Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Диагностическая и прогностическая значимость противомикробных пептидов у женщин с неразвивающейся беременностью

005055409

На правах рукописи

ДВОРЕЦКАЯ ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ У ЖЕНЩИН С НЕРАЗВИВАЮЩЕЙСЯ БЕРЕМЕННОСТЬЮ

14.01.01 — акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 2 НОЯ 2012

Москва-2012

005055409

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Макаров Олег Васильевич

доктор медицинских наук,

профессор Ганковская Людмила Викторовна

Официальные оппоненты:

Кузьмин Владимир Николаевич - доктор медицинских наук, профессор кафедры репродуктивной медицины и хирургии факультета последипломного образования ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И.Евдокимова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Мурашко Андрей Владимирович - доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация

ГБУЗ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Министерства здравоохранения Московской области

Защита диссертации состоится «3» декабря 2012 года в 14.00 на заседании Диссертационного совета Д 208.072.12 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России адресу: 117997,

г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «3» ноября 2012 года

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Хашукоева Асият Зульчифовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время проблема неразвивающейся беременности (НБ) остается одной из ведущих в современном акушерстве. Актуальность данной проблемы связана с распространенностью этой патологии в структуре репродуктивных потерь, составляющей 10-20% (Баранов B.C., 2004; Серова О.Ф., 20011). Среди этиологических факторов неразвивающейся беременности, наряду с генетическими, аутоиммунными, выделяют роль урогенитального инфицирования и гормональных нарушений у беременных. Влияние инфекции на течение беременности в 1 триместре объясняется высоким уровнем инфекционной заболеваемости беременных, приводящей к развитию акушерской патологии. Среди инфекций, являющихся причиной неразвивающейся беременности, выделяют вирусную (цитомегаловирус, вирус простого герпеса, вирусы Коксаки А и В, энтеровирусы), бактериальную (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, стрептококки, стафилококки, гонококки) и грибы. Следующей причиной неразвивающейся беременности можно назвать гормональные нарушения. Известно, что у 2132% женщин с невынашиванием беременности в анамнезе выявлена гиперандрогения (Раисова А.Т.,1999).

Однако не ясно, почему в одних случаях инфекционные агенты и изменения в гормональном статусе женщины приводят к неразвивающейся беременности, а в других - практически не влияют на ее течение.

Для понимания механизмов этиологии и патогенеза неразвивающейся беременности представляются перспективными исследования в области иммунологии репродукции. Для нормального течения беременности, процессов имплантации, роста и развития эмбриона необходимо состояние локальной иммуносупрессии, которое может быть обеспечено в организме матери сбалансированным действием гормонов, простагландинов, j?

/

регуляторных молекул иммунной системы (цитокинов, хемокинов, противомикробных пептидов и др.)

В настоящее время активно изучается роль системы врожденного иммунитета в защите репродуктивной системы женщины. Врожденный иммунитет предотвращает развитие инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще не задействованы, а при беременности - супрессированы (Макаров О.В., 2007; Сухих Г.Т., 2010). В последние годы исследуется структура и функции нового класса эффекторных молекул врожденного иммунитета - противомикробных пептидов (ПМП), представляющих собой естественные эндогенные антибиотики с прямым противовирусным, противобактериальным, противогрибковым действием. ПМП формируют молекулярную основу врожденного иммунитета и участвуют в реализации ряда защитно-приспособительных реакций (Коряков В.Н., 2006). ПМП обнаружены во всех тканях, имеющих контакт с микроорганизмами (кожа, слизистая дыхательных путей, пищеварительный и урогенитальный тракт и др.). Особое значение приобретают противомикробные пептиды в репродуктивной системе женщины при беременности, так как они защищают от инфекции не только материнский организм, но и организм плода.

Отсутствуют работы по анализу противомикробных пептидов в первом триместре беременности, в частности, в слизистой цервикального канала и в периферической крови у женщин с физиологически протекающей беременностью. В настоящее время остается неясным вопрос, какую роль противомикробные пептиды играют в репродуктивной системе женщины при неразвивающейся беременности. Комплексный анализ противомикробных пептидов в вышеуказанных биологических материалах поможет определить возможные критерии риска неразвивающейся беременности, ее ранней диагностики, а также позволят провести отбор пациенток для своевременного лечения. Помимо этого представляется возможность обоснования необходимости применения новых препаратов на основе

4

противомикробных пептидов для коррекции врожденного иммунитета репродуктивной системы у женщин с неразвивающейся беременностью.

Цель исследования

Комплексное исследование уровня противомикробных пептидов (НЫР1-3, ЬЬ37, Н1Ш1) и экспрессии гена Т1Л12 крови и слизистой цервикального канала и определение их значимости в диагностики и прогнозировании неразвивающейся беременности.

Задачи исследования

1. Провести комплексное клинико-лабораторное обследование беременных с неразвивающейся беременностью.

2. Исследовать уровни противомикробных пептидов (ПМЧ-З, ЬЬ37, НВШ) и экспрессии гена ТЬЯ2 в цервикальном канале и а-дефенсинов (НИР 1-3) в плазме крови женщин с физиологически протекающей беременностью

3.Изучить уровни противомикробных пептидов в слизистой цервикального канала и периферической крови у женщин с неразвивающейся беременностью.

4. Оценить роль противомикробных пептидов, как возможных маркеров неразвивающейся беременности.

Научная новизна исследования

Получены новые данные об экспрессии противомикробных пептидов (дефенсинов и кателицидинов) на локальном и системном уровне у женщин с физиологически протекающей беременностью. При беременности увеличивается экспрессия а-дефенсинов НЫР-1-3 в плазме крови и возрастает экспрессия генов молекул врожденного иммунитета НЕШ-1 в слизистой цервикального канала, что обеспечивает защиту женщины и плода от различных патогенов.

В результате комплексного исследования ПМП у женщин в плазме и слизистой цервикального канала получены новые данные, связанные с патогенезом и диагностикой неразвивающейся беременности. Впервые получены данные о снижении экспрессии генов То11-подобного рецептора 2 (ТЫ12) и противомикробного пептида ЬЬ-37 у беременных с неразвивающейся беременностью и гиперандрогенией, что свидетельствует о супрессии врожденного иммунитета на уровне слизистой цервикального канала у этих пациенток.

При неразвивающейся беременности наблюдается снижение уровня а-дефенсинов (НЫР-1-3) в плазме крови, что может свидетельствовать о супрессии эффекторных механизмов врожденного иммунитета на системном уровне.

Практическая значимость работы

На основании анализа противомикробных пептидов (НОТ-1-3) в плазме крови определены маркеры неразвивающейся беременности.

Уменьшение концентрации НЫР-ЬЗ в плазме крови (менее 0,1 нг/мл) в 70% определяется у женщин с неразвивающейся беременностью. Резкое снижение концентрации а-дефенсинов (НЫР-1-3 ) в плазме крови беременных может служить одним из диагностических критериев неразвивающейся беременности.

Диагностика нарушений врожденного иммунитета (снижение экспрессии противомикробных пептидов и распознающего рецептора ТЬГ12) в слизистой цервикального канала позволяет прогнозировать развитие осложнений во время беременности и определить показания к назначению иммунокорригирующей терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. При физиологической беременности увеличивается экспрессия а-дефенсинов ГШР-1-3 в плазме крови и возрастает экспрессия генов молекул врожденного иммунитета НВБ-1 и ТЬЕ2 в слизистой цервикального канала

2. У женщин с НБ выявлено достоверное снижение уровня а-дефенсинов (I1ЫР-1 -3) в плазме крови по сравнению со здоровыми беременными. У 40% беременных НИР-1-3 не определяется в плазме крови.

3. При гиперандрогении у женщин с НБ наблюдается достоверное снижение экспрессии гена Т1Ю по сравнению со здоровыми беременными в 1-м триместре гестации.

4. Снижение уровня а-дефенсинов НИР-1-3 в плазме крови менее 0,1 нг/мл и увеличение концентрации кателицидина ЬЬ-37 более 2000 пк/мл у беременных в 1 триместре могут явиться маркерами НБ.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты проведенных исследований внедрены в практику работы гинекологических отделений ГКБ №55 и ГКБ №4 г. Москвы, а также используются в учебном процессе кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета №1 ГБОУ ВПО РНИМУ им.Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета РНИМУ им Н.И. Пирогова, кафедры иммунологии РНИМУ им Н.И. Пирогова, врачей гинекологических отделений ГКБ №55 26 июня 2012г, протокол №12.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 работ, из них 3 — определенных перечнем ВАК Минобрнауки РФ.

в изданиях,

Личное участие автора

Автором лично проведена работа по клиническому и инструментальному обследованию тематических больных, анализу клинико-лабораторных и инструментальных исследований, статистическая обработка полученных данных и анализ результатов исследования.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 94 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, клинической характеристики пациенток и методов обследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя литературы, включающего 121 источник, из них - 54 отечественных и — 67 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 1 таблицей и 20 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Данное исследование проведено на клинических базах кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздравсоцразвития (заведующий кафедрой - д.м.н., профессор, Засл. Врач РФ Макаров О.В.) в гинекологических отделениях ГКБ №55 г. Москвы (и.о. главного врача - Бышов A.A.), в родильном доме при городской больнице №8 (главный врач - к.м.н. Дуленков А.Б.), женской консультации при родильном доме №10 (главный врач - Озимковская Е.П.) и на кафедре иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова (заведующий кафедрой - д.м.н., проф. Ковальчук Л.В.). Изучение

экспрессии генов противомикробных пептидов проводили в лаборатории диагностики вирусных инфекций ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (заведующая лабораторией молекулярной иммунологии - д.м.н. Свитич О.А.).

Диссертационная работа основана на результатах клинико-лабораторного обследования 126 пациенток. Основная группа представлена 47 беременными с неразвивающейся беременностью, которым выполнено инструментальное удаление измененного плодного яйца на сроках 5-13 недель беременности. Средний возраст пациенток основной группы составил 28,3±4,2 лет.

Первую группу сравнения составила 21 небеременная здоровая женщина (группа I) практически того же возраста, что и пациентки в основной группе - 29,7±4,6 года.

Во вторую группу сравнения вошли 58 пациенток с физиологически протекающей беременностью, которые были подразделены на 3 подгруппы: 20 женщин с физиологически протекающей беременностью на сроке 5-13 недель составили Па подгруппу; во Нб подгруппу вошли 20 беременных на сроках гестации 28-34 недели, а 18 женщин, которым в первом триместре был сделан аборт по показаниям представлены в подгруппе Ив). Средний возраст 28,5±3,9 лет.

Диагноз неразвивающейся беременности (НБ) мы устанавливали, используя данные анамнеза, общего и специального гинекологического исследования и дополнительных методов исследования (УЗИ, определение концентрации в крови хорионического гонадотропина).

При постановке диагноза НБ пациенткам проводили инструментальное удаление измененного плодного яйца с последующей антибактериальной, утеротонической терапией. Случаи неразвивающейся беременности, сопровождающиеся грубыми нарушением эмбриогенеза (анэмбриония), из исследования были исключены.

Всем пациенткам было проведено клинико-лабораторное обследование, которое включало в себя:

1. Подробный сбор анамнестических данных:

2. Объективный осмотр:

3. Гинекологический осмотр:

4. Дополнительные методы обследования:

- 1Ш, ВН4, НВБ, НСУ

- Определение группы крови, резус-фактора, КЕЬЬ

- Клинический анализ крови

- Биохимический анализ крови

- Коагулограмма

- Общий анализ мочи -ЭКГ

- УЗИ органов малого таза

- Определение в крови концентрации хорионического гонадотропина

- Определение стероидного профиля мочи для исключения или подтверждения гиперандрогении

Бактериоскопическое исследование содержимого влагалища и цервикального канала

- Исследование клеток цервикального канала на наличие ДНК вируса простого герпеса I, II типов, хламидий, уреаплазмы, микоплазмы, цитомегаловируса, вируса папилломы человека методом полимеразной цепной реакции.

Ультразвуковое исследование органов малого таза проводили с помощью аппарата Уо1иБоп Е8 фирмы вЕ с использованием мультичастотного микроконвексного внутриполостного ректо-вагинального датчика с частотой 4.0-11.0 МГц. При проведении исследования оценивали размеры матки, состояние эндометрия и миометрия,

эхоструктуру яичников. Особое внимание уделяли размерам эмбриона и плодного яйца, особенностям имплантации и хориона.

ю

Для определения срока гестации, при котором произошла гибель плодного яйца, проводили измерение копчико-теменного размера (КТР) эмбриона и средний внутренний диаметр плодного яйца (СДВ). При сомнении в достоверности постановки диагноза НБ проводили повторное исследование через 3-5 дней.

Иммунологические методы исследования заключались в определении уровней дефенсинов и кателицидинов в плазме периферической крови обследуемых пациентов. Уровни исследуемых противомикробных пептидов определялись с помощью иммуноферментного анализа. Для определения уровня НЫР-1 и ЬЬ-37 в плазме периферической крови использовали наборы для иммуноферментного определения человеческих НЫР1-3 (дефенсинов нейтрофилов) и для иммуноферментного определения человеческих ЬЬ-37 фирмы НВТ (Нидерланды).

Молекулярно-биологические методы состояли из нескольких этапов:

1. Получение клеток слизистой цервикального канала. Взятие клеток слизистой цервикального канала проводили во время осмотра при помощи зеркал. Для получения клеток слизистой цервикального канала перед взятием материала удаляли слизь, помещали ее в чистый эппендорф (для проведения в последующем иммуноферментного анализа) и обрабатывали шейку матки стерильным физиологическим раствором. Затем цитощеткой «Юнона» осторожными вращательными движениями проводили взятие материала. Далее клетки слизистой аккуратно переносили в эпендорф, содержащий культуральную среду Игла, полученную клеточную взвесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут. Клеточный осадок в дальнейшем был использован в работе.

2. Выделение общей РНК из клеток слизистой цервикального канала проводилось методом кислофенольной экстракции.

3. Реакцию обратной транскрипции проводили для синтеза на матрице мРНК к ДНК интересующего гена для последующего определения числа копий с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени.

11

4. Полимеразная цепная реакция в реальном времени. Последовательность праймеров для исследуемых генов подбирали с помощью программы Vector NTI, анализируя последовательность интересующих генов, полученную из GenBank. Прибор АНК-32 позволял анализировать образцы ДНК/РНК в динамическом диапазоне от 1 до 109 копий, одновременно детектировали 4 красителя (FAM/SYBR Green, ROX, R6G, Су5) в одной пробирке. Полученные результаты были обработаны с помощью программного обеспечения, которое прилагалось к прибору АНК-32 (количество копий было получено в десятичных логарифмах). Результаты оценивали относительно 1 млн. копий гена актина человека.

5. Электрофорез в агарозном геле. Для дополнительного подтверждения специфичности ПЦР-продукта проводили электрофорез в 2% агарозном геле с бромистым этидием (Helicon, Россия) в присутствии набора ДНК маркеров с известными длинами (lOObp DNA ladder, Сибэнзим, Россия). Заливали гели в формы с «гребенками». Разделение проводили в 1х буфере ТАЕ при напряжении 100В в течение 30 мин. В состав пробы входило 10 мкл ПЦР-продукта и 10 мкл 1х буфера для нанесения проб (СибЭнзим, РФ).

Статистическую обработку материала проводили методами вариационной статистики. Для статистического анализа были использованы следующие методы:

1. Проверка нормальности распределения количественных признаков с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (адрес свободного доступа http://www.nsu.ru/mmf/tvims/chernova/ms/lec/node45.html).

2. Для оценки критерия значимости в двух независимых группах, представленных непараметрическими ранговыми величинами, использовали критерий у2 (Хи-квадрат) и критерия Фишера (пакет программ WinPePi, адрес свободного доступа http://www.brixtonhealth.com/pepi4windows.html).

3. Для групп, представленных параметрическими величинами, использовали t-тест Стьюдента.

4. Для определения достоверности различий между выборками, учитывая различную дисперсию и ненормальное распределение значений, применяли непараметрические статистические методы (критерий Манна-Уитни с поправкой Йейтса).

5. Оценку корреляционной зависимости для непараметрических ранговых величин проводили по методу Спирмена (Я).

Выборочные параметры, приводимые далее в таблицах и рисунках, имеют следующие обозначения: М - среднее, б - стандартное (среднеквадратичное) отклонение, п - объем анализируемой подгруппы, р -достигнутый уровень значимости.

Различия между сравниваемыми величинами признавали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Возраст обследованных нами пациенток варьировал от 24,1 и до 32,5 лет, средний возраст составил 28,3±4,5 лет. Группы были сопоставимы по возрасту.

Основным поводом госпитализации в стационар пациенток основной группы послужило осложненное течение данной беременности - выявление по данным гинекологического осмотра, УЗИ неразвивающейся беременности.

Нами у обследованных пациенток выявлена более высокая частота работающих с компьютером (почти в два раза), а так же испытывающих постоянный стресс на производстве или дома. Из вредных привычек женщины как основной, так и контрольной групп курили без статистически достоверной разницы.

Из обследованных нами 126 пациенток у 14,8% была выявлена различная сопутствующая экстрагенитальная патология. Наиболее часто встречались хронические воспалительные заболевания: хронический

13

бронхит (28,6%), хронический тонзиллит и хронический фарингит (13,3%), хронический цистит (13,3%), хронический пиелонефрит (5,7%), хронический гастрит (13,3%) как в основной, так и в контрольной группах примерно с одинаковой частотой.

При изучении менструальной и репродуктивной функции в основной группе чаще встречались дисфункция яичников (17,1%), так же хронические воспалительные процессы - хронический цервицит (40,4%), эктопия шейки матки (36,2%), хронический сальпингоофорит (19,2%), хронический эндометрит (6%), бактериальный вагиноз (17,1%) с обнаружением бактериальной, вирусной и смешанной инфекции.

У большинства обследованных нами пациенток данная беременность была первая. Естественно возникает вопрос о прогнозировании, течении настоящей беременности, возможных осложнениях и разработки профилактики и лечения, учитывая возможный инфекционный процесс и условия для репродуктивной потери.

Работами отечественных и зарубежных ученых показано, что при беременности происходит активация системы врожденного иммунитета на фоне супрессии адаптивного (Сухих Г.Т., 1997). Наши исследования дополнили эти данные. Анализ экспрессии гена ТЫ12 клетками цервикального канала у женщин с физиологически протекающей беременностью выявил достоверное увеличение экспрессии гена ТЫ12 в I триместре (рис.1).

Полученные нами данные показали, что экспрессия р-дефенсина-1 клетками цервикального канала достоверно возрастает при беременности в первом триместре по сравнению с таковой у небеременных женщин (р<0,05). Также следует отметить, что к третьему триместру уровень экспрессии гена НВО-1 снижается у женщин с физиологически протекающей беременностью, но остается выше, чем в группе сравнения I.

TLR2

здоровые беременные здоровые беременные здоровые

I триместр II триместр небеременные

Рис. 1. Экспрессия гена TLR2 клетками слизистой цервикального канала у женщин с физиологически протекающей беременностью (в I и III триместрах) и у небеременных женщин.

Примечание: * - значение достоверно отличается от значения в группе небеременных женщин (р<0,05);

- значение

достоверно

отличается (Р<0,05).

от значения

группе беременных женщин в I триместре

На рисунке 2 представлены данные экспрессии гена HBD-1 клетками слизистой цервикального канала здоровых беременных (I и III триместр) (подгруппы IIa и 116) и здоровых небеременных женщин (группа I).

Известно, что в отличие от ß-дефенсинов, имеющих местное действие, а-дефенсины представляют собой молекулы системного действия. Их выброс из гранул нейтрофилов в кровь является одним из регуляторных механизмов стимуляции врожденного и адаптивного иммунитета за счет угнетения продукции глюкокортикостероидов, обладающих подавляющим действием на иммунные реакции и вызывающих формирование иммунодефицитного состояния. Данное положение послужило причиной изучения уровня а-дефенсинов HNP-1 в плазме крови здоровых беременных женщин. Анализ уровня (HNP1-3) выявил достоверное увеличение концентрации этих

пептидов в плазме здоровых беременных по сравнению с группой небеременных (р<0,05).

НВО-1

3,7*

О 'Г'' >

здоровые беременные здоровые беременные здоровые

1триместр И триместр небеременные

Рис.2. Уровень экспрессии гена НЕШ-1 в клетках слизистой цервикального канала у здоровых беременных и небеременных женщин.

Примечание: * - значение достоверно отличается от значения в группе небеременных женщин (р<0,05).

Полученный результат можно объяснить активацией нейтрофилов -основных клеток, высвобождающих НЫР1-3. При беременности происходит увеличение количества нейтрофилов в периферической крови и их активация. Таким образом можно предположить, что уровень а-дефенсинов в плазме крови коррелирует с активацией нейтрофилов (рис.3).

На основании полученных данных можно сделать вывод, что при беременности происходит увеличение экспрессии генов р-дефенсина НЕШ-1 и ТЬЯ2, осуществляющих защиту матери и плода от патогенов на уровне слизистых. В периферической крови возрастает концентрация нейтрофильных а-дефенсинов, регулирующих системный воспалительный ответ и обладающих прямым противомикробным действием. Концентрация

кателицидина ЬЬ-37 несколько снижена в группе беременных женщин.

16

физиологически небеременные

протекающей беременностью

Рис.3. Концентрация НЫР1-3 в плазме крови у обследованных женщин.

Примечание: * - значение достоверно отличается от значения в группе небеременных женщин (р<0,05).

Далее нами проведены исследования по изучению экспрессии ПМП у женщин с неразвивающейся беременностью. Эта группа была неоднородной, и среди обследованных женщин у 29,0 % определялась гиперандрогения, у 23,7% - хронический сальпингоофорит. В дальнейшем нами были проанализированы уровни экспрессии генов ТЬЯ2 и НВБ-1 у женщин этих групп. Нами установлено, что у пациенток с неразвивающейся беременностью и гиперандрогенией выявлены изменения в системе врожденного иммунитета на уровне слизистой цервикального канала, выражающиеся в снижении экспрессии ТЬГ12 по сравнению с группой здоровых беременных. Известно, что андрогены супрессируют функциональную активность клеток врожденного иммунитета, в частности, фагоцитоз, выработку цитокинов, кислородных радикалов макрофагами (Уата§исЫ Т., 2001), экспрессию ТЬЯ4 (Яейе\у .ТА., 2008)

Наши данные о снижении экспрессиии ТЬЯ2 в слизистой

цервикального канала позволят в дальнейшем подойти к пониманию

17

механизмов патогенеза неразвивающейся беременности при гиперандрогении. Известно, что так называемые сигналы опасности (белки теплового шока, модифицированный коллаген, фибриноген и др.), появляющиеся в дефектных, разрушившихся или подвергшихся стрессу клетках организма распознаются также в основном ТЫ12. При неразвивающейся беременности эндогенные лиганды появляются, но снижение экспрессии распознающих рецепторов не обеспечивает достаточной активации эффекторных механизмов врожденного иммунитета, таких как выработка противомикробных пептидов, провоспалительных цитокинов и др., и в организме развивается тяжелейший патологический процесс.

Об этом свидетельствует и значительное уменьшение в плазме крови женщин с неразвивающейся беременностью концентрации нейтрофильных а-дефенсинов НЫР-1-3 - ПМП, вовлеченных в системные иммунные механизмы. У 40,0 % пациенток с неразвивающейся беременностью ШМР-1-3 вовсе не определяются в плазме, у 30,0 % - его концентрация менее 0,1 нг/мл. Полученные нами данные позволяют считать, что уменьшение концентрации НЫР-ЬЗ в крови беременных может служить диагностическим критерием невынашивания беременности.

Концентрация 1Х-37 у женщин с неразвивающейся беременностью в слизи цервикального канала была достоверно выше группы здоровых беременных и сопоставима с показателями небеременных женщин (рис 4).

Можно предположить, что увеличение концентрации кателицидина IX-37 - неблагоприятный прогностический признак и может свидетельствовать об увеличении количества нейтрофилов в слизи, их гибели и высвобождении 1Х-37 из гранул.

Согласно проведенных нами исследованиям у женщин при нормальном течении беременности уровень противомикробных пептидов НИР 1-3 в плазме крови повышался по сравнению с небеременными женщинами, что

свидетельствует об активации гуморальных компонентов врожденного иммунитета на системном уровне при беременности.

2882,0

а> ■3 х о

пациентки с гиперандрогенией

пациентки без гиперандрогении

Рис.4. Изменение концентрации кателицидина ЬЬ-37 в слизи цервикального канала женщин с неразвивающейся беременностью

Примечание: * — значение достоверно отличается от показателя в группе пациентов без гиперандрогении (р<0,05).

Нами у пациенток с неразвивающейся беременностью была определена концентрация ИКР 1-3 в плазме крови и установлено, что средние показатели НМР1-3 были достоверно ниже, чем в подгруппах сравнения Па и Пв (р<0,05) и составили 0,018±0,012 нг/мл.

При анализе индивидуальных данных нами выявлено, что «нулевые» значения Н№1-3 в плазме крови пациенток с неразвивающейся беременностью встречались у 42,0 % пациенток, концентрация нейтрофильных пептидов до 0,1 нг/ мл - у 31,0 %, более 0,1 нг/мл - лишь у 27,0 % пациенток. В то же время нами установлено, что у здоровых беременных НКР1-3 определялись всегда, причем почти у 70,0 % пациенток

концентрация нейтрофильных пептидов была в диапазоне от 0,1 нг/мл до 1,0нг/мл, а у 25,0 % пациенток - выше 1,0нг/мл (рис. 5).

0 нг/мл 0 - ОД нг/мл ОД -1 нг/мл более 1 нг/мл

■ пациентки с неразвивающейся беременностью ■ здоровые беременные

Рис.5. Концентрация а-дефенсинов НИР 1-3 в плазме крови женщин с неразвивающейся беременностью и здоровых беременных.

Нами установлено, что у пациенток с гиперандрогенией изменения концентрации НИР-1-3 в плазме крови не отличались от основной группы. У 72,0 % пациенток показатели нейтрофильных пептидов были менее 0,1 нг/мл (рис.6). Полученные нами данные выявили совершенно другие механизмы при урогенитальной инфекции: экспрессия ТЬЯ2 возрастает в несколько раз, что приводит к продукции провоспалительных цитокинов и прерыванию беременности, а концентрация НЫР-1-3 в плазме крови при УГИ превышает аналогичные показатели при неразвивающейся беременности.

Таким образом, определение концентрации нейтрофильных пептидов в плазме крови может служить надежным методом в диагностике и прогнозировании течения различной патологии беременности.

О нг/мл 0 - ОД нг/мл ОД - 1 нг/мл более 1 нг/мл

Рис.6. Концентрация а-дефенсинов НИРЬЗ в плазме крови женщин с неразвивающейся беременностью и беременных с гиперандрогенией.

Методы оценки врожденного иммунитета (определения экспрессия генов ТЬЯ2 в слизистой репродуктивной системы в комплексе с оценкой противомикробных пептидов и цитокинов) позволят вскрыть механизмы патогенеза патологии беременности, открыть новые маркеры патологии и обосновать назначение иммунотропных препаратов, действие которых направлено на регуляцию врожденного иммунитета (противомикробных пептидов, агонистов То11-подобных рецепторов, противовоспалительных цитокинов, растворимых рецепторов и др.).

выводы

1. При физиологической беременности увеличивается экспрессия а-дефенсинов НЫР-1-3 в плазме крови и возрастает экспрессия генов молекул врожденного иммунитета НВО-1 и ТЬЯ2 в слизистой цервикального канала, что обеспечивает защиту женщины и плода от различных патогенов на системном и локальном уровнях.

2. У женщин с неразвивающейся беременностью выявлено достоверное снижение уровня а-дефенсинов (НЫР-1 -3 ) в плазме крови по сравнению со здоровыми беременными. У 40% беременных НЫР-1-3 не определялся в плазме крови. Это позволит с высокой чувствительностью прогнозировать неразвивающуюся беременность.

3. У пациенток с неразвивающейся беременностью и гиперандрогенией наблюдается достоверное снижение экспрессии гена ТЬИ2 по сравнению со здоровыми беременными в 1-м триместре гестации.

4. Снижение уровня а-дефенсинов Н№-1-3 в плазме менее 0,1 нг/мл и увеличение концентрации кателицидина 1Х-37 более 2000 пк/мл у беременных в 1 триместре могут явиться маркерами неразвивающейся беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Факторами риска неразвивающейся беременности являются:

- хронические воспалительные заболевания органов малого таза

- наличие урогенитапьной инфекции в анамнезе

- увеличение концентрации андрогенов.

2. Для своевременного прогнозирования неразвивающейся беременности в комплекс обследования целесообразно включить оценку врожденного иммунитета с определением в 1 триместре гестации концентрации а-дефенсинов НИР-1-3 в плазме крови. При отсутствии пептидов в плазме или их концентрации менее 0,1нг/мл пациенты включаются в группу риска по неразвивающейся беременности и угрозе прерывания и проходят целенаправленное обследование и соответствующую терапию.

3.Увеличение концентрации кателицидина ЬЬ-37 в слизи цервикалыюго канала более 2000 пг/мл позволяет отнести данных пациенток в группу риска по угрозе прерывания и неразвивающейся беременности.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Дворецкая Е.В. Профилактика гнойно-септических осложнений при неразвивающейся беременности. /Озолиня Л.А., Нечипоренко O.A., Дворецкая Е.В., Алиева М.А.,. Кузнецов П.А. // Диагностика, лечение и реабилитация. Материалы научно-практической конференции, посвященные 50-летию ГКБ№55. - Москва. - 2006. - с. 59-63.

2. Дворецкая Е.В. Состояние некоторых факторов локального иммунитета шейки матки при невынашивании беременности бактериально-вирусной этиологии и применение препарата «Эпиген-интим». /Озолиня Л.А., Сумеди Т.Н., Дворецкая Е.В. // Акушерство и гинекология. - 2007. - №6. - с. 43-48.

3. Дворецкая Е.В. Анализ противомикробных пептидов человека в биологических жидкостях. / Карташов Д.Д., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Ганковская O.A., Щукина A.B., Дворецкая Е.В. //Российский аллергологический журнал.-2009. - №3.- Выпуск 1. - с. 354-357.

4. Дворецкая Е.В. Нарушение микробиоциноза влагалища как фактор невынашивания беременности. / Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Свитич O.A., Романовская В.В., Кузнецов П.А., Магомедова A.M., Дворецкая Е.В.//Лечение и профилактика. - 2012.-№ 1(2). - С. 39-44.

5. Дворецкая Е.В. Прогностическое значение экспрессии генов молекул врожденного иммунитета (TLR2, TLR4 и HBD1) при невынашивании беременности. /Бахарева И.В., Ганковская Л.В., Ковальчук Л.В., Свитич O.A., Романовская В.В., Кузнецов П.А., Магомедова A.M., Дворецкая Е.В. // Лечащий врач. — №9. - 2012. - с. 84-89.

Подписано в печать:

02.11.2012

Заказ № 7789 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

В настоящее время проблема неразвивающейся беременности остается одной из ведущих проблем в современном акушерстве. Актуальность данной проблемы связана с распространенностью этой патологии в структуре репродуктивных потерь, составляющей 10-20% (2, 39). Среди этиологических факторов неразвивающейся беременности наряду с генетическими, аутоиммунными, выделяют роль урогенитального инфицирования и гормональных нарушений у беременных.

Влияние инфекции на течение беременности в 1-ом триместре объясняется высоким уровнем инфекционной заболеваемости беременных, приводящей к развитию акушерской патологии. Среди инфекций, являющихся причиной неразвивающейся беременности, выделяют вирусную (цитомегалови-рус, вирус простого герпеса, вирусы Коксаки А и В, энтеровирусы), и бактериальную (хламидии, микоплазмы, уреаплазмы, стрептококки, стафилококки, гонококки) и грибы. Следующей причиной неразвивающейся беременности можно назвать гормональные нарушения. Известно, что у 21-32% женщин с невынашиванием беременности в анамнезе выявлена гиперандрогения (36).

Однако не ясно, почему в одних случаях инфекционные агенты и изменения в гормональном статусе женщины приводят к неразвивающейся беременности, а в других - практически не влияют на ее течение.

Для понимания механизмов этиологии и патогенеза неразвивающейся беременности представляются перспективными исследования в области иммунологии репродукции. Для нормального течения беременности, процессов имплантации, роста и развития эмбриона необходимо состояние локальной иммуносупрессии, которое может быть обеспечено в организме матери сбалансированным действием гормонов, простагландинов, регуляторных моле кул иммунной системы (цитокинов, хемокинов, противомикробных пептидов И др.)

В настоящее время активно изучается роль системы врожденного иммунитета в защите репродуктивной системы женщины. Врожденный иммунитет предотвращает развитие инфекции на ранних этапах, когда механизмы адаптивного иммунитета еще не задействованы, а при беременности супрессиро-ваны (24, 48). В последние годы исследуется структура и функции нового класса эффекторных молекул врожденного иммунитета - противомикробных пептидов (ПМП), представляющих собой естественные эндогенные антибиотики с прямым противовирусным, противобактериальным, противогрибковым действием. ПМП формируют молекулярную основу врожденного иммунитета и участвуют в реализации ряда защитно-приспособительных реакций (19). ПМП обнаружены во всех тканях, имеющих контакт с микроорганизмами (кожа, слизистая дыхательных путей, пищеварительный и урогениталь-ный тракт и др.). Особое значение приобретают противомикробные пептиды в репродуктивной системе женщины при беременности, так как они защищают от инфекции не только материнский организм, но и организм плода.

Отсутствуют работы по анализу противомикробных пептидов в первом триместре беременности, в частности, в слизистой цервикального канала и в периферической крови у женщин с физиологически протекающей беременностью. В настоящее время остается неясным вопрос, какую роль противомикробные пептиды играют в репродуктивной системе женщины при неразвивающейся беременности. Комплексный анализ противомикробных пептидов в вышеуказанных биологических материалах поможет определить возможные критерии риска неразвивающейся беременности, ее ранней диагностики, а также позволят провести отбор пациенток для своевременного лечения. Помимо этого представляется возможность обоснования необходимости применения новых препаратов на основе противомикробных пептидов для коррекции врожденного иммунитета репродуктивной системы у женщин с неразвивающейся беременностью.

Цель исследования

Комплексное исследование уровня противомикробных пептидов (ИМР1-3,1X37, НЕЮ1) и экспрессии генаТЫ12 крови и слизистой цервикального канала и определение их значимости в диагностике и прогнозировании неразвивающейся беременности.

Задачи исследования

1. Провести комплексное клинико-лабораторное обследование беременных с неразвивающейся беременностью.

2. Исследовать уровни противомикробных пептидов (НЫР1-3, 1X37, НЕШ1) и экспрессии гена ТЫ12 в цервикальном канале и а-дефенсинов (НИР 1-3) в плазме крови женщин с физиологически протекающей беременностью

3. Изучить уровни противомикробных пептидов в слизистой цервикального канала и периферической крови у женщин с неразвивающейся беременностью.

4. Оценить роль противомикробных пептидов как возможных маркеров неразвивающейся беременности.

Научная новизна

Впервые получены данные об экспрессии противомикробных пептидов (дефенсинов и кателицидинов) на локальном и системном уровнях у женщин с физиологически протекающей беременностью. При беременности увеличивается содержание а-дефенсинов НИР-1-3 в плазме крови и возрастает экспрессия генов молекул врожденного иммунитета НВБ-1 в слизистой цервикального канала, что обеспечивает защиту женщины и плода от различных патогенов.

В результате комплексного исследования ПМП у женщин в плазме крови и слизистой цервикального канала получены новые данные, связанные с патогенезом и диагностикой неразвивающейся беременности. Впервые получены данные о снижении экспрессии генов То11-подобного рецептора2 (ТЫ12) и противомикробного пептида ІХ-37 у беременных с неразвивающейся беременностью и гиперандрогенией, что свидетельствует о супрессии врожденного иммунитета на уровне слизистой цервикального канала у этих пациенток.

При неразвивающейся беременности впервые выявлено снижение уровня а-дефенсинов (НММ-З) в плазме крови.

Практическая значимость

На основании анализа противомикробных пептидов (НЫР-1-3) в плазме крови определены маркеры неразвивающейся беременности.

Уменьшение концентрации НИР-1-3 в плазме (менее 0,1 нг/мл) определяется у 70% женщин с неразвивающейся беременностью. Резкое снижение концентрации а-дефенсинов (НЫР-1-3 ) в плазме беременных может служить одним из диагностических критериев неразвивающейся беременности, наряду с другими клиническими критериями.

Диагностика нарушений врожденного иммунитета (снижение экспрессии противомикробных пептидов и распознающего рецептора ТІЛ12) в слизистой цервикального канала позволяет прогнозировать развитие осложнений во время беременности и определить показания к назначению иммуно-корригирующей терапии.

выводы

1. При физиологической беременности увеличивается экспрессия а-дефенсинов НЫР-1-3 в плазме крови и возрастает экспрессия генов молекул врожденного иммунитета НЕН>1 и ТЫ12 в слизистой цервикального канала, что обеспечивает защиту женщины и плода от различных патогенов на системном и локальном уровнях.

2. У женщин с неразвивающейся беременностью выявлено достоверное снижение уровня а-дефенсинов (НЫР-1 -3 ) в плазме крови по сравнению со здоровыми беременными. У 40% беременных НЫР-1-3 не определялся в плазме крови. Это позволит с высокой чувствительностью прогнозировать неразвивающуюся беременность.

3. При гиперандрогении у женщин с неразвивающейся беременностью наблюдается достоверное снижение экспрессии гена ТЫ12 по сравнению со здоровыми беременными в 1-м триместре гестации.

4. Снижение уровня а-дефенсинов НИР-1-3 в плазме менее 0,1 нг/мл и увеличение концентрации кателицидина ЬЬ-37 более 2000 пк/мл у беременных в 1 триместре могут явиться маркерами неразвивающейся беременности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. На основании анализа данных анамнеза пациенток можно выделить следующие факторы риска неразвивающейся беременности:

- хронические воспалительные заболевания органов малого таза

- наличие урогенитальной инфекции в анамнезе

- увеличение концентрации андрогенов.

2. Для своевременного прогнозирования неразвивающейся беременности в комплекс обследования целесообразно включить оценку врожденного иммунитета с определением в 1-м триместре гестации концентрации а-дефенсинов НЫР-1-3 в плазме крови. При отсутствии пептидов в плазме или их концентрации менее 0,1нг/мл пациенты включаются в группу риска по неразвивающейся беременности и угрозе прерывания и проходят целенаправленное обследование и соответствующую терапию.

3.Увеличение концентрации кателицидина 1Х-37 в слизи цервикально-го канала более 2000 пг/мл позволяет отнести данных пациенток в группу риска по угрозе прерывания и неразвивающейся беременности.