Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Значение структуры клеточных мембран в инициировании свертывания крови

На правах

Киселев Сергей Васильевич

ЗНАЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН В ИНИЦИИРОВАНИИ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

14.00.16 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Казань 2005

Работа выполнена в Государственном общеобразовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Зубаиров Дилявер Мирзабдуллович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, доцент Бойчук Сергей Васильевич; доктор медицинских наук, профессор Горбунова Нигелла Анатольевна; доктор медицинских наук, профессор Фассахов Рустем Салахович.

Ведущая организация:

Российский государственный медицинский университет (г. Москва)

Защита диссертации состоится « $ » 2005 г. в jO часов

на заседании диссертационного совета ~Jx208.034.01 при Казанском

государственном медицинском университете по адресу: 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Казанского государственного медицинского университета (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, 49 «б»).

Автореферат разослан « D » ШХЯф^ 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Р.Р. Нигматуллина

Ш ЛМ7/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В настоящее время проблемы гемостаза продолжают привлекать внимание многих исследователей, так как имеют большое значение для клинической практики. Нарушения в этом процессе являются составным элементом хирургической и акушерской патологии, лежат в основе патогенеза многих сердечно-сосудистых, цереброваскулярных, инфекционных, иммунных заболеваний. Необходимость предупреждения и лечения тромбозов и геморрагических состояний, создание атромбогенных материалов, применяемых в хирургической практике, требуют более глубокого познания молекулярного механизма свертывания крови и его регуляции. В последние годы получены значительные результаты в исследованиях, проясняющих сосудисто-тромбоцитарный гемостаз и молекулярный механизм превращений факторов свертывания в плазменном гемостазе (Зубаиров Д.М., 2000; Шитикова A.C., 2000; Бутенас С. и Манн К.Г., 2002; Hansson К. и Stenflo J., 2005). Вместе с тем, несмотря на прогресс в понимании отдельных стадий, как и в начале изучения проблемы, остается неясным, какова физико-химическая природа исходного импульса, запускающего процесс гемостаза в целом. Разрешение этой проблемы в дальнейшем позволит предупреждать развитие нарушений в системе гемостаза, разрабатывать лекарственные препараты, способные эффективно воздействовать на молекулярный механизм системы свертывания крови с целью его нормализации при различных патологических состояниях.

Свертывание крови представляет собой сложный биологический процесс, в котором участвуют сосудистая стенка, форменные элементы крови (в основном тромбоциты) и некоторые растворимые белки плазмы, участвующие в каскаде генерации ключевого фермента свертывания - тромбина. Клинические наблюдения показывают, что в этом процессе абсолютно необходимы только те реакции, в которых участвуют витамин K-зависимые факторы свертывания (факторы VII, IX, X и протромбин). Они последовательно активируются в нескольких ферментных комплексах при участии ионов Са2+. Комплексы имеют однотипную организацию, включающую, наряду с ферментом и субстратом, белок-кофактор и каталитическую фосфолипидную поверхность, представляемую мембранами клеток, соприкасающихся с кровью. При этом ферментные комплексы витамин K-зависимых факторов в 105-109 раз более эффективны в лротеолизе их естественных субстратов, чем свободные ферменты (Бутенас С. и Манн К.Г., 2002) В норме мембраны клеток атромбогенны. Следовательно, приобретение клеточными мембранами тромбогенных свойств является одним из основных элементов инициирования свертывания крови.

До начала наших исследований было известно, что прокоагулянтное свойство клеточных мембран обусловлено присутствием в них фосфатидилсерина, а скорость активации витамин K-зависимых факторов зависит от их фосфолипидного состава. Было установлено, что при образовании ферментных комплексов витамин К-зависил ^^^^^^^^иилтшт связывание

БИБЛИОТЕКА

зу

и\ с кислыми фосфолипидами мембран, главным образом, с фосфатидилсерином Гипотезы строения и функционирования коагуляционных ферментных комплексов витамин K-зависимых факторов были разработаны в основном по данным, полученным в исследованиях по связыванию этих факторов с модельиыми фосфолипидными монослоями или везикулами (Mann К G. и др., 1990; Gerads I. и др., 1990; Pei G. и др., 1993). Однако природные клеточные мембраны имеют более сложную структурную организацию, присутствие на этой поверхности различных белков, углеводов может иметь значение для связывания с ней факторов свертывания и влиять на формирование и работу их ферментных комплексов. Следовательно, выяснение принципов формирования ферментных комплексов витамин K-зависимых факторов свертывания на естественных клеточных мембранах является фундаментальной задачей всей проблемы свертывания крови.

Превращение протромбина в тромбин является ключевым звеном, на котором замыкаются внешний и внутренний биохимические механизмы свертывания. Поэтому мы в своих исследованиях в основном остановились на изучении взаимодействия протромбина с клеточными мембранами, подвер! нутыми различным физико-химическим воздействиям. Выяснение молекулярного механизма взаимодействия этого фактора свертывания с поверхностью трансформированных клеточных мембран позволило прояснить структурную основу приобретения ими тромбогенных свойств. Из выше изложенного следует, что такое исследование является актуальным как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Цель исследования

Целью работы являлось выяснение значения структуры поверхности естественных клеточных мембран в обеспечении их тромбогенных свойств.

Задачи исследования

Достижение цели работы требовало последовательного выполнения следующих исследований: изучения взаимодействия протромбина, продуктов его активации и другого витамин K-зависимого фактора свертывания - фактора X с тромбогенной поверхностью препарата тканевого тромбопластина; выяснения молекулярного механизма связывания протромбина с клеточными поверхностями после воздействия различных физико-химических факторов. В соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1 Разработка и совершенствование методов получения витамин К-зависимых факторов свертывания - фактора X, протромбина и продуктов его активации: фрагмента 1, претромбина 1, а-тромбина; ,

2 Исследование молекулярного механизма и количественных закономерностей связывания протромбина, продуктов его активации и фактора X с тканевым тромбопластином;

3. Выяснение влияния различных факторов на взаимодействие протромбина с

основными клетками крови и клеточными мембранами; 4 Разработка представлений о молекулярном механизме приобретения клеточными мембранами тромбогенных свойств и формирования ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов свертывания крови.

Научная новизна

Разработаны новые методы очищения протромбина и фактора X, отличающиеся от существующих меньшей трудоемкостью при сравнимом выходе, чистоте и биологической активности препаратов. Впервые предложен способ получения меченного 1251 а-тромбина, позволяющий полностью сохранять его ферментативную активность. В ходе проведенных исследований установлено, что связывание протромбина и фактора X, в отличие от модельных фосфолипидных везикул, на фрагментах мембран происходит по двум типам фосфолипидных центров. Получены доказательства Са2+-независимого связывания витамин К-зависимых факторов с клеточными мембранами. Обнаружена способность ионов Са2+ подавлять электростатическое связывание тромбина с фосфолипопротеиновыми частицами, что обеспечивает быстрое освобождение фермента из ферментативного комплекса и его участие в последующих этапах гемостаза. Установлено наличие в плазме крови здоровых людей нетромбиновых продуктов распада протромбина, что свидетельствует о фоновой активности системы свертывания крови. Впервые показано, что в основе развития гиперкоагуляции при радиационном воздействии лежит повышение способности клеточных мембран связывать витамин К-зависимые факторы свертывания, обусловленное изменением их фосфолипидной структуры. В исследованиях по взаимодействию протромбина с клетками обнаружили адсорбцию на их поверхности молекул протромбина, неспецифическое связывание которых позволяет ускорять процесс свертывания крови. При связывании протромбина с эритроцитами и альвеолярными макрофагами обнаружено, что гепарин снижает адсорбционную способность клеточной поверхности, а после повреждения эритроцитов осмотическим шоком, наоборот, способствует связыванию с ней протромбина. Растительные лектины Glycine max исключают участие протромбина в свертывании крови посредством связывания его с углеводами клеточной мембраны. Волчаночноподобные антитела обусловливают дополнительное связывание протромбина тромбоцитами, что, вероятно, и определяет их антикоагулянтный эффект.

Теоретическое значение результатов проведенных исследований определяется раскрытием молекулярного механизма приобретения клеточными мембранами тромбогенных свойств. Проведенный анализ обнаруженных закономерностей показывает значительную роль структурных изменений мембраны клеток для процесса свертывания крови и тем самым позволяет понять патогенез заболеваний, протекающих с нарушениями в системе гемостаза.

Практическая значимость

Разработанные способы получения протромбина, фактора X, меченного ,251 а-тромбина и определения продуктов распада протромбина (фрагмента 1, претромбина 1) могут использоваться в практике научно-исследовательских лабораторий с целью разрешения проблем гемостазиологии.

Определения содержания фрагмента 1 и претромбина 1 в плазме крови могут быть использованы для диагностики тромботических состояний в клинике.

Установление причины гиперкоагуляции при острой лучевой болезни позволяет проводить целенаправленный поиск новых подходов в проведении патогенетического лечения этого заболевания.

Полученные данные о влиянии гепарина, растительного лектина Glycine max на связывание протромбина с клеточными мембранами помогут разрабатывать лекарственные препараты, способные эффективно воздействовать на молекулярный механизм системы свертывания крови с целью его нормализации при различных патологических состояниях.

Положения, выносимые на защиту

1. Протромбин и фактор X взаимодействуют на поверхности фрагментов клеточных мембран с двумя типами фосфолипидных центров связывания, наличие которых обусловлено гетерофазной структурой этих фрагментов.

2. Са2+ опосредованная перестройка бислойной структуры нативных клеточных мембран в мезоморфную лежит в основе молекулярного механизма приобретения мембранами тромбогенных свойств, специфического связывания с ней витамин К-зависимых факторов и обеспечивает формирование их ферментных комплексов.

3. Патогенные воздействия на процесс взаимодействия протромбина с клеточными мембранами определяют эффективность его участия в свертывании крови.

Внедрение результатов исследования

Материалы диссертации включены в лекционный курс для студентов Казанского государственного медицинского университета на кафедре биологической химии. Методы получения протромбина, фактора X и способ сохранения биологической активности меченного 1251 а-тромбина используется в научно-практической работе ФГУН Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Рос потреб надзора.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на Всесоюзном съезде врачей-лаборантов (Москва, 1985), Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» (Москва, 1987), Первом международном патофизиологическом конгрессе (Москва, 1991), Всесоюзной конференции «Физиология и патология гемостаза» (Полтава, 1991),

Российской конференции «Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии» (С.-Петербург, 1995), XIII Международном съезде гематологов (Стамбул, 1995), XIV Международном конгрессе (Монтпеллье, 1996), III Съезде биохимического общества (С-Петербург, 2002), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003)

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ (статей - 13, тезисов - 12), получено авторское свидетельство на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и библиографии. Работа содержит 15 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 295 источника, из них 235 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В исследованиях использовали фактор X, протромбин, продукты его активации - фрагмент 1, претромбин 1 и a-тромбин. Протромбин из плазмы крови человека или свиньи получали разработанным в нашей лаборатории методом, используя совокупность наиболее распространенных приемов его выделения. Фактор X человека выделяли хроматографией на впервые нами использованном с этой целью ДЭАЭ-аффигеле блю 15 из раствора, содержащего смесь витамин K-зависимых белков. Протромбин и фактор X метили |251, применяя хлораминовый способ (Hunter W.H. и Greenwood F.C., 1962). Фрагмент 1 и претромбин 1, меченные 1231, получали хроматографией на ДЭАЭ-сефадексе А-50 после расщепления |251-протромбина тромбином. Меченный 1251 а-тромбин с сохраненной биологической активностью получали разработанным нами способом после активации |251-протромбина, используя хроматографию на ДЭАЭ-сефадексе А-50 и на SP-сефадексе С-50 (Lundblad R.L. и др., 1975).

Чистоту полученных белков и их молекулярную массу оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Weber К. и Osborn М., 1969) Биологическую активность протромбина и тромбина измеряли двухэтапным методом (Magnusson S., 1965). Активность фактора X определяли по нормализации времени свертывания субстрат-дефицитной плазмы человека. Спектрофотометрическим методом определяли амидазную активность фактора X на хромогенном субстрате S-2222, используя рекомендации фирмы-изготовителя. Идентификацию продуктов распада протромбина проводили по N-концевым аминокислотным остаткам с помощью фенилизотиоцианатного метода (Fraenkel-Conrat, 1954). Концентрации белков в

растворе устанавливали по Lowry О.Н. и др (1951), а также УФ-адсорбционной спектроскопией по оптической плотности раствора, используя известные удельные коэффициенты экстинкции и молекулярные массы исследуемых белков. Концентрацию фрагмента 1 и претромбина 1 в плазме крови человека определяли методом перекрестного иммуноэлектрофореза (Clarke H.G.M. и Freeman Т., 1966).

В исследованиях по связыванию факторов свертывания цитоплазматическими мембранами использовали коммерческий препарат тканевого тромбопластина из мозга человека, а также фрагменты клеточных мембран внутреннего слоя грудной части аорты здоровых и больных лучевой болезнью свиней. Животных облучали на гамма-установке "Пума" (источник -n7Cs). Кроме того, исследовали взаимодействие протромбина с эритроцитами, тромбоцитами и альвеолярными макрофагами, подвергнутыми разным физико-химическим воздействиям. Эритроциты выделяли центрифугированием цитратной крови свиней, а их тени получали осмотическим шоком (Jarvis S.M., 1988). Альвеолярные макрофаги выделяли из легких свиней после лаважа и центрифугирования в среде разделения фиколла-верографина. Жизнеспособность альвеолярных макрофагов определяли по эксклюзии красшеля метиленового синего (Paterson N.A.H. и Graig J.D., 1981). Тромбоциты получали путем щадящего центрифугирования стабилизированной цитратной венозной крови человека в тефлоновых пробирках. Коагуляционную активность полученных клеток устанавливали по времени свертывания рекальцифицированной плазмы, истощенной по контактным факторам свертывания в условиях стандартной активации каолином (Зубаиров Д.М. и Попова Л.Г.. 1967).

Взаимодействие факторов свертывания с мембранами изучали радиолигандным методом в условиях равновесного связывания различных концентраций меченых белков в присутствии СаС12 или ЭДТА. Для этого использовали коммерческий препарат тканевого тромбопластина или тромбопластин после частичного протеолиза его белков папаином. Этим же методом определяли связывание протромбина: с фрагментами клеточных мембран из внутреннего сосудистого слоя аорты до и после радиационного воздействия при наличии ионов Са"'; с эритроцитами до и после гемолиза в присутствии СаС12 или ЭДТА, гепарина или растительного лектина Glycine max; с альвеолярными макрофагами до и после замораживания в присутствии СаС12 или ЭДТА и гепарина; с неактивированными тромбоцитами в присутствии СаСЬ или ЭДТА и волчаночноподобных антител. Радиоактивность проб (расп/мин) измеряли на сцингилляционном счетчике Минигамма.

Данные по связыванию белков представляли в координатах Скэтчарда (Scatchard G., 1949). Для оценки взаимодействия факторов свертывания и их производных с клеточными мембранами определяли равновесную константу диссоциации (Kd) и число центров связывания (Q). Эти значения рассчитывали с помощью специализированной программы линейной регрессии (Пеккель В.А., 1987). Полученные наблюдаемые параметры связывания уточнялись методом

Клотца и Ханстона (1971), а вычисления дублировались разностным методом (Зайцев C.B. и др., 1985). Достоверность различий параметров связывания определяли регрессионным и вариационным анализами по критерию Стьюдента при уровне значимости менее 0,05.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Взаимодействие протромбина, продуктов его активации и фактора X с тканевым тромбопластином. Тканевой тромбопластин широко используется в исследованиях системы свертывания крови как препарат, обладающий наиболее выраженной тромбопластической активностью. Изучение взаимодействия с ним факторов свертывания может прояснить структурную основу каталитически активной тромбогенной поверхности клеточных мембран.

Тромбопластин представляет собой фрагменты мембран ткани мозга человека. По данным ЯМР-^'Р и ЯМР-'Н эти фрагменты потеряли бислойную структуру нативной клеточной мембраны. В водной среде фосфолипиды тромбопластина в основном организованы в виде гексагональной лиотропной мезофазы (Нп) с экспонированием 10-20% полярных головок фосфолипидов (Зубаиров Д.М. и др., 1989). Связывание с ним протромбина в основном ряде используемых концентраций (2х10"8 М-2,4х10"6 М) как в присутствии ионов Са2', так и в их отсутствии характеризовалось вогнутыми кривыми на графиках Скэтчарда (рис. 1 А, Б). Форма кривой свидетельствует, что протромбин связывается с тромбопластином по двум типам независимых центров -высокоаффинным и низкоаффинным.

Рис. 1. График Скэтчарда по данным связывания протромбина с тромбопластином. А - связывание в присутствии СаС12; Б - связывание в присутствии ЭДТА: 1 - нативный тромбопластин; 2 - тромбопластин, обработанный папаином.

В таблице 1 приведены наблюдаемые параметры связывания по каждому

типу центров: К^ - константа диссоциации, () - число центров связывания. В условиях взаимодействия наиболее близких к естественным (нативный тромбопластин, наличие ионов Са~) сродство протромбина к высокоаффинным центрам (К<1=7,5х10~8 М) почти на два порядка выше, чем к низкоаффинным (К<1-4,5х10"6 М). Количество низкоаффинных центров значительно превышает (в 15-17 раз) число высокоаффинных центров. В таблице 1 приведены также средние значения процентов общего связывания протромбина, выражающие общий итог изменений К^ и С? для разных условий связывания. Можно видеть, что относительный вклад в суммарное связывание протромбина для высокоаффинных центров всегда выше, чем для низкоаффинных. Все различия в параметрах связывания между высокоаффинными и низкоаффинными центрами статистически достоверны.

Удаление свободных ионов Са~" из системы не сказывалось достоверным образом на центров обоего типа. В то же время число центров резко снижалось, особенно в случае модифицированного тромбопластина и для низкоаффинных центров. Это вело к уменьшению суммарного связывания протромбина с тромбопластином в 4-6 раз.

Таблица 1

Наблюдаемые параметры связывания протромбина с тромбопластином

Параметры связывания Состав смеси Модифицированный тромбопластин Нативный тромбопластин Р

Высокоаффинные центры

Ка, нМ СаСЬ 338±64 75115 <0,01

ЭДТА 210±27 118125 <0,05

Р >0,05 >0,05

О, нМ СаСЬ 293±56 104123 <0,02

ЭДТА 37±5 2416 >0,05

Р <0,01 <0,01

СаСЬ 42,6+3,4 44,8+10,8 >0,7

% ЭДТА 11,7±1,9 11,2+4,1 >0,8

Р <0,001 <0,02

Низкоаффинные центры

К* нМ СаСЬ 571611800 44741177 >0,2

ЭДТА 423411875 4529+189 >0,8

Р >0,3 >0,7

нМ СаСЬ . 364611156 1808173 <0,02

ЭДТА 333+150 285112 >0,6

Р <0,01 <0,01

СаСЬ 35,7+2,0 24,511,3 <0,01

% ЭДТА 6,110,6 4,610,3 <0,05

Р <0,001 <0,00!

Обработка тромбопластина папаином сказывалась на разных центрах различным образом. Сродство высокоаффинных центров к протромбину снижалось (Кс1 увеличивалась) как в присутствии ионов Са2', так и в их отсутствие. Сродство низкоаффинных центров существенно не менялось. В то же время число центров обоего типа увеличивалось, но для проявления этого эффекта были необходимы ионы Са2+ Общее связывание протромбина после протеолиза белков тромбопластина возрастало по низкоаффинным центрам, что находит объяснение в увеличении их числа при неизменной

При низких концентрациях протромбина, порядка 1% и ниже от его содержания в плазме крови, характер связывания видоизменялся. В присутствии свободных ионов Са24 кривые образуют купол (рис. 2 А), а в их отсутствии становятся вогнутыми (рис 2 Б). Этот результат позволяет предположить проявление положительного (при наличии ионов Са2') и отрицательного кооперативных эффектов взаимодействия протромбина с высокоаффинными центрами.

1 2

&!

| 3 0,6

^ 1 те 2

88 а в

О О

20

[Связанный протромбин]

40

0,07

0,035

0 12 3

[Связажьм прсттрэмбин] нМ

Рис. 2. График Скэтчарда по данным связывания низких концентраций протромбина с тромбопластином. Обозначения такие же, как на рис. I.

При связывании основного ряда концентраций фрагмента I (6,2х 10'7М -6,1х10'8М) и его низких концентраций (1,2х10"7М - 1,2хЮ"9М) получили кривые, практически полностью соответствующие связыванию с тромбопластином протромбина. Можно заключить, что фрагмент 1, как и протромбин, связывается с тромбопластином по двум типам независимых центров - высокоаффинным (К<)=7,6х 10"8 М) и низкоаффинным (К,р= 1,3х 10"6 М; табл. 2). Сродство этих центров практически полностью соответствовало сродству центров для протромбина (7,5 х 10'8 М и 4,5 х 10"6 М).

Удаление ионов Са2* сказывается на связывании фрагмента 1 в целом так же, как и на связывании протромбина. Как и у протромбина, это приводит в итоге к достоверному снижению суммарного связывания фрагмента 1 по

каждому типу центров в 5-7 раз.

Обработка тромбопластина папаином сказывалась на сродстве центров связывания фрагмента I разного типа противоположным образом, чем при связывании протромбина Происходило снижение аффинитета низкоаффинных центров (увеличение К^), без существенного изменения его у высокоаффинных центров Число же низкоаффинных центров, как и для связывания протромбина, возрастало. Эти изменения проявлялись лишь при наличии ионов Са2+. Общее связывание фрагмента 1 после протеолиза белков тромбопластина, как и у протромбина, заметно менялось лишь по низкоаффинным центрам, но в сторону уменьшения, что и следовало ожидать ввиду отмеченной инверсии изменений по сравнению с протромбином.

Таблица 2

Наблюдаемые параметры связывания фрагмента 1 протромбина _с тромбопластином_

Параметры Состав Модифицированный Нативный Р

связывания смеси тромбопластин тромбопластин

Высокоаффинныс центры

Ка, нМ СаС12 65±4 7614 <0,01

ЭДТА Р * *

нМ СаС12 50±4 4913 >0,4

ЭДТА Р * *

% СаС12 35,4±6,5 32,315,7 >0,3

ЭДТА 4,9±0,3 4,5+1,4 >0,4

Р < 0,001 <0,001

Низкоаффинные центры

Ка, нМ СаСЬ 4352+1163 1302+234 <0,01

ЭДТА 286611116 9813+7929 >0,1

Р >0,1 >0,1

нМ СаС12 15911426 6991128 <0,02

ЭДТА 193176 5511445 >0,2

Р <0,01 >0,5

% СаСЬ 26,1 + 1,4 31,3+2,0 <0,001

ЭДТА 6,0+0,8 5,410,6 >0,2

Р <0,001 <0,001

* - расчет некорректен ввиду отрицательной кооперативности связывания

Связывание претромбина 1 и а-тромбина с тромбопластином было ненасышаемым и в координатах Скэтчарда получены почти прямые горизонтальные линии для всего ряда концентраций каждого белка. При таком

взаимодействии К^ и С? невозможно рассчитать, и для характеристики связывания претромбина 1 и а-тромбина тромбопластином использовали средний процент связывания (табл. 3) Привлекает внимание резкое отличие во влиянии ионов Са2+ на общее связывание претромбина 1 по сравнению с протромбином и фрагментом 1. Связывание претромбина 1 не зависит от ионов Са2+, оно было гакое же, как у протромбина и фрагмента 1 без ионов Са2' Протеолиз белков тромбопластина приводил к небольшому снижению связывания претромбина 1 в присутствии ионов Са2\ а в их отсутствии связывание, наоборот, увеличивалось. Небольшая величина связывания, ненасыщаемость связывающих центров на тромбопластине и то, что взаимодействие претромбина 1 существенно не зависит ни от ионов кальция, ни от протеолиза белкового компонента тромбопластина, свидетельствуют о неспособности этой части молекулы протромбина к специфичному взаимодействию с тромбопластином.

Таблица 3

Общее связывание (%) претромбина 1 и а-тромбина с тромбопластином

Белок Состав смеси Модифициров. тромбопластин Нативный тромбопластин Р

Претромбин СаС12 4,2±0,5 4,9+0,3 <0,01

1 ЭДТА 5,8±1,0 4,6±0,3 <0,02

Р <0,01 >0,05

а-Тромбин СаС12 ЭДТА 13,3±1,0 17,8+1,6 12,0±1,1 24,5±3,3 >0,05 <0,001

Р <0,001 <0,001

Как и в случае претромбина 1, общее связывание а-тромбина в присутствии ионов Са2+ было значительно меньше, чем у протромбина и фрагмента 1 (табл 3), но в 2-3 раза выше связывания претромбина 1. Однако более высокое связывание а-тромбина с тромбопластином обеспечивается не за счет ионов Са2+, так как оно повышалось почти в 2 раза в присутствии ЭДТА. Таким образом, если в отсутствие ионов кальция общее связывание протромбина и фрагмента 1 резко снижается, то связывание а-тромбина, наоборот, значительно повышается. Модификация тромбопластина отражалась на связывании а-тромбина только в отсутствие ионов кальция в виде небольшого снижения.

Полученные данные показывают, что с тканевым тромбопластином протромбин связывается за счет своего 1^-концевого участка, соответствующего фрагменту 1. Некоторые отличия в связывании протромбина и фрагмента 1 обусловлены, по-видимому, различной величиной их молекул и выпадением

возможного неспецифического взаимодействия претромбиновой части профермента с белками тромбопластина.

Взаимодействие фактора X с тромбопластином в основном ряде исследованных концентраций (5,4x10"'° - 5,4х10'9 М) в координатах Скэтчарда характеризовалось кривыми связывания подобными кривым для протромбина. При низких концентрациях белка (5,4хЮ""-5,4х10"ю М, что соответствует 0,0540,54% от содержания в плазме) они также образовывали купол Связывание фактора X с низкоаффинными центрами в пределах концентраций 5,4x10"9-5,4x10"'° М оказалось ненасыщаемым Это означает, что для данных концентраций белка низкоаффинные центры связывания оказываются в подавляющем избытке, поэтому связывание не может быть корректно охарактеризовано константой диссоциации и числом центров. Сродство фактора X к высокоаффинным центрам тромбопластина более чем в 40 раз выше сродства протромбина (Кй=1,8хЮ"9М и 7,4x10"8М соответственно), но их число значительно уступало (в 170 раз) количеству высокоаффинных центров для протромбина. Кроме того, в отличие от связывания протромбина, при удалении ионов Са2+ сродство фактора X к высокоаффинным центрам уменьшалось (К<) увеличивается, табл. 4) и не было значительного снижения их числа. У нативного тромбопластина число центров даже несколько возрастает. Эти изменения, в конечном счете, также обеспечивают снижение общего связывания фактора X почти в 2 раза, но выражено оно заметно меньше, чем у протромбина (в 4 раза). Обработка тромбопластина папаином сказывалась на связывании фактора X с высокоаффинными центрами в целом таким же образом, как и на связывании протромбина. Однако в отсутствие ионов Са2+ эффект протеолиза белков тромбопластина на связывание фактора X с центрами проявлялся в значительно меньшей степени, чем в случае протромбина. Сохранялась лишь тенденция к снижению аффинитета центров, а число их даже начинало снижаться.

Таблица 4

Наблюдаемые параметры связывания фактора X с тромбопластином

Параметры Состав Модифицированный Нативный р

связывания смеси тромбопластин тромбопластин

Высокоаффинные цент ры

Ка, нМ СаС12 5,2±1,1 1,8±0,5 <0,001

ЭДТА 6,6±0,6 5,9±0,8 >0,1

Р <0,01 <0,001

0, нМ СаСЬ 0,9±0,2 0,6±0,2 <0,01

ЭДТА 0,5±0,05 1,1 ±0,2 <0,001

Р <0,001 <0,001

% СаСЬ 13,9±0,3 20,6±0,3 <0,001

ЭДТА 6,9±0,2 14,3±0,2 <0,001

Р <0,001 <0,001

Связывание протромбина с тромбопластином в присутствии 0,6x10"7 М фактора X проводили при концентрациях 0,6х10"9-0,6х10"7 М В экспериментах, использовались небольшие количества протромбина (0,04-4,3% от возможной концентрации в плазме) для определения влияния фактора X на связывание по высокоаффинным центрам В координатах Скэтчарда кривые связывания протромбина в присутствии фактора X полностью соответствовали кривым взаимодействия протромбина с тромбопластином (рис 2). При наличии ионов Са2+ кривые приобретали форму купола, а в отсутствии этих ионов становились вогнутыми, с большей выраженностью в присутствии фактора X. Следовательно, при наличии ионов кальция процесс взаимодействия протромбина с тромбопластином протекал с положительным, а в их отсутствии с отрицательным кооперативным эффектом, который усиливался присутствием фактора X. Введение в инкубационные смеси фактора X приводило почти к трехкратному уменьшению сродства протромбина к высокоаффинным центрам тромбопластина, а количество мест связывания при этом повышалось в 3 раза (табл. 5). Эти изменения сопровождались небольшим увеличением среднего процента связывания протромбина в присутствии фактора X. При сравнении связывания протромбина с обработанным папаином тромбопластином достоверных различий по К,) и О не выявлялось, лишь в присутствии фактора X ненамного увеличивался средний процент связывания протромбина. Удаление ионов Са2+ приводило в одинаковой степени к резкому падению общего связывания протромбина тромбопластином (уменьшался % связывания в 10 -12 раз) как при наличии фактора X, так и в его отсутствии. Параметры связывания при этом невозможно было рассчитать, так как процесс взаимодействия протекал с отрицательным кооперативным эффектом.

Таблица 5

Наблюдаемые параметры связывания протромбина высокоаффинными центрами тромбопластина в присутствии фактора X

Парам, связыв. Состав смеси Модифиц. тромбопл. сф X Модифиц. тромбопл. без ф. X Р Нативный тромбопл сф. X Нативный тромбопл без ф X Р

Кй, нМ СаС12 ЭДТА 348,8±52,2 * 502,7±101 ,8 * >0,1 770,31143 ,8 * 265,2±35, 3 * <0,01

0, нМ СаС12 ЭДТА 428,7+64,2 * 466,6±94, 5 * >0,5 872,7+162 4* 264,7±35, 4 * <0,01

% СаС12 ЭДТА Р 52,9+1,9 4,9±0,5 <0,001 46,8±1,1 4,5+0,4 <0,001 <0,01 >0,1 51,5±1,5 4,2±0,9 <0,001 48,2+1,3 3,9+0,8 <0,001 <0,01 >0,1

* - расчет некорректен ввиду отрицательной кооперативное™ связывания

До начала наших исследований было установлено, что витамин К-■зависимые факторы связывались с модельными фосфолипидными поверхностями только с одним Са2+-зависимым типом центров с Kd в пределах 1х10'6-2,3х10"6 М (Resnick R.M и Nelsestuen GM., 1980, Cutsforth G А. и др., 1989) Взаимодействие включает амино- и карбоксильные группы фосфатидилсерина (Rosing J. и др., 1988), ионы кальция, аминогруппы и остатки у-карбоксиглутаминовых кислот N-концевых областей витамин К-зависимых белков (Welsch D.J. и Nelsestuen G.M , 1988). Существовало две точки зрения на связывание витамин K-зависимых белков с фосфолипидами. И в том, и другом случае постулируется обязательное присутствие ионов кальция, но их значение для связывания понималось по-разному Одни исследователи предполагали образование кальциевых мостиков между кислыми фосфолипидами мембран и белком (Dombrose F. А. и др., 1979; Resnick R.M и Nelsestuen G.M., 1980). Другие считали, что Са2+ необходим для конформационных изменений молекул витамин K-зависимых белков, обусловливающих их гидрофобное взаимодействие с фосфолипидной поверхностью (Rhee M.J. и др., 1982; Sarasua М.М. и др., 1983). Результаты наших исследований показали, что взаимодействие протромбина и фактора X с фрагментами мембран, в отличие от модельных фосфолипидных поверхностей, происходит по двум типам центров связывания. Вместе с тем, и наши экспериментальные данные показывают несомненное значение присутствия ионов кальция для связывания этих факторов с выявленными центрами. В то же время обращает на себя внимание относительно высокое остаточное связывания протромбина (см. табл. 1) и сохранение формы кривых связывания в присутствии ЭДТА (см рис. 1). При этом Kd центров связывания достоверно не менялась, а лишь значительно уменьшалось их число. Это означает, что ионы кальция необходимы для организации центров связывания обоего типа. Однако некоторое количество центров (приблизительно 1/5 часть) возникает и связывает протромбин и без ионов кальция. Результаты приводят к необходимости признать наличие определенного Са2+-независимого вклада во взаимодействие протромбина как с высокоаффинными, так и с низкоаффинными центрами тромбопластина.

Рядом исследований показано, что присоединение ионов кальция к фрагменту 1 или к соответствующему участку протромбина ведет к изменению конформаций молекул и усиливает их гидрофобное взаимодействие с фосфолипидной поверхностью модельных везикул (Sarasua М.М и др., 1983; Tarvers R С., 1985). Кроме того, на поверхности фрагмента 1 как в присутствии, так и в отсутствии ионов кальция нашли экспонированный кластер, создаваемый остатками ароматических аминокислот, следующими в N-концевой последовательности непосредственно за группой остатков у-карбоксиглутаминовых аминокислот (Rarck С.Н и Tulinsky А, 1986; Harlos C.W.G. и др., 1987). Неоднократно отмечалось, что для взаимодействия витамин K-зависимых факторов свертывания с фосфолипидной поверхностью необходимо присутствие фосфатидилсерина. Однако фосфолипидные везикулы,

составленные исключительно из фосфатидилсерина оказывают антикоагулянтное действие (Мухачева Н.Ф. и Бышевский А.ULI., 1976). В то же время максимальной прокоагулянтной активностью обладают мембраны, в которых фосфатидилсерин смешан с нейтральными фосфолипидами, главным образом с фосфатидилэтаноламином и фосфатидилхолином (Bull R.K. и др, 1972; Esmon С Т и др., 1974; Engelmann В. и др , 2002) В смеси фосфолипидов фосфатидилсерин способен образовывать кластеры, которые более стабильны в присутствии ионов кальция (Антонов В.Ф. и др, 1992; Ермаков Ю.А., 1999), и этот процесс может усиливаться при адсорбции витамин K-зависимых белков (Mayer L.D. и др., 1983). Это приводит к обогащению соседних участков мембраны фосфатидилэтаноламином и диацилглицеролом. Известно также, что их молекулы имеют форму конуса и в бислойных мембранах смешанного состава вследствие Са2+-индуцированного фазового разделения фосфолипидов склонны образовывать обращенные мицеллярную и цилиндрическую (гексагональную) мезофазы (Твердислов В.А. и др., 1987; Devaux Ph., 1991; Harper P.E. и др., 2001). В этих местах гидрофильная, но неоднородная фосфолипидная поверхность находится в напряженном состоянии, может иметь дефекты и разрыхления, облегчающие гидрофобные взаимодействия. Подобные структуры были обнаружены и в препаратах тромбопластина из мозга человека (Зубаиров Д.М. и др., 1989). Наши результаты, учитывая представленные данные, позволяют сделать вывод, что связывание протромбина с неоднородной фосфолипидной поверхностью клеточных мембран наряду с основным ранее известным Са2+-опосредованным электростатическим взаимодействием с молекулами фосфатидилсерина обеспечивается и дополнительным гидрофобным взаимодействием с молекулами нейтральных фосфолипидов в ближайшем окружении.

Из выше изложенного следует, что две модели связывания витамин К-зависимых факторов свертывания с мембранами - модель кальциевых мостиков и модель гидрофобного связывания - должны включаться в интегральную модель как взаимодополняющие. Современные данные других исследователей подтвердили предложенный нами молекулярный механизм взаимодействия витамин K-зависимых факторов (Huang М. и др., 2003; Brown М.А. и Stenflo J , 2004; Hansson К. и Stenflo J., 2005).

Наблюдаемая Kd низкоаффинных центров тромбопластина (4,5x10'6 М) сравнима с величинами, полученными для единственного типа центров в исследованиях по взаимодействию протромбина с чисто фосфолипидными везикулами, содержащих аналогичное количество фосфатидилсерина (1,0x10"6 -2,3х 10"6 М, Bloom J W и др. 1979; Resnic R.M. и Nelsestuen G.L., 1980; Cutsforth G.A. и др., 1989). Кроме того, независимость эффективности связывания от протеолиза папаином белков тромбопластина, низкая насыщаемость этих центров, зависящая от ионов Са2+, позволяет считать их просто участками фосфолипидной поверхности, включающими молекулы как кислых, так и нейтральных фосфолипидов Высокоаффинные центры связывания протромбина

(Kd меньше IО"7 M) выявлены лишь в монослоях с высоким содержанием фосфатидилсерина (более 40%, Кор J М.М. и др., 19S4). Ввиду значительно меньшего количества фосфатидилсерина в тромбопластине (6-7%, Bjorklid Е. и Storm Е., 1977) представляется маловероятным возникновение подобных центров на его поверхности только лишь за счет этого фосфолипида. В то же время высокоаффинные центры связывания протромбина возникали на фосфолипидных везикулах с 20% содержанием фосфатидилсерина при добавлении белкового кофактора свертывания крови Va (van de Waart P. и др., 1984). Совокупность данных по связыванию протромбина с модифицированным тромбопластином позволяет заключить, что в формировании высокоаффинных центров связывания наряду с фосфолипидами участвуют и мембранные белки. Повреждение их протеолизом снижает эффективность связывания протромбина с высокоаффинными центрами (Kd увеличивается в 2-4 раза, см табл. 1). Известно, что мембранные белки могут индуцировать фазовое разделение прилегающих фосфолипидов и обусловливают возможное существование гидрофобных участков на поверхности клеточных мембран (Болдырев А.А., 1990; Pike L.J., 2004). Кластерирование фосфатидилсерина и появление дефектов бислоя на границе кластеров будут усиливать как электростатический, так и гидрофобный компоненты белок-липидного взаимодействия протромбина. Следовательно, роль мембранных белков может состоять как в непосредственном связывании протромбина, так и в создании структуры поверхности, способствующей взаимодействию протромбина с фосфолипидами. Наши результаты показывают, что более вероятен второй вариант, так как расщепление белкового компонента тромбопластина папаином приводит к пропорциональному увеличению числа мест связывания как низкоаффинных, так и высокоаффинных. Очевидно, при протеолизе белкового компонента тромбопластина стерическая доступность и однородность фосфолипидной поверхности возрастает, что и приводит к увеличению числа центров связывания обоих типов. Исходя из вышеизложенного, можно полагать, что высокоаффинный центр связывания представляет собой мембранный белок с его ближайшим специфически организованным фосфолипидным окружением. Более высокое сродство этих центров обусловлено суммированием разных типов взаимодействий - Са2+-опосредованного электростатического остатков Гла протромбина с фосфатидилсерином и гидрофобного между кластером остатков ароматических аминокислот N-концевой области протромбина с углеводородными радикалами нейтральных фосфолипидов на границе мезофазных структур, стабилизированных мембранными белками. Возможное участие мембранных белков в формировании подобных центров доказывают исследования, в которых показана зависимость протромбиназной активности от содержания неспецифичных для свертывания белков EPR-1 и гликопротеинов VI тромбоцитов (Bouchard В.А. и др., 1997; Furihata К.и др., 2001).

Высокоаффинные центры тромбогенных мембран обладают способностью концентрировать витамин К-зависимые факторы, посредством наблюдаемого положительного кооперативного эффекта. Этот эффект может обеспечиваться

Са2+-опосредованным кластерированием фосфатидилсерина (Антонов В Ф и др., 1992, Ермаков Ю.А., 1999), которое усиливается присоединением молекул витамин K-зависимых белков (Mayer L.D и др, 1983). Кластерирование фосфатидилсерина приведет к еще большему межфазному разделению фосфолипидов и тем самым облегчит присоединение последующих молекул белка. Кроме того, этому процессу может способствовать образование гомо- и гетеродимеров, возникающих посредством кальциевых мостиков между Гла-доменами молекул протромбина, фрагмента 1 и фактора X (Harlos К. и др., 1987; Jacson С.М. и др., 1987; Tarvers R.C. и др., 1987). Предполагаемый механизм положительного кооперативного эффекта подтверждают данные других исследователей. В экспериментах по связыванию витамин K-зависимого фактора УП с фосфолипидными везикулами, содержащими тканевой фактор, также наблюдали положительный кооперативный эффект, который усиливался с увеличением концентрации фосфатидилсерина и проявлялся только в присутствии ионов Ca2+(Bach R. и др., 1986).

При изучении взаимодействия фактора X с фосфолипидными везикулами другими исследователями был выявлен только один тип центров связывания Эффективность взаимодействия зависела от содержания фосфатидилсерина в везикулах и концентрации ионов кальция. При значениях этих параметров, близких к физиологическим (15-20 мол. % фосфатидилсерина и 1-5 мМ ионов кальция, что соответствует условиям наших экспериментов), Kd для фактора X составляет 0,2-0,3x10^ (Nelsestuen G.L. и Broderius М., 1977; Mertens К. и др., 1984; Burri В. и др., 1987). В наших экспериментах связывание фактора X с высокоаффинными центрами в 6000-9000 раз превосходит аффинитет центров связывания фактора X на однородной поверхности фосфолипидных везикул, и в значительно большей степени проявилось более высокое сродство фактора X к тромбопластину по сравнению с п ротромбином (Kd=l,8xl0'9M и 7,4x10'8М соответственно). Удаление ионов Ca +, несколько снижает аффинитет центров связывания, однако это не сказывается принципиальным образом на высокой специфичности взаимодействия с ними фактора X. Проявлялся еще более высокий уровень остаточного связывания его с тромбопластином, чем у протромбина. Это означает, что связывание фактора X, как и у протромбина, обеспечивается наряду с Са2+-опосредованным также и Са21-независимым взаимодействием. В Гла-домене фактора X, как в протромбине и других витамин K-зависимых факторах свертывания в идентичных положениях, имеются консервативные остатки неполярных аминокислот (Фен-4, Лей-5, и Вал-18; Fung M.R. и др., 1985) Они образуют поверхностно расположенный гидрофобный узел, критически важный для связывания фактора с фосфолипидной поверхностью (Zhang L и Castellino F.G , 1994; Sunnerhagen М. и др., 1995). Учитывая эти данные и результаты наших опытов, можно считать, что, аналогично протромбину, Са"'-независимое взаимодействие фактора X с тромбопластином является гидрофобным Как и у протромбина, вначале должно происходить Ca2'-опосредованное взаимодействие фактора X с

фосфатидилсерином, проявляющими себя как низкоаффинные центры связывания. Затем присоединяется взаимодействие гидрофобного узла Гла-домена фактора X с остатками жирных кислот по структурным дефектам поверхности на границах мезофаз фосфатидилэтаноламина, что значительно усиливает связывание. Из двух типов взаимодействия - Са2+опосредованного электростатического и гидрофобного, относительный вклад первого из них при связывании фактора X оказывается менее значимым, чем при связывании протромбина Это следует из ненасыщаемости связывания по низкоаффинным центрам, более высокого остаточного связывания в присутствии ЭДТА и нивелирования эффекта расщепления белков тромбопластина в отсутствие ионов кальция. Принципиальное сходство основных черт взаимодействия протромбина и фактора X с тромбопластином показывает, что центры связывания имеют единую природу. Однако более сильное гидрофобное взаимодействие с высокоаффинными центрами обеспечивает более высокое сродство к ним фактора X по сравнению с протромбином. Различие в сродстве протромбина и фактора X к высокоаффинным центрам связывания на поверхности тромбопластина должно обеспечиваться отличием в структуре N-концевых участков этих белков. Кардинальным различием является наличие двух дополнительных остатков Гла в молекуле фактора X (Fung M.R. и др., 1985). Кроме того, в факторе X, в отличие от протромбина, после Гла-домена следуют не кринглы, а модули эпидермального фактора роста (ФРЭ-модуль) (Furie В. и Furie B.C., 1988). Присоединение ионов Са2+ к ФРЭ-модулю повышает аффинность взаимодействия его Гла-домена в 10-100 раз (Stenflo J., 1999). Подобно протромбину фактор X при связывании ионов кальция претерпевает конформационный переход (Church W.R. и Boulanger L.L., 1989). Поэтому представляется вероятным, что наличие дополнительного пограничного с ФРЭ-модулем центра связывания ионов кальция в факторе X усиливает косвенно Са2+-зависимое гидрофобное взаимодействие белка с тромбопластином, через гидрофобный узел аминокислот Гла-домена сам по себе или в кооперации с ФРЭ-модулем.

В присутствии фактора X эффективность связывания протромбина с высокоаффинными центрами тромбопластина снижается (Kd увеличивается почти в 3 раза), усиливается отрицательный кооперативный эффект. Это означает, что взаимодействие фактора X и протромбина происходит с одними и теми же центрами связывания и носит конкурентный характер. Очевидно, фактор X, имея более высокое сродство (K<j=l,8xl0'9 M), чем протромбин (Kd=7,5x10'8 M), в первую очередь связывается с высокоаффинными центрами и тем самым вытесняет протромбин на окружающую их фосфолипидную поверхность. Это в свою очередь приводит к увеличению количества мест связывания для протромбина, сродство которых снижалось, вероятно, вследствие повышения однородности фосфолипидной поверхности по мере удаления от высокоаффинного центра связывания. Ранее в нашей лаборатории было установлено, что модификация тромбопластина папаином ведет к снижению

связывания с ним факторов X и УП (Зубаиров ДМ и др, 1984). В наших экспериментах мы также нашли, что после обработки тромбопластина папапном общее связывание фактора X с высокоаффинными центрами, независимо от присутствия ионов кальция, снижалось. Кроме того, фактор X вытеснял профомбин из высокоаффинных центров связывания, но при условии целостности мембранных белков. При их протеолитическом повреждении присутствие фактора X не влияло на взаимодействие протромбина с этими центрами. Следовательно, можно сделать вывод, что белки мембраны участвуют в формировании высокоаффинных центров, а взаимодействие с ними фактора X в большей степени зависит от их присутствия, чем связывание протромбина. Однако прямого взаимодействия этих факторов свертывания с мембранными белками мы не обнаружили, так как протеолиз белкового компонента тромбопластина не приводил к уменьшению высокоаффинных центров связывания в присутствии ионов кальция.

Взаимодействие протромбина с фрагментами клеточных мембран из внутреннего сосудистого слоя аорты. Взаимодействие протромбина в основном ряде используемых концентраций (1,35х10"9 №1-7,0x10"* М), как и в случае с тромбопластином, в присутствии ионов Са2+ характеризовалось вогнутой кривой на графике Скэтчарда (рис. 3-1) Это означает, что взаимодействие протромбина с препаратами ткани сосудистой стенки происходит так же, как и с тромбопластином (см. рис. 1). Протромбин связывался по двум типам центров - с высоким и низким сродством. Сродство высокоаффинных (К^ ,=6,3x10"8 М) и низкоаффинных центров связывания протромбина (Ка2=1,6х10"6 М; табл 6) почти совпадало с аналогичными центрами на тромбопластине (Ка=7,5хЮ"8 М и 4,5x10'6 М соответственно). Взаимодействие по сравнению с тромбопластином отличалось лишь меньшим количеством как высокоаффинных, так и низкоаффинных мест связывания (« в 5-6 раз) и отсутствием положительного кооперативного эффекта в связывании протромбина с высокоаффинными центрами. Радиационное воздействие не вызывало изменения формы кривых связывания протромбина фрагментами мембран (рис. 3-2), а приводило к увеличению в 7-10 раз сродства протромбина как к высокоаффинным, так и к низкоаффинным центрам связывания (табл. 6).

В то же время число высокоаффинных центров увеличивалось в 2-3 раза, а низкоаффинных, наоборот, уменьшалось в 2 раза. Эти изменения приводили к 4-кратному увеличению суммарного связывания протромбина.

При небольших концентрациях протромбина, порядка 1% и ниже от его содержания в плазме крови, взаимодействие после радиационного поражения мембран видоизменялось. Кривая на графике Скэтчарда принимала вид купола (рис. 4). Этот результат позволяет предположить появление положительных кооперативных эффектов при связывании протромбина с высокоаффинными центрами, либо их ненасыщаемости вследствие увеличения сродства и количества этих центров.

[Связанный протромбин], нМ [Связэ+ьй протрсжйН М

Рис. 3. График Скэтчарда по данным связывания протромбина с фрагментами клеточных мембран. 1 - неповрежденные мембраны; 2 - поврежденные радиационным воздействием: • - 3,5 Гр, П - 1 Гр.

Таблица 6

Наблюдаемые параметры связывания протромбина _с фрагментами клеточных мембран_

Параметры Фрагменты клеточных мембран Фрагменты клеточных мембран после радиационного воздействия

связывания Доза излучения Р

3,5 Гр 1 Гр

,, нМ 63±28,4 9,32+2,95 6,3211,36 <0,05

Ка2, нМ 1640±290 178+24 170129 <0,05

Р <0,05 <0,05 <0,05

нМ 17,5±7,9 40,1+13,8 33,317,7 <0,05

02, НМ 278150 122+20 120124 <0,05

р <0,05 <0,05 <0,05

%| 15,713,2 57,5120,4 62,2120,3 <0,05

%2 10,214,1 14,2+4,1 13,814,6 >0,5

р >0,5 <0,05 <0,05

[Связанный протромбин] нМ

Рис. 4. График Скэтчарда по данным связывания низких концентраций протромбина с фрагментами клеточных мембран, поврежденных воздействием радиации. Обозначения такие же, как на рис. 3-2.

Тканевой тромбопластин представляет собой препарат ткани мозга человека, который в ходе приготовления подвергается обработке ацетоном. При этом происходит изменение липидного состава клеточных мембран, и могут быть повреждены мембранные белки. Следовательно, это воздействие способно вызвать изменения в структурной организации фрагментов клеточных мембран и тем самым повлиять на взаимодействия с ними витамин К-зависимых факторов свертывания. Это предопределило проведение последующих экспериментов по связыванию протромбина с фрагментами ткани внутреннего сосудистого слоя аорты. Целью этих опытов было проверить, насколько обнаруженные закономерности взаимодействия протромбина с препаратом тромбопластина человека соответствуют связыванию с естественными фрагментами клеточных мембран. Из проведенных экспериментов следует, что взаимодействие протромбина с фрагментами ткани сосудистой стенки в присутствии ионов С а2 за некоторыми отличиями происходит так же, как и с тромбопластином (связывание происходило по двум типам центров с почти совпадающим сродством, но количество центров было значительно меньше (в 6-8 раз, табл. 1, 6), и отсутствовал положительный кооперативный эффект). Ранее в нашей лаборатории было установлено, что в ткани мозга человека фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина содержится в 4-5 раз больше, чем в соответствующем количестве ткани внутреннего сосудистого слоя аорты (Зубаиров Д.М. и др., 1970) Следовательно, снижение количества центров связывания на фрагментах ткани аорты по сравнению с тромбопластином можно связать с уменьшением содержания этих фосфолипидов в использованных препаратах. Очевидно, изменения в фосфолипидном составе мембран имеют принципиальное значение и для проявления положительного кооперативного эффекта при связывании протромбина с высокоаффинными центрами, который зависит от количества фосфатидилсерина (Bach R. и др., 1986). Фосфолипидную

природу центров связывания и их значение для проявления тромбогенных свойств клеточными мембранами подтвердили последующие эксперименты с фрагментами клеточных мембран, поврежденных ионизирующей радиацией.

Ионизирующее излучение при однократной дозовой нагрузке на живой организм в 3,5 и 1 Гр вызывает у животных острую и подострую формы лучевой болезни. Одним из наиболее важных звеньев в патогенезе этих заболеваний является развитие значительных нарушений в системе гемостаза. Уже в первые сутки болезни наблюдается гиперкоагуляция, обусловленная чрезмерной активацией факторов свертывания крови (Ярмоненко С.П., 1988). Поэтому целью этого исследования было выяснить, влияют ли изменения, происходящие в мембранах клеток после их повреждения ионизирующим излучением, на молекулярный механизм связывания протромбина. В настоящее время известно, что повреждающее действие ионизирующей радиации на мембраны клеток опосредуется главным образом перекисным окислением фосфолипидов, «

проявляющимся в первые сутки после воздействия дозой излучения свыше 0,4 Гр (Зима Г.В. и Древаль В.И., 2000). Ключевой стадией этих реакций является распад возникающих радикалов в гидрофобной части липидов (фосфатидилглицерина, сфингомиелина; Stark G., 1991, Власов А.П. и др., 2000). Вследствие этих процессов нарушается упаковка фосфолипидов в бислое, появляется множество дефектов структуры мембраны и резко возрастает пассивная проницаемость для ионов (Болдырев A.A. и др., 1990). Деградация ' гидроперекисей ведет к образованию лизоформ фосфолипидов. Они, как и фосфатидил ланоламин, имеют конусообразные молекулы, не подходящие для формирования устойчивого бислоя. При накоплении в плазматической мембране они образуют обращенные мезофазы, что еще более трансформирует ее структуру. Кроме того, образующиеся свободные радикалы и малоновый диальдегид могут окислять свободные сульфгидрильные группы аминофосфолипидтранслоказы, которые необходимы для проявления ее активности (Петрина Л.Г., 2001). Это ведет к блокаде системы поддержания асимметрии фосфолипидного состава мембраны, экспонированию фосфатидилсерина во внешнем слое и образованию гетерофазной структуры фосфолипидов (Aurdini А. и др., 1989; Zwaal R.F.A. и др., 1997). Появление подобных структур, вероятно, и обусловливает в наших экспериментах увеличение количества высокоаффинных центров связывания, сродство которых *

повышается за счет усиления вклада гидрофобного взаимодействия с ними протромбина.

Ранее в нашей лаборатории было установлено, что радиационное воздействие приводит к снижению в препаратах сосудистой стенки аорты общего содержания фосфолипидов и особенно фосфатидилсерина (Зубаиров Д.М. и др., 1970). Поэтому уменьшение количества низкоаффинных мест связывания можно объяснить снижением содержания этого фосфолипида в клеточных мембранах В то же время, их сродство, как и у высокоаффинных центров, повышалось, очевидно, также за счет возможного присоединения гидрофобного взаимодействия протромбина с возникающими дефектами в

бислойной мембране. Вероятность такого взаимодействия с клеточными мембранами должна повышаться, так как в них соотношение фосфатидилэтаноламина и фосфатидилсерина становится больше, чем в неповрежденных радиацией мембранах. Более выраженные деструктивные процессы, происходящие в клеточных мембранах после радиационного воздействия, очевидно, лежат в основе и возникающего эффекта положительной кооперации при связывании молекул протромбина с высокоаффинными центрами. Молекулы поврежденных фосфолипидов становятся неустойчивы в бислойной структуре мембран и присоединение первых молекул протромбина индуцирует дальнейшее их фазовое разделение, что способствует присоединению последующих молекул. Следствием этого процесса, наряду с повышением сродства и количества высокоаффинных центров связывания, является значительный рост общего связывания протромбина клеточными мембранами.

Взаимодействие протромбина с клетками. Связывание протромбина эритроцитами в основном ряде используемых концентрации (9,0x10"6 М - 1,4x10" 6 М), независимо от ионов Са2' характеризовалось прямыми наклонными линиями на графиках Скэтчарда (рис. 5). При концентрациях протромбина ниже физиологических (меньше 1,4x10"6 М) кривые становились куполообразными.

0,3

|| 0,2 И

ч

11 °'1 0 ш

О р.

чЛ

500 1000

[Связанный протромбин] нМ

Рис. 5. График Скэтчарда по данным связывания протромбина эритроцитами: I - в присутствии СаСЬ; 2 - в присутствии ЭДТА.

Форма кривых показывает связывание протромбина с одним типом центров, которые не насыщались при небольших концентрациях протромбина. В таблице

7 приведены наблюдаемые параметры связывания, рассчитанные по точкам, расположенным на нисходящих линиях графиков Скэтчарда. Сродство протромбина к центрам связывания на эритроцитах было небольшим СКа-3,7х10"бМ) и почти соответствовало низкоаффинным центрам связывания на тканевом тромбопластине (1^=4,5х]0"6 М) и на фрагментах клеточных мембран (Кй=1,6х10"6 М). Удаление свободных ионов Са2+ из системы не сказывалось на аффинности центров связывания, однако количество мест связывания увеличивалось почти в 4 раза (табл. 7).

Таблица 7

Наблюдаемые параметры связывания протромбина _с эритроцитами и их тенями_

Параметры Состав Эритроциты Тени эритроцитов Р

связывания смеси

Kd, мкМ СаС12 3,7±0,8 5,6±0,5 <0,05

ЭДТА 8,4±2,9 *

Р >0,1

Q, мкМ СаС12 0,8±0,2 0,76±0,07 >0,4

ЭДТА 2,6±1,0 *

Р <0,05

% СаС12 8,5±2,0 6,2±2,6 >0,1

ЭДТА 10,4±4,2 4,3+1,3 <0,01

Р >0,1 >0,1

* - параметры нельзя рассчитать из-за ненасыщаемости центров связывания.

Гемолиз эритроцитов в присутствии ионов Са2+ не приводил к изменению хода кривой связывания протромбина и сопровождался лишь небольшим снижением его сродства к поверхности теней эритроцитов (табл. 7). В присутствии ЭДТА связывание протромбина с поверхностью гемолизированных эритроцитов стало ненасыщаемым, очевидно, из-за ослабления взаимодействия. Это, в свою очередь, проявилось в 2-кратном снижении суммарного связывания протромбина в среде, содержащей ЭДТА.

Время свертывания при рекальцификации плазмы истощенной по контактным факторам в условиях стандартной активации каолином и взвесью эритроцитов составило (95,2±0,2) с В присутствии лектина соевых бобов Glycine max эритроциты полностью теряли способность ускорять реакции гемокоагуляционного каскада. Время свертывания увеличилось до (126,7± ±1,7) с, что соответствовало времени свертывания без эритроцитов или в присутствии их теней. Связывание протромбина с эритроцитами при добавлении лектина становилось ненасыщаемым при концентрациях, соответствующих содержанию протромбина в плазме крови и для анализа взаимодействия пришлось использовать средний процент связывания (табл 8). Предварительная обработка лектином эритроцитов приводила к увеличению в 4-5 раз связывания

протромбина. То же самое наблюдалось и в связывании предварительно обработанного лектином протромбина, но в меньшей степени выраженности (возрастало в 2-3 раза).

Таблица 8

Общее связывание протромбина эритроцитами в присутствии лектина, %

Концен. протромбина Состав смеси

[эритроциты+ лектин]+ протромбин Р Эритроциты + протромбин Р эритроциты+ [протромбин+ лектин]

1,4, мкМ 30,0+7,8 <0,001 6,8±0,5 <0,001 16,7±3,6

Связывание протромбина с эритроцитами и их тенями в присутствии ионов Са2+ после добавления гепарина также стало ненасыщаемым Внесение гепарина в инкубационные смеси снизило сорбцию протромбина эритроцитами в 1,2 раза (Р<0,05), а для их теней, наоборот, приводило к увеличению связывания протромбина в 4 раза (Р< 0,001).

Взаимодействие протромбина с альвеолярными макрофагами в основном ряде используемых концентраций (0,2x10"6 М - 4,4x10"6 М) как в присутствии ионов Са2+, так и в их отсутствии, характеризовалось прямыми наклонными линиями на графиках Скэтчарда, которые при низких концентрациях протромбина становились куполообразными и практически полностью соответствовали кривым связывания на эритроцитах. Следовательно, связывание происходило с одним типом центров, которые не насыщались при небольших концентрациях протромбина. Сродство протромбина к центрам связывания на макрофагах было невысоким (К^ 1,9x10"6 М; табл. 9) и почти соответствовало центрам связывания на эритроцитах (Ка=3,7х10"6 М). Число этих центров ((3=0,1 х I О'6 М) оказалось меньше, чем на эритроцитах (<3=0,8х 10"6 М). Поэтому и общее связывание протромбина макрофагами по сравнению с эритроцитами снизилось в 2,5 раза, но это отличие было обусловлено меньшим количеством макрофагов (в 2 раза) в инкубационных смесях по сравнению с эритроцитами.

Таблица 9

Наблюдаемые параметры связывания протромбина с макрофагами_

Состав смеси Параметры связывания

К<), мкМ 0, мкМ %

СаС12 1,9±1,0 0,1+0,05 3,0±0,5

ЭДТА 4,8±3,3 0,46±0,3 6,2±1,5

Р >0,2 >0,1 <0,05

Удаление свободных ионов Са2+ из системы не сказывалось достоверным образом на параметрах взаимодействие протромбина с центрами связывания на поверхности альвеолярных макрофагов, но общее связывание при этом

увеличивалось в 2 раза. Однократное замораживание и оттаивание клеточной суспензии макрофагов вызвало в присутствии ионов Са2' снижение аффинности центров связывания в 2 раза (Р< 0,0IX а их число при этом увеличивалось в 4 раза (Р< 0,01), что привело к 2-кратному увеличению общего связывания протромбина Внесение гепарина в инкубационные смеси, как и в случае с эритроцитами, при наличии ионов кальция снижало сорбцию протромбина на поверхности альвеолярных макрофагов в 1,5-2 раза (Р< 0,02).

Свя5ывание протромбина тромбоцитами человека в основном ряде используемых концентраций (0,3x10"° М-Н^хЮ"6 М) как в присутствии ионов Са2', так и в их отсутствии происходило с одним типом центров связывания (кривые связывания имели вид наклонных прямых на графиках Скэтчарда; рис. 6).

[Связанный протромбин], мкМ

Рис.6. График Скэтчарда по данным связывания протромбина тромбоцитами.

1 - в присутствии СаС12, 2 - в присутствии ЭДТА.

Сродство и количество центров связывания профомбина на тромбоцитах (К,)-6,5х 10'6 М, 0=0,бхЮ"6 М; табл. 10) почти соответствовали центрам связывания на эритроцитах (Кй=3,7х106 М, 0=0,вхЮ"6 М; табл. 7). Однако центры связывания на тромбоцитах, в отличие от центров связывания эритроцитов и макрофагов, насыщались и при небольших концентрациях протромбина (кривые связывания не становились куполообразными). Удаление свободных ионов Са2+ из системы приводило к небольшому снижению сродства протромбина к поверхности тромбоцитов и к 4-кратному увеличению мест связывания. В присутствии волчаночноподобного антикоагулянта связывание протромбина с тромбоцитами характеризовалось прямыми наклонными линиями на графиках Скэтчарда, которые приобретали при небольших концентрациях протромбина (меньше 0,3 мкМ) форму купола. Куполообразность кривых

связывания при небольших концентрациях протромбина исчезала в присутствии избытка "холодного" протромбина. Как можно видеть из таблицы 10, в присутствии ионов Са2~ и волчаночноподобного антикоагулянта число мест связывания протромбина на тромбоцитах увеличивалось в два раза, а сродство к ним не изменялось. Увеличение числа центров связывания не зависело от наличия свободных ионов Са2+, так как р достоверно не менялось в присутствии ЭДТА.

Таблица 10

Наблюдаемые параметры связывания протромбина тромбоцитами

Параметры Состав Контрольная Р Сыворотка с

связывания смеси сыворотка антикоагулянтом

Ка, мкМ СаС12 6,5+2,1 >0,5 9,3 ±2,4

ЭДТА 19,1 ±3,8 <0,05 10,6 ±3,5

Р <0,05 >0,5

С?, мкМ СаС12 0,58 ±0,22 <0,05 1,22 ±0,23

ЭДТА 2,44 ±0,51 <0,05 1,16 ±0,4

Р <0,05 >0,5

% СаС12 6,0 ±1,4 >0,5 8,2+1,2

ЭДТА 9,1 +1,1 >0,5 7,6 ±2,5

Р <0,05 >0,5

При наличии ЭДТА сродство протромбина к тромбоцитам в присутствии волчаночноподобного антикоагулянга возрастало почти в два раза, а количество мест связывания соответственно уменьшалось.

Эксперименты по исследованию взаимодействия протромбина с поверхностью клеток выполняли для проведения сравнительного анализа связывания протромбина с атромбогенными и тромбогенными мембранными поверхностями и выяснения влияния некоторых физико-химических факторов на этот процесс. Для этого использовали основные клетки крови: эритроциты, так как на них приходится почти 99 % всей клеточной поверхности крови; тромбоциты, играющие основную роль в свертывании крови, а также альвеолярные макрофаги, которые, в отличие от предыдущих клеток, содержат на своей поверхности тканевой фактор.

Исследования по связыванию протромбина с эритроцитами, тромбоцитами и альвеолярными макрофагами показали, за небольшими отличиями, одинаковый молекулярный механизм взаимодействия с ними протромбина. Связывание происходило с одним типом центров и характеризовалось невысоким сродством (Ка=3,7х10'6 М. 6,5x10"6 М, 1,9x10"6 М соответственно), которое почти совпадало с низкоаффинными центрами на тромбопластине и фрагментах мембран (К<1=4,5х10"6 М, 1,6хЮ'6 М), но их количество при удалении ионов Са2~ не уменьшалось, а, наоборот,

увеличивалось Поверхность клеток, и в частности эритроцитов, заряжена отрицательно за счет гликопротеинов и гликолипидов мембран (Шереметьев ЮЛ и Шереметьева A.B., 2003). Ионы Са2+, связываясь с отрицательно заряженными группами этих молекул, нейтрализуют их заряд и тем самым способствуют взаимной агрегации клеток, а в присутствии ЭДТА электростатические силы отталкивания не позволяют клеткам объединяться. Можно думать, что причиной повышения количества мест связывания при наличии ЭДТА в наших опытах является увеличение общей площади клеточной поверхности, участвующей в связывании протромбина Низкая насыщаемость центров связывания, не зависящая от присутствия ионов Са2+, свидетельствует о неспецифическом характере взаимодействия протромбина с этими центрами, поэтому связывание протромбина может происходить как с фосфолипидами, так и с гликопротеинами клеточной мембраны.

Результаты экспериментов по взаимодействию протромбина с клетками в присутствии гепарина предполагают возможное участие в этом процессе белкового компонента мембраны. Известно, что гепарин способен к комплексообразованию как с белками плазмы крови (фибриногеном, протромбином, тромбином, альбумином и пр.; Кудряшов Б.А. и др., 1966, Юнусов Р.В., 1972, Sobel М. и др., 1996; Tollefsen D.M., 1997), так и с мембранными гликопротеинами (Пальцев М.А. и Иванов A.A., 1995). После связывания гепарина общий отрицательный суммарный заряд их молекул повышается, что должно привести к взаимному электростатическому отталкиванию. Кроме того, гепарин способен вытеснять с гликопротеинов мембран адсорбированные на них лиганды (Пальцев М.А. и Иванов A.A., 1995). По-видимому, этими свойствами гепарина и объясняется снижение адсорбционной возможности поверхности клеток для протромбина.

Последующие эксперименты по взаимодействию протромбина с гемолизированными эритроцитами показали, что неспецифическое связывание протромбина гликопротеинами мембран имеет значение и для процесса свертывания крови. Эритроциты сами по себе способны ускорять свертывание крови, как считается посредством предоставления фосфолипидной поверхности идя формирования ферментных комплексов факторов свертывания. Мы также наблюдали эту возможность при рекальцификации плазмы, истощенной по контактным факторам (время свертывания составило 95 с). После осмотического шока эта способность эритроцитов пропадала (время свертывания плазмы увеличилось до 126,7 с, что соответствовало времени свертывания без эритроцитов). Мы предполагаем, что наблюдаемый результат связан в большей степени с изменением конформации мембранных гликопротеинов. В основном гликопротеины клеточных мембран представляют собой гетеродимерные интегральные белки, взаимодействующие с цитоскелетными филаментами актина клетки (Пальцев М А. и Иванов А А., 1995). При гемолизе цитоскелет эритроцитов повреждается Это в свою очередь может вызвать изменение в экстрацеллюлярном домене гликопротеинов мембраны, которое, вероятно, и проявилось в снижении сродства протромбина к центрам связывания без

изменения их числа. Кроме того, экстрацеллюлярный домен интегральных белков содержит Ca2f-связывающую область. Ионы кальция необходимы для поддержания пространственной формы гликопротеинов и участвуют во взаимодействии с лшандами. В отсутствии ионов Са2+ это взаимодействие будет уменьшаться. Подобную закономерность мы и получили в виде появления ненасыщаемости центров связывания в присутствии ЭДТА. Са"'-зависимая конформационная перестройка экстрацеллюлярных доменов мембранных белков, очевидно, определяет и инверсию связывания с ними протромбина в присутствии гепарина после повреждения структуры эритроцитов осмотическим шоком.

Участие фосфолипидов в неспецифическом связывании протромбина полностью исключить нельзя, так как возможны после гемолиза их структурные и фазовые изменения. Однако отсутствие перемен в количестве Са2+-зависимых мест связывания свидетельствует о сохранении асимметричного распределения фосфолипидов в мембране теней эритроцитов. В экспериментах использовались эритроциты свиньи, липидный состав которых очень сходен с эритроцитами человека, но в них отсутствует ферментативная активность, осуществляющая Са2+-индуцированное перемешивание липидов между листками бислоя клеточной мембраны и выносящих фосфатидилсерин на их поверхность (Galli М. и Bevers Е.М., 1994). Следовательно, гемолизированные эритроциты не проявляли тромбопластической активности вследствие этой своей особенности и изменения взаимодействия протромбина с мембранными гликопротеинами. Вероятное взаимодействие протромбина с гликопротеинами подтверждают результаты исследований других авторов, которые установили, что обработка трипсином эритроцитов снижала не только их электроотрицательность, но и коагуляционную активность (Ашкинази И Я., 1977). Таким образом, эритроциты ускоряют процесс свертывания крови за счет неспецифической сорбции на своей поверхности протромбина, а также, возможно, и других витамин К-зависимых факторов свертывания, что обеспечивает их быстрое включение в этот процесс.

В отличие от эритроцитов альвеолярные макрофаги имели более высокую тромбопластическую активность (95 и 48 с соответственно). Известно, что способность макрофагов ускорять процесс свертывания крови обеспечивается присутствием на их поверхности тканевого фактора. Тканевой фактор активирует фактор VII при участии фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина (Bach R. и др., 1988; Neuenschwander P.F. и др., 1995). Эти фосфолипиды в основном находятся во внутреннем слое клеточных мембран, и поэтому мы не нашли никаких различий в связывании протромбина эритроцитами и альвеолярными макрофагами. Это означает, что для реализации активности комплекса тканевой фактор-фактор VII достаточно небольшого количества фосфатидилсерина, который всегда присутствует на поверхности клеточных мембран вследствие термодинамических флуктуаций. Эксперименты по связыванию протромбина с травмированными замораживанием макрофагами подтверждают отсутствие значительных количеств фосфатидилсерина на их поверхности. Повреждение цитоскелета кристаллами воды должно привести к

нарушению механизмов, поддерживающих асимметричное строение мембран. При этом на их поверхности появляется фосфатидилсерин, что и выразилось в наших опытах в виде роста числа Са2+-зависимых мест связывания. В то же время, вероятно, происходит и повреждение мембранных белков, которые, как показывают наших эксперименты с модифицированным папаином тромбопластином, могут опосредованно влиять на их формирование.

В настоящее время остается не совсем ясной роль углеводного компонента витамин K-зависимых факторов свертывания для их активации. Возможное участие углеводов в этом процессе мы попытались определить с помощью лектина соевых бобов Glycine max. Растительный лектин Glycine max -это гликопротеин, который состоит из 4 субъединиц и имеет 2 идентичных места связывания олигосахаридов на отдельных субъединицах (Луцик М.Д и др, 1981) Тем самым он способен связывать углеводные радикалы протромбина и гликопротеинов мембран между собой, что мы и наблюдали в виде значительного роста общего связывания протромбина в наших опытах. Более заметное увеличение связывания протромбина с предварительно обработанными лектином эритроцитами, очевидно, обусловлено вовлечением в это взаимодействие не только гликопротеинов мембраны, но и их гликолипидов. Однако в присутствии лектина эритроциты полностью теряли способность ускорять реакции гемокоагуляционного каскада. Потерю коагуляционной активности плазменных факторов свертывания в присутствии растительного лектина Phaseolus Vulgaris наблюдали и другие исследователи (Nadiradze N.I. и Green D., 2002). Следовательно, связывание протромбина с мембранами через углеводные цепи не только не имеет значение для его активации, а даже, наоборот, исключает такую возможность.

На фоне общих закономерностей, обнаруженных при взаимодействии протромбина с изучаемыми клетками, связывание с тромбоцитами несколько отличалось. Снижение аффинности взаимодействия протромбина с тромбоцитами в присутствии ЭДТА было более выраженным, чем на эритроцитах и макрофагах (увеличение I(d стало достоверным). Это означает, что связывание протромбина с этими центрами в большей степени зависит от ионов кальция. Возможно, что это происходит вследствие увеличения вклада в связывание протромбина фосфатидилсерина, которого на поверхности тромбоцитов содержится больше (2,4 моль%; Шитикова А.С, 2000), чем на эритроцитах (1,7 моль%; Atichartakarn V. и др., 2002). Уменьшение сродства центров связывания в присутствии ЭДТА может быть обусловлено сменой характера электростатического взаимодействия с ними протромбина. При наличии ионов Ca2" протромбин связывается с поверхностью тромбоцитов, как через их гликопротеины, так и через фосфатидилсерин за счет хелатного взаимодействия, а в их отсутствии за счет более слабого ионного взаимодействия. Участие фосфатидилсерина в этом взаимодействии мы попытались проверить с помощью волчаночноподобных антител Известно, что волчаночноподобный антикоагулянт связывается с эпитопами антигена, представляющими собой участки клеточных мембран, состоящие из

фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина и фосфатидилсерина, на которых адсорбирован протромбин и/или (32-гликопротеин I (Rauch J. и др, 1989; Horbach DA. и др, 1998). Вместе с тем, на поверхности тромбоцитов имеется Fc-рецептор, который связывается с Fe доменом иммуноглобулина G (Шитико-ва A.C., 2000) Следовательно, волчаночноподобный антикоагулянт может взаимодействовать с тромбоцитами как через адсорбированный протромбин, так и через Fc-рецептор В нашем исследовании обнаруженное двукратное увеличение мест связывания протромбина в присутствии волчаночноподобного антикоагулянта позволяет предположить, что эти антитела ведут себя как истинные бивалентные иммуноглобулины, присоединяющие по две молекулы протромбина. Подобный результат получили и другие авторы, которые исследовали связывание протромбина в присутствии волчаночных иммуноглобулинов G на модельных фосфолипидных мембранах (Willems G.M. и др., 2001). Кроме того, в опытах при небольших концентрациях протромбина взаимодействие с иммуноглобулином происходило с положительным кооперативным эффектом. Появление положительного кооперативного эффекта является одним из характерных свойств двухвалентных антител, которое обусловлено разными кинетическими и равновесными константами связывания первого и второго антигена (Егоров A.M. и др., 1991). Исчезновение этого эффекта при избытке «холодного» протромбина, очевидно, происходит вследствие проявления конкурентных взаимодействий. Таким образом, волчаночноподобный антикоагулянт, связываясь с адсорбированной молекулой протромбина, обусловливает присоединение дополнительной молекулы из окружающей среды или сам организует места связывания за счет взаимодействия с Fc-рецептором тромбоцитов. Второй вариант менее вероятен, так как соединение Fe домена иммуноглобулина G с Fc-рецептором на тромбоците зависит от наличия ионов кальция (Шитикова A.C., 2000), что не было обнаружено в наших опытах (Kd и Q не изменялись в присутствии ЭДТА). Учитывая многочисленные данные о том, что для взаимодействия волчаночноподобных антител с протромбином необходимо присутствие в эпитопе антигена фосфатидилсерина (Galli М. и Bevers Е.М., 1994; Horbach D.A. и др., 1998; Willems G.M. и др., 2001), можно предполагать участие этого фосфолипида в связывании протромбина на поверхности неактивированных тромбоцитов.

Результаты наших исследований позволяют расширить представления о значении структуры клеточной мембраны для гемостаза. Учитывая приведенные данные других исследователей, мы предполагаем ведущую роль в процессе инициирования свертывания крови Са2+-опосредованной перестройки структуры клеточных мембран Проведенный анализ наблюдаемых явлений позволяет выявить причинно-следственную взаимосвязь разнородных явлений и объяснить непонятные ранее факты в практической гемо

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

становится понятным, каким образом различные воздействия на уровне организма (действие гормонов, биологически активных веществ, фармакологических препаратов, токсинов, радиоактивного излучения, физической травмы и др.) приводят к однотипному эффекту - повышению прокоагулянтно) о потенциала крови и генерации тромбина Все эти воздействия трансформируются в перестройку плазматических мембран с образованием тромбогенной фосфолипопротеиновой поверхности.

В настоящее время считается, что активация свертывания крови запускается тканевым фактором, представляющим собой ассоциированный с фосфолипидами трансмембранный белок (Бутенас С. и Манн КГ., 2001). Инициирование свертывания крови происходит посредством его взаимодействия с фактором VII, но для этого требуется присутствие фосфолипидной поверхности, содержащей фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин и фосфатидилхолин (Bach R. и др., 1986; Neuenschwander P.F. и др , 1995; Smirnov M.D. и др., 1999). На поверхности неактивированных клеток фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин практически отсутствует. Для их появления необходимо разрушить системы, поддерживающие асимметричное строение мембран. Это происходит под воздействием различных индукторов (коллагена, тромбина, бактериальных токсинов и т.д.), действующих через различные мембранные рецепторы. Во всех случаях это приводит к поступлению ионов Са2+ в цитоплазму из внутриклеточного депо или внеклеточной жидкости и крови при повреждении мембран. Ионы Са2+ подавляют активность АТФ-зависимой аминофосфолипидной транслоказы, переносящую фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин из наружного во внутренний слой клеточной мембраны (Devaux Ph., 1991) и одновременно активируют скремблазу - быстро действующий фермент, выносящий фосфатидилсерин на поверхность (Zwaal R.F.A и Schroit A.J., 1997; Stout J.G. и др., 1998). Появление фосфатидилсерина и определяло в наших опытах Са2+-зависимое связывание протромбина с низкоаффинными центрами на поврежденных замораживанием альвеолярных макрофагах. В то же время на фрагментах мембран, обладающих высокой тромбогенностью, мы нашли как низкоаффинные, так и высокоаффинные центры связывания. Существование этих центров обусловлено перестройкой структуры мембран - возникновением цилиндрических и мицелллярных мезофаз фосфолипидов. Приобретение мембранами гетерофазной структуры приводит к усилению связывания протромбина за счет присоединения к Са2<-зависимому связыванию с фосфатидилсерином гидрофобного взаимодействия с ацильными остатками фосфолипидов на границе мезофаз Таким образом, становится понятным, почему для проявления максимальной коагуляционной активности необходимо одновременно присутствие как минимум фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина.

Как показали наши исследования с модифицированным папаином тканевым тромбопластином, существование высокоаффинных центров обусловлено мембранными белками, которые, по-видимому, способствуют стабилизации возникающих в поврежденных мембранах кластеров

фосфатидилсерина и мезофаз фосфатидилэтаноламина. Очевидно, поэтому высокоаффинные центры в отсутствие мембранных белков не наблюдались в опытах с модельными фосфолипидными поверхностями. Возможное участие мембранных белков в формировании ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов, вероятно, объясняет результаты исследований, в которых было обнаружено, что протромбиназная активность тромбоцитов зависит от присутствия на их поверхности неспециализированных белков (Bouchard В. А. и др , 1997; Furihata К. и др., 2001).

Наличие различных по аффинности центров связывания на тромбогенных мембранах является важным условием выполнения мембраной матрично-каталитической функции в активации витамин К-зависимых факторов свертывания - VII, IX, X и протромбина. В каскаде реакций продукт одного ферментного комплекса является ферментом в следующем комплексе. В начале наших исследований оставался неясным молекулярный механизм, обеспечивающий согласованность реакций каскада. Мы считаем, что гетерофазная структура тромбогенных мембран сама по себе обеспечивает формирование и функционирование ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов. Низкоаффинные центры связывания служат для накопления на поверхности мембран факторов свертывания и их латеральной диффузии к высокоаффинным центрам. Высокоаффинные центры необходимы для самосборки ферментных комплексов, обусловленной особенностями строения N-концевых участков витамин К-зависимых факторов. В первую очередь с этими центрами взаимодействует фактор VII, так как он способен непосредственно связываться с тканевым фактором (Kd=0,6-2,0xl0"9 М; Waxman В. и др., 1992). После связывания с ним и экспозиции фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина, фактор VII переходит в активную форму Vila. Субстратом для этого ферментного комплекса являются факторы IX или X Фактор X, как показали наши эксперименты, не связывается непосредственно с белковым компонентом высокоаффинного центра, но имеет высокое сродство (Kd=l,8xl0'9 М) к окружающей его фосфолипидной поверхности, что обуславливает преимущественное связывание перед протромбином (Kd=7,5xl0'8 М). Более высокое сродство фактора X обеспечивается как наличием в его молекуле дополнительных мест связывания ионов Са2+, так и присутствием ЭФР-модуля. Вероятно, подобный результат связывания можно ожидать и от фактора IX, так как его молекула также, в отличие от протромбина, содержит ЭФР-модуль и большее количество Са2+-зависимых мест (Stenflo J., 1999). В свою очередь, протромбин в основном накапливается на окружающей высокоаффинный центр фосфолипидной поверхности Следовательно, эти центры определяют распределение витамин К-зависимых факторов вокруг активационного комплекса - тканевой фактор-фактор Vila. Кроме того, межфазное разделение фосфолипидов в аннулярной области центров, очевидно, может быть и молекулярной основой связывания с ними кофакторных белков -фактора VIII и фактора V. Связывание их с мембраной происходит за счет

электростатических и гидрофобных взаимодействий (Krieg U.C и др., 1987; Cutsforth G А. и др., 1996; Gilbert G Е. и Arena A.A., 1996). Необходимость связывания витамин K-зависимых факторов на высокоаффинных центрах обусловлена возможностью их конформационных изменений, возникающих при суммировании разных типов взаимодействий. Связанные определенным образом факторы значительно быстрее активируются Кроме того, на этих центрах процесс может усиливаться за счет положительного кооперативного эффекта, который создает возможность концентрирования витамин К-зависимых факторов вокруг активационного комплекса

Представляется маловероятным независимое и изолированное формирование теназного и протромбиназного комплексов витамин К-зависимых факторов свертывания. Наличие на мембране неоднородных участков связывания кажется наиболее простой молекулярной основой осуществления каскада активации в ансамбле близко расположенных кофакторов и факторов свертывания. Продукт одного ферментного комплекса является ферментом в следующем комплексе, что должно значительно повышать эффективность процесса свертывания крови.

Структурные изменения в цитоплазматических мембранах не только определяют формирование ферментных комплексов свертывания крови, но и определяют степень их активности. Эффективность процесса свертывания определяется природой связей факторов свертывания с клеточной поверхностью. Неспецифическое взаимодействие факторов, например, с мембранными белками, только незначительно ускоряет свертывание крови. При воздействии физиологических индукторов (АДФ, гистамин, катехоламины, тромбин, коллаген и т.д.) происходит дозированное высвобождение из внутриклеточного депо ионов Са2+ и их поступление из внеклеточной среды, что приводит к постепенному перераспределению фосфолипидов между слоями. Перемещение фосфолипидов в этом случае происходит путем flip-flop со временем «полуперехода» от несколько минут до одного часа (Devaux Ph., 1991), что недостаточно для быстрого разворачивания процесса свертывания крови. Однако появление фосфатидилсерина на поверхности мембраны приводит к концентрированию факторов свертывания и тем самым повышается вероятность их активации. При воздействии сильных индукторов (тромбин+коллаген, бактериальный токсин, мембраноатакующий комплекс комплемента, ионизирующее излучение, ионофор А-23187 и др.) процесс значительно ускоряется, и рандомизация завершается в течение одной минуты, а в мембране возникают мицеллярные и гексагональные мезофазы фосфолипидов (Devaux Ph., 1991), Появление таких структур обусловливает полноценное связывание витамин K-зависимых факторов, что значительно облегчает их активацию благодаря конформационным изменениям в их молекулах. Кроме того, перераспределение фосфолипидов мембраны приводит не только к возникновению гетерофазной поверхности, но и к отшнуровыванию от нее фосфолипидных микровезикул (Sims P.J и др, 1989; Comfurius Р. и др., 1990; Hamilton K.K и др., 1990). Следовательно, поступление в кровь фрагментов

клеточных мембран является следствием их фазовой перестройки Увеличение в кровотоке фрагментов мембран с полной тромбопластической активностью (то есть с экспонированным тканевым фактором и гетерофазной структурой мембраны) вызовет значительное ускорение свертывания крови. Таким образом, предлагаемый молекулярный механизм инициирования свертывания крови трансформированными мембранами проясняет основное звено патогенеза многих заболеваний, при которых развивается гиперкоагуляция (хирургические вмешательства, инфаркт миокарда, инфекционные и аутоиммунные заболевания и др.), а также развитие синдрома ДВС.

Следует отметить, что контакт с кровью небольшого количества клеток с перестроенной плазматической мембраной или даже микровезикул с экспонированным тканевым фактором может быть недостаточным для активации процесса свертывания крови. Многие из упомянутых выше индукторов тромбиногенеза постоянно действуют в организме, обеспечивая обычный уровень прокоагулянтной активности крови и тканей. Обнаружение нами в крови здоровых людей продуктов расщепления тромбином протромбина (фрагмента 1 и претромбина 1) доказывает фоновый уровень этого процесса. Это подтверждают и эксперименты, в которых тромбопластическая активность плазмы здоровых людей значительно уменьшалась после удаления центрифугированием фосфолипидных частиц (Бышевский А.Ш. и др., 1993). Накопление тромбогенных клеток и частиц сверх определенного уровня в крови не происходит. Это обусловлено тем, что макрофаги крови и тканей опознают экспонированный на поверхности клеток и фосфолипидных везикул ФС, атакуют их и удаляют из циркуляции (Devaux Ph, 1991). Появляющиеся при этом активные витамин K-зависимые факторы эффективно нейтрализуются совместным действием гликозаминогликанов на поверхности эндотелиальных клеток, гепарина и антитромбина Ш, а также ингибитором внешнего пути свертывания и плазменными ингибиторами протеаз. Свертывание крови начинается лишь тогда, когда количество контактирующих с ней клеток с перестроенной плазматической мембраной и отделившихся от них фосфолипидных везикул достигает порогового уровня Наше представление о пороговом характере действия индуцирующего свертывание крови сигнала подтверждается экспериментальными данными и математическим моделированием этого процесса (Khanin М., 1995).

Исследования последних лет показывают, что возникновение гетерофазных структур в мембране имеет существенное значение и в патогенезе аутоиммунных заболеваний (Gennari L.C и др , 2002; Borcat D. и др., 2003; Bidot С J и др., 2003; Ashrani A.A. и др., 2003) Прямым свидетельством существования гетерофазных структур в поврежденных мембранах явилось обнаружение антител против фосфатидилэтаноламина в гексагональной мезофазе (Rauch J. и др., 1989). Кажется ясным, что причиной развития данных заболеваний являются дефекты иммунной системы, но связывание антифосфолипидных аутоантител с витамин K-зависимыми белками само по себе доказывает контактирование с кровью клеточных мембран с перестроенной,

мезоморфной структурой фосфолипидов Взаимосвязь между иммунной системой и системой свертывания крови проявляется не только в выработке антител к факторам свертывания Стимуляция иммунного ответа сопровождается синтезом и экспрессией тканевого фактора макрофагами крови и тканей, образованием поверхности для формирования протромбиназного комплекса лимфоцитами и нейтрофилами и выработкой иммунокомпетентными клетками различных биологически активных веществ (Кузник Б.И. и др., 1989). Многие из этих веществ, например, гистамин, фактор активации тромбоцитов, через рецепторы индуцируют повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ и реализацию тромбогенного потенциала тромбоцитов, эндотелиальных клеток, макрофагов в соответствии с рассмотренным ранее механизмом. Сопряженностью этих процессов, очевидно, и объясняется наблюдаемый парадокс при аутоиммунных заболеваниях, который выражается проявлением тромботических состояний в условиях организма, а вне организма коагуляционные тесты показывают снижение активности системы свертывания крови. Как показали наши опыты по взаимодействию протромбина с клетками в присутствии волчаночноподобных антител или растительного лектина, связанный неспецифическим образом протромбин теряет способность к активации. В условиях организма при тромбозах антикоагулянтное действие волчаночноподобных антител не проявляется из-за значительного избытка мембран с видоизмененной поверхностью.

Из вышеизложенного следует, что изменение структуры мембраны определяет формирование ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов свертывания и эффективность их участия в процессе свертывания крови. Таким образом, функциональная перестройка бислойной мембраны в гетерофазную является определяющим моментом как для инициирования свертывания крови, так и для процесса гемостаза в целом. Проведенное исследование показывает возможность регуляции процесса свертывания крови посредством использования препаратов, влияющих на состояние клеточной мембраны и на связывание с ними факторов свертывания.

Выводы

1 Протромбин взаимодействует с фрагментами клеточных мембран по двум типам независимых центров связывания - высокоаффинным (К^ 6,3-10"8 М) и низкоаффинным (К,) 1,6-10"6 М). Центры связывания протромбина имеют фосфолипидную природу Связывание с центрами обоего типа осуществляется при участии ионов Са2+ Вместе с тем оно обеспечивается и дополнительным Са2н-независимым, наиболее вероятно гидрофобным, взаимодействием протромбина с фосфолипидами клеточных мембран определенным образом организованных при участии мембранных белков.

2 Протромбин взаимодействует с центрами связывания Ы-концевым участком молекулы, соответствующим фрагменту [. Фрагменту I свойственны все

специфические особенности связывания протромбина с тромбопластином, тогда как взаимодействия претромбина I и а-тромбина с тромбопластином являются неспецифическими.

3. Ионы Са2+ подавляют электростатическое связывание тромбина с тромбопластином, что обеспечивает быстрое освобождение фермента от протромбиназного комплекса в плазму для участия в последующих этапах свертывания крови.

4 Фактор X взаимодействует с теми же высокоаффинными центрами связывания (Kd 1,8-10'9 М), что и протромбин. Различие в сродстве этих факторов к клеточной мембране является наиболее вероятной молекулярной основой формирования ансамбля ферментных комплексов с участием этих белков.

5 Радиационное воздействие приводит к значительному росту связывания протромбина фрагментами клеточных мембран за счет увеличения количества высокоаффинных центров и повышения его сродства как к высокоаффинным (Kd 9,3-10"9 М), так и к низкоаффинным центрам связывания (Kd 17,810"' M). Этот результат подтверждает фосфолипидную природу центров и значение перестройки структуры клеточной мембраны для процесса инициирования свертывания крови.

6. В плазме крови человека в норме присутствуют нетромбиновые продукты распада протромбина (фрагмент 1 2,4±0,8х10"7 М; претромбин 1 3,9±1,7х10'7 М), что свидетельствует о фоновой активности системы свертывания крови, обеспеченной трансформацией клеточных мембран.

7. Взаимодействие протромбина с эритроцитами, тромбоцитами и альвеолярными макрофагами происходит с одним типом низкоаффинных центров (Kd порядка-10"6 М) посредством неспецифического связывания, вероятнее всего с мембранными гликопротеинами.

8. Неспецифическое связывание протромбина волчаночноподобными антителами, растительными лектинами Glycin Мах на поверхности клеточных мембран, как и его десорбция в присутствии гепарина доказывают возможность регуляции свертывания крови путем изменения связывания витамин K-зависимых факторов с мембранами.

9. Приобретение клеточными мембранами тромбогенных свойств и инициирование ими свертывания крови обеспечивается Са?"-опосредованной перестройкой их бислойной структуры в мезоморфную. Это лежит в основе молекулярного механизма специфического связывания с мембранами витамин K-зависимых факторов и обеспечивает формирование их ферментных комплексов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Киселев C.B. Методы получения протромбина человека и продуктов его

расщепления тромбином / C.B. Киселев // Физиология и патология гемостаза, тез

докл межвузов, конф молодых ученых. - Чита, 1982. - С. 82-83.

2. Киселев С В Одновременное определение протромбина и его производных фрагмента 1 и претромбина 1 в плазме / С.В. Киселев, В Н. Тимербаев // Лабораторная диагностика тез. докл. Всесоюзн. съезда врачей лаборантов - Москва, 1985. - С. 223-224.

3 Зубаиров Д.М. Молекулярный механизм взаимодействия протромбина с тканевым тромбопластином / Д.М. Зубаиров, В.Н. Тимербаев, С.В. Киселев, И В. Соболева, С.В. Киршин // Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике: тез. докл Всесоюзн. конф. - Москва, 1987.-С 23-24.

4 Киселев С.В. Рецепция тромбина и протромбина тканевым тромбопластином / СВ. Киселев, С В. Киршин, В Н. Тимербаев, И.В. Соболева, Д М. Зубаиров // Биоорганическая и органическая химия- тез. докл. УП Республикан конф. молодых ученых-химиков. - Таллинн, 1987. - С. 100.

5 Зубаиров Д.М. Взаимодействие протромбина человека с тканевым тромбопластином / ДМ. Зубаиров, В.Н Тимербаев, С.В. Киселев, С.В. Киршин, И.В. Соболева // Биохимия. - 1989. - Т. 54, № 6. - С. 1046-1054.

6. Зубаиров Д.М. Исследование внешнего пути свертывания крови / Д М Зубаиров, В.Н Тимербаев, Р.Ф. Байкеев, С.В Киселев, Л.Г. Попова, И.В. Соболева, Г.Ш Ченборисова, С В Киршин // Биохимия животных и человека. - Киев: Наукова Думка. - 1989. - № 13. - С. 1-10.

7. Исследование инициальных механизмов диссеминированного свертывания крови: Сб науч. тр. / Казанский медицинский институт. 1814-1989. - Казань, 1989. - Т. 11. - С. 42-47.

8 Тимербаев В.Н. Способ получения меченного 1251 а-тромбина /

B.Н. Тимербаев, С.В. Киселев, С.В. Киршин // Авторское свидетельство на изобретение СССР № 1474937, МКИ5 А 61 К 43/00.- Казанский мед. институт.-№ заявки 4143946/28-14,- Заявлено 06. 11. 86,- Опубликовано 15. 10. 90. -Бюллетень «Открытия и изобретения». - 1990. - № 38. - С. 273.

9. Zubairov D.M. Study of the Biochemical and Physiological Mechanisms of Blood Coagulation via the Extrinsic Pathway / D.M. Zubairov, R.F. Baikeev, S.V. Kirshin, S.V. Kiselev, L.G Popova, I.V. Soboleva, V.N. Timerbaev // Biochemical Mechanisms of the System Regulating the Aggregate State of Blood (Ed. O.K. Gavrilov). - London: Harwood Acad. Publ. - 1990. - V. 3. - Pt. I. - P.9-25.

10 Zubairov D.M. Athrombogenety-thrombogenety transformation of cytoplasmic membrane / D.M. Zubairov, V.N Timerbaev, S.V Kiselev, A.I. Khairutdinova // Constituent Congress Int. Soc For Pathophysiol Moscow, May 28 -June 1, 1991: Abstracts. - Kuopio., 1991.-P. 128.

11 Киселев С В. Взаимодействие протромбина с эритроцитами / Киселев

C.В, Хайрутдинова А.И. // Физиология и патология гемостаза: тез. докл. Всесоюзн. конф. - Полтава, 1991. - С. 33.

12. Тимербаев В Н. Взаимодействие фрагмента I протромбина, претромбина 1 и а-тромбина человека с тканевым тромбопластином / ВН Тимербаев, ДМ. Зубаиров, С В Киселев, С В Киршин, ИВ Соболева // Биохимия - 1992 - Т. 57. № 1. С 77-90.

13. Киселев СВ. Взаимодействие протромбина с эритроцитами и альвеолярными макрофагами / С.В Киселев, А И Хайрутдинова, Д M Зубаиров // Гематология и трансфузиология - 1993 - № 7 - С. 36-37.

14 Булатова А.И. Влияние гепарина на взаимодействие протромбина с клеточными поверхностями / А.И. Булатова, C.B. Киселев // Казанский мед журнал, - 1993,-№5.-С. 369-370.

15 Zubairov DM. Interaction of prothrombin with erythrocytes and alveolar macrophages / D M. Zubairov, S.V. Kiselev, A.I Khairutdinova // Thromb. Haemost. -1993,-V. 69, N6 - P.872.

16. Тимербаев В.H. Взаимодействие фактора X с тканевым тромбопластином / В.Н. Тимербаев, С.В Киселев, И.В. Соболева, Д M Зубаиров // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии- тез. докл. Российской конф. - СПб., 1995. - С. 131-132.

17. Zubairov D.M. The effect of lupus anticoagulant on 125I-prothrombin binding to the platelets / D.M. Zubairov, S.V. Kiselev, I.A. Andruchko // XIII th Meeting of the international society of Haematology 3-8 September. - Istanbul., 1995. -P. 956.

18. Zubairov DM. The effects os lectin Glycin Max on the binding of l25I-prothrombin to porcine erythrocytes / D.M. Zubairov, S V. Kiselev, A.I Bulatova //14 th International congress on Thrombosis.- October 14-19- Montpellier., 1996: Haemostasis. - 1996. - V 26, S. 3. - P.588.

19. Зубаиров Д.M. Влияние лектина Glycin Мах на взаимодействие протромбина с эритроцитами / Д.М. Зубаиров, C.B. Киселев, А.И Булатова // Вопросы мед. химии. - 1997. - Т. 43. - С. 226-232.

20. Киселев C.B. Взаимодействие протромбина с клеточными мембранами / C.B. Киселев, Д.М. Зубаиров // III Съезд биохимического общества: тез докл. -СПб., 2002. - С. 172.

21. Киселев C.B. Взаимодействие витамин K-зависимых факторов свертывания крови с фрагментами клеточных мембран / C.B. Киселев, Д М. Зубаиров, В.Н. Тимербаев // III Съезд биохимического общества- тез. докл. -СПб., 2002. - С. 173.

22. Киселев C.B. Влияние радиационного воздействия на взаимодействие протромбина с фрагментами клеточных мембран / С.В Киселев, Д.М Зубаиров, C.B. Киршин II Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2002. - № 11. - С. 515-518.

23. Киселев C.B. Взаимодействие фактора X человека с тканевым тромбопластином / C.B. Киселев, Д.М. Зубаиров, В.Н. Тимербаев // Биомедицинская химия. - 2003. - Т. 49, № 5. - С.443-450.

24. Киселев C.B. Значение химического состава фосфолипидов на поверхности клеточных мембран и их структуры для инициирования процесса свертывания крови / C.B. Киселев // XVII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии: тез. докл. - Казань, 2003. - С. 245

25. Киселев С В. Влияние волчаночноподобного антикоагулянта на взаимодействие протромбина и тромбоцитов / C.B. Киселев, Д.М Зубаиров, И А Андрушко, Ю.Л. Кацадзе // Бюлл. эксп. биол. и мед. - 2004. - № 6. - С. 614-617

РНБ Русский фонд

2006-4 18345

»22224

Подписано в печать 31.10.2005 Бумага офсетная 60x84/16 Ризография Объем 2,0 усл.-печ. л. Тираж 100

Заказ № 84

420012. I. Казань. Бутлерова. 49. типография КГМУ

Актуальность проблемы

В настоящее время проблемы гемостаза продолжают привлекать внимание многих исследователей, так как имеют большое значение для клинической практики. Нарушения в этом процессе являются составным элементом хирургической и акушерской патологии, лежат в основе патогенеза многих сердечно-сосудистых, цереброваскулярных, инфекционных, иммунных заболеваний. Необходимость предупреждения и лечения тромбозов и геморрагических состояний, создание атромбогенных материалов, применяемых в хирургической практике, требуют более глубокого познания молекулярного механизма свертывания крови и его регуляции. В последние годы получены значительные результаты в исследованиях проясняющих сосудисто-тромбоцитарный гемостаз и молекулярный механизм превращений факторов свертывания в плазменном гемостазе (Зубаиров Д.М., 2000; Шитикова А.С., 2000; Бутенас С. и Манн К.Г., 2002; Hansson К. и Stenflo J., 2005). Вместе с тем, несмотря на прогресс в понимании отдельных стадий, как и в начале изучения проблемы, остается неясным, какова физико-химическая природа исходного импульса, запускающего процесс гемостаза в целом. Разрешение этой проблемы в дальнейшем позволит предупреждать развитие нарушений в системе гемостаза, разрабатывать лекарственные препараты способные эффективно воздействовать на молекулярный механизм системы свертывания крови с целью его нормализации при различных патологических состояниях.

Свертывание крови представляет собой сложный биологический процесс, в котором участвуют сосудистая стенка, форменные элементы крови (в основном тромбоциты) и некоторые растворимые белки плазмы, участвующие в каскаде генерации ключевого фермента свертывания -тромбина. Клинические наблюдения показывают, что в этом процессе абсолютно необходимы только те реакции, в которых участвуют витамин Кзависимые факторы свертывания (факторы VII, IX, X и протромбин). Они последовательно активируются в нескольких ферментных комплексах при участии ионов Са . Комплексы имеют однотипную организацию, включающую наряду с ферментом и субстратом белок-кофактор и каталитическую фосфолипидную поверхность, представляемую мембранами клеток, соприкасающихся с кровью. При этом ферментные комплексы витамин К-зависимых факторов в

105-109 раз более эффективны в протеолизе их естественных субстратов, чем свободные ферменты (Бутенас С. и Манн К.Г., 2002). В норме мембраны клеток атромбогенны. Следовательно, приобретение клеточными мембранами тромбогенных свойств является одним из основных элементов инициирования свертывания крови.

До начала наших исследований было известно, что прокоагулянтное свойство клеточных мембран обусловлено присутствием в них фосфатидилсерина, а скорость активации витамин К-зависимых факторов зависит от их фосфолипидного состава. Было установлено, что при образовании ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов происходит связывание их с кислыми фосфолипидами мембран, главным образом, с фосфатидилсерином. Гипотезы строения и функционирования коагуляционных ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов были разработаны в основном по данным, полученным в исследованиях по связыванию этих факторов с модельными фосфолипидными монослоями или везикулами (Mann K.G. и др., 1990; Gerads I. и др., 1990; Pei G. и др., 1993). Однако природные клеточные мембраны имеют более сложную структурную организацию, присутствие на этой поверхности различных белков, углеводов может иметь значение для связывания с ней факторов свертывания и влиять на формирование и работу их ферментных комплексов. Следовательно, выяснение принципов формирования ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов свертывания на естественных клеточных мембранах является фундаментальной задачей всей проблемы свертывания крови.

Превращение протромбина в тромбин является ключевым звеном, на котором замыкаются внешний и внутренний биохимические механизмы свертывания. Поэтому мы в своих исследованиях в основном остановились на изучении взаимодействия протромбина с клеточными мембранами, подвергнутых различным физико-химическим воздействиям. Выяснение молекулярного механизма взаимодействия этого фактора свертывания с поверхностью трансформированных клеточных мембран позволило прояснить структурную основу приобретения ими тромбогенных свойств. Из выше изложенного следует, что такое исследование является актуальным как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Цель исследования

Целью работы являлось выяснение значения структуры поверхности естественных клеточных мембран в обеспечении их тромбогенных свойств.

Задачи исследования

Достижение цели работы требовало последовательного выполнения следующих исследований: изучения взаимодействия протромбина, продуктов его активации и другого витамин К-зависимого фактора свертывания -фактора X с тромбогенной поверхностью препарата тканевого тромбопластина; выяснения молекулярного механизма связывания протромбина с клеточными поверхностями после воздействия различных физико-химических факторов. В соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и совершенствование методов получения витамин Кзависимых факторов свертывания - фактора X, протромбина и продуктов его активации: фрагмента 1, претромбина 1, а-тромбина;

2. Исследование молекулярного механизма и количественных закономерностей связывания протромбина, продуктов его активации и фактора X с тканевым тромбопластином;

3. Выяснение влияния различных факторов на взаимодействие протромбина с основными клетками крови и клеточными мембранами;

4. Разработка представлений о молекулярном механизме приобретения клеточными мембранами тромбогенных свойств и формирования ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов свертывания крови.

Научная новизна

Разработаны новые методы очищения протромбина и фактора X, отличающиеся от существующих меньшей трудоемкостью при сравнимом выходе, чистоте и биологической активности препаратов. Впервые предложен способ получения меченного I а-тромбина, позволяющий полностью сохранять его ферментативную активность. В ходе проведенных исследований установлено, что связывание протромбина и фактора X, в отличие от модельных фосфолипидных везикул, на фрагментах мембран происходит по двум типам фосфолипидных центров. Получены

О I доказательства Са -независимого связывания витамин К-зависимых л . факторов с клеточными мембранами. Обнаружена способность ионов Са подавлять электростатическое связывание тромбина с фосфолипопротеиновыми частицами, что обеспечивает быстрое освобождение фермента из ферментативного комплекса и его участие в последующих этапах гемостаза. Установлено наличие в плазме крови здоровых людей нетромбиновых продуктов распада протромбина, что свидетельствует о фоновой активности системы свертывания крови. Впервые показано, что в основе развития гиперкоагуляции при радиационном воздействии лежит повышение способности клеточных мембран связывать витамин К-зависимые факторы свертывания, обусловленное изменением их фосфолипидной структуры. В исследованиях по взаимодействию протромбина с клетками обнаружили адсорбцию на их поверхности молекул протромбина, неспецифическое связывание которых позволяет ускорять процесс свертывания крови. При связывании протромбина с эритроцитами и альвеолярными макрофагами обнаружено, что гепарин снижает адсорбционную способность клеточной поверхности, а после повреждения эритроцитов осмотическим шоком, наоборот, способствует связыванию с ней протромбина. Растительные лектины Glycine max исключают участие протромбина в свертывании крови посредством связывания его с углеводами клеточной мембраны. Волчаночноподобные антитела обусловливают дополнительное связывание протромбина тромбоцитами, что, вероятно, и определяет их антикоагулянтный эффект.

Теоретическое значение результатов проведенных исследований определяется раскрытием молекулярного механизма приобретения клеточными мембранами тромбогенных свойств. Проведенный анализ обнаруженных закономерностей показывает значительную роль структурных изменений мембраны клеток для процесса свертывания крови и тем самым позволяет понять патогенез заболеваний, протекающих с нарушениями в системе гемостаза.

Практическая значимость

Разработанные способы получения протромбина, фактора X, меченного 1251 а-тромбина и определения продуктов распада протромбина (фрагмента 1, претромбина 1) могут широко использоваться в практике научно-исследовательских лаборатории с целью дальнейшего разрешения проблем гемостазиологии.

Определения содержания фрагмента 1 и претромбина 1 в плазме крови могут быть использованы для диагностики тромботических состояний в клинике.

Установление причины гиперкоагуляции при острой лучевой болезни позволяет проводить целенаправленный поиск новых подходов в проведении патогенетического лечения этого заболевания.

Полученные данные о влияние гепарина, растительного лектина Glycine max на связывание протромбина с клеточными мембранами помогут разрабатывать лекарственные препараты способные эффективно воздействовать на молекулярный механизм системы свертывания крови • с целью его нормализации при различных патологических состояниях.

Положения, выносимые на защиту

1. Протромбин и фактор X взаимодействуют на поверхности фрагментов клеточных мембран с двумя типами фосфолипидных центров связывания, наличие которых обусловлено гетерофазной структурой этих фрагментов.

2. CaZT опосредованная перестройка бислойной структуры нативных клеточных мембран в мезоморфную лежит в основе молекулярного механизма приобретения мембранами тромбогенных свойств, специфического связывания с ней витамин К-зависимых факторов и обеспечивает формирование их ферментных комплексов.

3. Патогенные воздействия на процесс взаимодействия протромбина с клеточными мембранами определяют эффективность его участия в V свертывании'крови.

Внедрение результатов исследования

Материалы диссертации включены в лекционный курс для студентов Казанского государственного медицинского университета на кафедре биологической химии. Методы получения протромбина, фактора X и способ сохранения биологической активности меченного 1251 а-тромбина используется в научно-практической работе ФГУН Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на Всесоюзном съезде врачей-лаборантов (Москва, 1985), Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» (Москва, 1987), Первом международном патофизиологическом конгрессе (Москва, 1991), Всесоюзной конференции «Физиология и патология гемостаза» (Полтава, 1991), Российской конференции «Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии» (С.-Петербург, 1995), XIII Международном съезде гематологов (Стамбул, 1995), XIV Международном конгрессе (Монтпеллье, 1996), III Съезд биохимического общества (С.-Петербург, 2002), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ (статей -13, тезисов - 12), получено авторское свидетельство на изобретение.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и библиографии. Работа, содержит 15 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 295 источника, из них 235 на иностранных языках.

Выводы

1. Протромбин взаимодействует с фрагментами клеточных мембран по двум типам независимых центров связывания - высокоаффинным (Kd 6,3-10"8 М) и низкоаффинным (Kd 1,6-10"6 М). Центры связывания протромбина имеют фосфолипидную природу. Связывание с центрами обоего типа

Л I осуществляется при участии ионов Са . Вместе с тем оно обеспечивается и

Л I дополнительным Са -независимым, наиболее вероятно гидрофобным, взаимодействием протромбина с фосфолипидами клеточных мембран, определенным образом организованных при участии мембранных белков.

2. Протромбин взаимодействует с центрами связывания N-концевым участком молекулы, соответствующим фрагменту I. Фрагменту I свойственны все специфические особенности связывания протромбина с тромбопластином, тогда как взаимодействия претромбина I и а-тромбина с тромбопластином являются неспецифическими.

3. Ионы Са подавляют электростатическое связывание тромбина с* тромбопластином, что обеспечивает быстрое освобождение фермента от протромбиназного комплекса в плазму для участия в последующих этапах свертывания крови.

4. Фактор X взаимодействует с теми же высокоаффинными центрами связывания

Kd 1,8-10"9 М), что и протромбин. Различие в сродстве этих факторов к клеточной мембране является наиболее вероятной молекулярной основой формирования ансамбля ферментных комплексов с участием этих белков.

5. Радиационное воздействие приводит к значительному росту связывания протромбина фрагментами клеточных мембран за счет увеличения количества высокоаффинных центров и повышения его сродства как к высокоаффинным (Kd 9,3-10"9 М), так и к низкоаффинным центрам связывания (Kd 17,8-10"8 М). Этот результат подтверждает фосфолипидную природу центров и значение перестройки структуры клеточной мембраны для процесса инициирования свертывания крови.

6. В плазме крови человека в норме присутствуют нетромбиновые продукты

7 *7 распада протромбина (фрагмент 1 2,4+0,8x10" М; претромбин 1 3,9+1,7x10 М), что свидетельствует о фоновой активности системы свертывания крови, обеспеченной трансформацией клеточных мембран.

7. Взаимодействие протромбина с эритроцитами, тромбоцитами и альвеолярными макрофагами происходит с одним типом низкоаффинных центров (Kd порядка-10"6 М) посредством неспецифического связывания, вероятнее всего с мембранными гликопротеинами.

8. Неспецифическое связывание протромбина волчаночноподобными антителами, растительными лектинами Glycin Мах на поверхности клеточных мембран, как и его десорбция в присутствии гепарина доказывают возможность регуляции свертывания крови путем изменения связывания витамин К-зависимых факторов с мембранами.

9. Приобретение клеточными мембранами тромбогенных свойств и инициирование ими свертывания крови обеспечивается Са2+-опосредованной перестройкой их бислойной структуры в мезоморфную. Это лежит в основе молекулярного механизма специфического связывания с мембранами витамин К-зависимых факторов и обеспечивает формирование их ферментных комплексов.

ГЛАВА 7. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ВЫВОДЫ

Са опосредованное формирование гетерофазной структуры клеточных мембран представляется основным событием в инициировании свертывания крови. Транслокация аминофосфолипидов из внутреннего монослоя во внешний, последующая кластеризация фосфатидилсерина под действием ионов Са2+ и образование мезофаз фосфатидилэтаноламина, а также специфическое взаимодействие их с экстрацеллюлярной частью молекулы апопротеина III является конкретными элементами превращения атромбогенной поверхности клеточной мембраны в тромбогенную. Наличие различных по аффинности центров связывания на тромбогенных мембранах является важным условием выполнения мембраной матрично-каталитической функции в активации витамин К-зависимых факторов свертывания - VII, IX, X и протромбина. В каскаде реакций продукт одного ферментного комплекса является ферментом в следующем комплексе. В начале наших исследований оставался неясным молекулярный механизм, обеспечивающий согласованность реакций каскада.

Мы считаем, что гетерофазная структура тромбогенных мембран сама по себе обеспечивает формирование и функционирование ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов. Низкоаффинные центры связывания служат для накопления на поверхности мембран факторов свертывания и их латеральной диффузии к высокоаффинным центрам. Высокоаффинные центры необходимы для самосборки ферментных комплексов, обусловленной особенностями строения N-концевых участков витамин К-зависимых факторов.

В первую очередь с этими центрами взаимодействует фактор VII, так как он способен непосредственно связываться с тканевым фактором (Kd=0,6-2,0x 10"9

М; Waxman Е. и др., 1992). После связывания с ним и экспозиции фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина фактор VII переходит в активную форму Vila. Субстратом для этого ферментного комплекса являются факторы IX или X. Фактор X, как показали наши эксперименты, не связывается непосредственно с белковым компонентом высокоаффинного центра, но имеет высокое сродство (Kd=l,8xl0'9 М) к окружающей его фосфолипидной поверхности, что обуславливает преимущественное связывание перед ft протромбином (Kd=7,5xlCT М). Более высокое сродство фактора X обеспечивается как наличием в его молекуле дополнительных мест связывания ионов

Са , так и присутствием ЭФР-модуля. Вероятно, подобный результат связывания можно ожидать и от фактора IX, так как его молекула также, в отличие от протромбина, содержит ЭФР-модуль и большее количество

Са зависимых мест (Stenflo J., 1999). В свою очередь, протромбин в основном накапливается на окружающей высокоаффинный центр фосфолипидной поверхности. Следовательно, эти центры определяют распределение витамин К-зависимых факторов вокруг активационного комплекса - тканевой фактор-фактор Vila. Кроме того, межфазное разделение фосфолипидов в аннулярной области центров, очевидно, может быть и молекулярной основой связывания с ними кофакторных белков - фактора VIII и фактора V. Связывание их с мембраной происходит за счет электростатических и гидрофобных взаимодействий (Krieg U.C и др., 1987; Cutsforth G.A. и др., 1996; Gilbert G.E. и Arena A.A., 1996). Необходимость связывания витамин К-зависимых факторов на высокоаффинных центрах обусловлена возможностью их конформационных изменений, возникающих при суммировании разных типов взаимодействий. Связанные определенным образом факторы значительно быстрее активируются. Кроме того, на этих центрах этот процесс может усиливаться за счет положительного кооперативного эффекта, который создает возможность концентрирования витамин К-зависимых факторов вокруг активационного комплекса.

Представляется маловероятным независимое и изолированное формирование теназного и протромбиназного комплексов витамин К-зависимых факторов свертывания. Наличие на мембране неоднородных участков связывания кажется наиболее простой молекулярной основой осуществления каскада активации в ансамбле близко расположенных кофакторов и факторов свертывания. Продукт одного ферментного комплекса является ферментом в следующем комплексе, что должно значительно повышать эффективность процесса свертывания крови.

Из вышеизложенного следует, что изменение структуры мембраны определяет формирование ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов свертывания и эффективность их участия в процессе свертывания крови. Таким образом, функциональная перестройка бислойной мембраны в гетерофазную является определяющим моментом как для инициирования свертывания крови, так и для процесса гемостаза в целом. Проведенное исследование показывает возможность регуляции процесса свертывания крови посредством использования препаратов, влияющих на состояние клеточной мембраны и на связывание с ними факторов свертывания.