Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Аллергическая диагностика болезни Ауески у свиней

!УСІ УКРАЇНСЬКА академія аграрних наук

, Ь-'ГНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

' ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ

На правах рукопису САМОЙЛЮК Вячеслав Володимирович

АЛЕРГІЧНА ДІАГНОСТИКА ХВОРОБИ АУЄСКІ У СВИНЕЙ

16.00.03 — ветеринарна мікробіологія, вірусологія, епізоотологія, мікологія і імунологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня хандидата ветеринарии наук

Робота виконана в лабораторії мікробіології та імунології Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН. - -

Науковий керівник доктор ветеринарних наук Конаржезський К- Є.

Офіційні опоненти:

доктор ветеринарних наук, професор Апатенко В. М., кандидат ветеринарних наук, старший науковий співробітник Кочмарський В- А-

Провідна організація — Сумський сільськогосподарський інститут Мінсільгосппроду України, м- Суми-

Захист дисертації відбудеться « і-?- » КОІґз~)\~$Я 1997 р. на

засіданні спеціалізованої вченої ради Д 02.32.01. лри Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини, 310 023 м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини, 310023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розіслано « »_______________1997 р.

Вчений секретар ґ~) ^

спеціалізованої вченої ради, ¡У// доктор ветеринарних наук ^

ич<-^ ЧЕЧОТКІНА Н. П-

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Хвороба Ауескі — широко розповсюджене у всьому світі захворювання, яке уражає сільськогосподарських, домашніх, промислових тварин та гризунів. Особливо небезпечна вона для свиней, у яких відмічається гостра форма захворювання, а також латентний перебіг та вірусоносійство. При цьому геном вірусу, ДНК, персистує в клітинах центральної нервової системи, особливо в гангліях трійчастого нерва. В зв’язку з цим, свині є резервуаром вірусу хвороби Ауєскі в природі та джерелом збудника і при певних умовах можуть виділяти вірус, інфікуючи інших тварин, чим зумовлюють тривале стаціонарне неблагополуччя господарств.

Латентні форми хвороби Ауєскі у вірусоносіїв діагностуються за допомогою різних серологічних реакцій, головним чином реакції нейтралізації, а також імуноферментпого аналізу (ІФА). Слід відмітити, що через трудомісткість серологічних досліджень, процедури забору крові у тварин, а також недоступність поки що для більшості практичних ветеринарних лабораторій спеціального коштовного обладнання та реактивів, вони не знайшли широкого застосування у ветеринарній практиці.

В літературі є повідомлення (Бкосіа ї?., 1968; Иотов М., 1969; Мосзагі Я., 1976; БсІїегЬа О., 1978; УапсіериМе J., 1980; Госма-нов Р. Г., '1981; Камалов Г. X., 1983; ОгапсіеП І?., 1984; Абдурахманов С. К-, 1994) про можливість виявлення свиней-вірусоносіїв за допомогою алергічної шкірної проби, але широкого застосування цей метод не знайшов у зв’язку з тим, що алерген, який при цьому застосовувався, викликав сероконверсію та був недостатньо специфічним.

У зв’язку з викладеним, питання про розробку менш трудомісткого і в той же час ефективнішого та економічнішого методу широкого дослідження тварин з метою виявлення свиней-вірусо-носіїв за допомогою алергічної внутрішньошкірної проби набуває значної актуальності.

Мета і завдання досліджень. Метою досліджень був пошук способу виготовлення алергену з вірусу хвороби Ауєскі та розробка методу прижиттєвої діагностики вірусоносійства з використанням алергічної шкірної проби у свиней.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

— розробити спосіб виготовлення алергену з вірусу хвороби Ауєскі та метод прижиттєвої алергічної діганостики вірусоносій-:тва у свиней;

— випробувати виготовлені серії алергену на стерильність, нешкідливість і специфічну активність, а також на відсутність цермотоксичних, сенсибілізуючих і антигенних властивостей;

—• вивчити вірусоносійство в різні терміни після експеримен-

тального зараження вірусом хвороби Ауєскі свиней інтактних та.імунізованих різними типами вакцин;- - -...

— випробувати алергічний метод для виявленнясвиней-віру-соносіїв у стаціонарно неблагополучному щодо хвороби Ауєскі господарстві. . .

Теоретична і практична цінність роботи та її наукова новизна.

Вперше в Україні розроблено специфічний алерген (аулергіи) з вірусу хвороби Ауєскі та метод прижиттєвого виявлення сви-ней-вірусоносіїв шляхом постановки внутрішньошкірної проби з використанням безтолкового ін’єктора БІ-7. . .

Вірусоносійство при хворобі Ауєскі встановлено не тільки у інтактних — заражених тварин, але і в імунізованих різними типами вакцин, а потім заражених вірулентним вірусом хвороби Ауєскі. У вакцинованих в оптимальні терміни свиней вірус виявляли на протязі 22—29 днів, у тварин з недостатньо напруженим імунітетом — на протязі двох місяців, а у інтактних — через чотири місяці після зараження (строк спостереження).

В стаціонарно неблагополучному щодо хвороби Ауєскі господарстві визначена схема дослідження свиней в алергічній шкірній пробі з використанням безтолкового ін’єктора БІ-7, з меток повного виявлення і подальшого вилучення свиней-вірусоносіїв

Застосування алергену із вірусу хвороби Ауєскі в сполученії з інактивованою культуральною вакциною УНДІЕВ можна ви користати як основу для розробки системи викорінення цієї хво роби в неблагополучних господарствах та регіонах.

Рівень реалізації та впровадження результатів дослідженії

Результати проведених досліджень використані при розробці -т; складанні нормативно-технічної документації на алерген ІЕКВА для прижиттєвого виявлення свиней-вірусоносіїв при хвороб Ауєскі (Інструкція з виготовлення та контролю алергену, техніч ні умови та настанова по його застосуванню). Матеріали роз глянуті та схвалені методичною комісією по інфекційній нато логії ІЕКВМ і подані в ГУВ МСГіП України для затвердження

Апробація та публікація результатів досліджень. Основні положення дисертаційної роботи докладені та обговорені:

1. На засіданні Вченої Ради ІЕКВМ у 1993—1995 рр.

2. На науково-практичній конференції «Збереженість моло;: няка с.-г. тварин — запорука розвитку тваринництва Україню (м. Біла Церква, 1994).

3. На міжнародній науковій конференції «Загальна епізоот< логія; імунологічні, екологічні та методологічні проблеми: (м. Харків, 1995).

За матеріалами дисертації опубліковано Б статей.

Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертаційної робі

з

ти викладені на 15о сторінках машинописного тексту та включають вступ/ огляд літератури, власні дослідження, обговорення результатів власних досліджень, висновки, практичні пропозиції, список літератури та додатки. Робота ілюстрована 26 таблицями, 8 фотографіями. Список літератури містить 246 джерел, у тому числі 181 — іноземних.

Особистий вклад дисертанта у виконану роботу та положення, які виносяться на захист. Самостійно виконано весь обсяг експериментальної роботи, статистична обробка і аналіз отриманих даних.

На основі аналізу результатів дисертантом сформульовані положення, які виносяться на захист:

1. Спосіб виготовлення, контролю та застосування алергену ІЕКВМ для прижиттєвого виявлення свиней-вірусоносіїв.

2. Матеріали по вивченню строків вірусоносійства після експериментального зараження вірусом хвороби Ауєскі інтактних та імунізованих різними типами вакцин підсвинків.

3. Результати застосування алергічного внутрішньошкірного методу діагностики з метою виявлення свиней-вірусоносіїв у стаціонарно неблагополучному щодо хвороби Ауєскі господарстві.

І. В Л А С Н І ДОСЛІДЖЕННЯ

1.1. Матеріали і методи досліджень

Робота виконана в лабораторії мікробіології та імунології ІЕКВМ і в неблагополучному щодо хвороби Ауєскі господарстві в 1993—1995 рр. При проведенні досліджень було використано 123 підсвинки, 39 основних та ремонтних свиноматок, 71 кнур, 250 кролів і 52 морських свинки.

В дослідах використовували вірулентний вірус хвороби Ауєскі штам «УНДІЕВ-18-В», адаптований до перещеплюваної лінії клітин СНЕВ, які вирощували стаціонарним способом в 1,5 літрових матрасах, а також в пробірках (для встановлення інфекційної активності вірусу хвороби Ауєскі і постановки реакції нейтралізації). При культивуванні клітин використовували живильне середовище 199 з включенням 10% стерильної неконсер-вованої сироватки великої рогатої худоби та антибіотиків; пеніциліну— 100 Од/см3, стрептоміцину — 100 мкг/см3, ністатіну — 30 Од/см3.

Інтактних, а також імунізованих різними типами вакцин (сухою культуральною вірусвакциною ВДНКІ проти хвороби Ауєскі свиней, великої рогатої худоби і вівців, вакциною рідкою культуральною інактивованою УНДІЕВ проти хвороби Ауєскі свиней, вівців та хутрових звірів, емульсійною інактивованою концент-

рат-вакциною проти хвороби Ауескі) підсвинків Інфікували штра назальним методом в дозі 104 ТЦД50, в об’ємі 1 см3 (по 0,5 см в кожний носовий хід). Для виявлення вірусу хвороби Ауєск проводили забій свиней з подальшим відбором проб органів т; тканин; шматочків легенів, мигдалин, півкуль головного мозку довгастого мозку, мозочку, гангліїв трійчастого нерва, а такол зрізи слизової оболонки носа. Для виділення вірусу 10% суспен зію органів вносили в культуру клітин СНЕВ та вводили під шкірно кролям у дозі 1 см3. Пробу на виявлення вірусу в сус пензії органів та тканин вважали позитивною: в культурі клі тин — при появі специфічної для хвороби Ауескі ЦПД, а в біо пробі на кролях — при наявності в місці введення суспензії роз чуху та загибелі тварин.

Для вивчення сенсибілізації організму свиней та вірусоносій ства при хворобі Ауескі застосували алерген, який готували концентрованого вірусу за спеціальною методикою. Алерген тва ринам вводили біля основи зовнішньої поверхні вуха, внутрішньо шкірно, в дозі 0,2 см3. Облік реакції проводили через 24 годи ни. При наявності в місці введення препарату гарячої, болючоі червоної припухлості реакцію вважали позитивною. Для конт ролю брали живильне середовище, що використовувалось пр. культивуванні клітин СНЕВ.

Наявність віруснейтралізуючих антитіл у сироватках кров інтактних, вакцинованих та перехворілих свиней визначали в реак ції нейтралізації, яку ставили за загальноприйнятою методикою (Сюрін Н. В. та ін., 1984).

' Патологоморфологічні дослідження були проведені в лабора торії патоморфології спільно з академіком Красніковим Г. А Експериментально інфікованих вірусом хвороби Ауескі свине з позитивною шкірною реакцією забивали через 24 години післ введення їм алергену. Потім відбирали ділянки шкіри: здорове та з позитивною реакцією на алерген. Відібраний матераіл фін сували у нейтральному формаліні та рідині Карнуа. З блокії поміщених в парафін, готували зрізи, які фарбували гематоксд ліном та еозіном. Проводили мікроскопічний аналіз та вибірков фотографування гістопрепаратів.

Для оцінки імунного стану в крові досліджуваних тварин вг значали кількість лейкоцитів, абсолютну та відносну кількіст Т-лімфоцитів і їх теофілінрезистентну та теофілінчутливу субпопу ляції. Кількість лімфоцитів визначали в тесті спонтанного розет коутїзорювання (Е-розеткоутворювання) з еритроцитами баран за методиками, розробленими в лабораторії мікробіології та іму пології ІЕКВМ (Цимбал О. М. та ін., 1983). _

Результати, одержані в процесі виконання досліджень, об робляли статистичним методом за Г, Ф. Лакіним (1990). Пр:

.ьому вираховували середнє арифметичне (М) 4 середнє квадра-ичне відхилення ((і), середню квадратичну помилку (ш) та Д0-товіриість середньої величини вибіркової сукупності і. Значен-я р знаходили за таблицею Ст’юдента.

. 2. Результати досліджень

.2.1. Розробка та випробування аулергіну для виявлення виней-вірусоносіїв при хворобі Ауєскі

,2.1.1. Виготовлення та контроль аулергіну, одержаного з ірулентного вірусу хвороби Ауєскі

Виготовлення алергену для шкірної проби прн хворобі Ауєскі роводилось із вірулентного вірусу, з подальшим випробуванням ього препарату в лабораторних умовах на інтактних і імунізо-аних різними вакцинами, а потім заражених вірусом хвороби іуєскі підсвинках, а також в неблагополучному з нього захво-ювання господарстві.

Алерген готували з вірусу, репродукованого в одношаровій ультурі клітин СНЕВ. Для виготовлення препарату використо-ували внробничнії штам вірусу хвороби Ауєскі «УНДІЕВ-18-В» 0—25 пасажу на клітинах СНЕВ з інфекційною активністю —8 ^ ТЦДБО/мл. В процесі виготовлення алергену вірус ¡накивували та концентрували. Всього було виготовлено 13 серій лергену.

1.2.1.2. Контроль аулергіну

Основними вимогами до алергенів, призначених для введен-я в організм тварин з діагностичною метою, є їх стерильність, іешкідливість, специфічна активність, відсутність дермотоксич-нх, антигенних та сенсибілізуючих властивостей. У всіх серій лергену були вивчені вказані властивості.

При посівах на МЛА, МПБ, МППБ під вазеліновим маслом на агарі Сабуро встановлено, що препарат був стерильним.

Кожну серію алергену контролювали на нешкідливість шля-эм підшкірного введення в ділянку стегна двом кролям масою ,8—2 кг в дозі 1 см3. Тварини залишились клінічно здоровими, [О свідчило про його нешкідливість.

Препарат не був дермотоксичннм, тобто він не викликав будь-ких змін в шкірі після введення його тваринам, а також не мав їнсибілізуючих властивостей, про що свідчила негативна шкіра проба після повторного його введення (через 3—4 тижні). При ьому в сироватці крові не було виявлено віруснейтралізуючих нтитіл, що вказувало на відсутність антигенних властивостей.

Алерген мав високу специфічну активність — він викликав по-ітивну шкірну реакцію у інфікованих вірусом свиней. У інтакт-

них підсвинків шкірна проба була завжди негативной У свиней, щеплених емульсійною вакциною проти хвороби Ауеск позитивна шкірна реакція на введений алерген відмічалась н протязі 12 місяців (строк спостереження). Таких щеплених сві ней у подальшому використовували як моделі для контролю сш цифічної активності алергену.

1.2.1.3. Випробування способів введення аулергіну

Необхідною умовою застосування алергену було визначена найбільш придатньої для шкірної проби анатомічної ділянки т способу введення препарату. Цю роботу проводили шляхом пі рівняння інтенсивності реакції на алерген, введений в різні ан томічні ділянки тіла свиней. Препарат вводили різними спос бами — за допомогою шприца (через голку), безголкового іи’є тора БІ-7 з однією та двома насадками, а також нанесення його на скарифіковану поверхню різних ділянок шкіри свине основу зовнішньої поверхні вушної раковини, дорзальної поізер ні шиї в передній, задній та середніх частинах, ділянки груд« поясниці та сідннці.

Встановлено, що найбільш придатним способом введення але гену є його ін’єкція за допомогою безголкового ін’єктора БІ-7 двома насадками в зовнішню поверхню вуха на відстані 2—3 < від його основи, де шкіра тонка і ніжна. Облік шкірної реакі при введенні алергену в інші місця викликає значні трудной

Не виявлено різниці в інтенсивності прояву шкірної реакі після внутрішньошкірного введення алергену за допомогою шпр ца (через голку) та безголкового ін’єктора БІ-7.

1.2.1.4. Динаміка шкірної реакції у свиней після введення аулергіну

З метою вивчення динаміки шкірної реакції алерген вводи, двом підсвинкам 5-ти місячного віку попередньо щепленим ІНс тивованою емульсійною вакциною УНДІЕВ—ВНІЯІ проти хі

роби Ауєскі, а також двом підсвинкам, що перехворіли, внутрі

ньошкірно, біля основи вуха за допомогою шприца (через голк та безголкового ін’єктора, в дозі 0,2 см3.

Зразу після ін’єкції алергену в місці його введення утвор

вався горбик, який повністю зникав через декілька годин. Чер

8 годин і пізніше в місці введення алергену з’явилась припухліс почервоніння, спостерігалось підвищення місцевої температу] Ці зміни набули максимального розвитку через 24 години і зі кали повністю через 48 годин.

1.2.1.5. Вивчення патологоморфологічних змін у хворих свн-їєй в місці внутрішньошкірного введення аулергіну

Алергічний стан організму при хворобі Ауєскі, як і при інших захворюваннях, що супроводжуються сенсибілізацією, після введення алергену призводить до виникнення шкірної реакції в місці ііого інокуляції. Метою даного дослідження було вивчення гістологічних змін шкіри при позитивній реакції на алерген.

Дослідження зразків із шкіри показали, що в місці введення препарату розвивався набряк. Пучки колагенових волокон потовщені, особливо навколо судин. Місцями відмічався набряк кола-’енових пучків та їх гомогенізація з посиленим зафарбленням еозіном. Спостерігалась дифузна та пєриваскулярпа інфільтрація гканин клітинами. Навколо судин — густі скупчення лімфоїдних клітин. За межами цих щільних скупчень були розташовані поля розсипчасто розміщених лімфоцитів. Відмічено також тяжкі ураження стінок артеріальних судин, картина прояву яких була різноманітною. В одних випадках спостерігався лізис, набрякання га відшарування ендотелію з активною проліферацією клітин середньої оболонки артерій і периваскулярний набряк, а також розпушення середнього шару артерії шкіри. В інших же, рідше, відмічались проліферація клітин внутрішнього шару і обтурація проліфератом просвіту судини, тобто повна зупинка циркуляції, з активною бласттрансформацією та набряком клітин зовнішніх шарів. При обтурації судин в їх стінці інколи були присутні клітини з проявами загибелі. В місцях скупчення мононуклеарів іасто виявлялось багато капілярів та дрібних судин.

В контрольному матеріалі, поза межами алергічної реакції вказані зміни були відсутні, або місцями спостерігались лише невеликі розсипчасті периваскулярні проліферати. .

Гострий характер запальних змін у місці введення алергену особливо тяжкі ураження судин з обтурацією їх просвітів свід-іать про гіперергічннн характер реакції, пов’язаний із сенспбі-іізацією тварин.

1.2.2. Виявлення вірусоносійства при хворобі Ауєскі у свиней : різним імунним статусом за допомогою алергічної шкірної проби

.2.2.1. Вивчення алергії та вірусоносійства у свиней, зара-кених вірусом хвороби Ауєскі

Вивчення стану алергії і вірусоносійства у свиней проводили [ісля експериментального інфікування їх вірулентним вірусом :вороби Ауєскі. Тварин завозили з благополучного щодо хворо-

би Ауєскі господарства,. в якому не. проводилось щеплення проти цього захворювання. Крім шкірної проби використовували також серологічні та вірусологічні методи досліджень.

. Дослід було проведено на 15 клінічно здорових свинях. 4 — 5-місячного віку масою 40 — 50 кг, яких заразили вірусом хвороби Ауєскі іптрапазальним методом. Як видно з наведених в табл. 1 даних, віруснейтралізуючі антитіла у тварин з’явились па 14-й день після зараження і зберігались до 130 днів (строк спостереження).

. Таблиця 1

Динаміка виявлення віруснейтралізуючих антитіл та розвитку алергії у заражених вірусом хвороби Ауєскі свиней

Примітка: *) —величини зворотні розведенню сироватки крові-

Поряд з цим, у свиней, заражених вірусом хвороби Ауєскі, розвивалась підвищена чутливість до нього. У частини тварин вона спостерігалась уже через 2—3 тижні (40% позитивно реагуючих), а повністю в усіх тварин вона відмічалась через 6 тижнів. При цьому позитивна шкірна реакція на алерген набувала максимального розвитку через 24 години і повністю зникала через 48 годин.

У 12 із 15 підсвинків в культурі клітин СНЕВ вдалося виділити вірус хвороби Ауєскі. Частіше всього вірус ізолювали із довгастого мозку — у 5 свиней на 6, 20, 57, 80 та 114-й день після зараження, рідше (у 3 тварин) — із носового слизу (2—10 день), мозочку (10—20 день) та мигдалин (на 114 день).

1.2.2,2. Вивчення алергії і вірусоносійства у свиней, заражених вірусом хвороби Ауєскі в різні терміни після імунізації

Титр віруснейтралізуючих антитіл (М±пт)

Шкірна прог.і (процент реагуючих)

До зараження

14

26

41

13С

25,6 ±2,34*)

40

40

100

100

96 гЬ 12,1 44,8±4,68 42,6 ±7,4

: 3 метою вивчення механізмів формування алергії, імунітету та вірусоносійства при хворобі Ауєскі у свиней, щеплених різними типами вакцин, було проведено ряд дослідів.

У першому досліді використано 20 підсвинків 4—5-місячного іку, завезених з благополучного щодо хвороби Ауєскі господар-тва. Тварини були розділені на три групи. Свиней двох груп по 8 голів у кожній) відповідно імунізували вірусвакциною 5ДНК1 та культуральною інактнвованою вакциною УНДІЕВ [роти хвороби Ауєскі, а чотири голови свиней не щепили — вони лужили контролем. До імунізації в усіх групах підсвинків та :ісля вакцинації у тварин, щеплених вакциною УНДІЕВ, вірус-іейтралізуючі антитіла були відсутні, а в імунізованих вакциною ЗДНКІ з’явились у невисоких титрах — 1:2.

Через два місяці після щеплення свиней заразили вірусом хво-юби Ауєскі інтраназально, в дозі 104 ТЦД50. На 3—5 день після кспериментального зараження у щеплених тварин в незначній лірі, а у контрольній групі тварин — у вираженій формі проявн-гись клінічні ознаки захворювання. Титри віруснейтралізуючих ан-•итіл у контрольній групі були до 1 : 256. У свиней, щеплених вірус-закциною ВДНКІ, вони складали від 1 : 182 до 1 : 1024, а імунізова-шх культуральною вакциною УНДІЕВ — від 1:192 до 1:1536, цо зумовлено бустер-ефектом.

Шкірна проба у свиней, щеплених культуральною вакциною /НДІЕВ, після імунізації та зараження була негативною, а у цеплених вакциною ВДНКІ — позитивною.

При дослідженні матеріалу від підсвинків, інфікованих віру-:ом хвороби Ауєскі, в культурі клітин СНЕВ вірус виділили іерез два тижні після зараження у 4 із 8 тварин в кожній і.ослідній групі імунізованих свиней.

В другому досліді проводилось вивчення взаємовідношень злергії, імунітету та вірусоносійства у свиней, імунізованих вак-шною УНДІЕВ, в різні терміни до і після зараження вірусом (вороби Ауєскі. В цьому лабораторному досліді зроблена спроба моделювання епізоотичної ситуації, яка нерідко складається в -осподарствах при гострих спалахах хвороби Ауєскі.

У досліді було використано 20 свиней 4—5-місячного віку, які п,о заражения вірусом хвороби Ауєскі не мали віруспеіітралізую-інх антитіл та негативно реагували в шкірній пробі з алергеном. Першу групу тварин інфікували в день проведення другого деплення вакциною, другу — одночасно з першим введенням вак-іпнн, третю — за 12 днів до нього, четверту — заразили через їва місяці після вакцинації, а п’яту — не імунізували (табл. 2)

Клінічні ознаки захворювання були особливо виважені у контрольній групі та у тварин груп № 2 і № 3, е легкій формі перехворіли свині груп № 1 і №-4. Результати алергічних та серологічних досліджень свідчать про те, що позитивна реакція на алерген була установлена у неімунких (контрольних) свиней та в групах тварин № 2 і № 3, які на день зараження не мали іму-

нітету проти хвороби Ауєскі. У свиней груп № 1 і № 4 з достатньо напруженим імунітетом шкірна реакція на алерген була відсутня, що свідчить про певну залежність між наявністю імунітету і процесом сенсибілізації.

Таблиця 2 — Результати алергічних та серологічних досліджень свиней, заражених вірусом хвороби Ауєскі в різні терміни після щеплення ¡»активованою культуральною вакциною УНДІЕВ проти хвороби Ауєскі

Група

свиней

Строки зараження

1 В день другого щеплення

2 В день першого щеплення

З За 12 днів до вакцинації

4 Через два місяці після вакцинації

5 Нещеплені (контрольні)

Номери

свицей

Титр вірусней-тралізуючих антитіл

Шкірна

проба

17 96 *) -

18 768

19 - 92 —

20 128 —

13 128 +

14 192 +

15 192 —

16 192 —

1 384 +

2 384 +

3 196 4-

4 підсвинок загинув

9 1536 —

10 3072 —

11 1536 —

12 768 —

5 192 -4-

6 768 +

7 384 +

8 384 4-

Примітка: /4- /' — позитивна;

і—/негативна; ■

— величини зворотні розведенню сироватки крові.

При проведенні вірусологічних досліджень в біопробі на кролях вірус виділили із півкуль головного мозку, мозочку довгастого мозку, мигдалин, легенів та гангліїв трійчастого нерпа у тварин з напруженим поствакциналышм імунітетом не пізніше як через 3 тижні після зараження, а у тварин з недостатнім пост-вакцинальним імунітетом більше ніж через 40 днів.

Таким чином, одержані дані свідчать про тісну залежність ві русоносійства при хворобі Ауєскі у свиней від імунного статус; тварин. Така залежність існує між наявністю імунітету і сенсибі лізацією організму свиней вірусом хвороби Ауєскі. У проведенії: дослідженнях показано, що шкірна проба на алерген була пози тивною тільки у інфікованих вірусом свиней, які не мали пере,

и

цим імунітету. У імунних, щеплених інактивованою вакциною УНДІЕВ тварин, сенсибілізація не мала місця. Це, очевидно, пояснюється тим, що вакцина виготовлена за методикою, яка сприяє збереженню цілістності і прнродньої структури віріонів вірусу. При цьому білкові фрагменти збудника, які відповідають за алергізацію організму, залишаються прихованими під оболонками вірусу.

У третьому досліді вивчали взаємозалежність алергії, імунітету та вірусоносійства у підсвинків, імунізованих проти хвороби Ауєскі інактивованою емульсинвакцкною УНДІЕВ-ВНІЯІ та вірусвакци-ною ВДНКІ. В досліді використано 9 свиней 4—5-місячного віку, завезених з благополучного щодо хвороби Ауєскі господарства. Цими вакцинами імунізували по 3 голови свиней. Трьох підсвинків не щепили.

Результати алергічних та серологічних досліджень наведені в табл. 3. Дані таблиці свідчать про те, що через 49 днів після вакцинації у свиней, імунізованих як однією, так і другою вакцинами, відмічено стан сенсибілізації, який виявляється алергеном, при відсутності в ці строки віруснейтралізуючих антитіл у тварин, імунізованих живою вакциною., і наявністю їх уже через 3—7 тижнів у щеплених емульсійною інактивованою вакциною УНДІЕВ-ВНІЯІ.

Таблиця 3 — Динаміка алергічних та серологічних показників у свиней, щеплених проти хвороби Ауєскі вірусвакциною ВДНКІ ветпрепаратів та емульсійною інактивованою вакциною УНДІЕВ-ВНІЯІ

Титри віруснейтралізуючих антитіл Шкірна проба

Вакцина Номери свиней До вакцинації ж їй- са д- 5 к 2 со 5 к см •- г* * . о сз со & 2 о а к ^ с * два місяці ПІСЛЯ зараження й’5 со пз Я ЇС о 5 е( ^ 49 днів після вакцинації два місяці після ' зараження

Вірусвакци- 1 0 0 0 1536 *) - 4- +

на 2 0 0 0 96 — + +

ВДНКІ 3 0 0 0 96 — + +

Емульсійна 4 0 6 6 1536 — + +

вакцина 5 0 3 16 384 — + Ч"

УНДІЕВ. ВНІЯІ 6 0 6 32 підсвинок, — загинув -Ь підсвинок загинув

Примітка: /+/ — позитивна;

/—/ — негативна;

*) — величини зворотні розведенню сироватки крові.

Через 50 днів після щеплення тварини, були заражені вірусом хвороби Ауєскі інтраназальним методом у дозі 104 ТІДД50. Через два місяці після зараження у свиней усіх дослідних груп відмічено високий титр віруснейтралізуючих антитіл та. позитивну шкірну реакцію на алерген, В групі тварин, імунізованих вірусвакциною ВДНКІ, він складав від 1:96 до 1:1536, у імунізованих емульсин-вакциною УНДІЕВ-ВНІЯІ від 1:384 до 1:1536, в контрольній же групі до 1 : 768.

У свиней, щеплених обома вакцинами, в біопробі на кролях через 4 тижні після зараження із слизової оболонки носа, легенів, мигдалин, півкуль головного мозку, мозочку, довгастого мозку виділили вірус хвороби Ауєскі.

1.2.3. Вивчення природи сенсибілізації у свиней до вірусу хвороби Ауєскі

Відомо, що гіперчутливість сповільненого типу обумовлюється Т-лімфоцитами. В зв’язку з цим, для вивчення природи явища сенсибілізації був проведений спеціальний дослід на 4 підсвинках. Два з них були імунізовані проти хвороби емульсійною інактиво-ваною вакциною УНДІЕВ-ВНІЯІ. Тварини після щеплення позитивно реагували в шкірній пробі з алергеном. У подальшому були проведені дослідження по відтворенню реакції гіперчутливості сповільненого типу у двох неімунізованих свиней-реципієнтів шляхом інтраперитонеального введення 18 і'млн. (клітин лімфоцитів від щеплених емульсійною вакциною свиней-донорів. На другий день після цього тваринам-реципієнтам ввели алерген, в місці введення якого через 24 години розвивалась виражена позитивна реакція, що свідчило про відтворення гіперчутливості сповільненого типу у сенсибілізованих алогенними лімфоцитами свиней.

Вивчався також стан алергії у тварин на повторне введення аулергіну. З цією метою 3 сенсибілізованим підсвинкам алерген ' вводили через 3 і 13 днів після чергового введення препарату. При цьому змін у шкірі не відмічалось, тобто реакція була негативною. Тільки через 3 тижні після останнього введення алергену позитивна реакція повністю відновилась. Втрату реакції можна пояснити явищем десенсибілізації організму тварин.

1.2.4. Показники Т-лімфоцитів у свиней при вивченні імунного стану після зараження вірусом хвороби Ауєскі

І

При вивченні імунного стану організму у інтактних та імунізованих різними вакцинами, а потім заражених вірусом хвороби Ауєскі підсвинків, вивчали кількість лейкоцитів, лімфоцитів, ро-зеткоутворюючих Х-лімфошітів.

Результати імунологічного дослідження свідчать про те, що у свиней, щеплених культуральною вакциною УНДІЕВ через 9 днів після імунізації вірогідно збільшується кількість лейкоцитів та лімфоцитів (р<0,05) відповідно на 14,4 і 2,6%. У підсвинків, щеплених вірусвакциною ВДНКІ та емульсійною вакциною УНДІЕВ-ВНІЯІ, після імунізації відмічено значне збільшення загального вмісту Т-лімфоцитів, відповідно на 26,0 і 19,6% (р<0,05).

Через 48 днів після зараження вірусом хвороби Ауєскі в усіх групах тварин спостерігалось вірогідне зниження загальної кількості Т-лімфоцитів (р<0,05). В групі свиней, щеплених культуральною вакциною, цей показник знизився на 4,0%, у щеплених вірусвакциною ВДНКІ — 9,4% і у імунізованих емульсійною вакциною УНДІЕВ-ВШЯІ — на 4,4%. Крім цього, в указаних групах тварин після зараження відмічалось також незначне зниження показників теофілінрезистентних та теофілінчутливих Т-лімфоцитів.

У контрольних підсвинків після зараження вірусом хвороби Ауєскі спостерігалось зниження загальної кількості Т-лімфоцитів на 13,0% (р<0,05). Щодо теофілінрезистентних та теофілінчутливих Т-клітии, то їх кількість зменшилась відповідно на 9,0 та 19,9%.

Таким чином, результати імунологічних досліджень свідчать про варіабельність показників імунного статусу свиней після щеплення та зараження вірусом хвороби Ауєскі, причому зміни майже аналогічні у підсвинків, щеплених усіми трьома вакцинами. Можливо, ці показники відображають відомі явища про зниження загальної резистентності організму людини і тварин після перенесених вірусних та бактеріальних інфекцій, які в даному випадку були більш тривалими і поглибленими у інфікованих, невакцинова-них свиней.

1.2.5. Випробування алергічного методу з метою виявлення свиней-вірусоносіїв у стаціонарно неблагополучному щодо хвороби Ауєскі господарстві

Після застосування алергену в лабораторних умовах, цей препарат було випробувано в неблагополучному відносно хвороби Ауєскі господарстві, де останній спалах захворювання було відмічено серед новонароджених поросят Та свиноматок у 1992 році, після завозу ремонтних кнурів. Після діагностування хвороби все свинопоголів'я було одномоментно імунізовано культуральною вакциною УНДІЕВ без подальшої ревакцинації. Були вакциновані також новопрн'буваючі свині. Після спалаху хвороби Ауєскі частина свиноматок та кнурів у господарстві досліджувались у реакції нейтралізації. При цьому позитивно реагуючих тварин вилу-

чали із стада, але частина свиней із-за трудомісткості поголівного кровозабору не була досліджена.

У 1993 році в господарство були завезені ремонтні кнури з іншої області. Всі вони були здорові і не мали віруснейтралізуючих антитіл до вірусу хвороби Ауєскі. За весь час після ліквідації останнього спалаху клінічних ознак даної хвороби не було зареєстровано.

При клінічному дослідженні свинопоголів’я господарства, проведеному тричі на протязі 1994 року, також не виникло будь-яких підозр на хворобу Ауєскі. Але при алергічних та серологічних дослідженнях свиней, зокрема свиноматок, які збереглися з моменту спалаху хвороби Ауєскі, а також кнурів, завезених у 1993 році, були виявлені високі титри віруснейтралізуючих антитіл, а також встановлені позитивні реакції в шкірній пробі з алергеном ІЕКВМ. Три свиноматки (№ 3, 5 і 6), які позитивно реагували в шкірній пробі з алергеном, при наявності у двох із них віруснейтралізуючих антитіл (№ 3 і 6), були спеціально забиті для дослідження на присутність вірусу хвороби Ауєскі в мозку, гангліях трійчастого нерва, а також внутрішніх органах (легенях, печінці, селезінці, нирках) в біопробі на кролях та культурі клітин СНЕВ. В результаті цих досліджень вірус хвороби Ауєскі виявлено в мозку, гангліях трійчастого нерва та внутрішніх органах свиноматки № 5, що позитивно реагувала на алерген, але не мала віруснейтралізуючих антитіл, та у свиноматки № 3, реагуючої в реакції нейтралізації і шкірній пробі. Виділення вірусу від свиноматки № 5, при відсутності в неї віруснейтралізуючих антитіл, але наявності позитивної реакції на алерген, свідчить, очевидно, про те, що стан сенсибілізації зберігається довше, ніж антитілоутворювання, або для нього не потрібна наявність повноцінного вірусу.

Одержані дані свідчать про придатність алергічного методу для виявлення вірусоносіїв. По цінності він не поступається перед серологічним методом, а можливо, і перевершує його, зокрема при використанні в стаціонарно неблагополучних з цієї інфекції господарствах при масовому дослідженні тварин.

Результати епізоотологічних, клінічних, алергічних, серологічних та вірусологічних досліджень свідчать також про те, що причиною стаціонарності хвороби Ауєскі є свині-вірусоносії, у яких вірус зберігається в неактивній формі. Але цей вірус здатний, як видно, до трансмісивності, індукує утворення антитіл і викликає сенсибілізацію організму у дорослих тварин без прояву у більшості випадків клінічних ознак захворювання. Повне вилучення вірусоносіїв із стада, таким чином, є необхідною умовою для викорінення хвороби Ауєскі в неблагополучних господарствах.

У цьому ж господарстві з метою вивчення алергічних реакцій у свиней при багаторазових повторних введеннях алергену, прове-

Дено дослід на 27 кнурах та 18 свиноматках з триразовим внут-рішньошкірним введенням препарату, з інтервалом у 4 тижні. В стаді, де утримувались вказані тварини, за 6 місяців до цього виділяли свиней з позитивною реакцією на алерген.

В результаті проведених досліджень встановлено, що всі кнури після триразового введення їм алергену реагували негативно, а серед свиноматок були позитивні реакції: при першому дослідженні виявлено 2 голови, при другому — 3 голови і при третьому —2 позитивно реагуючі свиноматки, що зв’язано, можливо, з фізіологічними особливостями реактивності організму тварин. Одинадцять свиноматок, які на протязі трьох проведених алергічних досліджень реагували негативно, вважали вільними від вірусу хвороби Ауєскі.

На основі проведених досліджень визначена схема дослідження свинопоголів’я неблагополучннх господарств алергеном для повного виявлення вірусоносіїв. Ця схема включає дослідження свиней, які знаходяться в господарстві тривалий строк — це свиноматки та кнури. Після першого введення алергану та виділення позитивно реагуючих свиней, група тварин досліджується в шкірній про'бі ще три рази з інтервалом 4 тижні. Свиней, які при цьому мали негативну реакцію, вважають вільними від вірусу хвороби Ауєскі.

В умовах свинарського господарства проведено також хронометраж робочого часу, витраченого на внутрішньошкірне введення алергену за допомогою безтолкового ін’єктора БІ—7. Встановлено, що в середньому, для введення препарату одній голові (з урахуванням фіксації тварин) витрачається 1 хвилина, що свідчить про високу технологічність даного способу введення алергену і можливість його використання при масових діагностичних дослідженнях.

Таким чином, запропонований алерген 1ЕК.ВМ, виготовлений з інактивоваиого вірусу хвороби Ауєскі, за допомогою якого можна проводити масові дослідження свиней, сумісно з культуральною інактивованою вакциною УНДІЕВ проти хвороби Ауєскі, що не викликає поствакцинальної серопознтивності та сенсибілізації, можуть служити основою для розробки системи викорінення хвороби Ауєскі та її збудника в неблагополучннх господарствах та регіонах. .

висновки

1. Розроблено спосіб виготовлення алергену (аулергіну) з вірусу хвороби Ауєскі для виявлення свиней-вірусоносіїв в шкірній пробі. Препарат є стерильним, нешкідливим, високоспецифічним, не має дермотокснчних, сенсибілізуючих та антигенних властивостей.

2. Позитивна шкірна реакція на алерген проявляється у вигляді тістуватої, болючої припухлості, рожево-червоного кольору. З’являючись через 8—10 годин, реакція досягає максимального розвитку через 24 години і зникає через 48 годин після введення препарату.

3. Найбільш виражена реакція розвивається після введення алергену в ділянку шкіри зовнішньої поверхні вуха, на відстані 2—3 см. від його основи.

4. Встановлено повний збіг інтенсивності шкірної реакції та кількості виявлених позитивно реагуючих свиней після внутрішньо-шкірного введення алергену за допомогою шприца (через голку) та безголкового ін'єкгора БІ-7 в дозі 0,2 см3.

5. При хворобі Ауєскі у свиней розвивається алергічний стан до вірусу в формі гіперчутливості сповільненого тину. Сенсибілізація до вірусу хвороби Ауєскі наступає у свиней через 3—4 тижні після зараження або імунізації тварин вірусвакциною та інактнво-вапою вакциною з масляним ад'ювантом і зберігається не менше як 12 місяців (термін спостереження).

6. Після постановки алергічної шкірної проби свині не реагують на повторне введення алергену. Позитивна шкірна реакція у цих тварин повністю відновлюється через 3—4 тижні після останнього введення препарату, що слід враховувати при проведенні повторних алергічних досліджень.

7. Стан гіперчутливості сповільненого типу при хворобі Ауєскі відтворюється у інтактних підсвинків адоптивним переносом моно-нуклеарної фракції лімфоцитів крові, одержаної від сенсибілізованих тварин-донорів.

8. Свині, що позитивно реагують у шкірній пробі з алергеном, є вірусоносіями. В більшості випадків результати алергічних досліджень співпадають з показниками реакції нейтралізації вірусу хвороби Ауєскі.

9. Шкірна реакція на алерген не розвивається у тварин, які не мали контакту з вірусом, та свиней, імунізованих проти хвороби Ауєскі інактивованою вакциною УНДІЕВ, але вона виникає у перехворівших тварин або імунізованих вірус-та емуль-синвакцинами проти хвороби Ауєскі.

10. В стаціонарно неблагополучному щодо хвороби Ауєскі господарстві, де встановлена позитивна шкірна реакція на введення

алергену, в сироватці крові свиней виявляються віруснейтралізую-чі антитіла, а з мозку, легенів, мигдалин, гангліїв трійчастого нерва цих тварин виділяється вірус хвороби Ауєскі. Це свідчить про можливість за допомогою алергічної шкірної проби проводити виявлення свиней-вірусоносіїв та вилучення їх із стада з метою повного оздоровлення від хвороби Ауєскі.

11. Застосування запропонованого алергену із вірусу хвороби Ауєскі в сполученні з інактивованою культуральною вакциною УНДІЕВ проти хвороби Аускі може служити основою для розробки системи викорінення цієї хвороби та її збудника в неблагополуч-них господарствах та регіонах.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ

Розроблено алерген із вірусу хвороби Ауєскі для виявлення свиней-вірусоносіїв у неблагополучних з цього захворювання господарствах.

Результати проведених досліджень використані при розробці і складанні нормативно-технічної документації на алерген:

— Інструкції по виготовленню і контролю аулергіна для прижиттєвого виявлення свиней-вірусоносіїв при хворобі Ауєскі.

— Технічних умов (ТУ У).

— Тимчасової настанови по застосуванню аулергіну ІЕКВМ. для прижиттєвого виявлення свиней-вірусоносіїв при хворобі Ауєскі.

Результати досліджень використовуються в учбовому процесі на факультетах ветеринарної медицини Харьківського зооветеринарного та Сумського сільськогосподарського інститутів.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Алергічна проба при-хворобі Ауєскі К- Є. Конаржевський, О. М. Цимбал, T. М. Сєрбіненко, В. В. Самойлюк /'/' Збережність молодняка с.-г. тварин — запорука розвитку тваринництва України. 36. статей) Наук. — практ. конф. Харків, 1994. — с. 41—42.

2. Алергічна проба при хворобі Ауєскі (К. Є. Конаржевський, О. М. Цимбал, Т. М. Сербіненко, В. В. Самойлюк // Инфсрм. бюл., 1994 г.) ИЭиКВМ. — Харьков, 1995.— с. 24—25.

3. Allergy in Aujeszky disease (К. E. Konarzhevsky, V. Romanenko, A. M. Tsym-bal, V. A. Bousol, T. N. Serijincnko, V. V. Samoylouck. /¡/ Programme and Abstracts) Symposium on IBR and other ruminant herpes virus infections, 26—27 July 1995 y., Belgium, Sart Tiiman. — Sart Tilman, 1995. — P. 45.

4. Вакдииопрофилактика и диагностика болезни Ауески у свиней (В. А. Бусол, К- Е. Конаржевский, А. М. Цымбал, Т. Н. Сербиненко, В. В. Самойлюк // Общая эгшзооюлогия: иммунол., экол. и ыетодол. пробл.: Материалы междунар. нау% конф., 20, 21, 22 сенг. 1995 г.) ИЭиКВМ. — Харьков, 1995. — с. 415—418.

5. Вірусоносійство у експериментально заражених вірусом хвороби Ауєскі свиней (В. О. Бусол, К. Є. Конаржевський, О. М. Цимбал, T. М. Сербіненко. В. В. Самойлюк // В;ет. медицина: Міжвід. тематич. наук зб. — К-, 1995. — Віт. 70. - с. 48-52.

Самойлюк В. В. Аллергическая диагностика болезни Ауески у

свиней.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология. Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, Харьков 1S96.

Установлено наличие гинерчувствительности замедленного типа при болезни Ауески у свиней, которая коррелирует с вирусоно-сптельством,

Разработан способ изготовления аллергена (аулергина) из гаруса болезни Ауески с целью выявления свиней-вирусоносителей в кожной пробе.

Сенсибилизация к вирусу болезни Ауески наступает у свиней через 3—4 недели после заражения или иммунизации животных внрусвакцниой и инактивированной вакциной с масляным адьюван-том и сохраняется не менее 12 месяцев (срок наблюдения).

Кожная реакция на аллерген не развивается у животных, которые не имели контакта с вирусом и свиней, иммунизированных против болезни Ауески инактивированной вакциной УНИИЭВ.

Применение разработанного аллергена из вируса болезни Ауески в комплексе с инактивированной вакциной УНИИЭВ против болезни Ауески, не вызывающей сенсибилизации и серопозитив-ности, может служить основой для разработки системы искоренения этой болезни и ее возбудителя в неблагополучных хозяйствах и регионах.

Dela,ed [hipersensitivity of swines at Aujeszky’s disease that correlates with virus—carriage has been determined.

Method of allergen (aulergin) produktion of Aujeszky’s disease virus to be used for swine virus-carriers identifikation by skin test has been developed.

Aujeszky’s disease virus sensibilization is observed with swines within 3—4 weeks after animali infektion or immunization with viral vaccine and killed vaccine with oil adjuvant and holds for 12 months min (observation pqriod).

Skin respouse is not observed with animls that were free of contact with the virus and with swines, immunized against Aujeszky’s disease with killed vaccine of ihe Ukrainian research , institute of experimental veterinary medicine.

Application of developed allergen of Aujeszky’s disease virus in combination with killed vaccine, of the Ukranian research institute of experimental veterinari mediciné against Aujeszky’s disease that does not induce sensibilization and seropositivity can be used as a basis to develop an eradication system of the disease and its causative agent in disease —1 affected animal husbandries and regions.

Ключові слова: алерген, вірус хвороби Ауескі, хвороба Ауєскі, вакцини, вірусоносійство, віруснейтралізуючі антитіла, шкірна проба, сенсибілізація.