Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние димефосфона, мексидола и вамина на гемостаз и перекисное окисление липидов при длительном иммобилизационном стрессе

На правах рукописи

ВИНТИН НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ ДИМЕФОСФОНА, МЕКСИДОЛА И ВАМИНА НА ГЕМОСТАЗ И ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ СТРЕССЕ

14.00.25— Фармакология РГБ ОД

1 з сен та

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саранск • 1999

Работа выполнена в Мордовском государственном университете имени Н.П. Огарева

Научный руководитель - доктор медицинских наук профессор В.И.Инчина

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки РФ доктор медицинских наук профессор Л.Н.Сернов; кандидат медицинских наук доцент Н.С.Русейкин

Ведущая организация - Институт фармакологии РАМН, г. Москва

Защита состоится "_"_ 1999 года в "_" часов на заседании диссертационного совета К 063.72.11 при Мордовском государственном университете (430000, г. Саранск, ул. Большевистская, 68)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Мордовского государственного университета

Автореферат разослан "_"_ 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук Л.А.Балыкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Сердечно-сосудистые заболевания продолжают оставаться ведущими причинами смерти населения во многих странах (Бокарев И.Н., 1996; Калинина A.M., Чазова Л.В., 1998; Мазур Н.А., 1998; Pyoralia К. et al.,-1994). При этом при этом тромбоз коронарных и церебральных артерий, ведущих к инфаркту миокарда и инсульту, является одной из главных причин смертности (Баркаган З.С., 1992; Гусев Е.И., 1993; Панченко Е.П., Добровольский А.Б., 1996; Крашутский В.В., Проскурин В.М., 1997; Кухтевич И.И., 1998). Тромбозы и тромбоэмболии - наиболее частые осложнения нехирургических и хирургических заболеваний, при этом резкое уменьшение двигательной активности, постоянно наблюдающееся у тяжелых больных, является основной причиной тромбоэмболий легочной артерии, в 40-50% случаев заканчивающаяся летально (Балуда В.П., Балуда М.В., 1997; Colatonio D. et al„ 1990; Fermont P., Simoni G., 1991). Эффективность реабилитационных мер при острой окклюзии сосудистого русла зависит, в первую очередь, от скорости начала реперфузии и позволяет сохранить от 20 до 30 жизней дополнительно на 1000 леченных пациентов (Ганелина И.Б. и др., 1992; Карпов Р.С. и др., 1992; Хараш J1.M. и др., 1998; Erne Р., 1995; Tatsuji Kono et al„ 1996; Benson N.H. et al., 1999). Специфическая профилактика артериальных и венозных тромбозов снижает их частоту в 5-6 раз (Преображенский Д.В., 1993; Бокарев И.Н., 1997). Однако применение традиционных антитромбогенных и тромболитических средств, высокоэффективных при уже развившемся тромбозе, не всегда возможно для профилактики тромбоэмболических осложнений и нередко требует тщательного лабораторного контроля из-за высокого риска тяжелых геморрагических осложнений (Сидоренко Б.А. с соавт., 1998; Hirsh J., Fuster V., 1994). Кроме того, ни тромболитические, ни антитромбогенные средства не устраняют основную причину тромбозов, что способствует их рецидивированию. В этой связи в последние годы внимание исследователей обращено на использование для профилактики сосудистых тромбозов ан-гиопротекторных средств (Грацианский Н.А., 1998; Жданов B.C., 1998; Моисеев B.C. с соавт., 1998; Соболева Г.Н. с соавт., 1998).

Учитывая важную в генезе повреждения клеточных мембран активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), а также сопряженность процессов липопероксидации и активации гемостаза (Лобань-Череда Г.А., 1992; Кудрин А.Н. с соавт., 1996; Соловьев В.Г., 1997) антиоксиданты могут рассматриваться как потенциальные средства для профилактики тромбозов, тем более, что антиоксиданты оказывают позитивное влияние при патологических состояниях, где нарушения гемостаза играют ведущую роль (Кудрин А.Н. с соавт., 1995; Смирнов Л.Д. с соавт., 1996; Сыркин А.Л. с соавт., 1998).

Вюпочение в комплексную терапию димефосфона и мексидола оказывает позитивный эффект при ишемическом инсульте (Хафизьянова Р.Х., 1993; Данилов В.И., Горожанин A.B., Студенцова И.А., 1994; Пашина И.В., 1995; Сернов Л.Н. с соавт., 1995; Зиганшина JI.E. с соавт., 1996), острой ишемии миокарда (Голиков А.П. с соавт., 1990; Михина В.П. с соавт., 1994; Давыдова Б.В. с соавт., 1996; Сернов J1.H., Смирнов Л.Д., 1996).

В этой связи представляет интерес изучение антитромбогенных свойств в ряду соединений с антиоксидантной активностью.

Работа является разделом комплексной темы кафедры фармакологии Мордовского государственного университета им. Н.П.Огарева «Влияние гиподинамии, гипоксемии и профессиональных вредностей на развитие и течение патологии внутренних органов». Номер государственной регистрации 01870009146.

Целью настоящей работы явилось исследование влияния димефосфона, мексидола и вамина на гемостаз и процессы ПОЛ при длительном им-мобилизационном стрессе.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1) изучить влияние 30 суточного иммобилизационного стресса на процессы ПОЛ и свертывание крови;

2) исследовать влияние димефосфона на гемостаз и перекисное окисление липидов при 30-суточной иммобилизации кроликов;

3) изучить влияние мексидола на свертывание крови и процессы ли-попероксидации при длительном иммобилизационном стрессе;

4) исследовать действие вамина на процессы ПОЛ и гемостаз при 30-суточной иммобилизации у кроликов.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование состояния гемостаза и ПОЛ в крови, тканях миокарда, головного мозга и печени при длительном иммобилизационном стрессе. Показано, что активация процессов гемокоагуляции и угнетение фибринолиза развивается на фоне стимуляции процессов липопероксидации и угнетения антиоксидантной системы (АОС) в плазме крови, эритроцитах, печени, сердце и головном мозге.

Показано, что димефосфон оказывает антикоагулянтный эффект, стимулирует фибринолиз, ограничивая процессы липопероксидации, и повышает активность ферментов АОС в плазме крови, эритроцитах, головном мозге и миокарде у кроликов при 30 суточном иммобилизационном стрессе.

Установлено, что мексидол предупреждает развитие гиперкоагулемии и повышает антитромбогенный потенциал крови, предотвращая активацию ПОЛ и стимулируя ферменты АОС в плазме крови и эритроцитах кро-

ликов при длительной иммобилизации.

Вамин уступает димефосфону и мексидолу по антиоксидантной активности в плазме крови, но сопоставим по антиоксидантному эффекту в эритроцитах. Вамин предупреждает потребление антитромбина III и повышает антитромбогенный потенциал крови у кроликов при длительном иммобилизационном стрессе.

Практическая ценность работы.

Эффективность мексидола, димефосфона и вамина в предупреждении развития нарушений гемостаза позволяет наметить пути оптимизации ан-титромботической терапии в клинике. Полученные данные о противотром-ботическом действии препаратов расширяет представления о механизме фармакологического действия мексидола, димефосфона и вамина.

Положения, выносимые на защиту:

1. Длительный иммобилизационный стресс активирует свертывание крови и стимулирует перекисное окисление липидов в плазме крови, эритроцитах, миокарде, головном мозге и печени кроликов.

2. Димефосфон предупреждает развитие гиперкоагулемии и активацию процессов ПОЛ.

3. Мексидол ограничивает активацию ПОЛ в плазме крови и эритроцитах, предупреждает развитие гиперкоагулемии и повышает антитромбогенный потенциал крови.

4. Вамин, ограничивая ПОЛ в плазме крови и эритроцитах, проявляет антитромбогенный эффект, сохраняя высокий уровень антитромбина III в крови.

Апробация работы. Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на III Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1996 г.), на Конгрессе по иммунореаби-литации (1996 г.), Республиканской научно-практической конференции (Саранск, 1996 г.), III Конференции молодых ученых (Саранск, 1998), международной конференции «Атеротромбоз - проблема современности» (Москва, 1999).

Публикации.

По результатам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов и указателя литературы.

Текст расположен на 169 страницах машинописи, иллюстрирован 12 рисунками и 20 таблицами. Список использованной литературы включает 294 источников, из них 187 отечественных и 107 - иностранных.

Заказ 3365

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 65 кроликах - самцах породы «шиншилла» массой 2-3 кг. Иммобилизационный стресс воспроизводили, помещая животных на 30 суток в клетку малого объема, ограничивающую перемещение животного, но не затрудняющего доступ к воде и пище (Тявокин В.В., 1975). Проведено 4 серии опытов. В 1-й серии на 16 кроликах изучали влияние 30 суточной иммобилизации на гемостаз и ПОЛ в крови и тканях печени, сердца и головного мозга. Во 2-й серии (18 кроликов) кроликам в условиях иммобилизации в краевую вену уха вводили димефосфон 50 мг/кг ежедневно. В 3-й серии (16 кроликов) кроликам внутривенно вводили 2-этил-6-метил-3-оксипиридина сукцинат (мексидол, 1 мг/кг) ежедневно в течение 30 суток иммобилизации. В 4-й серии (15 кроликов) в/в вводили вамин (Швеция «Pharmacia») из расчета 5 мл/кг ежедневно в течение 30 суток.

Кровь для исследования гемостаза забирали из краевой вены уха кролика в силиконированные и несиликонированные пробирки, стабилизируя 3,8% раствором цитрата натрия и эксилон-аминокапроновым цитратным раствором в соотношении 1:10.

Оценку гемостаза проводили по следующим тестам:

1. Определение времени свертывания несгабилизированной крови по Lee и White (1913).

2. Определение времени рекальцификации плазмы по Bergerhof и Roka (1954).

3. Определение толерантности плазмы к гепарину по Sigg в модификации В.П.Балуда (1954).

4. Определение силиконового времени плазмы по Beller и Graeff.

5. Определение каолинового времени по Hattersley P.G.J. (1966).

6. Определение индекса диапазона на контактной активации по Г.Ф.Еремину с соавт. (1974).

7. Оценку второй фазы свертывания крови проводили по определению времени потребления протромбина по Quck A.J. (1966).

8. Оценку третьей фазы свертывания крови проводили по определению тромбинового времени свертывания по Biggs и Macfarlane (1962).

- определение фибриногена проводили по методу Рутберг P.A. (1961)

- антитромбин III по Hensen Loeligep (модификация K.M. Бишевско-го, 1963).

9. Определение фибриногена Б проводили по Gummine и Lyons (1948).

10. Оценку фибрин-мономерных комплексов проводили протамин-сульфатным тестом по Lipinski (1971).

11. Фибринолитическую активность оценивали по времени естествен-

ного лизиса "фибринового сгустка по М.А. Котовщиковой и Б.И. Кузнику (1962).

После окончания эксперимента животных забивали, введя в/в летальную дозу этаминала натрия (100 мг/кг).

Содержание МДА в плазме, эритроцитах и гомогенатах тканей (миокард, головной мозг, печень) определяли по реакции с тиобарбитуро-вой кислотой (ТБК) по методу Владимирова Ю.А., Арчакова А.И. (1972), Конюховой С.Г. с соавт. (1983). Активность каталазы в плазме крови, эритроцитах и гомогенатах тканей оценивали по методу Королюк М.А. с соавт. (1988). Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли по методу Чевари С., Чаба Н., Секей (1985), глутатионпероксидазы (ГП) - по методу Гавриловой А.Р., Хмара Н.Ф. (1986).

Статистическая обработка результатов исследования проведена с помощью t - критерия Стьюдента (Закс JL, 1976) при 5% уровне значимости на персональном компьютере IBM PC/AT 386 SX.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Значительное уменьшение объема двигательной активности играет существенную роль в инициировании тромбоэмболических осложнений.

Как показали наши исследования, длительный иммобилизационный стресс сопровождается нарушениями гемостаза, прогрессивно нарастающими к 30 суткам опыта. Об активизации I фазы свертывания крови и развивающейся гиперкоагулемии свидетельствуют ускорение времени свертывания крови на 13,9% и 23,3%, времени рекальцификации плазмы на 35,5% и 27,3%, повышение толерантности плазмы к гепарину на 27% и 25,9% к 14 и 30 суткам опыта соответственно (рис. 1).

Исследования времени свертывания плазмы в условиях пониженного и повышенного контакта (силиконовое и коалиновое время плазмы) свидетельствует о том, что активизация гемостаза происходит, в основном, за счет ускорения времени фазы контактной активации. Так, силиконовое время плазмы сокращается на 32,1% и 42,5% к 14 и 30 суткам соответственно. В то время как коалиновое время плазмы практически не изменилось.

Сокращение силиконового времени плазмы привело к снижению индекса диапазона контактной активации (ИДКА) на 15,1 и 34,5% к 14-м и 30-м суткам иммобилизации. Данный индекс позволяет получить представление об интенсивности включения контактной фазы свертывания крови, о тромбопла-сгинемии и тромбинемии. Уменьшение индекса характеризует предтромботи-ческое состояние или гиперкоагуляционную фазу ДВС-синдрома (Иванов Е.П., 1983; Балуда Б.П. с соавт., 1980).

%

1 - фибриноген Б

2 - время рекальцификации плазмы

3 - силиконовое время плазмы

4 - каолиновое врямя плазмы

5 - время свертывания крови по Ли и Уайту

6 - антитромбин III

7 - фибринолиз

t=t

U

ы

(_ о

и k

о о

£ о т»-

О

гО

Рис. I. Динамика показателей гемостаза при иммобилизации (в % к исходным данным)

Причиной усиления фазы контактной активации при гиподинамии могут быть изменения свойств эндотелия сосудистой стенки, где наблюдается отек, набухание, слугцивание эндотелия, образование язв, бляшек (Тявокин В.В., 1975; Инчина В.И., 1974).

Развитие гиперкоагулемии протекает на фоне резкого снижения -почти в 5 раз, уровня антитромбина III, к 30 суткам опыта.

Известно, что антитромбин III является сильным ингибитором тромбина, а также некоторых других протеаз, включая активные формы факторов X, IX, XI и XII свертывающей системы крови (Баркаган З.С., 1988, 1989; Мачабели М.С., 1986-1995). Антитромбин III, взаимодействуя с активными центрами тромбина и других ферментов свертывающей системы крови, тормозит тромбообразование.

Гепарин, взаимодействуя с молекулой антитромбина III, вызывает конформационные изменения, которые позволяют ферменту быстрее соединиться с активными центрами факторов свертывающей системы крови, особенно тромбина и активной формы фактора Х/Ха (Момот А.П. с соавт., 1995; Балуда М.В., Деянов И.И., 1996; Hirsh J„ Fuster V., 1994). Резкое снижение антитромбина III при длительном иммобилизационном стрессе обусловлено его потреблением на инактивацию активных про-коагулянтов, что создает риск для тромбообразования.

Об активации внутрисосудистого свертывания в условиях иммоби-лизационного стресса свидетельствует и рост продуктов деградации фибриногена и фибрина.

Содержание фибрин-мономеров и их комплексов с фибринпепти-дами А и В возрастает на 146% к 14 и 120% к 30 суткам опыта. Резко возрастает содержание в плазме неполимеризующихся (заблокированных) фибрин-мономерных комплексов (в 6,42 и 8,2 раза к 14 и 30 суткам опыта соответственно). Появление и нарастание продуктов паракоагуляции свидетельствует о развитии ДВС-синдрома при длительном иммобилизационном стрессе. Угроза тромбообразования усиливается при снижении фибринолитической активности крови почти вдвое к 30-м суткам опыта.

Одним из значимых механизмов активации гемостаза при иммобилизационном стрессе является усиление ПОЛ в плазме крови, эритроцитах, в миокарде, головном мозге и печени кроликов (рис. 2).

Содержание конечного продукта ПОЛ - МДА - в плазме возрастает на 123,7% к 30 суткам опыта, в эритроцитах - на 133%. Существенно увеличивается содержание МДА в печени (на 402,8%), в миокарде (на 228,9%), в головном мозге (на 107,5%).

плазма эритроциты миокард головной мозг исход

Рис. 2. Динамика МДА при иммобилизации (в % к исходным данным)

Активация процессов липопероксидации при иммобилизационном стрессе протекает на фоне депрессии активности ферментов антиоксидант-ной системы (АОС). Активность каталазы в плазме снижается на 50%, в эритроцитах - на 39%. Активность СОД уменьшается вдвое в миокарде, печени и головном мозге. На 30% снижается активность ГП в миокарде, печени, на 15% - в головном мозге кроликов к 30 суткам опыта. Не отмечено и нарастание каталазной активности в изученных тканях.

Причиной повышения прооксидантной активности в тканях при иммобилизационном стрессе являются активация симпатоадреналовой системы, гипоксия, ишемия органов.

Нарастание свободнорадикальных процессов свидетельствует о деструкции клеточных мембран, повышает проницаемость, приводит к выходу продуктов активации ПОЛ в кровоток, отражением чего является рост МДА в плазме крови как результат генерализации процессов липопероксидации.

Тканевой тромбопластин, являясь по своей структуре фосфолипидом, как фрагмент клеточных мембран (Зубаиров Д.М. с соавт., 1982-1983; Бы-шевский А.Ш., Зубаиров Д.М., Терсенов О.А., 1993) подвержен при активации ПОЛ окислительной модификации (Байкеев Р.Ф., 1994, 1997; Балуда В.П., Балуда М.В., 1997; Oosting J.D. et al., 1992; Dei Papa N. et al., 1995; Hasselaar P. et al., 1989; Komberg A. et a!., 1994), что усиливает его прокоа-гулянтную активность (Зубаиров Д.М., 1997; Соловьев В.Г., 1997).

Учитывая тот факт, что стимуляция свертывания крови тканевым тром-бопластином в большинстве случаев является доминирующей (Бышеский А.Ш. соавт., 1990; 1993; Скипетров В.П., 1997; Мачабели М.С., 1986-1995), то предотвращение как поступления его в кровоток так и окислительной модификации позволило бы ограничить активацию гемостаза при различных патологических состояниях. Для реализации этого предположения были проведены экспериментальные исследования с использованием препаратов антиок-сидантного типа действия при длительной иммобилизации.

Как показали наши исследования, димефосфон ограничивает процессы ПОЛ в тканях головного мозга и сердца кроликов при 30 суточном иммобилизационном стрессе на 44% и 54% соответственно. Препарат активирует ферменты АОС в ткани головного мозга и миокарда кроликов. Для димефосфона характерна выраженная стимуляция активности СОД в гомо-генатах головного мозга, уровень которой возрастает на 120% по сравнению с данными серии сравнения (без препарата). Стимуляция СОД в миокарде менее выражена, тем не менее ее активность превышает данные серии сравнения на 45%. Активность глутатионпероксидазы повышается наиболее значимо под влиянием димефосфона в миокарде (на 68,8%) нежели в

по-

головном мозге. Достоверные различия в росте активности каталазы выявлены лишь в миокарде.

Одним из механизмов антирадикального эффекта димефосфона является снижение активности фосфолипазы Аг в тканях (Тарасова Т.В., 1998), стимуляция ферментов антиоксидантной системы (Зиганшина Л.Е., 1992; Зиганшин А.У. с соавт., 1992; Хафизьянова Р.Х., 1993), снижение внутриклеточного содержания Са++ (Цибулькин А.П., Минуллина И.Р., Цибуль-кина В.Н., 1998). Нормализующее действие на ПОЛ опосредовано стимуляцией АОС, ведущим компонентом которой является глутатионовый буфер клетки. По-видимому, димефосфон способствует интенсивному переходу восстановленной формы глутатиона в окисленную, что реализует его защитное действие при липидной пероксндации (Зиганшина Л.Е., Зиганшин А.У. и др., 1992).

Димефосфон предотвращает развитие нарушений липидного спектра мембранных структур, вызванных острой ишемией. При этом увеличивается доля фосфолипидов, фосфатидилинозита и фосфатидилхолина и уменьшалось образование мезоформ фосфолипидов в толстой кишке при острой ишемии (Власова В.П., 1997; Власов А.П. с соавт., 1997). Следовательно, димефосфон оказывает модифицирующее действие на липидный профиль мембранных структур, к каковым относится тканевый тромбопласгин, предотвращая его окислительную модификацию, поступление в кровоток и активизацию гемокоагуляции. Поскольку активация ПОЛ в крови отражает повышение процессов липопероксидации в тканях (т.е. это рассматривается как генерализация процесса, обусловленная поступлением продуктов ПОЛ из тканей в кровь), то снижение ТБК - реагирующих продуктов в исследуемых тканях под влиянием димефосфона привело к уменьшению ок-сидантного потенциала крови. Содержание МДА снизилось в плазме и эритроцитах на 55% по сравнению с серией сравнения (без препарата) и в плазме практически не отличалась от уровня контроля. Препарат повышал активность СОД и каталазы в эритроцитах на 54,5 и 19,7% соответственно.

Следовательно, ингибирование процессов ПОЛ в тканях привело к нормализации оксидантного потенциала крови. Ограничение процессов ПОЛ в тканях, плазме и эритроцитах под воздействием димефосфона предупреждало развитие гемокоагуляционных нарушений при длительной иммобилизации, о чем свидетельствовало удлинение на 32% времени свертывания крови. Антитромбогенное действие димефосфона в большей степени обусловлено ингибированием фазы контактной активации, о чем свидетельствует удлинение времени рекальцификации плазмы в условиях низкого контакта. Препарат удлинял силиконовое время плазмы на 65%, что не отличалось от данных интактных кроликов (рис. 3).

о/

/о

3 - силиконовое время плазмы 7 . фибринолиз ^

4 - каолиновое врямя плазмы

Рис. 3. Влияние димефосфона на динамику показателей гемостаза при иммобилизации (в % к исходным данным) /

Интересно отметить, что время свертывания плазмы в условиях максимального контакта (коалиновое время) было на 31% меньше, чем у подопытных кроликов, что свидетельствует о сохранении высокого уровня плазменных факторов, что, вероятно обусловлено их меньшим потреблением в процессе свертывания. Препарат увеличивает индекс диапазона контактной активации с 43,7±5% до 72±1,3% (Р<0,001), что, возможно, обусловлено высокой активностью антикоагулянтов. Исследование антитромбина III, основного естественного антикоагулянта крови показала, что ди-мефосфон увеличивает антитромбиновую активность крови с 9,9±3,1% в серии без препарата до 89,5+ 9,9% (Р<0,001).

Димефосфон предупреждает появление неполимеризующихся (заблокированных) фибрин-мономерных комплексов, снижая показатели про-тамин-сульфатного теста в 7,6 раза (с 2,3±0,1 до 0,3±0,08 усл.ед.). Позитивный эффект димефосфона проявляется и в стимуляции фибринолитической активности крови (рис. 3), которая возрастает на 80% по сравнению с серией сравнения (без препарата).

Таким образом, внутривенное введение димефосфона в дозе 50 мг/кг кроликам, подвергнутым воздействию иммобилизационного стресса, достоверно ограничивает не только процессы липопероксидации в тканях и крови, но и предупреждает развитие выраженных нарушений гемостаза, увеличивая концентрацию естественного антикоакулянта антитромбина III, возможно, за счет снижения потребления и инактивации в комплексах с прокоагулянтами, ограничивает внутрисосудистое свертывание крови, снижая содержание фибрин-мономерных комплексов и стимулируя фибри-нолиз.

Обнаруженный противотромбогенный эффект димефосфона на модели иммобилизационного стресса во многом обусловлен способностью препарата подавлять кальцийзависимые процессы клеточной активации в мембранах и в клетках (Цибулькин А.П., Цибулькина В.Н., 1997).

В следующей серии опытов нами было изучено влияние мексидола (сукцинат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина) на ПОЛ и гемостаз. Выбор данного препарата обусловлен широким спектром его фармакологического действия. Препарат обладает выраженными антиоксидантными и ангио-протекторными свойствами, повышает активность антиоксидантных ферментов, проявляет липидрегулирующие свойства, повышая содержание полярных фракций липидов - фосфатидилсерина и фосфатидилинозина, снижает соотношение холесгерин-фосфолипиды (Смирнов Л.Д., Дюмаев K.M., 1992; Гацура В.В. с соавт., 1996).

Наши исследования показали, что антиоксидантный эффект мексидола в плазме не уступает, а в эритроцитах превосходит димефосфон. Кон-

центрация МДА в эритроцитах при введении мексидола снижается в 3,7 раза. В отличие от димефосфона, мексидол резко повышает активность глутатионпероксидазы в плазме и эритроцитах (на 103 и 192% соответственно).

Препарат предупреждает снижение СОД и церулоплазмина в крови, повышает уровень восстановленного глутатиона в печени. Мексидол оказывает стабилизирующее действие на плазматические мембраны, снижает содержание триглицеридов, неэстерифицированных жирных кислот (Смирнов Л.Д. с соавт., 1992, 1995). Применение мексидола оказывает модифицирующее влияние на липидный состав мембран, увеличивая в них содержание фосфатидилсерина и фосфатидилинозита (Дюмаев K.M., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д., 1995). В плазматических мембранах мексидол уменьшает их вязкость, изменяя микроокружение рецепторов, изменяя их аффинитет.

Мексидол существенно изменяет фосфолипидный состав мембран митохондрий печени и синаптосам головного мозга мышей. Под влиянием этого препарата увеличивается содержание фосфатидилсерина, фосфатидилинозита и сфингогомиелина, повышается соотношение липид-белок в мембранах митохондрий (Дюмаев K.M., Т.А.Воронина, Смирнов Л.Д., 1995).

Модификация липидного состава мембран является одной из причин проявления противотромбогенных свойств мексидола при длительном им-мобилизационном стрессе у кроликов (рис. 4).

Мексидол нормализует время свертывания крови, укороченное к 30 суткам эксперимента, удлиняет силиконовое время плазмы, приближая его к исходным цифрам, что свидетельствует об уменьшении содержания про-коагулянтов и увеличении антикоагулянтов в крови. О снижении в крови соединений с прокоагулянтными свойствами свидетельствует и сохраняющиеся на исходном уровне показатели индекса диапазона контактной активации (ИДКА). По сравнению с серией без препарата, ИДКА возрастает на 40%. Полученные данные указывают о нормализации соотношений между про- и антикоагулянтами и стабилизация процессов гемокоагуляции за счет возникающего баланса. Наши исследования показали, что мексидол в 8 раз повышает уровень основного антикоагулянта антитромбина III (с 9,9% до 83,8%). При этом изучаемый показатель на 34% превышает данные ин-тактных кроликов, что, возможно, обусловлено не только предупреждением его потребления, но и индукцией синтеза в ответ на развивающуюся активацию гемостаза. Мексидол ограничивают не только потребление антитромбина III, но и фибриногена, так как его концентрация в плазме крови увеличивается на 37% по сравнению с серией без коррекции.

%

1 - время свертывания крови по Ли и Уайту

2 - время рекальцификации плазмы

3 - силиконовое время плазмы

4 - каолиновое врямя плазмы

5 - антитромбин III

6 - фибриноген Б

7 - фибринолиз

—р

и

о «

X О

и Н

2 >.

+ и

О

£

о

о

Г1

Рис. 4. Влияние мексидола на динамику показателей гемостаза при иммобилизации (в % к исходным данным)

Мексидол, как и димефосфон, ограничивает развитие диссеминиро-ванного внутрисосудистого свертывания крови, о чем свидетельствуют более низкие показатели фибриногена Б и протамин-сульфатного теста. Препарат на 81% снижает показатели протамин-сульфатного теста. Мексидол, в отличие от димефосфона, не стимулирует фибринолиз.

Таким образом, наши исследования показали, что мексидол проявляет противотромбогенную активность при длительном иммобилизационном стрессе у кроликов, реализация которой во многом обусловлена антиокси-дантными свойствами препарата. Мексидол в значительной степени ограничивает развитие внутрисосудистое свертывания крови, увеличивает ан-тикоагулянтный потенциал, снижает потребление фибриногена, ограничивает рост продуктов паракоагуляции.

К механизмам, реализующим антитромбогенный эффект мексидола, относятся не только его антиоксидантные свойства и способность модифицировать липидный состав мембран, то есть тканевого тромбопластина, но и его антиагрегатный эффект, обусловленный ингбированием синтеза тромбоксана Аг, повышением синтеза простациклина (Смирнов Л.Д., Дю-маев K.M., 1992). Препарат ингибирует полимеризацию фибрина, тормозит переход фибрин-мономера в фибрин-полимер (Дюмаев K.M. с соавт., 1995). Наличие у мексидола и эмоксипина антитромбогенных и антиоксидантных свойств обеспечивает его кардиопротекторный эффект при острой ишемии миокарда, церебропротекторное действие при остром нарушении церебрального кровообращения (Спасенников Б.А., 1992; Репин А.Н. с соавт., 1992; Полумисков В.Ю., 1992; Гацура В.В. с соавт., 1996).

Существенным фактором в реализации цитопротекторного действия мексидола является его способность стимулировать эндогенное дыхание митохондрии, увеличивать степень восстановленное™ дыхательных переносчиков (пиридиннуклеотидов и флавопротеидов). Считается, что действие мексидола на параметры окислительного метаболизма связана в основном, с наличием в его формуле янтарной кислоты (Дюмаев K.M., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д., 1995).

Учитывая ведущую роль состояния эндотелия сосудистой стенки в инициировании активации гемостаза, представляет интерес исследование влияния на гемокоагуляцию соединений метаболического типа действия, осуществляющих «подкормку» эндотелия, тем более, что при длительном иммобилизационном стрессе наблюдается преобладание процессов распада белковых структур над их синтезом (Тявокин В.В., 1978; Инчина В.И., Зорькина A.B., 1997).

Вамин проявляет антиоксидантную активность, ограничивая рост МДА как в плазме, так и, в большей степени, в эритроцитах. Если по вы-

раженности ингибирования процессов ПОЛ в плазме вамин уступает и мек-сидолу и димефосфону, снижая уровень МДА лишь на 20%, .то в эритроцитах его антиоксидантный эффект сопоставим с изученными препаратами. Вамин стимулирует активность глутатионпероксидазы в плазме крови, повышая ее значение на 44%, превосходя действие димефосфона, но уступая эффекту мексидола. Препарат, в отличие от димефосфона, не повышает активность СОД в эритроцитах.

Учитывая наличие у препарата антиоксидантного эффекта, и учитывая тесную взаимосвязь между активацией ПОЛ и стимуляцией гемостаза, было сделано предположение о возможности проявления антитромбоген-ных свойств у вамина при длительном иммобилизационном стрессе.

Показано, что применение вамина не устраняет активации гемокоа-гуляции, о чем свидетельствует и укорочение времени свертывания крови на 30% по сравнению к исходными данными. Динамика показателей, характеризующих 1-ю фазу свертывания крови (время рекальцификации плазмы, каолиновое, силиконовое время, ИДКА) имеет тенденцию к нормализации, но остается выше исходных данных, что свидетельствует о сохраняющейся гиперкоагулемии. Тем не менее, вамин ограничивает развитие внутрисосудистого свертывания крови за счет высокого уровня антитромбина III, содержание которого возрастает с 9,9±3% до 68,1±9,9% на фоне вамина (Р<0,001, рис. 5).

Подобный эффект вамина, вероятно, обусловлен снижением его потребления для инактивации активных прокоагулянтов, либо увеличением его синтеза в ответ на развивающуюся гиперкоагулемию. О снижении потребления фибриногена в процессе свертывания крови свидетельствуют и сохраняющиеся высокие показатели фибриногена к 30 суткам иммобилизации: на фоне введения вамина содержание фибриногена в плазме крови на 31,7% превышает показатели серии без препарата.

Динамика паракоагуляционных тестов подтверждает предположение о том, что вамин ограничивает развитие внутрисосудистой коагуляции, о чем свидетельствует снижение уровня фибриногена Б на 39% и значение протаминсульфатноготестас2,3±0,1 до 0,42±0,08 усл.ед. (Р<0,05). Вамин не устраняет депрессии фибринолиза, вызванной воздействием иммобилизации.

Таким образом, применение вамина не устраняют активацию гемо-коагуляции в условиях иммобилизации, но предупреждает развитие диссе-минированного внутрисосудистого свертывания за счет повышения уровня естественного антикоагулянта - антитромбина III.

%

Рис. 5. Влияние вамина на динамику показателей гемостаза при иммобилизации (в % к исходным данным)

Антиоксидантный и противотромбогенный эффекты вамина при длительном иммобилизационном стрессе у кроликов в определенной мере обусловлены наличием в его составе целого ряда аминокислот - глицина, глу-таминовой кислоты, аспарагиновой, гистидина, которые проявляют энер-гообеспечивающие эффекты при острой гипоксии. Отмечено, что глютами-новая кислота обладает антиишемическими и антиоксидантными свойствами (Маквелов Л., 1994). По данным Горчаковой H.A. (1990), распад глю-таминовой кислоты прямо связан с образованием альфа-кетоглутарата и щавелевоуксусной кислоты, что усиливает анаэробное образование АТФ и ГТФ в цикле тргасарбоновых кислот.

Гацура В.В. (1993) при использовании глутаминовой кислоты наблюдал более выраженную сопряженность процессов окисления и фосфорилирования при воспроизведении острой коронарной недостаточности. По мнению автора, потенциально наиболее активными энергообеспечивающими соединениями из аминокислот в условиях ишемии являются глутамат, аспартат, аспара-гинат, гистидин, глутамат, которые не требуют для своего превращения в субстраты цикла Кребса АТФ и окисленных форм ферментов.

Выявлено выраженное противогипоксическое действие глицина в остром периоде ишемического инсульта и инфаркта миокарда. По мнению Кор-нееева A.A. и Комиссаровой И.А. (1996), глицин проявляет свойства антиги-поксанта, который уменьшает степень пшоксического повреждения дыхательной цепи.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что препараты с антиоксидантным типом действия проявляют выраженный про-тивотромбогенный эффект при длительном иммобилизационном стрессе. Применение димефосфона, мексидола и вамина, ограничивая процессы пере-кисного окисления липидов в тканях, предупреждает выход прооксидантных соединений в кровоток и устраняет генерализацию процессов ПОЛ, что, в свою очередь, уменьшает степень повреждения других органов. Препараты, уменьшая активность процессов липопероксидации в тканях, предупреждают окислительную модификацию тканевого тромбопластина, выход его в сосудистое русло и активацию гемостаза, предотвращая развитие диссеминирован-ного внутрисосудистого свертывания. Димефосфон, мексидол и вамин в равной степени сохраняют высокий уровень антитромбина III в крови, предупреждая его потребление на инактивацию прокоагулянтов.

Следовательно, димефосфон, мексидол и вамин являются перспективными средствами для профилактики тромбозов при длительных стрессовых воздействиях.

ВЫВОДЫ

1. Длительный иммобилизационный стресс вызывает развитие гипер-коагулемии, снижение антикоагулянтной и фибринолитической активности крови. Нарушения гемостаза развиваются на фоне активации перекисного окисления липидов (ПОЛ) и депрессии антиоксидантной системы в плазме крови, эритроцитах, миокарде, головном мозге и печени кроликов.

2. Димефосфон в дозе 50 мг/кг предупреждает гиперкоагулемию, повышает антикоагулянтный и фибринолитический потенциал крови при иммобилизационном стрессе. Димефосфон ограничивает активацию перекисного окисления липидов в плазме крови, эритроцитах, миокарде и головном мозге и повышает активность ферментов антиоксидантной системы в плазме крови, в миокарде и головном мозге кроликов при длительной иммобилизации.

3. Мексидол в дозе 1 мг/кг предотвращает развитие патологических изменений в системе гемостаза, повышает антикоагулянтную активность крови и не влияет на фибринолитическую активность крови при длительном иммобилизационном стрессе. Мексидол предупреждает активацию ПОЛ в плазме крови, эритроцитах и повышает активность глутатионпе-роксидазы в плазме и эритроцитах кроликов в эксперименте.

4. Вамин не устраняет гиперкоагуляцию и депрессию фибринолиза в эксперименте, но повышает уровень антитромбина III в плазме кроликов. Вамин уступает димефосфону и мексидолу по антиоксидантной активности в плазме крови, но сопоставим в эритроцитах. Препарат повышает активность каталазы в эритроцитах и глутатионпероксидазы в плазме кроликов при длительной иммобилизации.

5. Антитромбогенные свойства на модели длительного иммобилиза-ционного стресса наиболее выражены у димефосфона и мексидола. Одним из наиболее значимых механизмов торможения гиперкоагуляции является способность препаратов предотвращать потребление антитромбина III. Димефосфон, в отличие от мексидола и вамина, стимулирует фибринолиз.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

С целью профилактики и коррекции нарушений гемостаза при длительной иммобилизации, а также при различных патологических состояниях, сопровождающихся активацией перекисного окисления липидов, рекомендовано применение лекарственных препаратов, проявляющих антиок-сидантную активность. При этом наиболее эффективно корригируют процессы липопероксидации и нарушения гемостаза димефосфон и мексидол.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зорькина A.B., Сернов Л.Н., Горшкова Е.В., Винтин H.A., Соколова

B.В., Родькина Ю.Г. Влияние эмоксипина на перекисное окисление липидов при пролонгированном иммобилизационном стрессе И III Росс. нац. конгр. «Человек и лекарство». - Тез. докл.- Москва. - 1996. - С.265.

2. Инчина В.И., Зорькина A.B., Винтин H.A., Горшкова Е.В., Подсеват-кин В.Г. Защитный эффект мексвдола при хроническом стрессе // III Росс. нац. конгр. «Человек и лекарство». - Тез. докл. - Москва. -1996. - С.266.

3. Инчина В.И., Винтин H.A., Зорькина A.B., Сернов Л.Н., Костин Я.В. Фармакологическая реабилитация в условиях пролонгированного иммобили-зационного стресса // International journal on immunorehabilitation. May 1996. -№2. - P.90.

4. Винтин H.A., Зорькина A.B. Влияние вамина на перекисное окисление липидов и гемостаз при длительной иммобилизации // Актуальные вопросы камбустиологии, реаниматологии и экстремальной медицины. - Тез. докл. республ. научно-практич. конф. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та. - 1996. -

C.252.

5. Пиксин И.Н., Винтин H.A., Аверина A.B., Давыдкин В.И., Карпуш-кина П.И. Квантовая гемотерапия в хирургии // III конф. молодых ученых МГУ им.Н.П.Огарева. Саранск, 22-24 апр. 1998. - Тез .докл. Часть II. - Саранск, 1998.-С.181.

6. Келейникова Т.Т., Винтин H.A. Гепатопротекторный эффект вамина при длительном иммобилизационном стрессе // III конф. молодых ученых МГУ им. Н.П.Огарева. Саранск, 22-24 апр. 1998. - Тез .докл. Часть II. - Саранск, 1998. - С. 166.

7. Кудашкин С.С., Зорькина A.B., Винтин H.A., Кильдюшева Л.Н. Влияние эмоксипина и вамина на некоторые показатели гемостаза при длительном ограничении подвижности // Атеротромбоз - проблема современности. Сб. материал, международной конф. М., 1999. - С.64-66.

ВИНТИН НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

АВТОРЕФЕРАТ

Лицензия ЛР № 040790 от 29 января 1997 года Подписано к печати 26.05.99. Формат 60x84 '/16- Бумага офс. № 1. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,16. Уч.-изд. л. 1,19. Тираж 100 экз. Заказ № 3437.

Отпечатано в ГП республиканской типографии «Красный Октябрь» 430000, г. Саранск, ул. Советская, 55а