Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Биологические особенности популяции и совершенствование индикации L.monocytogenes в продовольственном сырье

На правах рукописи

БОЛОТСКИИ МИХАИЛ НИКОЛАЕВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИИ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ИНДИКАЦИИ L. MONOCYTOGENES В ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ

16 00 06 - ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

□031G4205

Москва - 2008 г.

003164205

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии) в лаборатории санитарной микробиологии

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, доцент

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, профессор

Кононенко Анна Борисовна (ГНУ ВНИИВСГЭ)

Светличкин Вячеслав Владимирович (ГНУ ВНИИВСГЭ)

доктор ветеринарных наук, профессор

Меньшикова Зинаида Николаевна (МГАВМиБ им К И Скрябина)

Ведущая организация: Московский государственный университет прикладной биотехнологии (МГУHb)

Защита состоится «¿г» Мхх^УТЛ 2008 г в Y'f часов на заседании диссертационного совета Д 006 008 01 при ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе, д 5)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии

Автореферат разослан « i » ¿реЛрА/ь& 2008г

Ученый секретарь

/

диссертационного совета, канд биол наук ^ С Майстренко

t *''

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Листериоз является природно-очаговым опасным инфекционным заболеванием человека и животных и представляет актуальную медико-ветеринарную проблему

Болезнь характеризуется множественностью источников возбудителя инфекции, многообразием факторов и путей его передачи, а также разнообразной клинической картинои Листериоз, не являясь таким широко распространенным заболеванием, как сальмонеллез, превосходит его по тяжести проявления инфекции и частоте летального исхода [Тартаковский И С и др , 2002]

Листериоз регистрируется во многих странах мира, в том числе и на территории Российской Федерации

В работах Бакулова И А , Меньшиковой 3 H , Котлярова В M , Карликановой Н.Р , Васильева Д А, Тартаковскою И С ,, Шевелевой С А, Костеико Ю.Г., Бутко M П, Gray M.L, Seeliger H Р R, представлены основные сведения по биологии, экологии, индикации и идентификации листерий, а также эпизоотологии и эпидемиологии

Современные технологии переработки и хранения пищевых продуктов создают условия для контаминации и размножения листерий в продуктах питания, что приводит к заражению и последующему заболеванию людей [Макаров В В , Смирнов AM и др , 2004, Hedberg С , 2006, Goulet V, Jacquet С, et al 2006, Koch J, Stark К, 2006] В Канаде, США, Мексике, Великобритании, Швейцарии были зарегистрированы крупные вспышки листериос.а людей с высоким уровнем смертности при употреблении пищевых продуктов животного и растительного происхождения молока, мягких сыров, мяса и мясных продуктов, квашеной капусты [Бакулов И А, 1999, Bula С J. et al, 1995, Graves L M et al, 2005, Mayala R et al, 2001]

Листерии способны накапливаться при хранении продуктов в бытовых холодильниках, когда многие другие бактерии гибнут или не размножаются и не составляют конкуренции для значительного увеличения микробной

массы листерий Такая особенность этих бактерий объясняет название листерий как "микроба холодильника" Аналогичным образом соление овощей, молочных и мясных продуктов, которое губительно для многих микробов, не препятствует размножению листерий при содержании поваренной соли в концентрации 6-20%

В настоящее время лаборатории, проводящие исследования пищевых продуктов на наличие листерий, руководствуются ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые Методы выявления и определения бактерий L monocytogenes» При этом выделение L monocytogenes и окончательная идентификация выдеченного патогена может составлять по времени до 14 суток, что осложняет исследование продуктов с ограниченным сроком iодности

Нередко идентификация листерий, как и многих других микроорганизмов, затруднена в силу популяционной изменчивости их морфологических и биохимических свойств [Павлова И Б и др , 2004]

Для лабораторной практики наибольший интерес представляют ускоренные методы, такие как ИФА, ПЦР, ДНК-ДНК и ДНК-РНК гибридизация, радиоиммунологические методы исследования [Карликанова Н Р и др , 1999, Тартаковский И С идр 2002, Gray Michael J et al, 2004]

К достоинствам этих методов следует отнести их высокую чувствительность и специфичность Кроме того, их использование существенно сокращает расход питательных сред, время анализа и трудозатраты

Цель и задачи исследований. Целью нашей работы являлось изучение биологических особенностей популяций Listeria monocytogenes и совершенствование индикации патогенных листерий в продовольственном сырье и продуктах питания

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1 Провести сравнительный анализ культуральных, морфологических и биохимических свойств популяций листерий, полученных на разных питательных средах при различных условиях культивирования,

2 Изучить культурально-морфологические и биохимические свойства популяций листерий, подвергнутых влиянию низких и отрицательных температур,

3 Разработать ускоренный метод индикации L monocytogenes на основе ичмуноферментного анализа (ИФА),

4 Испытать разработанный метод при мониторинговых исследованиях продовольственного сырья и пищевой продукции животного происхождения

Научная новизна.

Новизна выполненной работы заключается в том, что были изучены биологические особенности листерий на уровне микробной популяции, благодаря использованию в работе метода сканирующей электронной микроскопии, позволяющего изучать популяцию бактерий, не нарушая их естественной архитектоники Показана зависимость морфологии клеток L monocytogenes от состава питательной среды и режимов культивирования

Установлено, что низкие и отрицательные температуры не влияют на морфологию клеток листерий, что связано с их психрофильными свойствами Однако при последующем культивировании популяций, подвергнутых длительному воздействию отрицательных температур, отмечается появление в популяции клеток на различных стадиях гетероморфизма

Разработан ускоренный метод индикации L monocytogenes с помощью ИФА, позволяющий в течение трех суток провести скрининговые исследования продовольственного сырья и продуктов питания, что актуально для бактериологических лабораторий, контролирующих качество продовольственного сырья и продукции животноводства

Практическая ценность работы.

На основании результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации сальмонелл и Listeria monocytogenes в животноводческом сырье и продуктах питания с помощью тест-систем LOCATE®SALMONELLA и LOCATE®USTERIA» (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 18 октября 2006г)

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены

на

- заседаниях Учены о совета ГНУ ВНИИВСГЭ в 2006 и 2007г,

— межлабораторном совещании ГНУ ВНИИВСГЭ (2007 г)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 научные статьи

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 стр

машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения Список литературы включает 208 источников (107 отечественных и 101 зарубежных авторов) Работа иллюстрирована 8 таблицами и 17 рисунками

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований

Работа выполнялась в течение 2004-2007 гг в лаборатории санитарной микробиологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Россельхозакадемии

Материалом для исследований служили образцы мясного сырья, мясного фарша, мясопродуктов (колбаса и т д), рыбы, поступавшие для сертификационных испытаний в лабораторию Всего было исследовано 126 образцов различных пищевых продуктов

В работе использовали 35 тест-культур разных видов микроорганизмов из коллекции лаборатории санитарной микробиологии ГНУ ВНИИВСГЭ

Для изучения культурально-морфологических свойств популяций листерий применяли следующие питательные среды МПБ, МПБ с 1 % глюкозы, МПЛ, МПА с 1% глюкозы, триптозо-соевый агар (TSA), бульоны обогащения Фразера и агар PALCAM

Изучение морфологических особенностей популяции бактерий рода Listeria при кучьтивировании на разных питательных средах при различных режимах инкубирования посевов проводили с помощью метода сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) С этой целью культуру высевали на мембранные фильтры «Владипор» №4, помещенные на поверхность плотной питательной среды После окончания времени инкубирования выросшие на фильтре колонии фиксировали парами 25%-го глутарового альдегида, а затем двукратно обезвоживали в парах пропиленоксида Участки мембранных фильтров, предназначенных для исследований, монтировали на электролитические медные пластинки -подложки и напыляли ионами платины и палладия на установке «Hitachi-E-102» Электронно-микроскопическое исследование проводили на микроскопе «Hitachi-800» со сканирующей приставкой «Hitachi-8010» (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении 1-15 гыс Исследования в СЭМ сопровождались фотосъемкой объектов с последующей компькнерной обработкой результаюв

Анализ проб на наличие L monocytogenes, как одного из микробиологических показателей безопасности, нормируемых СанПиН 2 3 2.1078-01, проводили согласно ГОСГ Р 51921-02 «Продукты пищевые Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes»

Для выявления L monocytogenes методом иммуноферментного анализа была испытана тест-система LOCATE®Listeria (производство R-Biopharm Rone Ltd, Германия, предоставленная нам ООО «Стайлаб») Процедура

анализа материала с помощью тест-системы LOCATE" Listeria включала обогащение исследуемых проб в соответствующих жидких селективных средах, термическую дезактивацию смешанных культур и постановку ИФА в планшетах

Чувствительность испытуемой тест-системы определяли в опытах с суспензиями гомологичных культур листерий, содержащими от 10 до 107 м кл/мл Для определения специфичности тест-системы

LOCATE® Listeria

использовали культуры энтеробактерий и стафилококков Эксперименты проводили в трех повторное гях

Результаты исследований Культурально-морфологические и биохимические свойства популяций листерий на различных питательных средах

На первом этапе наших исследований изучали кулыурально-морфологические свойства популяций L monocytogenes и L mnocua, полученных на различных питательных средах (неселективных, селективных и дифференциально-диагностических)

Рост бактерий рода Listeria в жидких питательных средах Рост листерий в МПБ (48 ч, 37°С) сопровождался равномерным помутнением среды При встряхивании пробирки наблюдались «муаровые волны» У отдельных культур отмечалось появление белого осадка, поднимающегося в виде косички при встряхивании В мазках преобладали грамположительные мелкие палочки, встречались единичные кокковые формы

Рост листерий в МПБ с 1% глюкозы (48 ч, 37°С) был аналогичен В мазках преобладали грамположительные кокковые формы, у отдельных культур в поле зрения встречались мелкие палочки, расположенные поодиночке

Рост бактерий рода Listeria на плотных питательных средах Бактерии рода Listeria образовывали на МПА (24 ч, 37°С) мелкие, бесцветные колонии в S- форме в виде капель росы В мазках преобладали как грамположительные, так и грамотрицательные короткие палочки, расположенные поодиночке, встречались формы в виде буквы V, а также единичные кокковые формы

На МПА с 1% глюкозы (24 ч, 30°С) листерии образовывали мелкие бесцветные колонии в виде капель росы В мазках преобладали грамположительные тонкие палочки, расположенные как поодиночке, так и в виде скоплений и цепочек

При изучении популяций листерий, культивируемых в указанных выше условиях на поверхностях мембранных фильтров, помещенных на МПА и МПА с 1% глюкозы, методами сканирующей электронной микроскопии было установлено, что на обеих средах культуры представлены однородными короткими клетками овоидной формы Клетки в популяции плотно прилегали друг к другу и были объединены межклеточным матриксом. Образования клеток измененной морфологии при этом не было выявлено (рис 1).

На триптозо-соевом агаре (48 ч, 37°С) листерии вырастали в виде мелких и крупных белесых колоний с ровными краями У отдельных культур L monocytogenes отмечалось образование колоний с неровными краями В мазках преобладали грамположительные короткие палочки и единичные кокковые формы

При изучении меюдом сканирующей электронной микроскопии культур листерий, полученных на триптозо-соевом агаре, популяции листерий были представлены удлиненными, плотно прилегающими друг к другу клетками палочковидной формы В некоторых участках колоний отмечалось образование клеток измененной морфологии — удлиненных палочек с нарушением процесса бинарного деления, а также клеток протопластного типа и мелких L-форм

Рост бактерий рода Listeria в средах обогащения и на дифференциально-диагностическом агаре PALCAM

Рост листерий в бульоне предобогащения Фразера сопровождался почернением среды В мазках преобладали кокковые формы, плохо окрашиваемые по Граму У отдельных культур в мазках наблюдали скопления длинных нитевидных грамположительных бактерий

Рост листерий в бульоне обогащения Фразера также сопровождался почернением среды В мазках преобладали кокковые формы, плохо окрашиваемые по Граму. У отдельных культур в мазках преобладали длинные нити, состоящие из неразделившихся клеток, образующие клубки, напоминающие волосы

Сканирующая электронная микроскопия популяций листерий ь бульонах обогащения и предобогащения Фразера показала, что листерии в популяции были представлены гетероморфными клетками шаровидной формы протопластного типа, а также мелкими - L-формами и короткими извитыми клетками - ревертантами

На агаре PALCAM листерии образовывали мелкие росинчатые колонии зеленовато-оливкового или черного цвета с металлическим блеском, вокруг колоний отмечался ареол почернения среды В мазках преобладали длинные грамположительные палочки, располагающиеся одиночно или образующие скопления В поле зрения также встречались нитевидные формы и единичные кокки

Сканирующая электронная микроскопия популяции листерий на среде PALCAM, показала, что бактерии представлены в виде плотно прилегающих друг к другу удлиненных палочковидных клеток разной длины с нарушенным процессом разделения на дочерние клетки На периферии колоний выявлено образование клеток протопластного типа и мелких L-форм, что характерно для гетероморфизма (рис 2)

Рис. ]. Фрагмент популяции L.monocytogenes (МПА с 1% глюкозы, 24 ч, 30 °С). Популяция представлена однородными клетками овоидной формы, СЭМ.

Рис. 2. Фрагмент популяции L.monocytogenes (Среда PALCAM, 24 ч, 37°С). Популяция представлена удлинёнными клетками палочковидной формы. На периферии колоний выявлено активное образование клеток протопласгного типа и мелких L-форм. А- центр колонии, В - край колонии. СЭМ.

Таким образом, изучение характера роста листерий на разных питательных средах (среды обогащения Фразера, среда РАЬСАМ, триптозо-соевый агар, МПБ и МПБ с 1% глюкозы, МПА, МПА с 1% глюкозы) показало, что степень проявления гетероморфизма листерий в популяции зависит от состава среды культивирования Гомогенные по морфологии клетки популяции листерий отмечались при культивировании бактерий на средах МПА и МПА с 1% глюкозы при 30 °С

При этом культуры листерий проявляли биохимические свойства, характерные для данных видов микроорганизмов (таблица 1)

Таблица 1

Биохимические свойства листерий

Тесты Ь топосую«елез Ь тпосиа

Катал аза + +

Рамноза + +

Маннит —

Ксилоза —

Гидролиз эскулина + +

Лецитиназная активность на средах с активированным углем + —

Лецитиназная активность на средах без активированного угля — —

Тест на подвижность в полужидкой среде показал, что все изученные культуры листерий были подвижными при 18-20 °С и неподвижными при 37 °С

Изучение биологических особенностей бактерий рода Listeria в популяции при различных температурных режимах культивирования

Для изучения особенностей строения популяции листерий были испытаны различные режимы культивирования: 18-22°С, 30°С и 37°С.

С помощью метода сканирующей электронной микроскопии нами было показано, что культуры L.monocytogenes и L. innocua, выросшие на МПА с 1% глюкозы при ]8-22°С и 30°С течение 48 ч, находились в S-форме и были представлены однородными клетками овоидной формы, объединенными в популяции межклеточным матриксом. Образования клеток измененной морфологии в популяциях листерий нами не было выявлено.

При культивировании изучаемых культур при 37°С в течение 48 ч на МПА с 1% глюкозы в популяциях выявлялись значительные изменения: наряду с клетками нормальной морфологии присутствовали клетки на различных стадиях гетероморфизма: округлые клетки протопластного типа, нитчатые структуры, L-формы, короткие извитые клетки - ревертанты (рис. 3).

Рис. 3. Фрагмент популяций L.monocytogenes ( 37°С, МПА). Наряду с клетками нормальной морфологии (показано стрелками - N), наблюдается формирование клеток протопластного типа (П) и нитчатых структур (Н). СЭМ.

Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств листерий, подвергнутых влиянию низких и отрицательных

температур

Воздействие на популяцию листерий низких и отрицательных •] емператур проводилось в целях

1) изучения длительного воздействия низких и отрицательных температур на популяции L monocytogenes и L innocua

2) изучения биологических свойств популяций листерий, ранее подвергнутых воздействию низких и отрицательных температур, после их культивирования в благоприятных условиях

Для этого культуры листерий, выросшие на мембранных фильтрах, расположенных на поверхности МПА с 1% глюкозы, помещали в холодильные (температура от 2 до 8 °С) и морозильные (температура -8±2 °С и -18±2°С) камеры Через 30 суток чашки с культурами извлекали и при необходимости размораживали в течение 40 мин при комнатной температуре

На поверхности мембранного фильтра популяции листерий, подвергнутые воздействию низких и отрицательных температур, имели вид мелких росинчачых колоний желтоватого цвета сухой консистенции В мазках наблюдались мелкие грамположительные палочки, образующие скопления

Методом сканирующей электронной микроскопии популяций листерий было показано, что популяции однородны и представлены клетками овоидной формы, объединенными межклеточным матриксом Клеток с измененной морфологией выявлено не было (рис 4)

Результаты изучения биохимических свойств листерий, подвергнутых воздействию низких и отрицательных температур, представлены в таблице 2

Таблица 2

Биохимические свойства популяции листерий после длительного воздействия низких (от 2 до 8 °С) и отрицательных температур (-8±2 °С и

-18±2 °С)

L monocytogenes L innocua

Температура воздействия Температура воздействия

Тесты 2-8 °С -8±2 V -18±2 °С 2-8 °С -8±2 °С -18±2 °С

Катал аза + + + + + +

Рамноза +/- * +/- * + +/- * +/- *

Манни" - — — — — —

Ксилоза — — — — — —

Лецитиназная

активность на

средах с + + + — — —

активированным

углем

Лецитиназная

активность на

средах без — — — — — -

активированного

угля

Гидролиз эскулина + + + j + +

* +/- слабое изменение окраски среды Проявляемые биохимические свойства были характерны для представителей листерий изучаемого вида При эгом о!мечено снижение уровня сбраживания рамнозы у культур, длительно хранившихся при температуре -8±2 °С и -18±2°С, что свидетельствует о снижении метаболизма микроорганизмов при отрицательных температурах

Рис. 4. Фрагменты популяций L.innocua (А) и L.monocytogenes (В), температурный режим хранения -18±2 °С 30 суток. Популяция представлена клетками нормальной морфологии. СЭМ.

При дальнейшем культивировании (МПА с 1%глюкозы, 30°С, 48ч) листерий, ранее подвергнутых влиянию низких и отрицательных температур, нами были получены следующие результаты.

На поверхности мембранного фильтра популяция листерий была представлена мелкими росинчатыми колониями желтоватого цвета. В мазках из культур листерий были отмечены грамположительные палочки и кокковые формы, плохо окрашиваемые по Граму.

Сканирующая электронная микроскопия популяции листерий, находившейся в течение 30 суток в холодильной камере при температуре от 2 до 8 С, показала, что в микробной популяции преобладают овоидные клетки нормальной морфологии, объединенные межклеточным матриксом, и практически не встречаются клетки измененной морфологии (рис 5).

При сканирующей электронной микроскопии культур листерий, хранившихся до подращивания в течение 30 суток в морозильных камерах, было отмечено, что наряду с клетками с типичной морфологией и объединенных межклеточным матриксом, в популяциях можно было

190419 75KV Х5.8К 6.00um

наблюдать образование клеток измененной морфологии - клеток протопи астного типа, нитевидных структур, мелких клеток - Ь-форм и извиты* клеток-ревертантов (рис 6)

Под мембранными фильтрами (после их удаления) на поверхности среды нами был отмечен рост очень мелких росинчатых колонии слизистой консистенции В мазках из этих колоний преобладали кокковые формы, плохо окрашиваемые по Граму и небольшое количество грамположительных овоидных клеток Данное явление можно объяснить тем, что клетки с дефектной клеточной стенкой, а это протопласты и I.-формы, легко проходят через поры мембранного фильтра, диаметр которых 0,45 мкм Подобные нестабильные Ь-формы способны реверсировать и давать видимый рост на питательных средах

Результаты определения биохимических свойств популяций листерий, полученных после культивирования культур, подвергнутых влиянию низких и отрицательных температур, представлены в таблице 3

Из таблицы 3 видно, что у культур листерий, хранившихся до подращивания 30 суток при -8±2 °С и -18±2°С, происходит снижение уровня сбраживания рамнозы Снижение ферментативной активности листерий при воздействии низких и отрицательных температур приводит к дефектности клеточной стенки

Таблица 3

Биохимические свойства листерий после культивирования популяций, подвергнутых воздействию низких и _____отрицательных температур___

Колонии листерий на поверхности мембранного фильтра | Колонии листерий на агаре под мембранным фильтром

L monocytogenes L innocua Ь топосук^спе1! L innocua

Температура воздействия Температура воздействия Температура воздействия I емпература воздействия

2-8 "С -8+2 "С -18+2 С 2-8 "С -8±2 "С -18±2"С 2-8 "С -8±2 "С -18±2"С 2-8 "С -8±2 "С -18±2"С

Каталаза + + + + + + + + + + + +

Рамноза + + + +I-* +

Маннит - - - - - - - - - - - -

Ксилоза - - - - - - - - - - - -

Лецетиназная

активность на

средах с + + + - - - + + + - - -

активированным

углем

Лецетиназная

активность на

средах без - - - - - - - - - - - -

активированного

угля

Гидролиз эскулина f + + + + + + + + + + +

* +/- слабое изменение окраски среды

Рис. 5. Фрагмент популяции L.monocytogenes (МПА с 1% глюкозы, 30 "С,48ч.) До подращивания популяции листерий хранились ЗОдней в холодильной камере при температуре 2-8°С. Наряду с клетками нормальной морфологии (обведены), встречаются единичные гетероморфные клетки различной величины (показаны стрелками). СЭМ. ;

Рис.6.Фрагмент популяции {..monocytogenes (МПА с 1% глюкозы, 30 °С,48ч). До подращивания популяции листерий хранились ЗОдней в морозильной камере при температуре-8±2 ОС. Наряду с клетками нормальной морфологии (обведены), отмечен гетероморфизм— мелкие L-формы, нитевидные структуры, клетки протопластного типа , извитые клетки-ревертанты (показаны стрелками). СЭМ

Разработка метода индикации L.monocytogenes в продовольственном сырье и продуктах питания с помощью ИФА

Бактериологический анализ образцов продовольственного сырья и продуктов питания на наличие патогенных листерий длителен и трудоемок Кроме того, возможны затруднения при интерпретации его результатов в силу отмеченных особенностей возбудителя болезни, в частности, морфологии листерий Ускорить индикацию и идентификацию патогенных листерий в продовольственном сырье и продуктах питания позволяют иммунологические методы, в частности ИФА.

Испытания тест-системы LOCATE® Listeria, предназначенной для обнаружения листерий методом ИФА, включали определение ее чувствительности, специфичности и эффективности использования для

выявления микроба в продовольственном сырье и продуктах питания

®

Чувствительность тест-системы LOCATE Listeria в опытах с разведениями чистых культур составила 106 м к/ мл

В образцах мясного фарша, колбасных изделий, рыбе, искусственно контаминированных различными штаммами L monocytogenes, после процедуры обогащения, предусмотренной методикой, искомые бактерии выявляли при первоначальном содержании не менее 102 клеток листерий в пробе массой 25г

Определение специфичности тест-системы LOCATE® Listeria проводили в опытах с 35 ппаммами различных представителей энтеробактерий, стафилококков и непатогенных штаммов листерий Результаты исследования показали ее строгую специфичность в отношении L monocytogenes Компоненты тест-системы не реагировали с гетерологачными культурами, включая L mnocua

Известно, что идентификация L monocytogenes после получения культуры на агаре PALCAM основывается на определении морфологических и биохимических свойств «подозрительных» колоний, что занимает до 7 суток. Нами была испытана тесг-система LOCATE^

Listeria для идентификации подозрительных колоний, выросших на PALCAM агаре Для этого образцы мясного фарша контаминировали взвесью культур L monocytogenes и L innocua Образцы исследовали бактериологическим методом до получения роста колоний на агаре PALCAM Затем отбирали подозрительные колонии, суспендировали в небольшом количестве физиологического раствора и осуществляли постановку ИФА с помощью тест-системы LOCATE4, Listeria Результаты ИФА суспензии колоний из образца, контаминированного L monocytogenes, были положительными, в то время как суспензии колоний из образца L innocua дали отрицательный результат Время анализа при этом составило 2 часа

Обнаружение L.monocytogenes в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом ИФА с помощью тест-системы LOCATE8 Listeria

При проведении мониторинговых исследований нами было исследовано 126 образцов мяса, рыбы, колбасных изделий (таблица 6)

Таблица 6

Результаты исследований сырья и пищевых продуктов на наличие Listeria

monocytogenes с использованием метода ИФА

Методы апашза

Объект исследований Количество исследованных проб Количество положительных проб ИФА Бактериологический по ГОСТР 51921-2002

1 2 3 4 5

Говяжий фарш 23 0 0 0

Охлажденная свинина 17 0 0 0

Замороженное мясо

птицы (куриные 28 1 1 1

окорочка)

1 2 3 4 5

Колбасные изделия 21 0 0 0

Мороженая морская рыба 12 0 0 0

Мороженая речная рыба 25 1 1 I

Таким образом, при проведении мониторинговых исследований с помощью тест-системы LOCATE Listeria нами было установлено наличие L monocytogenes в пробах замороженного мяса птицы и мороженой речной рыбе, что было подтверждено результатами бактериологического анализа согласно ГОСТ Р51921-2002

На основании проведенных исследований нами были разработаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации сальмонелл и Listeria monocytogenes в животноводческом сырье и продуктах питания с помощью тест систем LOCATE®SALMONELLA и LOCATE® LISTERIA» (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 18 октября 2006 г)

ВЫВОДЫ

1. Микробиологическими и электронно-микроскопическими

исследованиями показано, что биологической особенностью L monocytogenes является полиморфизм клеток в популяции в зависимости от состава питательной среды и режимов культивирования 2 Культивирование L monocytogenes на МПА и МП А с 1% глюкозы при 30°С приводит к образованию колоний, представленных однотипными клетками овоидной формы, на дифференциально-диагностических средах и при повышении температуры культивирования до 37°С -клетками на разных стадиях гетероморфизма с проявлением L-трансформации

3 В условиях низких (2-8°С) и отрицательных (-8 и -18°С) температур пс'пуляции L monocytogenes имели типичную морфологию и были представлены однотипными, нередко делящимися овоидными клетками, плотно прилегающими друг к другу, имеющими определенную ориентацию, объединенными межклеточным матриксом, что может быть обусловлено психрофильными свойствами данного мр кроорганизма

4 Низкие температуры (2-8°С) не вызывали изменений в морфологии клеток L monocytogenes в популяциях, полученных в последующих пассажах

5 Переход от температур отрицательных (-8°С, -18°С) к положительным (+20°С, +30°С) приводит в действие адаптационные механизмы листерий Культивирование популяций L monocytogenes, длительно находившихся под влиянием отрицательных температур (-8 и -18°С), приводило к образованию наряду с клетками нормальной морфологии клеток с различными проявлениями L-трансформации

6. Разработаный метод индикации L monocytogenes на основе ИФА, позволяет в течение 3 суток (время обогащения) выявить искомые бактерии в количестве 10 2 м к/ мл и более в 25 г образца продовольственного сырья и продуктов питания

7 При проведении мониторинговых исследований продовольственного сырья и продуктов животного происхождения с использованием разработанного метода индикации листерий на основе ИФА с тест-системой LOCATE Listeria установлена корреляция результатов ИФА и бактериологического анализа, что показывает возможность использования разработанного метода для скрининговых исследований

ПРЕДЛОЖЕНИЕ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Разработаны для использования в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях ветеринарно-санитарной экспертизы «Методические рекомендации по ускоренной индикации сальмонелл и Listeria monocytogenes в животноводческом сырье и продуктах питания с помощью тест систем LOCATE®SALMONELLA и LOCATE®LISTERIA» (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии за № 5/4 от 18 октября 2006г)

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1) Болотский М.Н Индикация L monocytogenes в пищевых продуктах методом ИФА // Тезисы международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», Ульяновск, 2006г, с35-37

2) Болотский МН Индикация L monocytogenes в продовольственном сырье и продуктах животного происхождения методом ИФА. // «Ветеринарная патология», №2, 2007г, с 17-21

3) Болотский МН Изучение воздействия на популяцию бактерий рода Listeria низких температур (сканирующая электронная микроскопия) // «Актуальные проблемы современной науки», № 6, 2007г, с 42-47

ВНИИВСГЭ, 2008 г, г Москва, Звенигородское шоссе, д 5 Заказ 3/Ь Тираж 80 экз

Листериоз является природно-очаговым опасным инфекционным заболеванием человека и животных и представляет актуальную медико-ветеринарную проблему.

Болезнь характеризуется множественностью источников возбудителя инфекции, многообразием факторов и путей его передачи, а также разнообразной клинической картиной (часто протекает в виде нейроинфекции).

Начиная с 80-х годов прошлого века, листериоз привлекает к себе внимание в связи с регистрацией заболеваний людей, связанных с употреблением продуктов питания, контаминированных возбудителем листериоза. Так в США, Канаде, Мексике, Великобритании, Швейцарии, Франции и других странах были зарегистрированы крупные вспышки листериоза людей с высоким уровнем смертности при употреблении пищевых продуктов животного и растительного происхождения: молока, мягких сыров, мяса и мясных продуктов, квашеной капусты и др. [3, 69, 118, 119, 121, 131, 143, 147, 148, 157, 166, 172, 174]. К настоящему времени листериоз животных зарегистрирован в более чем 50 странах мира, где он наносит весьма существенный экономический и эпидемиологический ущерб.

Эпизоотическая ситуация по листериозу в нашей стране остается напряженной. Листериоз животных учитывается, начиная с 1956 года. Регистрация и учет листериоза у людей, как самостоятельной нозологической формы, введена Минздравом Российской Федерации в 1992г. [60].

Согласно данным Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по городу Москве за первое полугодие 2007 г. зарегистрировано 9 случаев заболевания листериозом, в том числе: среди беременных женщин с отягощенным акушерским и гинекологическим анамнезом зарегистрировано 3 случая листериоза, клинический листериоз (окулогландулярная форма) диагностирован у ребенка 9 лет, в январе 2007 года зарегистрировано два случая летального исхода у мужчин 61 и 65 лет.

В период с 2002 по 2006 г.г. в Архангельской области зафиксировано 30 случаев заболевания листериозом, по 1 случаю в Ленинградской и Мурманской областях, 11 случаев в Санкт-Петербурге [80].

Предположительно, при совершенствовании организации и методики проведения лабораторных исследований число зарегистрированных больных значительно возрастет [37, 69, 83].

Сельскохозяйственные животные заражаются чаще всего через воду, корма. К листериозу восприимчивы овцы, козы, крупный рогатый скот, свиньи, лошади, кролики, домашняя птица. Чаще болеют молодые животные. Основной резервуар возбудителя в природе - грызуны [26].

Современные технологии переработки и хранения пищевых продуктов создают условия для контаминации и размножения листерий в продуктах питания, что приводит к эпидемическим вспышкам и спорадическим случаям листериоза [53].

Листерии способны накапливаться при хранении продуктов в бытовых холодильниках, когда многие другие бактерии гибнут или не размножаются и не составляют конкуренции для значительного увеличения микробной массы листерий. Такая особенность микробов объясняет распространенное название листерий как "микроб холодильника". В этой связи хранение зараженных пищевых продуктов в холодильниках не предотвращает, а часто, наоборот, способствует листериозу у людей при отсутствии дополнительной обработки таких продуктов. Аналогичным образом соление овощей, молочных и мясных продуктов, которое губительно для многих микробов, не препятствует размножению листерий, выдерживающих 6-20%-ные концентрации поваренной соли [13, 158, 198].

В настоящее время лаборатории, проводящие исследования пищевых продуктов на наличие листерий, руководствуются ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий

L.monocytogenes». При этом выделение L.monocytogenes и окончательная идентификация этого патогена может составлять по времени до 14 суток, что осложняет исследование продуктов с ограниченным сроком годности. Следует отметить возможность возникновения артефактных результатов в практике лабораторной диагностики листериоза. Например, некоторые бациллярные формы листерии принимаются за лактобациллы, а коккобациллярные формы за стрептококки [24].

Нередко идентификация листерий, как и многих других микроорганизмов, затруднена в силу популяционной изменчивости их морфологических и биохимических свойств [72].

Для лабораторной практики наибольший интерес представляют ускоренные методы, такие как ИФА, ПЦР, ДНК-ДНК и ДНК-РНК гибридизация, радиоиммунологические методы исследования, использование хромогенных питательных сред [35, 119, 156, 165, 170, 171, 197, 203] . К достоинствам этих методов' следует отнести их высокую чувствительность и специфичность, кроме того их использование существенно сокращает время анализа, расход питательных сред и трудозатраты.

В связи с вышеизложенным, нами была определена цель - изучение биологических особенностей популяций L. monocytogenes и совершенствование индикации патогенных листерий в продовольственном сырье и продуктах питания.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ культуральных, морфологических и биохимических свойств популяций листерий, полученных на разных питательных средах при различных условиях культивирования;

2. Изучить культурально-морфологические и биохимические свойства популяций листерий, подвергнутых влиянию низких и отрицательных температур;

3. Разработать ускоренный метод индикации L.monocytogenes на основе иммуноферментного анализа (ИФА);

4. Испытать разработанный метод при мониторинговых исследованиях продовольственного сырья и пищевой продукции животного происхождения.

Научная новизна. Новизна выполненной работы заключается в том, что были изучены биологические особенности листерий на уровне микробной популяции, благодаря использованию в работе метода сканирующей электронной микроскопии, позволяющего изучать популяцию бактерий, не нарушая их естественной архитектоники. Показана зависимость морфологии клеток L.monocytogenes от состава питательной среды и режимов культивирования.

Установлено, что низкие и отрицательные температуры не влияют на морфологию клеток листерий, что связано с их психрофильными свойствами. Однако при последующем культивировании популяций, подвергнутых длительному воздействию отрицательных температур, отмечается появление в популяции клеток на различных стадиях гетероморфизма.

Разработан ускоренный метод индикации L.monocytogenes с помощью ИФА, позволяющий в течение трех суток провести скрининговые исследования продовольственного сырья и продуктов питания, что актуально для бактериологических лабораторий, контролирующих качество продовольственного сырья и продукции животноводства.

Практическая ценность работы. На основании результатов исследований разработаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации сальмонелл и Listeria monocytogenes в животноводческом сырье и продуктах питания с помощью тест систем LOCATE®SALMONELLA и LOCATE®LISTERIA» (утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 18 октября 2006г).

Исследования по теме данной диссертационной работы были проведены в лаборатории санитарной микробиологии ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии.

Приношу глубокую благодарность доктору биологических наук, профессору Павловой Инне Борисовне и кандидату ветеринарных наук старшему научному сотруднику Банниковой Дарье Андреевне за помощь при выполнении разделов по сканирующей электронной микроскопии.

Приношу глубокую благодарность доктору ветеринарных наук, профессору Кавруку Леониду Сергеевичу и кандидату ветеринарных наук старшему научному сотруднику Бритовой Софье Васильевне за помощь в работе.

Приношу глубокую благодарность директору ООО «Стайлаб», кандидату химических наук Галкину Александру Викторовичу, за предоставленную тест - систему.

V. ВЫВОДЫ:

1. Микробиологическими и электронно-микроскопическими исследованиями показано, что биологической особенностью Ь. топо суи^епеэ является полиморфизм клеток в популяции в зависимости от состава питательной среды и режимов культивирования.

2. Культивирование Ь.топосу^епеБ на МПА и МПА с 1% глюкозы при 30°С приводит к образованию колоний, представленных однотипными клетками овоидной формы; на дифференциально-диагностических средах и при повышении температуры культивирования до 37°С -клетками на разных стадиях гетероморфизма с проявлением Ь-трансформации.

3. В условиях низких (2-8°С) и отрицательных (-8 и -18°С) температур популяции Ь.топосу1х^епе8 имели типичную морфологию и были представлены однотипными, нередко делящимися овоидными клетками, плотно прилегающими друг к другу, имеющими определенную ориентацию, объединенными межклеточным матриксом, что может быть обусловлено психрофильными свойствами данного микроорганизма.

4. Низкие температуры (2-8°С) не вызывали изменений в морфологии клеток Ь.шопосу1о§епеБ в популяциях, полученных в последующих пассажах.

5. Переход от температур отрицательных (-8°С, -18°С) к положительным (+20°С, +30°С) приводит в действие адаптационные механизмы листерий. Культивирование популяций Ь.топосуи^епеБ, длительно находившихся под влиянием отрицательных температур (-8 и -18°С), приводило к образованию наряду с клетками нормальной морфологии клеток с различными проявлениями Ь-трансформации.

6. Разработаный метод индикации L.monocytogenes на основе ИФА, позволяет в течение 3 суток (время обогащения) выявить искомые бактерии в количестве 10 м.к/ мл и более в 25 г образца продовольственного сырья и продуктов питания.

7. При проведении мониторинговых исследований продовольственного сырья и продуктов животного происхождения с использованием разработанного метода индикации листерий на основе ИФА с тест-системой LOCATE® Listeria установлена корреляция результатов ИФА и бактериологического анализа, что показывает возможность использования разработанного метода для скрининговых исследований.