Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Значение рецептора интерлейкина-6 на опухолевых клетках множественной миеломы

На правах рукописи

Костюкова Мария Николаевна

ЗНАЧЕНИЕ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-6 НА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЫ

14.01.12 — онкология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва —2014

005553180

Работа выполнена в Федеральном государственном биджстном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук

Директор — академик РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Тупицьш Николай Николаевич Османов Евгений Александрович

Официальные оппоненты: Пинегин Борис Владимирович

Спиридонова Вера Алексеевна

Доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «ГНЦ институт иммунологии» ФМБА России,

заведующий отделом иммунодиагностики и иммуноюррекции

Доктор биологических наук, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова, старший научный сотрудник отдела хромаго графического анализа

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава РФ

Защита диссертации состоится «_» _

» _ 2014 г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета Д001.017.02 ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН. Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

Автореферат разослан «_»_

2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Барсуков Юрий Андреевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Воздействие цитокшюв на пролиферацию и дифференцировку клеток костного мозга является мощным фактором гемопоэза и играет центральную роль в опухолевой прогрессии. Так, для многих В-клеточных неоплазий показано резкое повышение уровня основного фактора дифференцировки В-клеток ингерлейкина-б (1Ь-6). При этом клетки определенных типов опухолей требуют для пролиферации наличия высокой концентрации экзогенного 1Ь-6, то есть являются 1Ь-6-зависимыми. К таким опухолям относится множественная миелома. Показано, что при множественной миеломе передача сигнала с участием 1Ь-б является центральным механизмом опухолевой прогрессии. Выработка 1Ь-б при множественной миеломе поддерживается как функционированием аутокринной петли на опухолевых плазматических клетках, так и стромальным микроокружением костного мозга.

Действие 1Ь-6 на клетки опосредуется образованием рецепторного комплекса с участием трансмембранных молекул - лиганд-связывакяцей молекулы ГЬ-бЯа (СБ 126, gp80, а-цепь) и трансдуцерной молекулы £р130 (СЭПО, р-цепь), которые образуют рецептор интерлейкина-6. Исследовательскими группами получены несколько десятков моноклональных антител к внеклеточным доменам ГЬ-бЯа и £р130 и описаны функциональные свойства соответствующих им специфических эпитопов. Методология использования широкого спектра моноклональных антител послужила мощным инструментом для изучения структуры рецептора и передачи им сигнала в живых клетках. Несмотря на это, данные об экспрессии 1Ь-6Яа и зр!30 на мембране клеток множественной миеломы, а также об особенностях регуляции опухолевого роста рецептором интерлейкина-6, остаются малочисленными. Основную сложность в получении этих сведений составляют гетерогенность и широкий диапазон уровня экспрессии рецептора интерлейкина-6 на различных экспериментальных клеточных линиях множественной миеломы, а также на опухолевых клетках больных множественной миеломой. Существенно различаются по уровню экспрессии рецептора интерлейкина-6 также опухолевые клетки, присутствующие в одном образце костного мозга больного. Кроме того, уровень экспрессии молекул рецептора интерлейкина-6 во многих случаях очень низкий. Таким образом, несмотря на непосредственное участие рецептора интерлейкина-6 в передаче пролиферативного и антиапопготического сигналов опухолевыми клетками множественной миеломы, на настоящий момент не было проведено значимых систематических исследований взаимосвязи рецептора интерлейкина-6 с аберрантными характеристиками плазматических клеток.

Комплексное исследование значения рецептора интерлейкина-6 на мембране опухолевых клеток при множественной миеломе, а также оценка взаимосвязей клинических проявлений этого заболевания с экспрессией рецептора интерлейкина-6 представляют на сегодняшний день актуальное направление как в клиническом, так и в молекулярно-биологическом аспектах, и ведут к более глубокому пониманию факторов опухолевой прогрессии множественной миеломы.

Цель исследования

Изучить значение рецептора интерлейкина-6 на опухолевых клетках множественной миеломы.

Задачи исследования

1. Изучить с помощью моноклональных антител активационные состояния цепей рецептора интерлейкина-6 gpl30 и 1Ь-6Яа.

2. Дать количественную оценку компонентам рецепторного комплекса на клетках модельных миеломных культур.

3. Описать влияние 1Ь-6 на компоненты рецепторного комплекса др130 и 1Ь-6Яа на экспериментальных моделях, а также на опухолевых клетках больных множественной миеломой.

4. Определить частоту и уровни экспрессии рецептора интерлейкина-6 на опухолевых клетках больных множественной миеломой.

5. Охарактеризовать взаимосвязь экспрессии рецептора интерлейкина-6 с аберрантным иммунофенотипом плазматических клеток.

6. Исследовать взаимосвязь наличия ДНК вируса ННУ-8 в клетках костного мозга больных и экспрессии рецептора интерлейкина-6 на опухолевых плазматических клетках.

Научная новизна

Впервые подробно описан на клеточных линиях множественной миеломы, а также воспроизведен на клетках костного мозга больных множественной миеломой селективный механизм обратимого подавления ингерлейкином-6 экспрессии его рецептора Этот механизм проясняет способ функционирования 1Ь-б на опухолевых клетках в качестве фактора роста.

Впервые изучены уровень и характер экспрессии 1Ь-6Яа на клетках больных множественной миеломой во взаимосвязи с иммунологическими и морфологическими

4

характеристиками опухолевого субстрата; выявлены новые закономерности на уровне клинической картины и иммунофенотипа. Показано, что уровень экспрессии СБ 126 коррелирует с количеством проплазмоцитов в составе опухоли, ассоциирован с выраженностью плазмоцитоза, и не коррелирует с аберрантной экспрессией СЭ45 и С056.

Впервые дифференцированно рассмотрены особенности экспрессии рецептора 1Ь-б на клетках с наличием и отсутствием на мембране специфического плазмоклегочного антигена С0138 (синдекана-1). Показано существенное различие уровней С0126 на этих двух субпопуляциях опухолевых клеток. Экспрессия СБ126 на клетках СБ138+ более интенсивная; наличие СШ26 на этих клетках взаимосвязано с увеличением количества клеток СР45" и СБ56+. Уровень С0126 на клетках С0138" коррелирует с аберрантной экспрессией СБ19.

Показано, что инфицированность вирусом герпеса человека 8 типа связана с усилением экспрессии СБ 126 на мембране опухолевых плазматических клеток.

Научно-практическая значимость работы

Основную научно-практическую значимость настоящей работы составляют 4 аспекта.

1) Методологический: представлен комплексный способ оценки слабой экспрессии рецептора 1Ь-б на мембране, применимый в анализе клинических данных, а также в исследованиях других слабо экспрессированных молекул. На линиях множественной миеломы показана возможность иммунологического разграничения активированного (димеризованного) и неактивированного состояний рецепторов 11,-6.

2) Фундаментальный: выявлен и подтвержден на клиническом материале механизм селективной обратной регуляции интерлейкином-6 экспрессии рецептора интерлейкина-6 на клетках множественной миеломы.

3) Экспериментальный: полученные в работе результаты анализа иммунофенотипа клеток линий множественной миеломы являются платформой для экспериментального изучения особенностей неопластических плазматических клеток.

4) Клинический: обоснована необходимость дифференцированного рассмотрения СБ138+ и СБ138" субпопуляций плазматических клеток, различающихся в отношении экспрессии рецептора 11,-6, иммунологических параметров опухоли и взаимосвязей с характеристиками клинической картины. Учет данных субпопуляций опухолевых клеток как новой клинической категории может применяться для оценки прогноза и выбора стратегии противоопухолевого лечения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При использовании моноклональных антител к внеклеточным доменам цепей рецептора 1Ь-6 ^130 и 1Ь-611а) возможно иммунологическое цигофлуориметрическое разграничение эффектов, связанных с активацией рецептора, его ресингезом и интернализацией.

2. На опухолевых клетках множественной миеломы имеет место эффект обратной регуляции экспрессии цепей рецептора 1Ь-6Яа и Ёр130 интерлейкином-б.

3. Уровень экспрессии СБ 126 на опухолевых плазматических клетках является преимущественно низким, строго коррелирует с долей проплазмоцитов в костном мозге, а также ассоциирован с выраженностью плазмоцитоза.

4. Наличие экспрессии СБ 126 на мембране плазматических клеток сопутствует проявлению аберрантных иммунологических характеристик: увеличению доли клеток с СВ45", СО 19", СБ56+. В то же время отсутствует линейная зависимость уровней экспрессии СО 126 и аберрантных маркеров.

5. Существует статистически достоверное различие экспрессии СШ26 на клетках субпопуляций С0138+ и СБ 138": клетки СБ 138" экспрессируют СР126 в меньшей степени (в отношении частоты экспрессии, р=0,001 и по уровню экспрессии, р=0,003).

6. Значение рецептора 1Ь-6 на мембране клеток СР138+ и СБ138" различается: только для клеток СБ138+ показана взаимосвязь между присутствием СО 126 на мембране и высокими уровнями плазмоцитоза, проплазмоцитов, высокой экспрессией СР56, низкой экспрессией СБ45 и наличием аберрантного иммунофенотипа плазматических клеток СЭ457СБ197С056+.

7. Наличие на мембране рецептора 1Ь-6 ассоциировано с иммуноморфологическими параметрами костного мозга в большей степени, чем уровень его экспрессии.

8. Инфицированность клеток костного мозга вирусом ННУ-8 ассоциирована с усилением экспрессии СБ 126 на опухолевых плазматических клетках (р<0,05).

Апробация диссертации

Апробация диссертации состоялась 21 января 2014 года на совместной конференции отделения химиотерапии гемобласгозов, лаборатории клинической иммунологии опухолей, лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии, отделения химиотерапии гемобласгозов НИИ детской онкологии и гематологии, лаборатории механизмов регуляции иммунитета, лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, кафедры онкологии, кафедры детской онкологии РМАПО.

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 4 сообщения на российских и международных конференциях.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 160 источников, из которых 6 отечественных и 154 иностранных. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 21 таблицей.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Клеточные линии. В работе использованы lL-6-зависимые иммортализованные клеточные линии множественной миеломы XG-1 и XG-2, культивируемые в присутствии экзогенного IL-6; субклон XG-2PA, полученный селекцией в присутствии рост-стимулирующих антител В1 и 12 (B1+I2 - зависимые); мышиные пре-В-клетки BAF130/190, трансфицированные кДНК gpl30 и рецептора лейкозингибирующего фактора LIFR (LIF-зависимые); IL-6-независимые клеточные линии множественной миеломы IM9 и RPMI8226.

Антитела. Функциональные свойства цепей рецептора IL-6 изучали с применением панелей мышиных моноклональных антител (МКА) к различным эпитопам внеклеточных доменов gpl30 и IL-6Ra человека. Aimi-gpl30 МКА: Al, А2, A3, Bl, В2, И, 12, CI, С2, СЗ, С7, Dl, D2, D3, Е1, Е2, F4, G2, G4 и aimi-IL-6Ra МКА: М91, М195, М5, М182 и М164 (INSERM U475, Франция). Для регистрации антител в реакции непрямой флуоресценции клетки инкубировали с мечеными фрагментами иммуноглобулинов F(ab')2-FITC.

Исследования клинического материала проводили с использованием диагностической панели МКА (BD, США): CD38-PerCP (клон НГГ-2), CD138-FITC (клон MI-15) и конъюгированных с РЕ МКА к CD45 (клон Ш30), CD19, CD56, CD3 (клон UCHT1, изотип IgGl) и CD 126 (клон М5, изотип IgGl). Тип моноклональности опухолевых клеток определяли с помощью K-PE/X.-FITC реагента. Изотипическими контролями являлись IgGl-РЕ и IgGl-биотин. Регуляцию экспрессии рецептора IL-6 собственным лигандом изучали в присутствии анти-1Ь-б МКА, клон В-Е8 (Diaclone, Франция).

Культивирование клеточных линий; Клетки линий RPMI8226 и IM9 культивировали среде RPMI-1640, содержащей глутамин, телячью эмбриональную сыворотку и гентамицин,

7

в стерильных флаконах 25см2 при 37°С, 5% СО2, во влажной атмосфере. Пересевали клетки каждые 2-4 дня при плотности 1х106 кл/мл. Для экспериментов использовали клетки в логарифмической фазе роста. Клетки линий XG-1 и XG-2 (IL-6-зависимые), XG-2PA (B1+I2-зависимые), BAF130/190 (LIF-зависимые) культивировали в описанных выше условиях, но с добавлением в среду при пересеве необходимых ростовых факторов: IL-6 5 пМ (ОД нг/мл), В1 и 12 по 0,5 мкг/мл каждое, LIF 10 пМ, соответственно.

Характеристика клинического материала. В исследование включены образцы костного мозга 27 больных множественной миеломой (ММ), проходивших лечение в отделении химиотерапии гемобластозов ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН в 2010-2013 гг. Медиана возраста больных на момент исследования составила 61 год. Медиана уровня плазмоцитоза - 15,2% от общего количества миелокариоцитов. Морфологическая характеристика аспиратов костного мозга, включающая подсчет миелограммы, выполнена в морфо-цитохимической группе лаборатории иммунологии гемопоэза (рук. проф., д.м.н. М.А. Френкель).

Выделение фракции мононуклеарных клеток костного мозга из биопсийного материала проводили с использованием лизирующего буферного раствора (Becton Dickinson) согласно рекомендуемому протоколу.

Определение аберрантного иммунофенотипа опухолевых клеток больных ММ. Использовали диагностическую панель первично меченых МКА: CD38-PerCP, CD138-FITC (маркеры плазматических клеток), а также меченые фикоэритрином (РЕ) МКА: CD45-PE, CD19-PE, CD56-PE, CD3-PE (отрицательный контроль), CD126-PE. Для анализа методом трехцветной проточной цитометрии клетки окрашивали CD38, CD138 и РЕ-коньюгированным МКА. Пробоподготовку проводили по стандартной методике. Анализ проводили на проточных цигофлуориметрах FACScan (Becton Dickinson, США) и EPIC XL-MCL (Becton Coulter, США). Накапливали no 50000-500000 событий для каждого образца. Для анализа данных использовали программы WinMDI 2.8 и FCS3.

Изучение регуляции экспрессии рецептора IL-6 его лигандом. Клетки линий XG-1, XG-2, RPMI8226 культивировали в присутствии и в отсутствии IL-б. Методом непрямой цитофлуориметрии оценивали изменения различных эпитопов gpl30 и IL6Ra субьединиц рецептора с помощью соответствующих МКА в течение 1-3 суток роста в условиях депривации IL-6. Инкубацию клеток с цитокином после депривации проводили при +4°С либо при +37°С в течение 1, 5, 15, 30 и 60 минут. Нейтрализацию IL-6 в клиническом материале проводили в стерильных условиях при 37°С, 5% СОг и высокой влажности. 500 мкл аспирата костного мозга инкубировали 0, 3, 24 ч в присутствии 100 мкг/мл ацти-1Ь-6

8

МКА, клон В-Е8, отбирали стерильно для анализа 150 мкл инкубированного с МКА препарата; мононуклеарную фракцию клеток окрашивали aHTH-CD3-PE (контроль) и анти-CD126-РЕ МКА с использованием стандартной методики.

Количественное определение экспрессии молекул рецептора. Абсолютное количество молекул IL-6Ra и gpl30 определяли методом проточной цигометрии с помощью набора реагентов QIFIKIT в условиях полного насыщения препарата соответствующими МКА. Для каждого независимого эксперимента строили калибровочную кривую с использованием 4-8 концентраций стандартизированных микросфер, конъюгированных с заданным числом молекул флуорофора (рис. 1). Сравнивали с экспериментальными значения logMFI-

логарифма среднего значения флуоресценции, полученные для микросфер. Расчет количества эпитопов (молекул, N) проводили на основе линейной функции калибровочной кривой по формуле:

N = а-IogMFI + b, где а и b - константы для данного эксперимента, a MFI - среднее значение интенсивности флуоресценции для данного антитела.

Анализ данных, полученных методом проточной цитометрии. При обработке данных, полученных на клеточных линиях при одноцветном окрашивании, события представляли в координатах прямого и бокового рассеяния и выделяли основную популяцию живых клеток. В выбранном гейте строили гистограммы распределения флуоресцентного сигнала по количеству событий; в одном рисунке наложением получали два и более пиков (рис. 2 А).

Анализ данных с трехцветным окрашиванием образцов начинали с выявления популяции плазматических клеток из общего числа миелокариоцитов костного мозга путем гейтирования. Выделяли в координатах CD38/SSC клетки с высокой экспрессией CD38 (рис. 2 Б). Выбранные клетки рассматривали в координатах CD38/CD138, формировали популяции опухолевого пула CD38+, CD38+/CD138+, CD38+/CD138" (рис. 2 В, Г). Экспрессию аберрантных маркеров MM CD45, CD19, CD56, а также CD126 характеризовали на основе доли антиген-позитивных клеток. Логическую границу наличия экспрессии устанавливали по совокупности визуального разделения пупа клеток на «экспрессирующий» и <®еэкспрессирующий», клеток, отсекаемых границей сигнал/шум по экспрессии CD3 и по расположению границы пула Т-лимфоцитов. По гистограммам распределения уровней экспрессии находили среднее геометрическое для этих величин.

9

1од МП

Рисунок 1. - Калибровочная кривая для количественного определения мембранных

антигенов с использованием стандартизированных микросфер СОТКЛ.

10° 10

10° 10' 10= 10' 10' С038 РЕР.СР

Рисунок 2. - Обработка цитофлуориметрических данных: А. Наложение гистограмм, соответствующих флуоресцентному сигналу клеток с выбранными параметрами образцов и окрашенных Р(аЬ')2-Р1ТС (отрицательный контроль, закрашенный пик) и анти-§р130/Р(аЬ')2-Р1ТС (незакрашенный пик); Б, В, Г: Выделение анализируемых популяций плазматических клеток костного мозга больного ММ: Б: гейт Ы1 в координатах СШ8-РегСР/88С; В: гейты ¡12 -СБ38+/С0138* и ИЗ - С038+/С0138" в координатах СГО8-РегСР/СШ38-Р1ТС; Г: популяция плазматических клеток гейта костного мозга в координатах СМ8-РегСР/С0126-РЕ.

Экспрессию рецептора 1Ь-6 представляли для каждой из трех групп клеток СШ8+, СВ38+/СШ38+, СБ38+/СШ38" в виде характеристик: а) доли СВ126-позитивных клеток (%С0126+), б) среднего значения флуоресценции МП, в) среднего геометрического значения Стеап, г) соотношения средних геометрических значений сигнал/шум МРЫ = Сшеап(С0126)/Сшеап(СВЗ), д) непараметрического коэффициента Б Колмогорова-Смирнова, полученного при статистическом анализе распределений флуоресценции клеток, окрашенных МКА к СБ 126 и СБЗ (отрицательный контроль).

Выявление генов вируса ННУ-8 в опухолевых клетках. Аликвоты интактного костного мозга больных ММ объемом 100 мкл использовали для выявления ДНК вируса герпеса человека 8 типа (ННУ-8) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого выделяли ДНК, исследовали ее на наличие трех генов, специфичных для ННУ-8: К1, кодирующего трансмембранный вирусный белок, у1Ь-6 (К2) - аналога человеческого 1Ь-6, и ОИР26, кодирующего капсидный белок. Контрольным геном служил человеческий ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ОАСРН). Продукты реакции разделяли с помощью ДНК-электрофореза в 1,7% агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Результаты анализа регистрировали визуально в трансиллюминаторе.

Статистическая обработка данных проведена с применением пакета программ SPSS Statistics, версия 17.0. Для количественной оценки взаимосвязей между параметрами рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона. Достоверность различий рассчитывали с помощью точного критерия Фишера или критерия Стьюдента. Статистически достоверными принимали различия с р<0,05. Анализ данных, не описывающихся нормальным распределением, а также для категоризованных параметров, проводили с помощью непараметрических методов /2 «хи квадрат» с построением таблиц сопряженности и сравнения выборок по Манну-Уитни, при этом рассчитывали медианы значений. Построение графиков функций выполняли в программе GraphPad Prizra 5.0.

Метод Колмогорова-Смирнова применяли для выявления слабой экспрессии рецептора IL-6. Рассчитывали коэффициент D, коррелирующий с величиной экспрессии, в программе CellQuest (Becton Dickinson) на основе исходных данных проточной цитофлуориметрии формата .fcs 1.0. Для всех полученных значений D оценивали уровень достоверности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Функциональные особенности внеклеточных доменов субъединиц рецептора интерлейкина-6 gpl30 и IL-6Ra

1.1. Изменение активационных состояний IL-6Ra и gpl30 под действием IL-6 (функциональный эпитопный анализ)

Для работы сформировали панель моноклональных антител (МКА) к gpl30 и IL-6Ra цепям рецептора интерлейкина-6 таким образом, чтобы они оказывали различное воздействие на пролиферацию клеток, связываясь с разными эпитопами молекул рецептора (согласно данным литературы). Отобранные по этому принципу МКА: aHTH-gpl30 Al, В1, С2, анти-IL-Ra М195, М91 составили характеристическую экспериментальную панель дальнейшего исследования.

Присутствие в ростовой среде IL-6 во всех экспериментах на клеточных линиях XG-1 и XG-2, и фактора роста клеток XG-2PA МКА (В 1+12) приводило к существенному уменьшению детектируемых количеств эпитопов обеих цепей рецептора IL-6, то есть к изменению количества молекул рецептора на мембране. В попытке исключить интернализацию и ресинтез цепей рецептора эксперименты проводили при температуре 0°С в присутствии азида натрия, угнетающего клеточное дыхание и останавливающего физиологические процессы в клетке, что позволило выявить биохимические реакции на мембране клетки. В данных условиях некоторые эпитопы: Al, Bl, М195 оставались

воспроизводимо чувствительными к воздействию IL-6 (рис. 3).

11

Рисунок 3. - Окрашивание клеток ХО-2 анти-я>130 (А1, В1) и анти-1Ь-6Ка (М195) МКА до (пунктирная линия) и после (точечная линия) инкубации с 1Ь-6. Сплошная линия - изотипический контроль.

Изменения детектируемых количеств эпитопов А1, В1, М195, выраженные как ДИЬ (величина смещения пика в сторону изотипического контроля, рис. 3) носят строго дозозависимый характер при изменении концентрации 1Ь-6, что иллюстрируют классические кривые ингибирования (рис. 4). Коэффициент ЕС5о отражает концентрацию Ш-6, при которой его воздействие составляет половину от максимального.

Рисунок 4. - Анализ дозозависимого воздействия 1Ь-б наэпитопы А1 и В1 молекулы §р 130 и на эпитоп М195 молекулы ГЬ-бИя.

При выявлении сайтов димеризации рецептора интерлейкина-6 §р130 -гомодимеризации (gpl30-gpl30) и объединения gpl30 с Пь-бЛа на клетках ХС-2РА, фактором роста которых служит пара антител-агонистов рецептора 1Ь-6 - В1+12, изучено изменение доступности эпитопов рецептора для связывания с различными МКА в присутствии и в отсутствии ГЬ-б, в том числе продемонстрировано отсутствие перекрестного блокирования между эпитопами молекулы gpl30 стимулирующих рост клеток МКА В1, II, 12 и не стимулирующих МКА А1, С2. Варьирование условий преинкубащщ клеток с ростовыми факторами выявило эффекты ингернализации и ресинтеза обеих цепей рецептора. Показано существенное функциональное различие между эпитопами А1 и С2 (рис.5).

При гомодимеризации gpШ в присутствии МКА В1+12 (1 мин, 37°С) маскируется МКА

А1, при димеризации §р130 с участием 1Ь-6Яа происходит снижение уровня эпитопа М195,

12

находящегося в сайте связывания IL-6 молекулой IL-6Ra. При этом уровни эпитопов С2 gpl30 и М91 IL-6Ra, находящихся вне функциональных сайтов взаимодействия с IL-6 и димеризации gpl30, не изменяются. К группе эпитопов, не претерпевающих изменений при активации рецептора IL-6, также отнесены эпитопы групп С (СЗ, Cl), D (Dl, D3), Е (El, Е2) -для gp!30 и эпитопы М5, М91 - для IL-6Ra.

Fue-H FL2-H

Рисунок 5. - Детекция димеризации рецептора интерлейкина-6. Закрашенный пик - изотипический контроль, сплошная зеленая линия - изначальная экспрессия, голубая пунктирная линия -количество доступных эпитопов после преинкубации с не стимулирующей димеризацию парой МКА B1+I1 (отрицательный контроль), розовая пунктирная линия — количество доступных эпитопов после преинкубации с парой МКА-агонистов рецептора IL-6 - В1+12.

Поскольку, согласно данным литературы, МКА AI блокирует рост клеток, инициируемый любым цитокином семейства gpl 30, то оно связывается в сайте гомодимеризации рецептора IL-6; аналогично, В1 связывается в сайте взаимодействия gpl30 и IL-6Ra. Наблюдаемые в присутствии IL-6 воспроизводимые изменения количеств эпитопов AI и В1 gpl30 свидетельствуют о нахождении цепей рецептора в закрытой для антител, димеризованной конформации, то есть в активационном состоянии, при котором произошли связывания gpl30-gpl30 и IL-6Ra-gpl30 соответственно. МКА М182 блокирует при связывании с IL-6Ra передачу сигнала IL-6 в процессе гетеродимеризации gpl30-IL-6Rct, а МКА М195 - при непосредственном взаимодействии IL-6Ra с IL-6.

Обобщая полученные результаты, все описанные ранее типы эпитопов gpl30 и IL-6Ra можно разделить на две группы - маркеры цепей рецептора, не зависящие от его активационного статуса (aHTH-gpl30 МКА групп С, D, Е, G; анти-IL-ôRa МКА М5, М91) и маркеры определенных состояний образования олигомерного рецепторного комплекса (анти-gpl30 МКА групп А, В, I, F; анти-IL-öRa МКА М195, М182).

1.2. Определение абсолютных количеств молекул рецептора интерлейкина-6 на мембране клеток миеломных линий

Количественная оценка экспрессии рецептора интерлейкина-6 выполнена на основе калибровки сигнала флуоресценции с помощью стандартизованных микросфер (ЗПЧКГГ,

13

конъюгированных с заданным количеством флуорохрома. Миеломные клеточные линии существенно различаются по экспрессии рецептора 1Ь-6 (рис. 6).

Количества молекул 1Ь-6Ка и gpl30 на мембране коррелируют; в нескольких экспериментах мы наблюдали тенденцию к слабому преобладанию 1Ь-6Яа. Уровень экспрессии этих цепей для интерлейкин-зависимых линий Хв-1 и Хв-2 существенно ниже, чем для Ш-6-независимой линии ЯРМ18226.

1.3. Регуляция экспрессии рецептора интерлейкина-6 его лигандом на клеточных линиях ММ

При культивировании 1Ь-6-зависимых клеток в отсутствие цитокина отмечено воспроизводимое существенное усиление экспрессии молекул gpl30 и ГЬ-бЛа. В присутствии ГЬ-6 наблюдается существенное снижение уровней экспрессии §р!30 и ГЬ-бЛа. Влияние 1Ь-6 на отмытые от цитокина клетки изучено на трех клеточных линиях и в зависимости от времени интерлейкиновой депривации (табл. 1).

Таблица 1- Количество молекул §р130 и 1Ь-611а на миеломных клеточных линиях при

обычных условиях культивирования и при различных сроках депривации 1Ь-6

Рецептор Клеточная линия Стандартное культивирование Дни депривации 1Ь-6

1 2 3

ёр130 ХО-1 0 3500-4500 4500-6000 6000-7000

ХС-2 1500-2000 7000-10000 6000-7500 4000-6000

КРМ18226* 15000-25000 25000-30000 10000-12500 8000-10000

1Ь-6Яа ХО-1 0 3500 700 1500

Хв-2 4500 18000 7500 2500

КРМ18226* 23000 25000-30000 10500 8000-10000

* Примечание: ИРМ18226 не является 1Ь-6-зависимой линией и может служить контролем.

Обратный эффект - снижение экспрессии субъединиц gpl30 и 1Ь-6Яа в присутствии 1Ь-6 после культивирования клеток в условиях цитокиновой депривации - изучен для различных эпитопов на трех клеточных линиях. С помощью количественной оценки экспрессии рецептора выявлены различия между количествами эпитопов, оставшихся свободными для связывания МКА после воздействия 1Ь-б на клетки (рис. 7).

1*РМ18226

хв-г

ХС-1

О 5000 10000 15000 20000 25000 30000 Уроввньэкспрессии (п. количество молекул/кл)

Рисунок 6. — Уровни экспрессии цепей рецептора интерлейкина-6 на клетках миеломных линий 11РМ18226, Хв-2, Хв-1.

Хв-2

ХО-1

(?РМ1 8226

«ИЛИ В1 В2 02 А1 А2 АЗ И В1 В2 02

Рисунок 7. - Количества (Ы) различных эпитопов молекул яр130 и 1Ь-6Ла, определяемые на миеломных клеточных линиях ХО-2, ХС-1, 11РМ18226 до (серые столбики) и после (черные столбики) инкубации клеток с 1Ь-6.

Влияние 1Ъ-б различается в 1 и в 3 день цитокиновой депривации, причем на клетках с высоким уровнем экспрессии рецептора (ХО-2, 11РМ18226) этот эффект выражен сильнее (маскирование отдельных эпитопов более 90%). В целом отмечается более резкое снижение количества эпитопов 1Ь-6Яа. Уменьшение количеств всех эпитопов §р!30 и ГЬ-бЯа, то есть исчезновение молекул рецептора с мембраны при инкубации с 1Ь-б связано, в основном, с интернализацией активированного рецепторного комплекса внутрь клетки. При этом претерпевают изменения все характеристические эпитопы, как А1, В1, М195, так и С2 и М91.

Таким образом, 1Ь-б подавляет экспрессию как на 1Ь-6-зависимых, так и на ТЬ-6-независимых миеломных клетках человека.

Применение принципа дифференцированного описания процессов активации и экспрессии рецептора с рассмотрением специфических активационных состояний с помощью панели МКА позволило нам четко различал, эффекты ресинтеза рецептора (накопления молекул, детектируемых всеми МКА), димеризации (исчезновения эпитопов, ассоциированных с активацией рецептора) и интернализации (маскирования всех характеристических эпитопов рецептора) (табл. 2).

Таблица 2 — Цитофлуориметрическое разграничение процессов активации рецептора интерлейкина-6, его ресинтеза и интернализации

эпитоп А1,АЗ, И, Р2 В1, В2 М195 М182 М91, М5 С2,С7 С9 02, БЗ

Эпитопы, связанные Эпитопы, не связанные

с активациеи рецептора с активациеи рецептора

АКТИВАЦИЯ 1 1 4 4 • • •

РЕСИНТЕЗ т Г Т Т т т т

ИНТЕРНАЛИЗАЦИИ 4 4 4 4 4 4 4

4 - уменьшение количества эпитопов более чем на 50%;

Т - увеличение количества эпитопов более чем на 50%;

• - отсутствие изменений количеств детектируемых эпитопов.

Данный принцип позволяет сделать вывод о наличии эффекта значимого увеличения экспрессии новых молекул рецептора в ответ на депривацию 1Ь-6.

15

1.4. Особенности иммунофенотипов клеточных линий ММ с различными уровнями экспрессии рецептора 1Ь-6

При иммунофенотипировании 1Ь-6-независимых клеточных линий ММ выявлены особенности экспрессии 1Ь-6Яа (СБ 126) в совокупности с основными иммунологическими параметрами клеток ММ (табл. 3).

Таблица 3 - Экспрессия 1Ь-6Яа и иммунофенотипы клеточных линий

множественной миеломы

Кл. линия, %CD138" Гейт V.CD45" %CD19* %CD56+ %CD126+

RPMI8226 0-68%CD138" CD38+/CD138+ 7 4 21-43 80

CD38+/CD138" 52 H.O. 51 42

IM9 81%CD138" CD138+ 92 85 1-37 1-44

CD138 93 95 0,1 1,5

Общелейкоцитарный антиген CD45 имеет тенденцию к более сильной экспрессии на С0138~клетках линий ММ. Также CD138' популяция обладает существенно более низкой экспрессией CD126; при этом уровень экспрессии CD126 на С0138-позитивньгх клетках остается высоким. При длительном культивировании клеточной культуры IM9, представленной не классическим вариантом ММ, и не экспрессирующей ни плазмоклеточный маркер CD38, ни CD126, характерно появление популяции CD38+/CD126+ клеток. Таким образом, при плазмоклеточных неоплазиях опухолевые клетки могут как утрачивать, так и возобновлять экспрессию CD38, CD138, CD126.

2. Экспрессия рецептора IL-6 на плазмоцитах костного мозга у больных ММ 2.1. Уровень и характер экспрессии CD126 на мембране опухолевых клеток

Цитофлуориметрические данные по экспрессии CD 126 на мембране опухолевых клеток больных ММ характеризуют рецептор IL-6 как слабо экспрессированный, в то же время в большинстве наблюдений отмечено четкое различие между экспрессией CD 126 и отрицательным изотопическим маркером CD3. Методология численного представления цитофлуориметрических данных при слабой экспрессии мембранных молекул, помимо оценки доли рецептор-позитивных клеток (%CD126+), опирается также на расчет характеристик различий сигнал-фон, в том числе MFR (mean fluorescence ratio) -соотношения средних значений интенсивности флуоресценции MFI (mean fluorescence intensity) рецептора и контрольного маркера MFR = MFICDi26/MFIcd3 и непараметрического коэффициента D Колмогорова-Смирнова, рассчитываемого при анализе гистограмм распределения интенсивности флуоресценции CD 126 и CD3. Обобщенные характеристики экспрессии рецептора IL-6 на опухолевых клетках больных ММ представлены в табл. 4.

Статистические характеристики %С0126+ V №11

Диапазон экспрессии 0-67% 0,04-0,78 0,62-4,08

Медиана 5,3% 0,29 1,21

Наличие СШ2б(% наблюдений) 74% 76% 81%

Характер экспрессии СО 126 в большинстве наблюдений мономорфный, то есть все клетки составляют одну популяцию с уровнем экспрессии в зоне границы сигнал-шум. Однако в ряде случаев (у 44% пациентов) отмечено также наличие небольших популяций клеток, ярко экспрессирующих СБ 126. Доля наблюдений, при которых %СБ126+ > 10%, составила 37% от общего числа пациентов и 50% от наблюдений с наличием СБ 126 на мембране. Важным параметром анализа экспрессии рецептора 1Ь-6 явилась категория наличия либо отсутствия рецептора на мембране клеток. В случае процентного выражения уровня СШ26 рассматривалась разность сигнал-шум > 0 между средними геометрическими значениями уровней флуоресценции СБ 126 и отрицательного контроля (СРЗ). Аналогично, при соотношении сигнал/шум > 1 определено наличие экспрессии для категории МБЯ. Критерий разграничения наличия и отсутствия экспрессии, описанной в статистических значениях Б, заключался в проверке нулевой гипотезы теста Колмогорова-Смирнова при сравнении коэффициента Б с критическим значением, рассчитанным индивидуально по

„ . пс, 1п1 + п2

каждому пациенту: = ' п\-п2 ' где коэффициент 1,953 задан достоверностью

р<0,001, а л 1 и п2- количества событий (клеток), составивших сравниваемые распределения СЭ126 и СБЗ соответственно. Наличие экспрессии СШ26 констатировалось при Б > Бкрит. Для всех трех методов количественной оценки экспрессии СБ 126 получены схожие показатели наличия слабой экспрессии СР126 на мембране опухолевых клеток ММ (табл. 4).

2.2. Оценка взаимосвязей экспрессии рецептора 1Ь-6 с клинико-иммунологическими характеристиками опухолевых клеток

В число изученных клинико-иммуно логических параметров вошли следующие

характеристики пула опухолевых клеток: содержание плазмоцитов в костном мозге (в

процентном выражении, %РС), наличие и доля морфологически незрелых форм опухолевых

клеток - проплазмоцитов (налич.ргоРС, %ргоРС), характеристики аберрантного

иммунофенотипа: экспрессия диагностических маркеров ММ СШ38, СБ45, СБ19, С056,

наличие инфицированности вирусом герпеса 8-го типа ННУ-8, возраст пациентов. Для

получения наиболее полной картины взаимосвязей экспрессии СВ126 с этими

характеристиками были параллельно проанализированы значения %СБ126, МКЛ, О,

характеризующие экспрессию СБ 126, а также данные, описанные в категориях наличия

17

СБ 126 на мембране (лалич.С0126%, налич.СШ26 Б), а также наблюдения с относительно высоким уровнем экспрессии рецептора (СП126>10%). Числовые параметры опухолевых клеток рассмотрены с помощью корреляционного анализа по Пирсону. Уровень сопряженности категориальных характеристик (наличие/отсутствие свойства) оценен с помощью построения таблиц сопряженности хи-квадрат. Сравнение рассматриваемых характеристик в группах больных с разными категориальными показателями проведено в тесте Манна-Уитни.

2.3. Экспрессия рецептора 1Ь-6 в субпопуляциях плазмоцитов СБ138+ и СБ 138"

Одним из стандартных шагов методики обработки цитофлуориметрических данных является обнаружение в пуле миелокариоцитов костного мозга плазматических клеток путем выявления яркой экспрессии специфичных плазмоклеточных маркеров СБ38 и СБ138. Использование этих двух характеристических молекул существенно увеличивает чистоту анализируемой группы клеток. Однако, согласно данным литературы, СШ38 может отсутствовать на опухолевых клетках ММ, причем наличие существенной популяции С0138" клеток ассоциировано с плохим прогнозом, высокой вероятностью рецидива и со способностью опухоли к быстрому метастатическому росту. Таким образом, роль СШ38 может затрагивать ключевые механизмы выживания и гомео стаза опухолевых клеток, что на настоящий момент слабо изучено. Описание опухолевых клеток только в рамках СБ138-позитивной популяции делает невозможным рассмотрение части механизмов регуляции опухолевого процесса, связанных с потерей этого маркера. Поэтому одной из важных задач данного исследования стало дифференцированное описание и сравнение экспрессии СО 126 и свойств опухолевых клеток в трех различных гейтах: С038+, СВ38+/СБ138+, СП38+/СВ138\

В таблице 5 приведены общие характеристики опухолевого пула клеток больных ММ. Выборка характеризуется средним уровнем плазмоцитоза, наличием в препаратах значимой доли морфологически незрелых форм клеток плазмоцитарного ряда - проплазмоцитов (ргоРС) и наличием в 23 случаях из 27 (85% наблюдений) клеток, не экспрессирукмцих СО 138, с широким диапазоном доли этой популяции (от 0 до 74% всего опухолевого клона). Таблица 5 - Характеристики опухолевых клеток больных ММ

Статистические характеристики %РС %ргоРС %СБ138"

Диапазон 0,6 - 49% 0 - 27,4% 0 - 74,2%

Медиана 15,2% 2,4% 3,1%

Анализ уровней экспрессии рецептора 1Ь-6 на клетках С0138+ и С0138" в тесте Манна-Уитни показал статистически достоверное различие %С0126 (р=0,003), что характеризует экспрессию СВ126 на клетках С0138+ как достоверно более высокую по сравнению с его экспрессией на клетках СБ 13 8".

2.3.1. Корреляционный анализ уровня экспрессии рецептора интерлейкина-6 и клинических характеристик ММ

Численные соотношения уровня экспрессии СШ26 и клинико-иммунологических характеристик костного мозга больных ММ получены с помощью оценки линейной корреляции Пирсона в гейтах опухолевых плазмоцитов С038+, С038+/С0138+, С038+/С0138" и представлены в таблице 6. Звездочкой отмечены статистически достоверные линейные зависимости параметров (р<0,05).

Таблица 6 - Корреляционные зависимости между экспрессией рецептора интерлейкина-6 и

клиническими характеристиками костного мозга больных ММ (г, коэффициенты корреляции Пирсона)

СЭ38+ СБ38+/СВ138+ СВ38+/СВ138"

%СЭ126 О мга %С0126 О МП* %СШ26 О мт

%СШ26 1,0 1,0 1,0

О 0,86* 1,0 0,81* 1,0 0,57* 1,0

МРИ 0,95* 0,8* 1,0 0,96* 0,77* 1,0 0,56* 0,83* 1,0

%РС 0,3 0,4 0,3 0,3 0,2 0,3 0,0 0,3 0,56*

%ргоРС 0,49* 0,41* 0,48* 0,5* 0,4 0,46* 0,1 0,6* 0,84*

%С045+ -0,3 -0,3 -0,3 -0,3 -0,1 -0,2 0,3 0,0 0,4

%СШ9+ 0,0 0,1 -0,2 -0,1 0,0 -0,2 0,39* -0,1 0,0

%СР56+ 0,0 0,1 -0,1 0,0 0,0 -0,2 0,1 0,2 -0,1

%СШ38- -0,1 0,1 -0,2 -0,1 0,2 -0,2 0,3 0,0 -0,1

* - р<0.05

Важным методологическим результатом корреляционного анализа является сходимость (наличие статистически достоверной взаимосвязи) между всеми числовыми характеристиками экспрессии СП126 - %СП 126, \1FRj Б, полученными тремя различными расчетными методами.

В гейтах СБ38+ и С038+/С0138+ наблюдается положительная корреляция экспрессии Сй126 и количества проплазмоцитов в костном мозге. Несколько иная картина характеризует клетки С0138": в этом гейте уровень экспрессии СШ26 прямо пропорционален как количеству проплазмоцитов, так и уровню плазмоцитоза; кроме того, наблюдается статистически достоверная линейная зависимость экспрессии СЭ126 от уровня СЭ19. Показатели клинически значимых аберрантных маркеров, за исключением СШ9, не имеют корреляции с СО 126, что свидетельствует об относительной независимости сигнальных путей, модулирующих экспрессию СО 126 и характеристических молекул ММ. Экспрессия СБ 126 не коррелирует с количеством клеток СБ 138". Учитывая статистически достоверное снижение количества проплазмоцитов при образовании С0138" популяции (р<0,03), мы можем предположить экспрессию СО 126 в опухолевом пуле клеток преимущественно на проплазмоцитах, что требует дальнейшего иммунологического подтверждения.

2.3.2. Анализ сопряженности клииико-иммунологических характеристик ММ и экспрессии рецептора интерлейкина-б

В непараметрических тестах исследованы закономерности, характеризующие появление или исчезновение СБ 126 на мембране опухолевых клеток ММ. На основании морфологических данных отдельно рассмотрены группы пациентов со средним (РС>10%) и высоким (РС>30%) плазмоцитозом, группы с наличием, а также с высоким уровнем проплазмоцигов (ргоРС>10% от всех плазматических клеток). Изучены взаимосвязи в группах пациентов с наличием и отсутствием популяции С0138", ее средним (СШ38">10%), и высоким (С0138>50%), содержанием в пуле опухолевых клеток. Уровни экспрессии аберрантных маркеров С045, С019 и С056 категоризовали по принципу преобладания доли клеток с наличием или отсутствием их экспрессии. Тест хи-квадрат (табл. 7) показал для клеток С0138+, но не С0138", яркую сопряженность наличия СБ 126 со всеми аберрантными параметрами плазматических клеток: преобладанием СР45", С056+, высоким уровнем плазмоцитоза и проплазмоцигов, а также с отсутствием популяции СБ 13 8", за исключением связи с СБ 19. Одной звездочкой в таблице отмечены взаимосвязи с р<0,1 (близкие к статистически значимым), двумя звездочками - с р<0,05 (статистически значимые) Таблица 7 - Анализ сопряженности клинико-иммунологических характеристик ММ и

экспрессии рецептора интерлейкина-6 (таблица коэффициентов хи-квадрат)

CD38+/CD138+ CD38+/CD138"

Налич CD126 (%) Налич CD126 (D) CD126 >10% Налич CD 126 (%) Налич CD126 (D) CD126 >10%

CD45+>50% 7,6** 10,8** 2,8* 0,006 0,04 1,4

CD19+>50% 2,1 1,8 0,3 0,04 0,09 0,4

CD56*>50% 2,3 5,9** 2,1 1,1 1,7 0,1

РО10% 5,1** 16,8** 0,71 1,8 0,75 0,3

РС>30% 3,25* 3,7* 3,2* 0,002 2,4 0,7

Налич ргоРС 3,9** 9,6** 1,3 0,006 0,75 0,06

ргоР010% 1,5 5** 1,3 0,034 1,7 0,1

Налич CD138" 2,9* 0,67 0,34 0,09 0,98 0,002

CD138">10% 0,95 4,4** 0,08 0,006 1,6 0

CD138">50% 3,4* 4,4** 0,05 0,34 1,1 1,5

*-р<0,1; ** - р<0,05

Аналогичные закономерности демонстрирует тест Манна-Уитни (табл. 8): в присутствии CD126 на клетках CD138+, но не CD138", статистически достоверно ослаблена экспрессия CD45 и увеличен уровень CD56; кроме того, CD 126 появляется при высоких уровнях проплазмоцигов (р=0,008) и плазмоцитоза (р=0,005). Эффект утраты CD 126 клетками CD138+ пациентов более молодого возраста (р=0,012) связан, по-видимому, с биологическими особенностями этих клеток. В этой группе пациентов мы также отметили усиление экспрессии CD45 (р=0,008). Отсутствие описанных закономерностей для клеток

20

СВ138" может означать принципиально отличный вклад рецептора С0126 на этих клетках в прогрессию ММ по сравнению с клетками С0138+.

Таблица 8 - Различия клинико-иммунологических параметров в группах пациентов в

зависимости от наличия экспрессии СО 126 (достоверности различий, р)

Категоризованные параметры

СБ38+/СМ38 + СБ38+/С0138

Численные Налич Налнч СБ 126 Налич Налич С0126

параметры СБ126 (%) СБ126 (Б) >10% С0126 (%) СШ26 (О) >10%

%РС 0,009** • 0,002** 0,12 0,46 0,31 0,84

%ргоРС 0,57 0,008** 0,1* 0,69 0,26 0,89

%СШ38" 0,19 0,12 0,41 0,37 0,21 0,4

Возраст 0,3 0,012** 0,056* 0,3 0,21 0,62

%СБ45+ 0,11 0,022** 0,18 0,69 0,75 0,23

%С019+ 0,95 0,31 0,47 0,9 1 0,65

%С056+ 0,47 0,019** 0,09* 0,15 0,06* 0,7

* -р<0,1; ** - р<0,05

Таким образом, фактор наличия СБ 126 на мембране является строгим молекулярным индикатором злокачественной природы клеток множественной миеломы.

Отдельно проанализированы эффекты изменения уровня экспрессии СБ 126 в группах пациентов с различными клинико-иммунологических параметрами костного мозга; достоверности таких различий приведены в таблице 9, обозначения используются так же, как в таблицах 7 и 8. Увеличение уровня СЭ126 показано в гейте СВ138+, но не С0138", в группах пациентов с преобладанием клеток, не экспрессирующих СБ45 (р=0,024) и экспрессирующих СИ5б (р=0,09). В СБ138+ популяции усиление экспрессии С0126 происходит в условиях выраженного плазмоцитоза (РС>30%, р=0,019), а также при наличии (р=0,085) и увеличении количества (р=0,092) проплазмоцитов.

Таблица 9 - Различия уровней экспрессии СО 126 в группах пациентов в зависимости от

клинико-иммунологических параметров (достоверности различий, р)

Численные параметры

СБ38+/СШ38+ СН38+/СВ138"

Категоризо ванные %СБ126 й %СБ126 Р

СБ45+>50% 0,024** 0,87 0,048** 0,36 0,62 0,83

СВ19+>50% 0,61 0,82 0,21 0,65 0,65 0,91

СБ5б*>50% 0,09* 0,64 0,28 0,66 0,75 0,74

РО10% 0,094* 0,75 0,25 0,79 0,94 0,12

РОЗО% 0,019** 0,038** 0,027** 0,73 0,21 0,06*

Налнч ргоРС 0,085* 0,3 0,5 0,9 0,45 0,1*

ргоРОЮ% 0,092* 0,18 0,49 0,66 0,04** 0,03**

Налич СШ38" 0,35 0,9 0,62 0,85 0,95 0,62

СБ138'>10% 0,52 0,6 0,68 0,9 0,42 0,93

СО138^>50°/о 0,47 0,16 0,48 0,47 0,53 0,6

* -р<0,1; ** - р<0,05

Клетки CD138", напротив, не обнаруживают влияния экспрессии CD45 и CD56 на уровень CD126, но, тем не менее, взаимосвязаны с повышением уровня проплазмоцитов (ргоРС>10%, р<0,05). Нельзя в этом контексте исключать возможность паракринной стимуляции экспрессии CD126 на клетках CD138" проплазмоцитами. Очевидно также, что общее свойство всех ассоциированных с усилением экспрессии CD126 параметров — их принадлежность к характеристикам опухолевой прогрессии ММ.

2.3.3. Соотношение уровня экспрессии рецептора интерлейкина-6 с аберрантными иммунофенотипами ММ

Аберрантный иммунофенотип (ИФТ) как комплексная характеристика плазматической клетки при ММ позволяет отличить ее от нормальных клеток и является важным диагностическим инструментом. ИФТ нормальных плазмоцитов характеризуется сочетанием CD45+CD19+CD56"; напротив, опухолевые клетки ММ проявляют ИФТ CD45 CD19 CD56+, который обозначен для удобства символом «ИФТ--+». В то же время, в зависимости от биологических характеристик опухоли у разных пациентов могут преобладать клетки с любой из 8 комбинаций аберрантных маркеров.

При анализе соответствий отсутствия CD126 компонентам здорового ИФТ в сравнении с общим уровнем экспрессии маркеров при ММ показано, что при отсутствии CD126 на мембране наблюдается тенденция к уменьшению характерной для злокачественных клеток экспрессии всех трех диагностических маркеров ММ как на клетках CD138"1", так и CD138" (рис. 8). Изучение на клетках CD138+ и CD138' взаимосвязей параметров ИФТ и экспрессии CD126 показало высоко достоверную взаимосвязь уровня экспрессии CD126 и наличия злокачественного ИФТ—+ для клеток CD138+ и отсутствие такой взаимосвязи для клеток CD138". Статистически достоверно (р=0,045) различается уровень экспрессии CD126+ в группах с наличием и отсутствием ИФТ—+ на клетках CD138+, но не CD138". Эти данные еще раз подтверждают ассоциацию наличия CD126 на плазматических клетках с их малигнизацией, в то же время показывая более слабое влияние CD126 на свойства С0138-негативных плазмоцитов. Различие долей СБ19-позитивных клеток в субпопуляциях CD138+ и CD138" высоко достоверно взаимосвязано с различием уровней экспрессии CD126 на этих клетках (р<0,02) и

22

80% 70% 80% S0% 40% 30% 20% 10% 0%

,

Рисунок 8. - Доля СБ45+, С019+, С056" наблюдений в исследованной выборке больных ММ (черные столбики) и у больных с отсутствием С0126 на опухолевых клетках ММ (серые столбики).

с отсутствием СЭ126 на мембране клеток СШ38+ (р=0,01). В то же время уровни СР19 и СЭ126 в пределах гейта СЭ138+ не взаимосвязаны, однако на клетках СР138" эти параметры высоко коррелируют (г=0,39; р<0,05). Выявлены также взаимосвязи различия СБ126 в двух гейтах с изменениями иммунофенотипа в целом (р=0,026).

2.4. Регуляция интерлейкином-б экспрессии СБ126 на мембране опухолевых клеток в аспиратах костного мозга больных ММ

Эффект обратной регуляции интерлейкином-6 количества молекул рецептора на мембране клеток миеломных иммортализованных линий, описанный в разделе 1.3, имеет устойчивую воспроизводимость и представляет исследовательский интерес в контексте объяснения принципа функционирования П,-6 в качестве ключевого фактора роста и выживания клеток ММ при низком выявляемом уровне рецептора 1Ь-6 на мембране. Нейтрализация цитокина в аспиратах костного мозга полностью воспроизвела выявленный на клеточных линиях эффект усиления экспрессии рецептора 1Ь-6 (рис. 9). Для связывания цитокина использовали избыток анти-1Ь-6 МКА В-Е8, применяемого в зарубежных клиниках для терапии ММ и не имеющего токсичности.

А Б В

Рисунок 9. - Усиление экспрессии СБ126 плазматическими СЭ38+ клетками (не закрашенный пик) в сравнении с контролем (закрашенный пик) при депривации 1Ь-6 в аспирате костного мозга больного ММ: А - Исходная низкая экспрессия СБ126; Б - инкубация с анти-1Ь-6 МКА в течение 3 часов; формирование отчетливого пика СБ 126 происходит уже через 3 часа инкубации с анти-11,-6; В -инкубация с анти-1Ь-6 МКА в течение 24 часов.

При депривации 1Ь-6 в течение 3 и 24 часов происходит усиление экспрессии СБ 126 как на СШ38+, так и на СБ138" клетках, причем более яркий эффект прослеживается в гейте С0138+. Объемы этих двух субпопуляций, согласно данным литературы, могут изменяться: СШ38+ популяция утрачивает синдекан-1 при инкубации препарата костного мозга вследствие апоптотических процессов, в связи с чем накапливаются клетки СБ 13 8". В условиях данного эксперимента, в присутствии анти-Ш-6 МКА, напротив, отмечено ингибирование популяции клеток С0138" (снижение доли СШ38" с 50% до 20%).

Интактность препарата костного мозга в условиях эксперимента в отношении клеточного состава и растворимых факторов означает селективное участие в данном механизме только молекул 1Ь-6, §р130 и 1Ь-611а. Данный эффект может лежать в основе механизма регуляции рецептором шггерлейкина-6 процессов пролиферации и выживания опухолевых клеток ММ.

Таким образом, описан СО 126- и gpl30-cпeцифичный механизм, обеспечивающий селективное активирование 1Ь-6-сигнализации на опухолевых клетках путем аутокринной или паракринной модуляции экспрессии рецептора ингерлейкина-6.

2.5 Взаимосвязь инфицированности ННУ-8 с экспрессией С0126 и с морфологическими характеристиками костного мозга больных ММ

Ген вирусного 1Ь-6 (у1Ь-6) бьш вьивлен в клетках аспиратов костного мозга методом ПЦР в 8 случаях из 14 (57%). Взаимосвязь наличия СО 126 на мембране клеток ММ и наличия генов ННУ-8 (табл. 10) близки к статистически достоверным (отмечены звездочкой) и проявляются на всех клетках (СЭ138+ и СО 13 8").

Таблица 10 — Анализ сопряженности характеристик экспрессии рецептора интерлейкина-6 и

инфицированности ННУ-8 (таблица коэффициентов хи-квадрат)

Категориальные параметры Наличие ННУ-8

Гейт СВ38+/СБ138+ СБ38+/СВ138-

Налич СШ26 (%) 3,1* 3,1*

Налич СО 126 (О) 3,1* 2,4

СШ26>10% 2,9* 0

* -р<0,1

В тесте Манна-Уитни установлена статистически достоверная взаимосвязь (р<0,03) между усилением экспрессия СБ 126 и наличием гена уГЬ-6 во всех клетках костного мозга больных ММ. В группе больных, инфицированных ННУ-8, уровень экспрессии СО 126 выше как на клетках субпопупяции СБ138+ (р=0,033), так и на клетках С0138" (р=0,02).

Эта взаимосвязь, однако, не может быть интерпретирована как прямое воздействие у1Ь-6 на рецептор ввиду описанного нами механизма обратной регуляции интерлейкином-6 уровня СБ126. В то же время, поскольку, по нашим данным, наличие гена у1Ь-6 высоко достоверно ассоциировано также с наличием проплазмоцитов (р=0,006), то из прямой корреляции уровней СШ26 и проплазмоцитов (р<0,001), следует, что вирусный цитокин может активировать продукцию СЭ126 на клетках ММ и, в частности, на проплазмоцитах.

Подводя итог, можно отметить, что комплексная оценка экспрессии С0138, С0126, а также маркеров аберрантного иммунофенотипа (СБ45, С019, СБ56) позволяет обозначить иммунологические параметры больных множественной миеломой с различным прогнозом. Предложена для дальнейшего изучения прогностическая модель, основанная на оценке приведенных выше трех параметров.

выводы

1. Иммунологические методы определения специфических эпитопов цепей рецептора интерлейкина-6 IL-6R.ii и gpl30 позволяют дифференцировать активированные и неактивированные молекулы рецептора на мембране плазматических клеток.

2. Компоненты рецепторного комплекса и ир 130 экспрессированы на клетках множественной миеломы в равной степени. П^-б-зависимые клетки слабо экспрессируют рецептор интерлейкина-6 (0-4000 молекул/клетку), в отличие от П,-6-независимых клеток (более 20000 молекул/клетку).

3. На линиях клеток множественной миеломы экспериментально продемонстрирован селективный механизм обратной регуляции интерлейкином-6 экспрессии рецептора интерлейкина-6. Этот механизм подтвержден на опухолевых плазматических клетках костного мозга больных множественной миеломой.

4. Установлено наличие двух субпопуляций плазмоцитов: СБ138-позитивной и СБ138-негативной на клеточных линиях множественной миеломы и у больных множественной миеломой. Эти субпопуляции сосуществуют у одного и того же больного. Экспрессия СБ126 на клетках СБ138+ и СБ138" различается: клетки СШ38" экспрессируют рецептор 1Ъ-6 в меньшей степени (как в отношении частоты экспрессии, р=0,001, так и по уровню экспрессии, р=0,003).

5. Отсутствие СБ138 и снижение экспрессии СБ 126 на опухолевых клетках напрямую взаимосвязаны с аберрантным иммунофенотипом и, в частности, с экспрессией СБ 19. В условиях подавления активности интерлейкина-6 (депривации) СБ138-негативная популяция ингибируется. Выраженность плазмоцитоза костного мозга и пропорции проплазмоцигов в миелограмме, в отличие от экспрессии аберрантных маркеров (СБ45, СП 19, СБ56), напрямую коррелируют с уровнем СБ 126 на мембране опухолевых плазматических клеток.

6. Ген вирусного интерлейкина-6 ННУ-8 обнаружен в клетках костного мозга 57% больных множественной миеломой. Установлен факт усиления экспрессии рецептора интерлейкина-6 в ННУ-8-позитивных наблюдениях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Костюкова, М.Н. Функциональные особенности внеклеточных доменов трансдуцерного рецептора gpl30 / М.Н. Костюкова, H.H. Тупицын // Биохимия. -

2011. - Т. 76., № 4. - С. 487-501.

2. Костюкова, М.Н. Плазмобластный вариант множественной миеломы с лимфоидной морфологией злокачественных клеток и экспрессией CD20. Описание наблюдения / М.Н. Костюкова, О.Ю. Якимович, Л.Ю. Гривцова, H.A. Купрышина, М.А. Френкель, О.М. Вотякова, A.M. Степанова, O.A. Чегринец, Э.Р. Мусаев, A.M. Ковригина, Е.А. Османов, H.H. Тупицын // Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. - 2011. - Т. 4., № 1. - С. 44-49.

3. Калитин H.H. Экспрессия рецептора факторов роста эндотелия сосудов VEGFR1 в культурах клеток множественной миеломы: корреляция с иммунофенотипом и лекарственной устойчивостью / H.H. Калитин, М.Н. Костюкова, Е.С. Какпакова, H.H. Тупицын, А.Ф. Карамьппева // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -

2012. - Т. 153., № 6. - С. 865-868.

Другие работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Костюкова, М.Н. Gpl30 как мишень для модуляции гемопоэтических процессов / М.Н. Костюкова, H.H. Тупицын // Онкология и радиология Казахстана. - Алматы, IIIS ноября 2010. - № 3-4. - С. 147.

2. Костюкова, М.Н. Трансдуцер действия цитокинов гликопротеин gpl30 / М.Н. Костюкова, H.H. Тупицын // Сборник научных трудов научно-практической конференции «Клиническая иммунология, иммуногенетика - междисциплинарные проблемы». - Ташкент, 11-12 октября 2010. - С. 56-57.

3. Kalitin, N. Vascular endothelial growth factor receptor 1 (VEGFR1) gene expression depends on immunophenotype of human multiple myeloma cells / N. Kalitin, M. Kostjukova, E. Kakpakova, N. Tupitsyn, A. Karamysheva // Eur. J. Cancer. - 2011. - 47(1). -P.S644.

4. Карамьппева, А.Ф. Изменения VEGF-зависимых сигнальных систем в процессе злокачественной трансформации / А.Ф. Карамьппева, H.H. Капитан, М.Н. Костюкова, H.H. Тупицын // Сборник тезисов VIII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». - Звенигород, 6-9 декабря 2011. - С. 50.

26

Подписано в печать 07.02.14 Формат 60*8.4/16. Бумага офисная «БуейэСору». Тираж 100 экз. Заказ № 221 Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24