Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Адаптация и культивирование коронавируса крупного рогатого скота

УКРАИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАИШЯ УНИВЕРСИТЕТ

Аспирант ИМ ЛЕАП

АД/ШТАЩЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КОРОШИР/СА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

На правах рукописи

■)

Киев -

Работа выполнена в Украинском государственном . аграрном университете

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор, член-корреспондент УААН Онуфриев В. П.

Официальные оппоненты:

- доктор ветеринарных наук, Сгарчеус А.П.

- кандидат ветеринарных наук. Причина Д.С.

Ведущая организация - Украинский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии ( г. Чернигов )

Защита диссертации состоится " оЦ\ "<^¡>1^, 1 1994 г. в " часов в Украинской государственном аграрном универси-,

тете в специализированном совете 1 120.71.03.

Адрес университета: 252041, Киев-41, ул. Героев обороны, 15, сектор защиты диссертаций.

Просьба принять участие в обсуждении диссертации при ее защите или выслать ь адрес совета Ваш отзыв на автореферат в 2-х экземплярах, заверенный печатьо.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан " " 1994 г.

Уче.чьй секретарь . специализированного совета, доктор ветеринарных наук УЯШдКЯ СОС< В.А.Бортничук

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Для увеличения выхода продукции животноводства необходимо сохранение новорожденных животных и выр&цива-нио здорового, хорошо развитого и приспособленного к условиям промышленного содержания молодняка. Гибель новорожденных животных происходит главнчм образом от желудочно-кишечных заболеваний. Ке-лудочно-кишочние заболевания молодняка из-за их строкой распространенности и существенного экономического ущерба, который они приносят яивотноБОдческпм хозяйствам, составляют проблему для ветеринарной науки и практики.

Известно, что массовые диареи новорожденных телят чаще всего имеют инфекционную природу. Инфекция почти всегда развивается на фопэ неблагоприятных факторов кормления и содержания. Известно, по меньшей море, несколько инфекционных начал, вызывающих диарея у телят: эшеряхии коли, криптоспориди, парво- , рота- и коронави-русн / Mebus С.A. et al. , 1971, 1973, 1976; Wood G.N. et al., 1974, 1978; ЗЬсгг J". , 1978; Moon. H.W. et al, 1988/.

В последние годы информз ция по проблеме инфекционных диарей молодняка крупного рогатого окота свидетельствует о том, что важным этиологическим фактором в возникновении диарея новорожденных телят является корокавирус / Stair E.L. et al., 1972; Короиыслов Г.Ф. и ссавт., 1С84/. От больных энтеритом новорожденных телят кяогем исследователям удалось ввделить коронавирус и экспериментальным- путем подтвердить его патогенпость на телятах-гнотобиотах / Kebus С.A. et al. , 1972, 1973; Ticriix !t. et al. , 1974;

Wood G.N. e al. , 1978/. . •

Клинические признаки коронавирусной инфекции проявляются обычно у телят о 7-10 до 20-дневного возраста в ввде диареи о выделением жидких фокалий желтого цвета, часто со слизью и кровью.

Наолвдается обезволяваниз организма и депрессия. Заболевание час- . то ассоциируется с бактериальным и другими вирусными инфекциями. Симптомы йолозш не отличима от даарей других этиологий. Поэтов для успешной борьбы с этой болезнью необходимо своевременно и правильно ее диагностировать, а такяо иметь средства спопифпческоИ профилактики. Репенио этих вопросов затруднено сложность» выделения возбудителя и его культивирования. Бодьшенство изолятов вируса, полученные от спонтано инфицированных телят, трудно адаптируются к клеточном культурам и не вызывают цитопатических изменений.

Цель г. задачи исследований. Целью наией работы являлись адаптация короназируса крупного рогатого скота к клеточным культурам и его культивирование. достижения этой цели мы долмш били решить следуидие задачи:

- определить возможность вкделашш короназируса из фекалий больных новоровденнкх телят;

- определить чувствительные для его репродукции культуры клеток;

- отработать условия его культивирования;

- изучить некоторые биологические свойства вируса.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение

чувствительности перевиваемых линий клеток ТЯ и ВДВК к коро-навирусу крупного рогатого скота. Доказано влияние трипсина, ДЭАЭ-декстрина, дозн вируса, гипертонической среда и £¿1 на интенсивность размножения при адаптации и культивировании вируса. Вменена неустойчивость' вируса к воздействиям тейпературы.

Практическая ценность. Выполненная работа является разделом комплексной тематики кафедры микробиологии и вирусологии УГЛУ. Полученные результаты расширяют имеющиеся сведения о возко.улости выделения коронавируса крупного рогатого скота в перевиваема

-v-

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на кафедре микробиологии и вирусологии Украинского государственного аграрного университета в 1991-1993 гг,

В работе использовали пробы <$екалш1, доставленные из фермы неблагополучной по желудочно-кисечному заболеванию. Материал собран от телят с клинически,œ признаками энтерита в возраста 1-2 недель.

Изоляты, полученные от диарейнах телят и коронгвирус 4-го пассажа а поревиваемых клетках Vero были использованы при адаптации и культивировании вируса.

Выделение вируса и его пассирование проводили в перевиваемой культуре клеток слизистой,трахеи коровы / ТВ / и перевиваемой культуре клеток почки коровы /,1£БК/.

Клетки ТН взращивали на среде 199 пополам с 0,5^-нкм гид-ролизатом лакталбумина на растворе Хенкса с добавлением 10% сыворотки, несодержащвй антител к коронавирусу и неспецифическгос ингибиторов.

¡Слетки ЭДН культивировали на среде Игла /6СУ с средой 199 /40л/ с добавлением 10% сыворотки.

При выращивании культуры клеток и репродукции вируса применяли стационарный метод /в пробирках, маленьких и больших матрас-сах/.

Дитопатическоа действие /ЩЩ/ вируса учитывали на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10-е сутки после заражения.

Гемагглютинируодуо активность Еируса определяли в РТА я РЗТЛ с 1%-naft суспензией эритроцитов белой крысы или f.uraei. В РЗГА использовали телячью и крол.тию антикоронавирусные сыворотки. Реакций ставили шкромэтодом по общепринятой методике.

Реакцию гемадсорбции /РГАд/ выполняли по методике Gerno £ étal

клетках ТЕ и М1БК и давт основание вести поиск оптимальных условий культивирования вируса. Адаптированный к культуре клеток корона-вирус используется в лаборатории для постановки РГА и РЗГА при этой инфекции.

Апробация работы. Работа доложена на заседании кафедры микробиологии и вирусологии УГАУ. Материалы диссертации изложены, обсуждены и одобрены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов УГАУ /1993/. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и предложений, списка литературы, состоящего из 271 источников, в том числе 2й иностранных авторов. В текст диссертации вклвчены 19 таблиц и 16 рисунков.

-с-

женные и контролыше монослоз выдерживали в течение 10, 20 и 30 минут в поддерживающей среде с добавлением 100 М NaCl . с этого времени монослои дважды приливали и вйосшш свежую поддерживающую среду.

Действие рН на репродукцию ¿яруса изучали с использованием метода, описанного Dea S. eb al. /1980/, которые испытывали при рН мезду 6,5 и 8,5.

Спектр геыагглютинируидей активности вируса изучали с эритроцитами шшей, крис. морских свинок, кроликов, "иаренов, крупного . рогатого скота и - свиней.

Для изучения температурных условий, при которых более четко и быстро проходила агглютинация, РТА ставили при 4, 22 и 37°С с 1%-noR суспензией эритроцитов красы.

Вируссодержащий материал прогревали перед постановкой РТА при '50, 60 и 70°С в течение 10, 20 и 30 шву т. Затем изучали влияние температур;; на ге;/ягглютинирулцуи активность вируса.

Действие теютературы на ин$екцнонность вируса испытывали путем прогревания очищенного вируссодержащего материала при 37, 45,. 50, 60 и 70°С в течение 60 минут.

Инактивацию ирогревапием как действие времени выдержки определяли таким образом: образцы,вируса выдерглваль при 50°С в течение О, 15, 30, 60, 90 и 120 минут. Затем суспензию вируса испытывали на остаточную' инфекционность. ' '

Для вычисления средней статистической ошибки применяли методику, описанную Сюриным Б.Н, и соавт. /1585/.

'1961/ , а реакции торможения гекадсорбцик выполняли по методике Золовьева В.Д. и Маствкова В.Н. /1958/;

Инфекционную активность вируса определяли по цитопатическому )ффекту и расчитывали по Риду и Менчу /1938/.

Электронно-микроскопический внеклеточный вирус исследовали юсле негативного контрастирования 3%-тн раствором фосфорноволь-¡)раиовой кислоты рН 6,8. Культуральнув вируссодержапзга жидкость зредварительно осветляли центрифугированием при 5000 об/мин. в те^ 1ение 20 минут. Затем надосадочнуе жидкость ультрацентрифугировали 5 режиме 35000 об/мин., 2 часа при 4°С. Полученный осадок ресуспен-зировали в малых объемах дистилированной воды. Препараты прссматри-зали в электронном микроскопе ЭВМ-IOCüI при ускоряющем напряжении 75 ¿иловодьт. При иммунноэлектронно-микроскопическом исследовании к вдосадку прибавляли 1:1 антикоронавируснус сыворотку в разведении 1:3. Смесь помещали на 16-18 часов в холодильник при 4°С, потом подвергали ультрацентрифугированив; Пооледусдие операции с меге-риалом выполняли аналогично описанным при электронной микроскопии.

Для изучения влияния трипсина на размножение вируса использовали технику, описаннуо Toth Т.Е. /1982/. При этом коронавирусные инокуляти готовили в среде, содержащей 1, 5 и 10 мкг трипсина в ид. После адсорбции вируса из пробирок удаляли инокулят и вносили соот-ветствупцую поддерживасцус среду.

В опытах изучила влияние ДЭАЭ-декстрана на репродукцио вируса, используя технику, описанную Dea S. et al. /1980/, которые заражали клеточные культуры коронавирусом с средой, содерааиен 15, 25 и 50 мкг ДЭАЭ~дек.страна/мл.

.При изучении влияния гипертонической среды на репродукцию вируса использовали метод, описанный Ñuss D.L. et al. /1975/. Клеточные культуры заражали 0,1мл вируса . Через 5 или- 7 часов зара -

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение питопатических свойств коронаииотса крупного рогатого скот^

Цитопатическое дойствио бычьего коронавируса яа зараженные летки ТЕ характеризовалось образованием разреженных участков, оторне расширялись и появлялись бесклеточныв участки."Позже кле-очный монослой имел вид сети, сформированной из отдельных клеток ли их групп и цитоплазматических тяжей. Наконец происходило полое разрушение клеточного монослоя.

Первые признаки ЦПД проявлялись через 72-96 часов после варенная коронавирусои К-1 с первого по третий пассаж и через 48-72 [асов - с четвертого по шестой пассаж. Максимальное ШД вируоа в |Тих пассажах паблвдалось на 6^-й день. С седьмого по одиннадцатый пассаж время наступления ЦПД увеличилось, так, первые призна-си 1Щ проявлялись на 4-5-й день и максимальное ЦПД - на 7-10 день. ! слелгутощих пассажах обнаруживались первые признаки ЦПД через 72-Ю часов с максимальной внраяенносты! на 7-9-й день.

При адаптации коропавяруса К--2 первые признаки ШД с первого м десятый пассаж проявлялись через 72-96 часов, кроме как в 4 и 5-ом пассажах - через 48-72 часов. Максимальное ШД наблюдалось аа 6-8-2 день. С одиниадпдтого пассажа ЦПД вируса наступило через 18-72 часа.

В зараженных клеточных монослоях ЭДЩ обнаруживали ЦОД, которое в начале проявлялось мелкой зернистостью в результате распада отдельных клеток. Со временем число округлившихся клеток возрастало и они образовывали грозди с появлением разреженных участков. Монослой имел вид сети, образованной датоплазматическими отростками, тяжами и участками из меток.

Цитопатическое действие бычьего короказнруса в зараженных

культурах клеток ВДЕК удалось наблодать с второго пассажа. Причем во втором пассаже коронавирусов К-3 в К-4 вызывали 1Щ через 72-96 часов. С каадкм успешным пассажем и повышением инфекционное-ти вируса время наступления ЦГЩ немного укорачивалось. Так ухе в 8-ом пассаже первые признаки ЦПД обнаруживались через 48-72 часов, Максимальное 1ДЩ вируса в этих пассажах иаблвдалось на 6-7-й день,

3.2. Электронная и иммуноэлектшниая

микроскопия

При электронной микроскопии образцов инфицированных корона-вирусом культуральшх жидкостей обнаружились коронавирусные частицы. Вярионн были умерено полиморфными, но главнш образом округлыми. Они покрыты буловидшдш выступами около 10-16 ни дашны. Диаметр полных вирионов варьировал между 80 и 130 им. В некоторых случаях эти частицы были лишены наружных отростков.

При иммуноэлектрошой микроскопии в поле зрения нередко обнаруживались скопления вирусных частиц как с булавовидными выступала, так и без них. Эти скопления были большими и малыми от 3-5 до 30 полиморфных частиц. .

3.3. Определение гемагглттитаруипей. гемалсо^и- ' . руюшеи и инфекционной активностей бычьего

корондвирус^

результаты исследования показали, что культуральная жвдкость зараженных-культур клеток Тй и МДБК содержала гемагглютинины к эритроцитам крыс в титре, -не превышавшем 1:16 и 1:32 соответственно. Титр гемагглютишша у изолятов К-1 и К-2, раз множащихся в.

ТВ. клетках, ае обнаружили в 1-ом и 2-ом пассажах. Он достигая титра 1:16 после Ю-го -пассажа. Гемахтлютинируицуп активность вируса, размножающегося в клетках ЗДЕК, наблсдали в более раннем

пассаже по сравнению с вирусом, размнокапцем ся в Тй , т.е. она появлялась уже в 2-ом пасам в тигре 1:2 и 1:4 у изолятов К-3 и К-4 соответственно /табл. 1/.

Таблица 1.

Гемагглтэтиниругадив титрн бычьих коронавярусов, выделенных в культурах клеток ТЯ и К'ДЕК.*

Культуры Кэсляты : ÍI а с с а ж я В и р у с а

клеток ; i : 2 : 3 4 : 5 : 7 10 15

та К-1 - 4 8 8 8 16 16

К-2 - 4 4 8 8 16 16

К-3 2 8 8 8 16 32 32

К-4 i 4 4 8 8 16 16 32

. * Цифрами обозначены обратные величины разведения суспензии вируса.

Установлено, что зараженные клетки ТН и f/ДЕК ранее чем че-, рез 72 часа после заражения не адсорбировали эритроциты крыс. Гем-адсорбимв клетками наблгдачи только через 72 часа после заражения. Гемадсорбция на культуре клеток TR и ГЛИН' тела сходный ци.]ф/з-hhü характер. Эритроцита располагались равномерно по всему меточному иснослою. Сравнение гемадсорбция в обоих зараженных клетках показало, что метки .ЧДБК обладай болое вчраженной способностью адсорбировать эритроцита крыс, чем TR клетки.

Увеличение урожаев бычьего коронавируса в метках ТН то медленно. Инфекционные титры, варьирующие между 102,4 и 10*,2 ТЦД50/мл, были получены с 2 по 10 пассажи вируса. Титр вируса достигал 10*15 ТЦЦдд/ии после 12.-14 пассажей /табч.З/.

В метках .'.ЩЕК инфекционный титры вируса К-3 я К-4 в 11-ом

пассаже достигали значения 104,5 и 105,0 ТЩ^о/мл соответственн Для обоих И80ЛЯТ0В характерно заметное увеличение урожаев вирус между 2-ым и 8-ым пассажами. В дальнейших пассажах наблвдали ме, ленное увеличение этого показателя /табл.2/.

' Таблица 2.

Результаты титрования бычьего коронавяруса, выращенного в клетках ТЯ и МДЕК, п = 3.

Т

• Пассажи — вируса 5

Инфекционные титры / ТЦДд^/мл /

та

ЧИК

К-1

■ к-

к-з

К-4

2 2,4 £ 0,28 2,8 ± 0,10 2',5 ± 0,0? 2,5+0,05

4 3,6 + 0,05 3,2 ± 0,24 3,0 ± 0,20 3,3 ± 0,01

6 3,7 ± 0,12 -3,6 ± 0,05 3,6 + 0,06 3,7 ± 0,07

8 3,7 ± 0,07 3,6 + 0,13 4,0 ± 0,03 4,0 £ 0,21

10 '4,0 ±.0,16 4,2 £ 0,0В 4,0 ± 0,16 4,5 + 0,15

12 . . 4,4+0,11 4,2 + 0,12 4,5 ± 0,14 4,5 ± 0,19

14' 4,5 ± 0,26 4,5-± 0,09 4,5 ± 0,09 5,0 ± 0,10

16 4,5 ± 0,15 4,5 £0,11

18 . 4,5 ± 0,17 5,0 ± 0,25

-//3.4, Изучение влияния трипсина и ПЭАЭ-тгакотряна на размножение бычьего коронавируса

Подцеряание клеток в среде, содержащей 10 мкг/мл трипсина, е оказало токсического действия на них. При отсутствии трипсина, ак клетки ТК , так и (ДДНС оказалась мало чувствительными для мчьего коронавируса. В этом случав ЦОД наступало лишь через 144 аса после заражения. Интенсификацию ЦДД в клетках ТВ. . выэван-¡ге) коронавирусом, наблюдали после добавления в среду 5 мкг и 10 кг трипсина/мл. При этом 50^-ное ЦДД обнаруживалось через 72-96 юов после зарадения и максимальное 1ЩД - на 6-8-й день. Концен-рация трипсина 1 мкг/мл в среде слабо влияла на появление ЦПД ви-рса.

В клетках ВДЬК добавление трипсина 1 жг/мл в среду несколько зкорило время наступления ЦПД, которое наблюдалось через 72-96 ча-эв. Концентрация трипсина в среде 5-10 мкг/мл интояся{йцироваяа Ш коронавируса в клетках ВДЕК. При обоих дозах трипсина,первые зизнаки ЦПД наблвдалось через 48 часов после заражения, 50^-н0е Щ - через 72-96 часов и максимальное ЦДД - на 5-7-й день.

В среде с трипсином 5 и 10 мкг/мл инфекционность вируса дослала максимума через 72 часа после заражения. После этого време-I наблщали снижение титра вируса на 10° •5 - 10®'8 ГЦДзд/мл. Ин-¡кционность вируса в среде с трипсином 1 мкг/мл повышалась посте-лшо, начиная с 96 часов после заражения /рис. 1/.

Результаты исследования показали, что добавление 25 мкг/мл )АЭ-декстрана в инокуляте усиливало ЦПД в культурах Г.ЗДЕК. При -ом 50^-ное 1Щ отмечали через 72 часа после заражения, в то вре-I как ЦПД проявлялось после 4-5 дней в культурах, заражении* ино-■лятами, свободными от ДЗАЭ-дексграна, или содераадим 15 мкг/мл ишмера. Большие дозы /50 мкг/мл/ были токсичны для клеток, в то «мя как 25 (чет ДЭАЭ-декс трана/мл проявляли слабое токсическое 1Ёствяв на клетки после 72-96 часов. .

Рис.1 . Выделение инфекционных вирионов клетками М1БК, зараженными коронавирусом, в среду свободную от трипсина и содержацуп трипсин

I 5

ел

о х

Г"*

Ч \ \ \ \ \ N

няк

5

\ \ ч \ ч ч ч К ч

..г-Ш,

Шч

ЧВ 72 96

Время после заражения

к

т

ч Ч

N

ш

120

г-а )

часов

-В'

3.5. изучение влияния пмташ.заралатаэй дтш.

. срзлн и til ва дазшиагегс

¿»чьего коронавируса

Разведение вируса до 1:32 мало влияло на время наступления 1Д в культуре клеток "ДШ. Так, исходный материал., как и раэве-1ШШЙ материал до 1:32, внзываля 1Щ через 48-72 часов после за-ления. При разводении вируса 1:100 и 1:1000 ЦПД наступало через -120 часов после заражения. Разведение 1:10000 не вызывало ЦДД • руса в культуро клеток í.'XíK в течение 120 часов.

Выдержка клеток 1.ЩК в гипертоническом растворе NaCl уваливала урожай вируса. Каблвдаяи увеличение на 0,1-0,9 lg ТЦД^Ди зависимости от временя обработки клеток после заражения и дли-дьносте выдержки моток в гипертонической среде. Максимальные Секционные титры вируса получали после 30-ти минутной обработки еток ва 7-ом часу после их заражения.

Появление ЦЦД в зараженных коронавирусок» клетках ЧДЕК зави-яо от рН ивокулята и поддерживающей среды. Максимальное ЦПД •набралось когда вирусный инокулят имел рН 6,5-7,0, a ¡H поддержи-гащей среды было 7,5-3,5. В опытах показано, что щелочной вярус-й инокулят задерживая появление ЦПД.

3.6. Изучение гемагглэттинитшжей активности

бычьего корокавзтггеа

Доронавярусы крупного рогатого скота как "Скальный", гак я иьтуралышй, агглютинировали эритроциты мышей и крнс, но не аг— отишроваля эритроцита морских свинок, кролжков, баранов, телят, эов и свиней.

Анализ результатов показал, что температура в пределах 4-37°С оказывала сколько-нибудь существенного влияния ва скорость реах-I гемагглютяяации. При инкубация вяруссодвржащей зидностн с зрит-

родатами крысы при температуре 22-37°С гемагтлхшшация наступила через 40-50 минут, а при температуре 4°С - через 50-60 минут. Изменения татра гемагглютишшов ке наблюдалось.

Изучение резистентности гемагглютининов бычьего коронавируса к прогревании показало, что при температуре 50°С в течение 30 «га-нут гемагглютиниругацая активность вируса еще сохранялась. При температура 60°С она нарушилась через 30 минут у фокального коронавируса и через 20 минут у куяьтурального. При температуре 70°С гег агглптанирупцая активность вируса начинала снижаться уже через 10 минут, а через 20 минут она исчезала полностью.

3.7. Изменение инТекпиоиноЬ активности бичт,ато коронавиууса под воздействием текпературы

Кн{.екшонность бычьего коронавируса была стабильной при температуре 37°С, но значительно уменьшалась после инкубации в течение 1 часа при температуре 45, 50 и бО^С на 2,2 ± 0,31, 2,5 ± 0,2' и 3,8 0,15 1§ ТЩ^д/мл соответственно. Инкубация при температуре 70°С в течение 1 часа полностью разрушала ин£>екглдикость вируса.

Прл температуре 50°С инсоекхдаонность вируса быстро уменьшалась в течение первых 60 минут. Уровень инактиваши 2,5 ± 0,12

ТЩэд/мл ин|вкдионносги был получен в течение этого периода. С этого времени скорость инактивации уменьшалась. Потеря 3,7 + О,

1§ ТЩ-ц/ил наблюдалась после 120 минут выдержки при +50°С /рис. 2/.

Результаты испытаний терыостабильности короналарусов К-1, К-2, К-3, К-4 к прогревши» при 50°С в течение 1 часа показали, что инфеквдонность вируса уменьшалась значительно. Изменение инфекционного титра между необработанным® и обработанннмя вирусами прогреванием составляло от 1,9 + 0,20 до 3,3 ± 0,37 ТЦЦ5д/мл.

18 ТЩ50/ил

15-

15 ' 30 60 90

Время обработки

120 минут

Рис.:й. Графика инактивации бычьего коронавируса при температуре 50 °С

выводы

1. Адаптация изолятов коронавируса, полученных от больных т лят и размноженного в клетках Уего , к перевиваемым клеткам Т характеризуется медленным появлением ЦПД. Вирусы, размноженные в этих клетках в 15-20 пассажах имели гемагглюташруидие титры 1:8 1:16,

2. Поревиваемыо клетка ЗДЕК являвтея белое чувствительными к бычьему коронавирусу по сравнению с клетками ТЯ . ЦДД вируса наступает раньше и более выражено. Гемагглютинирующнй титр вирус достигает 1:16 - 1:32 после 10 пассажа,

3. Урожай бычьего коронавируса в культуре клеток ТВ медленно увеличивается. Инфекционный титр вируса достигает Ю^'^ТЦЦ после 14 пассажей. В клетках ЩЗС характерно заметное увеличение урожаев вируса между 2-ым и 8-ым пассажами и медленное увеличены в дальнейшие пассажах. Титры вируса в 14-ом пассаже достигает 104»5 - 103,0 Т1Щ50/мл.

4. Добавление 5 мкг - 10 мкг трипсина/мл в ииокуляты и под-де ршдащую среду штекиифицирует размножение бычьего коронавирз с?.. При этом ипфекцсоиность вируса достигает максимума через 72 часа после заражения. . •

5. Прибавление 25 мкг/мя ДЭАЗ-декстрака в инокуляты усиливает ЦОД вируса. Однако больше дозы являются токсическими для клеток.

' 6. Разведение суспензии квдкудирушего вируса до 1:32 сужес тванно не влияет на время наступления ЦВД. При разведении сусле! зш выше 1:100 наблюдаются замедление размножения вируса.

7. Выдерживание клеток в гипертонической поддерживающей ор< де, содержащей 100 а'4 NаС1 , увеличивает урожай вируса на 10°

ю0»9 тщип/ш.

8. Максимальная продукция бнчьего коронавируса наблюдается рас значении pli вирусного инокулята 6,5 - 7,0 и рН поддериивалцей реда 7,5-8,5.

9. Коронавярус крупного рогатого скота обладает способностью стлютинировать эритроциты мышей и криси. Положительная температу-i в пределах 4-37°С но оказывает существенного влияния на скорость ¡«хождения ïTA. Гемагглютинарукщая активность вируса сохраняется ж температуре 30°С в течение 30 минут а полностью исчезает чероз

) минут при температуре 70°С.

10. Коронавирусные язоляты оказались неустойчивыми к воздей-■вию температуры вше 45°С. Ин^кциоиноеть вируса снижалась на

_ 103,3'ПЩ^д/вд посяе прогревания при 50°С в течение 1 часа.

практэтнжие птлотт

Адаптированный к клеткам УДК полевой изолят коронавируса утшого рогатого скота рекомендован для ротроспективной дийгнос-ки указанной инфекции в РЗГА, а также изучения напряженности я эдолжительноети гуморального иммунитета.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1.' Им Леап, Онуфриев B.ÎI. Изучение генагглстинирусщей акт ности коронавируса крупного рогатого скота. // Информационное письмо УГЛУ, Киев. 1993, - С. 3.

2. Им Леап, Онуфриев В.П. Изучение влияния трипсина на р: множение коронавируса крупного рогатого скота в культург mieroi почки коровы /ВДБК/. // "1нформагропром". Ветеринарний в1сник; Випуск 5. 1993. 34. - С. УА.

3. Им lean, Онуфриев В.П.; Влияние температуры на инфекци пуп активность коронавируса крупного рогатого скота. // "Гнфор агропром" . Ветеринарний в1сник. Випуск 5. 1993. 33. - С. 2-3.

4. 1и lean, ОнуфрГев В.П. АдаптацГя коронавГруса велико] porarol худоби до перевивно! л1н11 гсл1тин ТЕ I його 61олог1чн] властивост1. // Тези допоЫдей науково1 конференцИ npo$ecopci вкклададькйго складу та аспГрантГв, Ки1в - 1993, - С. 86.