведенные исследования в РИГА с использованием эритроци-тарного антигена УНИИЭВ из штамма "CII-73" энтеронефрита индеек показали,что авиреовиргсы широко распространены в птицехозяй-ствах различной специализации как по видам птиц,так и по производимой продукции.

При серологическом выявлении специфических антител к авиреовярусу "СП-73" в диагностических титрах я выполнении гирусО' логических исследований патологического материала при его куль тивировании на куриных эмбрионах нам удалось изолировать вирус в большинстве исследуемых проб.

Для идентификации вируса,кроме РДП.была использована РИГА е эритроцитарным'.антительным диагнбстякумом.Сеясибилизация эритроцитов иммунной сывороткой,полученной лабораторией путем гапериммунизации коз оказалась чувствительной и агглютинировалась лишь гомологичным антигеном (авиреовирусами). Титр специфических антител к авиреовирусу в этих хозяевах не превышал 5,5iog2 »a количество реагирующей птицы колебалось от 30$ до

' Из полученных данных эпизоотологичесього обследования птг цы хозяйств и результатов вирусологических и серологических ис следований патологического материала и проб сывороток установ1 ■ ли,что применение эритроцитарного диагностикума УНШЭВ и РИГА достоверно в специфично выявляет специфические антитела в сыворотках крови различных видов с/х птиц.

Использование комме в та лабораторной диагностики позболи-ло нам судить о течении реовирусной ийфекции в птицехозяйства:

Испытание специфичности и чувствительности антвтельного ератроцатарного препарата проверяли е РИГА с суспензиями виру са болезни Ньюкасла,авиаденовируо первого серотипа,инфекционный ларйяготрахеят,Еяф«кцвонн«!* бронхит,Марека и гриппа птиц

л о суспензиями штаммов азиреовирусов выделенных от кур в ян-цеек.Реакция была положительной только' прз татрациа эталонного лтачма авиреоэир'/са СП-73 а других штаммов авирзовирусов в титре 1:4-1:8.0 остальными вирусами результаты были отрицательными. '•■.*;

• Оценка э^ТектпЕкости меп борьбы о сеовптжжвм заболеванием у ктр. Было установлево,что ппленение комплекса мероприятий УН/ГИЭЗ с профилактической я лечебной целями при реовируоном заболевании у индеек в куриных птпцехозя/сгзах, который лредт/и-ривалгвла-кнуто дезинфекцию инкубационных яиц 0,4$ раствором эс-тостеркна на дистиллированной воде (температура +20°С) при экспозиция а мин,из расчета 30-50 ил раствора на одно яйцо;скарм-ляЕанае бройлерам суточного возраста по 15 дней антноксидант-ного преизкеа УНИИЗВ (селенит натрия,витамин В, аскорбиновая кио-лота,нетяонвн,сантохвн);использование комплексного препарата аваееротима - изготовитель УНл-!53,г> состаз которого входят сыворотка крови пмц-реконзалссцентов я антисептик растительного происхотдеяия.Сиворотку крови,авксе ротам и шкуноггобуляны пря-кеняют:аэрозоЛ1>по в дозе 2,0 мл на 1и3 специальной камеры,внутри кыппзчио - 1,0 я а I кг массы тола или энтерально е дозе 0,5-1,0 мл на I голову,обеспечили снижение заболеваемости и отхода, повышение сохранности на 2-9^,увеличенг9 прироста живой массы на 50,0-100,0 г.

ВЫВОДИ

1.Авареовпрусное заболевание кур широко распространено в пткцехозяПствах УССР и других регионах СОСР.Источником заноса возбудителя является больная й переболевшая птица.Заболевание наиболее тяжело протекает у молодняка з часто осложняется коля-бактериозом.

2.Штак:.ы авнреоЕирусов изолировать от кур я'индеек не обладали агглютинирующей способностью.Устойчивы к ингибитору ДНК, хлорофор-.ту.зфиру, температуре +50°С е течение 20 минут, патогенные ддл курикчх эмбрионов и цыплят.

3.Установлено,что очистку аааресвнрусоэ наиболее активно {ложно осуществлять органическими растворителями.

4.Специфические -иммунные сыворотки к авяреовзргсам к>:яю получить путем гиаерим;дуаизации кролшгав а коз,разработанные схемы иммунизация позволяют получить специфические сыворотки в течение 30 дней.■

5.Исследований серологического л антигенного родства штаммов авиреовирусов к перекреоткух реакциях непрямой гемагглютя-нации и диМузвонной преципитации по кап ало, что все штаммы обладали общими серологическими и антигенными свойствами.

6.Разработанная методика получения 'антигена для реакции диффузионной преципитации в агаровом геле позволяет ядентифици-

• ровать авиреовируеы и выявлять преципитирующие антитела в сыворотках крови больной ПТЙЦЫ.

7.Установлена специфичность эритроцитарного диагностикума УШИЭВ внтеронефрита индеек при внявленяя реовирусного заболевания у кур.Реакция непрямой гемагглютинации позволяет диагностировать персястирущую авареовирусную инфекции у различных вядов птицы.

8.Раз работала методика приготовления антительного эратро-цитарного препарата для индикации и идентификации авиреовирусов в РИГА. •

9.Диагностика авиреовирусного заболевания должна основываться на эпизоотологическях,клинических и патологоанатомичес-ких данных и также лабораторных исследованиях,предусматривающих выделение вируса и его идентификацию,выявление динамики специфических антител.

10.Комплексная система мероприятий предложенных ЗШИЭВ, обеспечивает снижение заболеваемости и отхода птицы,повышение их продуктивности,

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны и утверждены:

- Методические рекомендации по двагш стике, профилактике и мерам борьбы о реовярусяым заболеванием сельскохозяйствен- ной птяцы.Одобрены ГУВ о Государственной ветеринарной инспекцией при Совете Министров СССР по продовольствию и закупкам il.0ii.80, № 043-6/4.08.

- Методические указания по лабораторной диагностике рео-, вирусного заболевания сельскохозяйственной птяцы.Одобрены уе-

' тодаческой. комиссией УНИИЭВ (протокол й 16 от 19.10.89г.).

Указания включают:

-Методику приготовления антигена я иммунной сыворотки для внявленяя авиреовирусов, в специфических ■антител в сыворотках крови -в РДП.

- Методику изготовления аятительного эритроцитарного/пре-

!

парата и контроля для выявления авиреовирусов в РИГА. , Список опубликованных работ . " /

1. Абдилазиз Фахим. Изучение биологических свойств/реови-русов выделенных от кур я индеек // Республиканский иеяведом-стаенный тематический научный сборник / Ветеринария № 65.Кпев. Урожай,19Е0,ст.104-10?.

2. Абдилазиз Фахим. Реовирусиая инфекция у бройлеров и меры борьбы // Методические рекомендации по актуальным вопросам ветеринарии (молодые ученые-производству).Харьков,1980,

о т. 44-^5.

3. Герман В.3..Абдилазиз Ф. Изучение серологических свойотв реовирусов выделенных от кур я индеек // Тезисы докладов конференции национального отделения СССР Всемирной научной ассоциация по птицеводству. г.Рига,1990,ст.167.

4. Герман В.З.,Абдилазиз<5..Костенников О.С.// Методические рекомендации по диагностике а мерам борьбы с реовирусныы заболеванием сельскохозяйственной птицы.Харьков,1950,от.II.

5. Герман В.В.,Абдилазиз Ф.Изучение а реакции диффузионной преципитация авиреовирусов выделенных от кур и индеек

(в печати).