Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Значение полиморфизма генов в генезе неразвивающейся беременности

005008455

На правах рукописи

Ходжаева Дарья Алексеевна

Значение полиморфизма генов в генезе неразвивающейся беременности

14.01.01 - акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 д тт

Москва-2011

005008455

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Макаров Олег Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Панина Ольга Борисовна

доктор медицинских наук,

профессор Тетруашвили Нана Картлосовна

Ведущая организация: Московский областной научно исследовательский институт акушерства и гинекологии

Защита состоится « 2012 года в 14.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.12 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «_»

Ученый секретарь диссертационного доктор медицинских наук, профессор

2011 года

Хашукоева Асият Зульчифовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В структуре ранних репродуктивных потерь одно из лидирующих мест в настоящее время отводится неразвивающейся беременности (НБ). По мнению различных авторов, частота НБ находится в пределах от 18-20% (Серова О.Ф., 2001) до 70-80% (Подзолкова Н.М., 2003.; Аржанова О.Н., 2004) Длительное нахождение погибшего плодного яйца в полости матки представляет огромный риск здоровью и жизни женщины из-за развития гемостазиологических осложнений, нарушения сосудисто- тромбоцитарного и плазменно-коагуляционного звеньев гемостаза с развитием ДВС-синдрома, который в 15-29% наблюдений приобретает декомпенсированное течение (Сидельникова В.М., 2005; Сидорова И.С., 2007).

Генез НБ рассматривается с полиэтиологических позиций, и выделяется комплекс различных факторов, которые приводят к возникновению данной патологии (Подзолкова Н.М., 2003, Якорева И.Г., 2003; Радзинский В.Е., 2009). Необходимо отметить, что в 26-66% этиология НБ остается невыясненной (Липовенко JI.H., 2004; Shawky ZA., 2000). В настоящее время не вызывает сомнения наличие факта генетической предопределенности гибели эмбриона. По различным данным, 18-80% НБ в I триместре связано с различной геномной патологией родителей и плода (Баранов B.C. и соавт., 2007, Хамадьянов и соавт., 2007). Известно, что чем меньше срок беременности на момент гибели плодного яйца, тем выше частота хромосомных аберраций, выявляемых в абортивном материале. Так, в сроке 6-7 недель беременности хромосомные аномалии выявлялись в 6075%, 12-17 недель - в 20-25%, в 17-28 недель - только в 2-7% (Лебедев И.Н. и соавт., 2003; Сидорова И.С., Шешукова Н.Ф., 2006). Однако необходимо отметить, что если остановка развития эмбриона с аберрантным кариотипом представляется логичной, то причины НБ при нормальном кариотипе плода часто остаются невыясненными (Евдокимова В.Н. и соавт., 2000; Серова

О.Ф., Милованов А.П., 2001; Радзинский В.Е. и соавт., 2005). Учитывая

3

прогресс современной молекулярной генетики и геномики, становится все более реальным изучение скрытых и тонких генетических механизмов НБ.

Вариабельность генов, ограниченная одним видом, получила название генного полиморфизма (ГП). Полиморфные гены представлены в популяции несколькими разновидностями - аллелями, что обусловливает разнообразие признаков внутри вида (Wang S., Moult J., 2001).

Гены, аллельные варианты которых при определенных воздействиях среды предрасполагают к возникновению различных заболеваний, получили название генов предрасположенности (Wang S., Moult J., 2001; Yang Q at al., 2003). В комплексе с неблагоприятными внешними факторами гены предрасположенности обуславливают развитие целого ряда состояний, в частности, привычное невынашивание беременности, неразвивающаяся беременность, бесплодие. Следовательно, в генетический компонент НБ необходимо включать не только эффект спорадических генных и хромосомных мутаций, но и генетические факторы предрасположенности. Выявление таких генов предрасположенности представляет собой перспективный раздел медицины в целом, и репродуктивной ее отрасли особенно. Возможность прогнозирования различных патологических состояний, формирование групп риска по развитию заболеваний позволит применять терапию, базируясь на геномных особенностях каждого человека. Изучение генов предрасположенности к НБ позволит расширить спектр генетических факторов НБ и откроет новые возможности влияния на данную патологию, с учетом биохимического профиля конкретного пациента.

Учитывая вышеописанное, представляет научный и практический

интерес исследование тех генов, полиморфизм которых способен оказать

негативное влияние на ключевые моменты первого триместра беременности.

Полиморфизм гена SOD2, продуктом экспрессии которого является

супероксиддисмутаза - основной фермент антиоксидантной защиты,

поскольку даже физиологически протекающая беременность

сопровождается оксидативным стрессом (Хашукоева А.З., Маматиева М.А.,

4

2007; Золотухин П.В., 2010; Jaenich R„ Bird A., 2003; Jauniaux E. at al., 2004; L. Cui X., 2004), который играет важную роль в процессах имплантации плодного яйца и апоптозе эндометрия (Levine A.J. at al., 2006; Mikolajczyk M. at al., 2007) и полиморфизм генов семейства CYP1A1 (CYP1A1T3801C, CYP1A1A4889G, CYP1A1G606T), ферментативные продукты которого обеспечивают утилизацию токсических продуктов внешней среды (Lewis D.F, Lake B.G., 2004; Sowers M.R. at al., 2006). Кроме того нам представлялось важным провести генотипирование не только беременных, но и их супругов, поскольку в процессе гестации принимают участие равно как мать, так и плод, а приспособительные ресурсы плода определяются геномом обоих родителей.

Цель исследования

Определение роли генных полиморфизмов в генезе неразвивающейся беременности для профилактики репродуктивных потерь.

Задачи исследования

1. Определить частоту различных генотипов CYP1A1, SOD2, Тр53 у мужчин и женщин контрольной группы и группы с НБI триместра.

2. Определить значение полиморфизма генов CYP1A1, SOD2, Тр53 у супругов в генезе неразвивающейся беременности I триместра.

3. Выявить зависимость сроков остановки развития эмбриона от полиморфизма генов CYP1A1, SOD2, Тр53 .

4. Установить степень риска возникновения НБ у мужчин и женщин в супружеской паре - носителей полиморфных аллелей генов CYP1A1, SOD2, Тр53.

5. Сформировать группы риска по возникновению НБ в зависимости от результатов генотипирования супружеской пары.

Научная новизна

Впервые изучено влияние полиморфизма генов SOD2, Тр53, CYP1A1A606C у супружеских пар с НБ. Впервые доказано, что наличие аллельного полиморфизма генов SOD2, Тр53, CYP1A1A606C повышает риск НБ в супружеской паре в 1,8-6,6 раз. Показано нарастание негативного эффекта генных полиморфизмов с 8-12 недель гестации. Впервые изучена частота встречаемости различных генотипов SOD2, Тр53, CYP1A1A606C, CYP1A1T3801C, CYP1A1A4889G у мужчин и женщин в супружеских парах с НБ.

Практическая значимость работы

На основании проведенных исследований установлено, что аллельный полиморфизм генов SOD2, Тр53, CYP1A1A606C является фактором риска НБ в супружеской паре. Генотипирование супружеских пар с НБ в анамнезе может быть рекомендовано, при исключении других причин НБ, как способ формирования групп риска, с целью проведения специфической терапии в I триместре беременности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Аллельный полиморфизм генов SOD2, Тр53, CYP1A1A606C является фактором риска НБ в супружеской паре.

2. Прогностически наиболее неблагоприятным для возникновения НБ является наличие гомозиготного минорного генотипа С/С гена50£)2и гомозиготного мажорного генотипа G/GTp53, как для матерей, так и для отцов, а также носительство гомозиготного мажорного генотипа А/А CYP1A1A606C у матерей.

3. При наличии аллельного полиморфизма генов SOD2, Тр53, CYPIA1A606C риск НБ в супружеской паре возрастает в 1,8-6,6 раз.

4. Негативный фенотипический эффект полиморфизмов наиболее

выражен в сроке 8-12 недель гестации.

6

Внедрение результатов исследования

Материалы диссертационного исследования используются в учебно-педагогическом процессе на кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета РНИМУ им. Н.ИЛирогова, в практической работе гинекологических отделений ГКБ №55, родильного дома №1 г. Москвы.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на совместной конференции кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова, врачей гинекологических отделений Московской городской клинической больницы №55 и сотрудников института общей генетики им.Н.И. Вавилова 29 марта 2011г, протокол №8.

Публикации результатов исследования

По теме диссертации опубликованы 4 научные работы, отражающие ее основное содержание, из них 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 134 страницах компьютерного текста, состоит из . введения, обзора литературы, 4 глав и заключения, посвященного результатам собственных исследований и их обсуждению, выводов, практических рекомендаций. Библиографический указатель содержит 184 источника, из них - 84 отечественных и 100 - зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и 2 таблицами.

Материалы и методы исследования

Клиническую часть работы проводили на базе кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

(заведующий кафедрой - заслуженный врач России, д.м.н., профессор О В. Макаров) в городской клинической больнице № 55 (гл. врач д.м.н. Белостоцкий А.В.) Результаты диссертационной работы основаны на данных комплексного клинико-лабораторного обследования 211 супружеских пар, из которых 130 пар с неразвивающейся беременностью включены в основную группу и 81 пара с реализованной репродуктивной функцией и отсутствием неразвивающихся беременностей в анамнезе составили контрольную группу. Диагноз неразвивающейся беременности (НБ) мы устанавливали, используя данные анамнеза, общего и специального гинекологического и дополнительных методов исследования (УЗИ, определение концентрации в крови хорионического гонадотропина). При постановке диагноза НБ пациенткам проводили инструментальное удаление измененного плодного яйца на фоне антибактериальной, утеротонической терапией. Случаи неразвивающейся беременности, сопровождающиеся грубыми нарушением эмбриогенеза (анэмбриония), из исследования были исключены. Абортивный материал, с согласия пациенток подвергался кариотипированию. Из нашего исследования были исключены все наблюдения, где выявлены численные или структурные аномалии кариотипа плода. Так же в исследование не вошли пары, оплодотворение у которых наступило с использованием донорских гамет. В соответствии с поставленньми задачами мы исследовали супружеские пары, у которых была выявлена НБ в 1 триместре беременности. Все беременные помимо клинических методов исследования прошли обследование, включавшее:

• Генотипирование с целью выявления полиморфизма в системе генов SOD2,Tp53, CYP1A1

• Бактериоскопическое исследование содержимого влагалища и цервикального канала

• Исследование клеток цервикального канала на наличие ДНК вируса простого герпеса I, II, Chlamidia trachomatis, Ureaplasma urealyticum,

Micoplasma hominis, цитомегаловируса, вирус папилломы человека методом полимеразной цепной реакции Молекулярно-генетическое обследование проведено 422 пациентам, из них 211мужчин, 211 женщин. Выделение ДНК из периферической крови выполняли с помощью набора реактивов DLAtomDNAprep 100 (IsogeneLab.Ltd, Россия) по протоколу производителя. Специальные методы исследования выполнены на базе Учреждения Российской Академии Наук Института общей генетики им Н.И.Вавилова, лаборатории экологической генетики (заведующий лабораторией д.б.н,- Рубанович A.B.)

Статистическая обработка данных производилась следующим образом:

1) Проверка нормальности распределения количественных признаков с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (адрес свободного доступа http://www.nsu.ru/mmf/tvims/chernova/ms/lec/node45.html).

2) Для оценки критерия значимости в двух независимых группах, представленных непараметрическими ранговыми величинами, использовали критерий X2 (Хи- квадрат) и критерия Фишера (пакет программ WinPePi, адрес свободного доступа http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html).

3) Для групп, представленных параметрическими величинами, использовали t-тест Стьюдента

4) В ряде случаев для оценки достоверности различий частот бинарных показателей использовали также трендовый тест Армитажа (адрес свободного доступа http://www.biomedcentral.eom/1753-6561/3/S7/S37).

5) Вклады различных генотипов в заболеваемость определяли с помощью традиционного для таких исследований показателя «oddsratio» (пакет программ WinPePi, адрес свободного доступа http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html.

Результаты исследований и их обсуждение

При анализе клинико-анамнестических данных установлена гораздо большая приверженность к табакокурению среди женщин контрольной

9

группы и мужчин основной группы, отягощенный гинекологический анамнез женщин основной группы, большее число беременностей и меньшее число родов у женщин основной группы, значительно большее количество бездетных пар среди обследованных основной группы.

Средний возраст обследуемых женщин в основной и контрольной группах достоверно не различался. В основной группе он варьировал от 18 до 43 лет и составил 28,45± 4,9 года. В контрольной группе он был несколько выше 29,7+4,6 года и колебался от 19 до 39 лет, однако достоверной разницы выявлено не было t= -1,77; р=0,078.

Мужчины в основной и контрольных группах были старше женщин. Средний возраст мужчин контрольной группы составил 31,7±6,4 года и колебался в пределах от 18 до 50 лет. В контрольной группе мужчины были несколько старше, так же как и женщины, средний возраст 32,4±4,9года, но достоверных различий по данному признаку не было t=0,84; р=0,402. Согласно цели нашего исследования для выявления значения полиморфизма генов SOD2, Тр53, CYP1A1606, CYP1A13801, CYP1A14889G в генезе НБ 1 триместра нами было произведено генотипирование вышеописанных групп. Опираясь на данные литературы (Carp H.J.A., Shoenfeld Y., 2009), носительство аллеля 47С гена SOD2 ассоциировано со сниженной продукцией фермента СОД. Очевидно, что этот негативный эффект будет наиболее выражен в случае гомозиготы, популяционная частота которой невелика, и составляет только 15% (Shimoda-Maetsubayashi S., 1996), что также косвенно свидетельствует о ее отрицательном фенотипическом проявлении.

Наши данные подтверждают вышеописанные утверждения, так как

генотип С/С в основной группе представлен с частотой 21,78% наблюдений

(п=27), тогда как в контрольной группе, у женщин без нарушений

репродуктивной функции, он был лишь на уровне 3,70% (п=3). Показатель

достоверно различался между группами р=0,0001). Мы сочли

целесообразным математически подтвердить взаимосвязь вышеописанного

ю

аллелыюго варианта с НБ и рассчитать вероятность риска НБ у носителей аллеля 47С гена SOD2. Было установлено, что аллельный вариант 47С гена SOD2 ассоциирован с повышенным риском НБ. По двустороннему точному критерию Фишера риск НБ при наличии аллеля 47С у женщин в 1,99 раз выше, чем при наличии альтернативного аллеля 47Т (OR=l,99, р=0,0013,95% доверительный интервал 1,31-3,02). Необходимо отметить, что в случае гомозиготного носительства аллеля данный риск увеличивается в 2 раза. При анализе частот альтернативной гомозиготы Т/Т нами были получены результаты, подтверждающие положительное значение аллеля Т в процессе гестации. Среди женщин основной группы с НБ его частота составила 30,64% (п=38), в контрольной группе данный показатель соответствовал 44,45% ( п=36), что явилось достоверно различимым (%2=4,04; р=0,0443). Очевидно, что в случае гомозиготного носительства Т/Т продукция фермента не страдает и позволяет поддерживать редокс баланс в организме женщины, несмотря на нарастающую оксидативную нагрузку, сопутствующую беременности.

Особый интерес представляет изучение гетерозиготного аллельного варианта SOD2-Т/С. В нашем исследовании достоверных различий по частотам данного генотипа между контрольной и основной группой установлено не было. И в той и в другой группе она находилась на уровне 50%, что полностью соответствует популяционным данным (Shimoda-Maetsubayashi S., 1996). Однако, поскольку в случаях гетерозиготного носительства особь имеет как отрицательно направленный аллель, коим является аллель С, так и фенотипически положительный аллель Т, клинически имеет большое значение итог их совместного влияния на проявление признака. Для того, чтобы это выявить мы применили специальный тест (Армитаж тест или трендовый тест) rhttp://www.biomedcentral.com/1753-6561/3/S7/S371. выявляющий доминирование того или иного аллеля. Полученные нами результаты указывали на то, что в данной ситуации имеет место неполное доминирование аллеля Т.

11

Клинически это проявлялось нормальным содержанием фермента СОД в организме, что достигалось, по всей видимости, его более активной продукцией, обусловленной необходимостью компенсировать негативный эффект аллеля С. Хотелось бы отметить, что отсутствие достоверных различий в частоте данного генотипа между группами, может также косвенно указывать на то, что проявление отрицательного влияния аллеля С зависит от компенсаторных способностей ферментативных систем.

При анализе результатов генотипирования отцов полученные данные полностью отразили вышеописанные закономерности женской части обследованных. Однако риск НБ в супружеской паре при носительстве аллеля С отцом был незначительно снижен по сравнению с аналогичной ситуацией у женщин. Шансы НБ при наличии аллеля 47С у мужчин в 1,7 раз выше, чем при наличии альтернативного аллеля 47Т (OR=l,7 р=0,01, 95% доверительный интервал 1,1-2,62). Поскольку носительство аллеля 47С ассоциировано с риском НБ в супружеской паре как у мужчин, так и у женщин справедливо предполагать, что проведение превентивных мероприятий матерям с НБ в анамнезе может быть рекомендовано по результатам генотипирования в случае обнаружения полиморфизма хотя бы у одного из супругов. Вероятно, профилактическое лечение в таком случае позволит снизить возможность рецидива НБ, обусловленного генетической несостоятельностью антиоксидантных систем плода.

Проведя анализ влияния различных генотипов SOD2 на прогрессирование беременности, мы сочли клинически важным установить на каких сроках гестации отрицательный эффект полиморфизма приобретает наибольшее значение. В результате сравнения женщин основной группы с различными сроками беременности, установленными при УЗИ, с контрольной группой, нами было отмечено, что для сроков беременности меньше или равных 8 недель процент носителей минорных аллелей был существенно ниже по сравнению с контрольной группой. В то же время при сроках больше 8 недель беременности установлено значительное

12

возрастание частот минорных аллелей у женщин основной группы по сравнению с контрольной. Учитывая эти результаты, мы сочли интересным установить степень риска остановки развития эмбриона в сроке до и после 8 недель беременности. В процессе анализа данных было выявлено, что риск НБ до 8 недель при наличии аллеля 47С у женщин в 1,89 раз выше, чем при наличии альтернативного аллеля 47Т (OR=l,89, р=0,007, 95% доверительный интервал 1,17-3,04), что являлось практически идентичным общим рискам, установленным для женщин , носителей аллеля 47 С.

Крайне интересным оказался результат изучения частот различных аллелей у женщин, потерявших беременность после 8 недель гестации. Оказалось, что риск потери беременности в этих сроках при наличии аллеля 47С у женщин в 2,25 раз выше, чем при наличии альтернативного аллеля 47Т (OR=2,25, р=0,005, 95% доверительный интервал 1,22-4,12). Этот факт, скорее всего, указывает на возрастающее влияние генных полиморфизмов на течение беременности после 8 недель, за счет интенсификации метаболических процессов, требующих большого количества кислорода. Несостоятельность антиоксидантной защиты в таких условиях делает риск потери беременности крайне высоким по сравнению с пациентками, не имеющими полиморфных генов. Представляется вероятным, что компенсаторные возможности женского организма достигают критического уровня к 8 неделям гестации, и невозможность поддержания редокс баланса становится фатальной для развивающегося эмбриона,

Следующим объектом нашего изучения стал полиморфизм гена Тр53 у супружеских пар с НБ. Среди обследованных нами пациенток генотип G\G представлен в основной группе в 63,96% наблюдений (п=71), что достоверно различалось с контрольной группой, в которой процент G\G составил 40% (п=24), (х2=4,64; р=0,0313). Столь явное указание на негативный эффект генотипа G\G представляется тем более интересным, если брать во внимание, что данный генотип среди европеоидов является наиболее распространенным и его популяционная частота составляет около 62% (Atwal G.S. Bond G.L.,

13

2007). Также необходимо отметить, что по данным Kang HJ. и соавт. (2009) указанный ген в настоящее время находится под эволюционным прессингом и его фенотипическое значение пересматривается, о чем дополнительно свидетельствуют значительные межконтинентальные различия частот генотипов Тр53. Так среди жителей Африканского континента частота G/G составляет лишь 25-30%.

Таким образом, несмотря на соответствие полученных нами данных общепопуляционным, фенотипическое значение аллеля G в гестации представляется спорным, на что указывает столь значительное превышение его гомозиготных носителей среди основной группы. Полученные нами результаты указывают на то, что чрезмерный апоптоз оказывает крайне негативный эффект на беременность. По всей видимости, роль протеина р53 в развитии беременности является неоднозначной и, равно как недостаточность апоптоза, может привести к бесплодию и привычной необъяснимой потере беременности в ранние сроки, так и чрезмерная активность проапоптотических белков способна отрицательно воздействовать на активно пролиферирующие ткани эмбриона.

При анализе частот гетерозиготного варианта обращает на себя внимание изменение соотношения генотипов между группами при появлении аллеля С. Таким образом, при гетерозиготном варианте в группе здоровых женщин процент носителей G/C составил 55% (п=33), тогда как в основной группе данный показатель был на уровне 36,04% (п=40), что явилось достоверно различимым результатом (у*=5,73\ р=0,0167). Такие различия указывают на фенотипически благоприятное влияние аллеля С на течение беременности.

Для оценки значения гетерозиготных генотипов необходимо выявить, насколько проявляется тот или иной признак в гетерозиготном состоянии. С этой целью мы провели Армитаж тест и установили, что проявление аллеля С присутствует в гетерозиготном состоянии, при неполном доминировании аллеля G. Установлена достоверно большая частота аллеля G в основной

14

группе и достоверно высокая частота аллеля С в контрольной группе (у^ 11,52; р=0,0007). Данный факт указывает на то, что даже при наличии гетерозиготного состояния фенотипически положительный эффект аллеля С достаточен для нормального прогрессирования беременности. Кроме того, подтверждением позитивного влияния аллеля С служит тот факт, что аллельный вариант С/С в группе женщин с НБ отсутствовал, а в группе контроля соответствовал 5% (п=3), несмотря на минорный характер генотипа С/С среди европеоидов.

Для достоверного подтверждения полученных результатов нами было вычислено отношение рисков у женщин, носителей различных аллелей гена Тр53. По двустороннему точному критерию Фишера при наличии аллеля 72G риск НБ у женщин в 2,91 раз выше, чем при наличии альтернативного аллеля 72С (OR=2,91, р=0,0001,95% доверительный интервал 0,63-0,88).

Можно предположить, что для успешного течения гестации, изоформа р53 72Рго, является более благоприятной, тогда как для осуществления имплантации плодного яйца необходимо присутствие 72Arg р53. Вышеперечисленное указывает на универсальность гетерозиготного генотипа, способного обеспечить фенотипическое присутствие обеих изоформ.

Примечательно, что результаты генотипирования мужчин на предмет полиморфизма Тр53 оказались практически идентичными женским. Генотип G/G у мужчин был представлен с достоверно большей частотой в основной группе, гетерозиготный генотип G/C в основной группе выявлен с частотой 34,62% (п=45), в контроле - 40,74% (п=33), что не явилось достоверно различимым, однако указывало на тенденцию к превалированию его частот в контроле. Гомозигота С/С как и у женской части обследованных не была представлена в основной группе, однако в контрольной группе ее частота составила 10,10% (п=9), что явилось достоверно различимым между группами (х2=15,09; р=0,001). Согласно двустороннему точному критерию Фишера при наличии аллеля 72G у мужчин риск НБ в супружеской паре в

15

1,81 раз выше, чем при наличии альтернативного аллеля 72С (OR=l,81, р=0,0018,95% доверительный интервал 0,33-0,92 ).

Мы попытались установить, на каких сроках гестации отрицательный эффект полиморфизма Тр53 наиболее значим, полагая, что аналогично полиморфизму SOD2, нарастающее влияние полиморфизма Тр53 будет более выражено после 8 недель беременности. И, действительно, были получены данные, свидетельствующие о нарастающем влиянии фенотипически неблагоприятных аллелей после 8 недель гестации.

Таким образом, различия между контрольной группой и группой женщин, потерявших беременность до 8 недель соответствовали результатам, полученным при сравнении всей основной группы с контролем.

Нами было вычислено отношение рисков НБ до 8 недель у женщин, носителей различных аллелей гена Тр53. По двустороннему точному критерию Фишера при наличии аллеля 72G риск НБ до 8 недель у женщин в 2,26 раз выше, чем при наличии альтернативного аллеля 72С (OR=2,26, р=0,005, 95% доверительный интервал 0,25-0,8). Эти результаты свидетельствуют о том, что степень риска потери беременности до 8 недель при носительстве аллеля 72G практически не отличается от аналогичного риска среди всех носителей данного аллеля основной группы.

Крайне интересными представляются результаты, полученные у

женщин со сроком остановки развития эмбриона в 8 нед и более.

Гомозиготный вариант G/G, у женщин с фактическим сроком гестации более

8 недель, был отмечен в 82,35% (п=26) наблюдений, тогда как в контрольной

группе этот параметр был на уровне 40,0% (п=24), результаты были

достоверны (x^lSJS; р=0,0001). Учитывая активную плацентацию и

нарастание свободнорадикальной нагрузки в сроке беременности 8 недель и

более, можно предположить, что чрезмерная индукция белка р53 у

носителей данного генотипа, влечет за собой мощный проапоптотический

эффект, переходящий в некроз. Носителей гетерозиготы G/C среди

основной группы было 17,64% (п=6), тогда как в контрольной- 55% (п=33),

16

что явилось достоверно различимым (%2= 12,47; р=0,0004). Как уже говорилось ранее, такой результат явился ожидаемым и подтвердил, протективный эффект аллеля С. Учитывая, что носители генотипа С/С не были выявлены среди женщин в нашей выборке, данные оказались сходными с результатом, полученным при сравнении основной группы с контрольной группы.

Несмотря на установленный ранее отрицательный эффект аллеля G, и усиление его влияния после 8 недель гестации, при вычислении соотношений рисков для различных сроков беременности нам представляется неожиданным столь высокий риск потери беременности при носительстве данного аллеля. По двустороннему точному критерию Фишера при наличии аллеля 72G у женщин риск НБ после 8 недель беременности в 6,61 раз выше, чем при наличии альтернативного аллеля 72С (OR=6,61, р=0,0001, 95% доверительный интервал 0,05-0,4).

При изучении полиморфизма CYP1A1606 у женщин основной группы мажорная гомозигота А/А присутствовала с достоверно большей частотой в основной группе, по сравнению с контролем. Учитывая этот факт, мы предположили, что аллель А у женщин может быть ассоциирован с повышенным риском НБ. Дальнейшее изучение частот гетерозиготного генотипа А/С также указывало на отрицательный фенотипический эффект аллеля А. Так А/С в основной группе составил 44,83% (п=52) наблюдений, в контрольной этот показатель был на уровне 69,23% (п=54), что было достоверно различимьм (х2=11,21, р=0,0008). Однако при проведении аддитивного теста нами было установлено, что аллель А не обладает доминированием по отношению к аллелю С, из чего следует вывод о том, что в данной ситуации присутствует эффект «дозы гена», при котором отрицательное влияние аллеля А становится значимым лишь в гомозиготном состоянии (AJA). Достоверных различий между частотами минорного генотипа С/С в контрольной и основной группе не выявлено. Возможно предположить, что гомозигота С/С является фенотипически нейтральной и не

17

оказывает патологического влияния на гестационный процесс. Нами было вычислено отношение рисков НБ у женщин, носителей различных аллелей гена СУР1А1А606С. По двустороннему точному критерию Фишера риск НБ у женщин не ассоциирован с наличием аллеля 606А.

При генотипировании мужчин контрольной и основной групп на предмет выявления полиморфизма СУР1А1А606С достоверных различий между контрольной и основной группой нами выявлено не было. По двустороннему точному критерию Фишера риск НБ у мужчин не ассоциирован с наличием аллеля 606А.

При изучении результатов генотипирования женщин с различными сроками прерывания беременности, как и в случаях с двумя вышеописанными генами, нами было установлено, что влияние фенотипически отрицательного генотипа становится наиболее выраженным у женщин после достижения срока гестации 8 недель. Согласно двустороннему точному критерию Фишера риск НБ до 8 нед гестации не ассоциирован с наличием аллеля 606А. У женщин, со сроком беременности больше 8 нед результаты отличались от полученных до 8 нед беременности. Было установлено, что процент женщин, носителей гомозиготы А/А, среди тех у кого беременность прервалась в сроке 8 недель и выше, составил 51,43% (п=18), тогда как в контрольной этот показатель был на уровне 19,23% (п=15). Этот результат явился достоверно различимым, что лишний раз подтверждает закономерность негативного влияния генных полиморфизмов после 8 недель гестации. Гетерозиготный вариант А/С в основной группе составил 40% (п=14) и отмечался достоверно реже, чем в контрольной 69,23% (п=54). Поскольку эффект доминирования того или иного аллеля может зависеть от особенностей обследуемой популяции, мы сочли важным провести аддитивный тест среди женщин-носителей полиморфных генотипов с прервавшейся после 8 недель беременностью. Нами были получены результаты, согласно которым установлено, неполное доминирование аллеля А в гетерозиготном состоянии. Частота аллеля А

18

достоверно выше в группе с прервавшейся после 8 недель беременностью, аллеля С - в контрольной группе (%2= 8,21; р=0,0042.)

Нами было вычислено отношение рисков НБ после 8 недель у женщин, носителей различных аллелей гена CYP1A1A606C. Достоверно установлено, что риск НБ в сроках после 8 недель беременности в 2,14 раз выше у носителей аллеля 606А, по сравнению с альтернативным аллелем 606С (OR=2,14, р=0,013, 95% доверительный интервал 0,24-0,89).

При генотипировании женщин контрольной и основной групп на предмет выявления полиморфизма следующего гена входящего, в гаплотип CYP1A1 - CYP1A1T3801C, достоверных различий между группами установлено не было. Согласно двустороннему точному критерию Фишера риск НБ не ассоциирован с аллелем 3801С.

У мужчин контрольной и основной групп достоверных различий между частотами генотипов CYP1A1T3801C также получено не было. Согласно двустороннему точному критерию Фишера риск НБ не ассоциирован с наличием аллеля 3801С у отцов.

Выводы

1. Аллельный полиморфизм генов SOD2, Тр53, CYP1A1A606C является фактором риска НБ.

2. Аллельный вариант 47 С гена SOD2 и 72 G гена Тр53 в супружеской паре ассоциирован с повышенным риском НБ I триместра. Негативный фенотипический эффект генов наиболее выражен в сроке 8-12 недель гестации.

3. Риск НБ I триместра в супружеской паре при наличии аллеля 47С гена SOD2 у женщин в 1,99 раза, а у мужчин - в 1,7 раза выше, чем при наличии альтернативного аллеля 47Т. У женщин, носителей аллеля 47С гена SOD2 шансы гибели эмбриона в сроке беременности 8-12 недель возрастают до 2,25 раза.

4. Риск НБ I триместра в супружеской паре при наличии аллеля 110 гена Тр 53 у женщин в 2,91 раз выше, у мужчинв 1,81 раз выше, чем при наличии альтернативного аллеля 72С. Вероятность НБ с 8 до 12 недель гестации в 6,61 раз выше. Риск остановки развития эмбриона, в данном гестационном сроке в 2,93 раза превышают тот же риск до 8 недель беременности.

5. Аллельный вариант 606А гена СУР1А1А606С у женщин ассоциирован с повышенным риском НБ I триместра только в гомозиготном состоянии. Риск НБ в супружеской паре не ассоциирован с аллельным полиморфизмом гена СУР1А1А606С у отцов.

6. Негативный фенотипический эффект аллеля 606А гена С¥Р1А1А606С на течение беременности наиболее выражен в сроке 8-12 недель гестации. Риск потери беременности в этот период в 2,14 раз выше, по сравнению с носителями альтернативного аллеля 606С.

7. Аллельный полиморфизм генов СУР1А1А4889С, СУР1А1Т3801С, гаплотипа СУР1А1, не оказывает отрицательного фенотипического эффекта на течение гестации.

Практические рекомендации

1. Супружеским парам с НБ в анамнезе рекомендовано комплексное обследование с включением генотипирования, на предмет выявления полиморфизмов генов 5002, Тр53, СУР1А1А606С для формирования групп риска рецидива НБ.

2. Назначение антиоксидантной терапии с целью предгравидарной подготовки и во время беременности пациенткам, носителям отрицательно направленных аллелей может считаться этиопатогенетически обоснованным.

3. Проведение антиоксидантной терапии женщинам в супружеской паре с НБ в анамнезе показано даже в том случае, если носителем отрицательно направленных аллелей является только супруг.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Хашукоева А.З., Никулин Б.А., Маматиева М.А., Ходжаева Д.А. Особенности метаболического резерва фагоцитов и антиоксидантная активность крови при привычном невынашивании беременности в первом триместре // Вестник РГМУ-2009. - №4. - стр. 22-26.

2. Барцева О.Б., Ходжаева Д.А., Хандогина Е.К., Мутовин Г.Р. Геномные мутации при неразвивающейся беременности: предварительные результаты //Вопросы репродукции-2008г,- №4. - стр. 66-70.

3. Ходжаева Д.А., Лунина С.Н., Луценко H.H. Роль полиморфизма гена SOD2 у женщин в генезе неразвивающейся беременности //Вестник РГМУ-2011- специальный выпуск №2-134-136.

4. Ходжаева Д.А. Геномные мутации при неразвивающейся беременности I триместра. //Вестник РГМУ-2008-специальный выпуск, №3 (62), 67-70.

Заказ № 386. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.(499)250-92-06 www.postator.ru