Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Значение показателей процессов пероксидации липидов, иммунологических маркеров воспаления в диагностике бронхиальной астмы у детей раннего возраста

На правах рукописи

никогосян

АННА СПАРТАКОВНА

ЗНАЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРОЦЕССОВ ПЕРОКСИДАЦИИ ЛНПИДОВ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВОСПАЛЕНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У ДЕТЕЙ РАННЕГО

ВОЗРАСТА

14.01.08 - педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

йог щ\ д I

Тюмень-2014

005548123

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Петрушина Антонина Дмитриевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кривцова Людмила Алексеевна, заведующий кафедрой педиатрии ПДО государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

доктор медицинских наук, профессор Олехнович Владимир Мечиславович, профессор кафедры детских болезней медицинского института государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сургутский государственный университет Ханты-Мансийского автономного округа-Югры»

Ведущая организация:

государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Уральский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Екатеринбург, ул. Репина, д. 3

Защита диссертации состоится » ¿<£¿«¿^^2014 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.101.01 при государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (625023, г. Тюмень, ул. Одесская, 54)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Автореферат разослан 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Т.Н. Василькова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В 80% случаев бронхиальная астма у детей формируется в раннем возрасте, причем нередко уже на первом году жизни и длительное время протекает под маской обструктивного бронхита. [Мизерницкий Ю.Л., 2010]. В настоящее время для уточнения диагноза БА существуют рекомендации только для детей старше 2-3 лет. В Национальной программе «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика» (2012г) предлагается использовать индекс риска астмы (Asthma Predictive Index (API)), в котором основополагающим признаком является 3-4-х-кратный эпизод БОС за год, не связанный с инфекцией. А диагностика вирус-индуцированной астмы у детей раннего возраста до сих пор не имеет четких критериев диагностики, что определяет актуальность проведенных исследований.

Основная роль в формировании БА отводится иммунологическому статусу ребенка и ключевую роль в этом процессе играет интерлейкин 4 (IL 4). Эффекты IL 2 и IL 10 при аллергических заболеваниях изучены недостаточно. Возможно, изучение их активности при ООБ и при вирус-индуцированном обострении БА у детей раннего возраста позволит выявить особенности запуска и течения воспалительного ответа в слизистой бронхиального дерева.

Воспалительный процесс, как известно, приводит к формированию гиперреактивности бронхиального дерева и проявлению БОС, в котором участвуют холинергический и адренергический механизмы. Активность фермента, гидролизирующего остатки АЦХ, сывороточная холинэстераза (ХЭ) опосредовано определяет парасимпатическую регуляцию функций внутренних органов [Дегтева С .А, 2008]. В исследованиях Стрюк Р.С. и Длусской И.Г. (2003г) показано, что р -адренергическая реактивность мембран эритроцитов ф - АРМ), как модель, отражает характеристику рецепторного состояния симпато-адреналовой системы организма, в том числе и р2 - адренергической гиперреактивности бронхиального дерева у детей с бронхообструктивным синдромом (БОС). В связи с этим, представляет интерес изучения этих показателей у детей раннего возраста при исследуемой бронхолегочной патологии.

В патогенезе БОС, в том числе и при БА важную роль играет и свободно-радикальное окисление липидов мембран, основным триггерным фактором которого, в первую очередь, может быть инфекция. Подвергающиеся пероксидации ненасыщенные липиды, являются источником БАВ, и в частности лейкотриенов (LTD4). В настоящее время остаются не изученными процессы пероксидации, протекающих в раздельных фракциях ненасыщенных и насыщенных липидов мембран при различных формах бронхитов у детей раннего возраста, что возможно, позволит определить критерии более ранней диагностики БА. Цель исследования. Изучить показатели процессов пероксидации мембранных липидов, иммунологических показателей воспаления и вегетативного дисбаланса при различных формах бронхитов и определить их значение для диагностики БА у детей раннего возраста.

Задачи исследования.

1. Определить активность цитокинов IL 2 и IL 10 у детей раннего возраста при бронхитах и обострении БА.

2. Изучить p-адренергическую реактивность мембран эритроцитов и холинэстеразную активность плазмы, как относительные показатели вегетативной

дисфункции бронхиального дерева у детей раннего возраста при бронхитах и при вирус-индуцированном обострении БА.

3. Изучить липидную структуру мембран эритроцитов у детей раннего возраста при бронхитах и при обострении БА на фоне острой респираторной инфекции.

4. Исследовать состояние активности ПОЛ в насыщенных и ненасыщенных жирных кислотах и показателей антиоксидантной защиты мембран эритроцитов у детей раннего возраста при бронхитах и при обострении БА на фоне острой респираторной инфекции.

5. На основании биохимических и иммунологических результатов исследования разработать модель математического прогнозирования атопической бронхиальной астмы, спровоцированной инфекцией у детей первых 3-х лет жизни.

Научная новизна исследования. Впервые исследована активность 1Ь 2 и 1Ь 10 в сравнительном аспекте при различных формах бронхитов и обострении БА на фоне респираторной инфекции у детей раннего возраста.

В работе впервые изучена активность р-АРМ Эц и сывороточной ХЭ у детей при БОС и остром бронхите, как относительных показателей адренергической и холинэргической гиперреактивности бронхиального дерева.

Впервые в настоящей работе проведено комплексное изучение показателей процессов пероксидации липидов с дифференцированным определением фракций насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, антиоксидантной защиты у детей раннего возраста при различных формах бронхитов и при обострении БА, индуцированной инфекцией.

В результате проведенных исследований новым является разработка математической модели прогноза раннего формирования БА, индуцированной инфекцией у детей первых 3-х лет жизни.

Положения, выносимые на защиту:

1. Мембранопатологические процессы у детей с БА, индуцированной инфекцией и обструктивным бронхитом с аллергической предрасположенностью характеризуются однотипными изменениями и, в первую очередь, связаны с пероксидацией ненасыщенных жирных кислот.

2. Установлено, что уровень 1Ь 2 снижен у наблюдаемых пациентов, а уровень 1Ь 10 повышен. Активность 1Ь 2 и 1Ь 10 в группе детей с обострением Б А на фоне ОРИ и ООБ с аллергической предрасположенностью изменяется идентично.

3. Высокий уровень р -АРМ Эц и достоверное увеличение сывороточной ХЭ у детей с клиническим проявлением БОС свидетельствуют о нарушениях адаптационно-трофических процессов в организме и вегетативном дисбалансе на уровне бронхиального дерева.

4. Математическая модель, разработанная на основе биохимических и иммунологических показателей у наблюдаемых детей, позволяет в 94,5% случаев даже при первом эпизоде бронхообструкции прогнозировать формирование БА у детей раннего возраста с ООБ на фоне атопии.

Практическая значимость работы. Исследование расширяет имеющиеся представления о ранней диагностике БА у детей раннего возраста.

Предложены критерии прогностического формирования групп риска по развитию Б А у детей в возрасте до 3-х лет.

Установлено, что дети, начиная с первых месяцев жизни, имеющие отягощенный семейный и аллергологический анамнез при возникновении первого эпизода БОС должны быть консультированы аллергологом.

Учитывая ранний возраст детей, особенно из групп риска по БА, разработана и апробирована математическая модель с прогнозируемым результатом 72,7%, а верификацией диагноза 79,7%.

Апробация результатов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Новые здоровьесберегающие тенденции в фармации и медицине». Воронеж, 26-27 апреля, 2011 г; Научно-практической конференции Союза педиатров России, «Актуальные вопросы пульмонологии и аллергологии», Ханты-Мансийск, 26-27 апреля, 20 Юг; Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы педиатрии» г.Тюмень, 27 ноября, 2009г.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований используются в работе педиатрической амбулаторно-поликлинической службы Центра охраны здоровья детей ГБУЗ ТО «Областная клиническая больница №1», ММАУ «Городская поликлиника №5». Полученные результаты включены в учебный процесс на кафедре педиатрии ФПК и ППС ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Внедрение результатов подтверждено актами о внедрении.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано: 9 работ, из них 3 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит 144 страницы машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, 56 таблиц, 10 рисунков.

Личный вклад автора. Весь материал, представленный в диссертации, собран лично автором, обработан и проанализирован лично автором в объеме 70 %.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Организация и протокол исследования. В настоящей работе проведены клинические наблюдения и специальные биохимические исследования у 106 детей раннего возраста от 6-ти мес. до 3-х лет с бронхо-легочными заболеваниями. Пациенты были разделены на 4 группы. Дизайн исследования представлен на рис.1. Контрольная группа составила 25 здоровых детей, сопоставимая по возрасту и полу.

Клиническое наблюдение за детьми проводилось на базе ГБУЗ ТО «ОКБ №2».Педиатрическое отделение № 2. (главный врач — Сливкина Наталья Александровна; зам. главного врача по детству Бодрова Татьяна Васильевна). Набор контрольной группы производился на базе ММАУ ДГП №4, (главный врач Княжева Наталья Николаевна). Диагноз бронхиальной астмы основывался на совокупности клинического наблюдения и обследования больных с учетом семейного анамнеза, преморбидного фона, лабораторных, иммунологических исследований и рентгенографии органов дыхания, проведенной с целью дифференциальной диагностики. В работе за основу взята классификация БА, представленная в Национальной программе «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика» (2012г).

Рис.1.

ДИЗАЙН ИССЛЕДОВАНИЯ

II. Иммунологические методы:

Определение активности IL2 и ILIO

IV. Катамнез группы детей с ООБ и аллергической предрасположенностью через 2 года п=11

III. Биохимические методы:

1. определение фракций фосфолипидов в эритроцитах

2. определение продуктов пероксидации липидов с раздельной регистрацией продуктов ПОЛ (ИДС,ДК,КТ+СТ,ШО) в гептановой и изопропанольной фазах экстракции.

3. определение ß-адренергической активности эритроцитов и холиэстеразной активности плазмы.

4.Составление математической модели ранней диагностики БА

Под наблюдение в работе взяты дети раннего возраста от 6 мес. до 3 лет с диагнозом БА, обострение которой связано с ОРИ. При определении степени тяжести заболевания учитывали степень тяжести приступа, наличие или отсутствие ночных приступов, переносимость физической нагрузки.

Обоснование диагноза обструктивного бронхита и острого бронхита проводилось с учетом клинического симптомокомплекса, лабораторного и рентгенологического обследования пациентов, семейного анамнеза и преморбидного фона. В работе за основу взята классификация клинических форм бронхолегочных заболеваний у детей Российского респираторного общества, принятой в 2009г.

Аллергическая предрасположенность у третьей группы больных была представлена неполным аллергологическим анамнезом: наследственная атопия у кровных родственников ребенка, или наличием острых аллергических реакций на специфические агенты (чаще пищевые аллергены или медикаменты).

Специальные биохимические методы исследования

Специальные исследования проведены в ЦНИЛ ТюмГМА, (заведующий, к.м.н. доцент Платицын Виктор Анатольевич; старший научный сотрудник, к.б.н. Журавлева Татьяна Дмитриевна); иммунологические исследования проводились в отделе клинической иммунологии, клинико - диагностической лаборатории ГБУЗ ТО «Перинатальный центр» г Тюмени (зав. лаборатории Хмелёва Елена Федоровна).

Краткая характеристика специальных методов исследования

¡.Уровень интерлейкинов (IL)- IL2 и IL10 в сыворотке крови. Определение уровня интерлейкина 2, интерлейкина 10 в сыворотке крови больных детей проводили с использованием наборов реагентов «Вектор-Бест» (IL 2-ИФА-Бест, IL 10 - ИФА - Бест).

2. Определение активности холинэстеразы (ХЭ) сыворотки крови (КФ 3.1.1.8). Определение активности ХЭ выполнено с помощью кинетического колориметрического теста согласно рекомендациям DGKC, используя наборы реактивов фирмы «SENTINEL» (Италия). Активность фермента выражена в международных Е/л.

3. Определение р - адренергическую реактивность мембран эритроцитов (Р -АРМ) оценивали в цельной крови [Стрюк Р.И., 2003]. Результаты выражены в условных единицах торможения (усл. ед.). Для выполнения анализа использовались наборы реагентов «БЕТА - АРМ - АГАТ» (Москва).

4. Определение продуктов пероксидации липидов мембран эритроцитов проведено спектрофотометрическим методом И А. Волчегорского с сотр., (1989) в модификации с раздельной регистрацией продуктов ПОЛ в гептане и изопропаноле, что дает возможность более дифференцировано оценивать их содержание по степени насыщенности и окисленности. Результаты выражают в единицах оптической плотности - Е.

5. Антирадикальную защиту красных клеток крови оценивали по активности супероксиддисмутазы (СОД) по методу Верболович (1987г.). Активность фермента оценивали по степени торможения реакции восстановления в % торможения.

Антиперекисная активность оценивалась по ферменту каталаза (перекись водорода - оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.6) и определена по методу Caren М. (1986г.) Активность фермента выражена в млмоль/ мл/ мин.

6. Определение содержания фосфолипидов (ФЛ) в эритроцитах проведено по методике Фолча-Блюра. Количественное определение каждой фракции ФЛ проводили по методу Грибанова Г.А. Результаты выражали млмоль/л Рн.

Статистические методы исследования

Статистическую обработку результатов проводили на персональном компьютере Intel Core 2с помощью пакета программ Excel, STATISTIKA 7.0 и BIOSTATISTICA 4.03. Определялись основные характеристики: среднее значение вариационного ряда (М) и стандартное отклонение (SD). В зависимости от вида распределения переменные представлены в виде M±SD. Достоверность различий при нормальном распределении оценивали с использованием t - критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05, тем самым минимальная достоверность различий составила 95%. Корреляционный анализ проводился с использованием программы Logistic Regression SPSS. Для выявления корреляционной зависимости вычислялся ранговый коэффициент Спирмена (г). Силу связи оценивали следующим образом:

От -0,25 до 0,25 - как отсутствие связи, или слабую связь От -0,26 до -0,5 или 0,26 до 0,5 - как умеренную От -0,5 до -0,75 или от 0,5 до 0,75 - как среднюю Более 0,75 или -0,75 - как сильную.

Для построения математической модели прогноза формирования БА использовали математические методы, с помощью которых были вычислены постоянные коэффициенты (с учетом положительного или отрицательного аллергоанамнеза) для биохимических и иммунологических показателей исследуемых детей раннего возраста с ООБ, ООБ с аллергической предрасположенностью и БА (исследование проведено под руководством доцента кафедры «Моделирования и управления», к.т.н. Ревнивых А.В. ФГБОУ ВПО «ТюмГНГУ»). Верификация каждой модели проводилась путем сравнения реальных (фактических) предложенных иммунологических и биохимических показателей с полученными долженствующими показателями.

Результаты собственных исследований

Всего под наблюдением находилось 106 больных, которые разделены на клинические группы. В группе больных с диагнозом острый бронхит было 15 (мальчиков было 11 (0,74), девочек - 4 (0,26)). В акушерско-гинекологическом анамнезе прослеживалось неблагоприятное течение беременности у 12 (0,8) матерей наблюдаемых детей. На искусственном вскармливании адаптированными молочными смесями находилось 10 (0,66) детей. 73% детей неоднократно в анамнезе перенесли острые респираторные инфекции. У всех детей (1,0) начало заболевания было острым, с субфебрильной температурой и симптомокомплексом клиническим, рентгенологическим и лабораторным, характерным для диагноза «Острый бронхит».

Группа детей с диагнозом обструктивный бронхит без атопии (1-2 эпизода БОС) составила 24 ребенка, из них мальчиков - 17 (0,70), девочек - 7 (0,29). У всех детей этой группы отсутствовала наследственная отягощенность по атопии, но практически у всех детей (0,89) наблюдался отягощенный акушерский анамнез (гестозы различной степени тяжести - 16 детей и у 5 - угроза прерывания). Более половины детей исследуемой группы находилось на искусственном вскармливании (0,58). Все дети часто болели острыми респираторными инфекциями. БОС у всех детей данной группы развивался на 3-4 день ОРИ.

В группе исследуемых пациентов с обструктивным бронхитом, у которых был один эпизод бронхообструкции, и имеющих аллергическую предрасположенность наблюдалось 18 детей. Также как и в предыдущей группе преобладали мальчики (0,61). Диагноз обструктивный бронхит в исследуемой группе верифицирован в

соответствии с теми же критериями, что и в группе ООБ без атопии. Необходимо отметить, что БОС у них присоединился на 1-2 сутки от начала заболевания. Семейный атопический анамнез прослеживался у родителей в 44% случаев, а у детей атопический дерматит установлен в 33%, и чувствительность к пищевым аллергенам в 55% случаев.

С диагнозом БА наблюдалось 24 ребенка, причем преобладали мальчики 18(0,75) в возрасте от 2-3 лет. Все дети (1,0) в данной группе имели отягощенную наследственность по атопии. Наибольшая частота аллергических заболеваний у родственников в группе исследуемых больных отмечалась по линии матери - у 17 детей (0,70). Атопический анамнез прослеживался у всех наблюдаемых детей в виде пищевой аллергии, атопического дерматита, поллиноза, аллергического ринита, конъюнктивита и лекарственной аллергии. Все дети находились на диспансерном учете, как часто болеющие и эпизоды БОС наблюдались более 3-х раз. При иммунологическом обследовании детей с БА у 65,3% выявлено повышение общего IgE. Начало обострения Б А у детей было связано с инфекцией у 24 (1,0). Все дети исследуемой группы получали базисную терапию с положительным эффектом.

При сравнении клинической симптоматики, рентгенологических и лабораторных показателей у всех наблюдаемых детей установлено, что этиологическим фактором заболевания была респираторная инфекция, проявляющаяся синдромом интоксикации и катаральными проявлениями, воспалительными изменениями в периферической крови. Развитие БОС на фоне инфекции у детей без атопии происходило на 3-4 сутки, а в группе больных с атопией на 1-2 сутки, что можно уже рассматривать как признак формирования БА. Однако неполный семейный атопический и аллергологический анамнез и однократный БОС не позволяет в данной исследуемой группе поставить и обосновать диагноз БА с учетом индекса риска астмы (API). У больных с установленным диагнозом БА начало заболевания было аналогичным с предыдущей группой, но БА им диагностирована спустя два года, хотя БОС наблюдался уже неоднократно на фоне ОРИ, и все дети имели явную наследственную атопию, четкий аллергоанамнез (атопический дерматит и/или аллергический ринит).

Для оценки иммунологических изменений в формировании аллергического воспаления в настоящей работе проведено сравнительное исследование уровня цитокинов IL2 и ILIO у детей раннего возраста (до 3-х лет) при ОБ, ООБ, ООБ с аллергической предрасположенностью и БА в периоде обострения на фоне ОРИ. Данные представлены на рис.2.

Установлено, что уровень IL2 умеренно снижен при остром бронхите в сравнении с группой контроля (р=0,298), и значительно снижен при заболеваниях бронхов, протекающих с обструктивным синдромом (р<0,05) (особенно при БА как в сравнении с острым бронхитом (р=0,000), так и с группой здоровых детей (р=0,000). Различия уровня исследуемого цитокина у пациентов с БА и ООБ с аллергической предрасположенностью статистически недостоверные (р=0,423), что говорит об однонаправленных изменениях активности IL2 у детей с IgE - зависимым иммунным ответом, а также опосредовано свидетельствует о высокой активности Т-хелперов 2-го типа, синтезирующих IL 4, IL 5, ILIO, IL 13 и IL 25 [Чучалин А.Г., 2007]. Данные подтверждаются результатами следующего этапа исследования. Уровень ILIO у всех детей исследуемых групп значительно выше контрольной (р<0,05), особенно в группах с ОБ и ООБ, что характеризует мобилизацию противовирусного иммунного ответа детского организма. У больных же с ООБ с аллергической

предрасположенностью и при обострении БА на фоне ОРИ, активация противовирусного иммунного ответа недостаточна, т.к. уровень ILIO у исследуемых пациентов снижен в 2 раза в сравнении с группами острого и обструктивного бронхита (р<0,05), что, возможно, указывает на изменения в системе цитокиновой регуляции, характеризующие нарушения иммунных механизмов, необходимых для элиминации как аллергенов, так и инфекционных агентов. Ранее проводимые исследования [Чучалин А.Г., 2007; Горюнов A.B., 2010] подтверждают полученные нами результаты. Вероятно, исследуемый показатель иммунного статуса ILIO может служить ранним маркером инфекционно-зависимой БА у детей раннего возраста. При проведении линейного корреляционного анализа определяется умеренная положительная корреляционная двухсторонняя связь между IL2 и ILIO во всех группах с БОС (rs=0,340, при р=0,009). Это, возможно, отражает подавление интерлейкином 10 продукции IL 2 [Александрова Ю.Н., 2007; Helminen, М., Nuolivirta, 2008].

Рис. 2 Уровень активности Ш 2 и ЕЬ 10 у детей с различными формами бронхитов и БА *- статистически значимая достоверность между контрольной и исследуемыми группами

С целью изучения вегетативного дисбаланса бронхиального дерева у детей раннего возраста с бронхитами и с обострением БА в работе были проведены сравнительные исследования Р-АРМ Эц и сывороточной ХЭ. При сравнительном анализе р-АРМ Эц не установлено достоверных отличий у детей с БОС, в том числе и при БА. Данные представлены в табл. 1. Высокая Р-АРМ в этих группах определяется наличием патофизиологических механизмов снижения симпатического влияния при формировании гиперреактивности бронхиального дерева в условиях инфекционного воздействия на слизистую, а также может свидетельствовать о явных нарушениях адаптационно-трофических процессов в организме при гипоксических состояниях.

Также можно отметить высокую холинергическую гиперреактивность бронхиального дерева при БОС, в том числе и при БА у детей раннего возраста, т.к. в этих группах пациентов определяется достоверно высокий уровень сывороточной холинэстеразы (р<0,05). В группе исследуемых пациентов с БОС ХЭ увеличивается в сравнении с группой контроля практически в 2 раза (р=0,002). Статистических различий между исследуемыми группами с БОС нет (р>0,005). У детей в группе с

острым бронхитом уровень сывороточной ХЭ меняется незначительно. Учитывая выявленные закономерности, был проведен корреляционный анализ между уровнем сывороточной ХЭ и наличием БОС у исследуемых групп. Линейный коэффициент корреляции указывает на умеренную положительную степень зависимости г5=0,26 (р= 0,046) (Табл. 1).

Таблица 1

Показатели Р-адренергической реактивности мембран эритроцитов и активности сывороточной холинэстеразы у больных

Показатели М± БЭ Контроль (п=25) Острый бронхит (п=15) Обструктив-ный бронхит без атопии (п=24) Обструктивны й бронхит с атопией (п=18) Бронхиальная астма (п=24)

Р-АРМ (усл.ед) 18,0±2,0 24,01±3,8 * 42,1±11,7* 42,7 ±12,5* 51,6±18,5*

ХЭ(Е/л) 3576,2± 255,0 3858,1± 1094,9 6088,11±716,6 * 6521,5 ±714,3* 6575,5±544,5 *

* - р<0,05, статистически значимая достоверность между контрольными и исследуемыми показателями

Полученные результаты подтверждают наличие у исследуемых групп больных вегетативного дисбаланса бронхиального дерева, что существенно при диагностике БОС, особенно в случае скрытого бронхоспазма.

Согласно поставленной цели, нами были исследованы процессы ПОЛ в различных структурах мембран эритроцитов в зависимости от насыщенности липидов у детей раннего возраста при различных формах бронхитов и обострении БА. Это позволило дифференцировано определить воздействие свободно-радикального окисления в различных структурах мембран эритроцитов по уровню таких показателей как: вещества с изолированными двойными связями (ИДС), или потенциальные продукты ПОЛ, диеновые конъюгаты (ДК)-первичные продукты ПОЛ, сумма кетодиенов и сопряженных триенов (КД+СТ) - вторичные, и продукты нейтрализации ПОЛ - шиффовых оснований (ШО). Кроме того, для подтверждения различной активности процессов ПОЛ в насыщенных (гептановая фаза) и ненасыщенных липидах (изопропанольная фаза) определены дополнительные показатели: индекс окисленности липидов (ИОЛ) и конечные продукты переокисления степени ненасыщенных жирных кислот (СЫН) липидных комплексов. Данные представлены на рис. 3.

Установлено, что в острую фазу бронхита, ООБ, ООБ с атопией и БА уровень всех продуктов ПОЛ (кроме оснований Шиффа) в насыщенных липидах (гептан) значительно повышен в сравнении с контрольной группой (р<0,05), что, видимо, свидетельствует о глубокой деструкции мембран эритроцитов при исследуемых заболеваниях. Несколько интенсивнее процесс образования первичных продуктов (ДК) протекает у больных с БОС и атопией (р>0,05), и в сочетании с высоким уровнем потенциальных продуктов процессы пероксидации липидов скорее всего протекают активнее на фоне гипоксического фактора. Уровень КД+СТ в насыщенных липидах одинаков у всех пациентов с БОС, независимо от аллергофона (р>0,05). Показатели оснований Шиффа в мембранах эритроцитов исследуемых групп

пациентов отражают недостаточную нейтрализацию активных метаболитов ПОЛ, т.к. ниже уровня контрольной группы (р=0,000), что, возможно, связано с нарушением адаптационных механизмов. Максимальное снижение ШО наблюдается при БА.

V- I

БА ЙЯ 1

ООБиАт 00Б ОБ

конгроль

л\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\\ ti • , kJL..

k\\mm\\\m\\\m\mv

0.6

g\\\\\\\\Vj\\\m\\\\\\\ v ч\\\\\\\\\\\|\\\\\\\\\\\\\\\\\\\

ч\\\\\\\\\\\\\\\\\^\\\\\\\\\\\\\

0,5

1,5

Рио.З Содержание продуктов ПОЛ в мембранах эритроцитов у детей с бронхитами и БА в гептановой (слева) и изопропанольной (справа) фазе экстракции липидов * р<0,05 между контрольной и исследуемой группой

Изменения, происходящие в ненасыщенных липидах (изопропанол) мембран эритроцитов в острый период заболеваний исследуемых продуктов ПОЛ, неоднозначны (рис. 3.). Наблюдается снижение уровня потенциальных продуктов ПОЛ (ИДС) при всех вариантах бронхитов, а особенно при ООБ с аллергопатологией и БА. Учитывая, что они отражают исходный уровень ненасыщенности липидов [Волчегорский И. А., 1989], то можно говорить о высоком потреблении ненасыщенных липидов в процессе пероксидации при сочетанной патологии. Как первичные - ДК, так и вторичные продукты распада ненасыщенных и полиненасыщенных жирных кислот в изопропаноле меняются незначительно как в сравнении с группой контроля, так и между исследуемыми группами (р>0,05), и судить об активности свободнорадикальных процессов по данным показателям достаточно сложно [Новик Г.А, 2004; Bateman E.D., 2007]. Процессы инактивации продуктов патологической активности ПОЛ снижены при ОБ и БОС с аллергопатологией, о чем свидетельствует снижение оснований Шиффа в изопропаноле (р<0,05). Это также подтверждает неадекватность защитных механизмов детского организма при сочетанной патологии в острый период заболевания.

Таким образом, накопление исследуемых продуктов ПОЛ (ИДС, ДК, КД + CT) в насыщенных липидах и одновременное снижение потенциальных продуктов в ненасыщенных липидах мембран клеток при ООБ с аллергической предрасположенностью и БА указывают на выраженность воспалительного процесса и глубокую деструкцию клеточных мембран, что подтверждается данными других аналогичных исследований [Васильева Е.М., 2005].

То, что процессы пероксидации протекают более интенсивно в ненасыщенных липидах, наглядно отражает индекс окисленности липидных компонентов

12

L -_____ __________________

эритроцитов (доля образования первичных и вторичных продуктов пероксидации по отношению к показателям исходного окислительного потенциала). На рис. 4 представлены ИОЛ для ДК и КД+СТ в гептановой и изопропанольной фазах липидного экстракта в обследуемых группах больных. Установлено, что ИОЛдк в изопропанольной фазе увеличивается во всех исследуемых группах пациентов, а особенно в группах у детей с сочетанной патологией (р<0,05) и скорее всего зависит от наличия неблагоприятного аллергофона. ИОЛкд+ст также возрастает в всех группах больных с БОС, в сравнении с контрольными показателями, но статистически значимо в группе с Б А (р=0,01). Для гептановой фазы характерна противоположная направленность: ИОЛ снижаются для ДК и КД+СТ, причем независимо от аллергофона. По всей вероятности, это свидетельствует о включении адаптационно-компенсаторных механизмов, направленных на сохранение структурной организации клеточных мембран в условиях инфекционно-гипоксической агрессии [Васильева Е.М., Баканов М.И, 2005г.].

Рис. 4 Сравнительная характеристика показателей индекса окисленности липидов в изопропанольной фазе (слева) и в гептане (справа) у детей раннего возраста с различными вариантами бронхитов и БА

Для оценки глубины мембранодестабилизации у наблюдаемых детей проведено определение относительного содержания ненасыщенных жирнокислотных остатков (СННожк), подвергающихся пероксидации и удалению из мембранных комплексов эритроцитов для ИДС, ДК и КД+СТ. Данные представлены на рис. 5. У всех исследуемых групп пациентов резко снижены показатели степени ненасыщенности остатков жирных кислот липидов мембран эритроцитов для ИДС, ДК (р<0,05), а для суммы КД и СТ степень ненасыщенности снижен относительно контроля только при ООБ с аллергопатологией и БА (р|=0,000; р2=0,008). Кроме того, СННожк для КД+СТ в данных группах меняются однонаправленно и с одинаковой интенсивностью (р>0,05).

Высокая активность процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов обусловлена также несостоятельностью антиоксидантной и антиперекисной защиты клеточных структур во всех группах. Данные представлены на рис. 6.

Антиперекисная защита у всех пациентов явно недостаточна и снижена (р<0,05). Активность антиперекисной защиты, по-видимому, зависит не только от инфекционного воспаления в бронхиальном дереве, но и от выраженности

гипоксического фактора, а также от аллергического воспаления, т.к. в большей степени снижение активности каталазы наблюдается в группах пациентов с ООБ в сочетании с аллергопатологией (р=0,000) и при обострении БА. (р=0,000). Видимо при сочетанном воздействии инфекционного, гипоксического и атопического факторов в острый период заболевания наблюдается истощение адаптационно-компенсаторных возможностей детского организма, несмотря на повышение активности СОД, нейтрализующей активные радикалы, процессы мембранодестабилизации доминируют.

СННожкидс

ожк дк

СНН ожк кд+ст

'/. контроль а ОБ N006 3 ООБ и Ат «А

Рис. 5 Сравнительная характеристика показателей степени ненасыщенности остатков жирных кислот у детей раннего возраста с различными вариантами бронхитов и БА

каталаза

СОД

* А А А

контроль

А

Рис.6. Сравнительная характеристика показателей супероксиддисмутазы и каталазы у детей раннего возраста с различными вариантами бронхитов и БА

* р<0,05 между контрольной и исследуемой группой

Инфекция и гипоксический фактор, выраженное усиление процессов пероксидации липидов неизбежно влияют на структурную организацию биомембран. Так, в мембранах эритроцитов отмечается снижение фракции ФЭА (р,=0,028; р2=0,03) у детей с ООБ и атопией и БА относительно референтных значений (рис. 7). При этом уровень снижения у них синхронен. ЛФХ у детей, больных ООБ с атопией и БА увеличивается (р]= 0,000; р2=0,000). ЛФХ тесно связан с состоянием активности фосфолипазы А2, накоплением БАВ, играющих существенную роль в формировании аллергического воспаления [Прахин Е.И., 2000; Быков В.О., 2011].

В связи с этим можно считать, что высокий уровень ЛФХ у детей с ООБ и аллергической предрасположенностью и БА подтверждает наиболее высокую патологическую активность ПОЛ в данных группах больных. Нарастание фракций СФМ (р<0,05) у наблюдаемых больных может расцениваться как адаптационное, направленное на сохранение структуры мембран.

В ходе проведенных сравнительных исследований у детей с ООБ и атопией и БА установлены аналогичные биохимические и иммунологические изменения девяти показателей, отражающих как общую воспалительную реакцию организма на внедрение инфекционного агента, так и местную, на уровне бронхиального дерева. Для подтверждения правильности клинико-иммунологических и биохимических выводов, использован метод математического моделирования. Под руководством доцента кафедры «Моделирования и управления», к.т.н. Ревнивых А.В.(ФГБОУ ВПО «ТюмНГУ») создана математическая модель БА у детей раннего возраста. Данные представлены в табл. 2.

СФМ

ЛФХ

■ контроль ва ОБ * ООБ = ООБ и Ат III БА

ФЭА

Рис. 7. Содержание фракций фосфолипидов у детей раннего возраста с различными вариантами бронхитов и БА

020202010001000201010101000202020101

06133696

С помощью полученных данных рассчитывались значения индекса Р, специфичных для БА (Р,), ООБ с аллергической предрасположенностью (Р2), ООБ (Рз) по формулам:

Р, = К!Х (Х,/2,8+ Х2/1,84+ Х3/0,3 + Х4/17,8 + Х5/1,6 + Х6/0,75 + Х7/0,56 + Х8/0,87 + Х9/2,02); Р2 = К2 х (Х,/2,3+ Х2/1,82+ Х3/0,3 + + Х5/1,8 + Хб/0,75 + Х7/0,41 +

X8/0,84 + Х9/2,02); Р3= К3 х (Х,/2,3+ Х2/1,7+ Х3/0,41 + Х4/36,3 + Х5/1,8 + Х6/1,8 + Х7/0,5 + Х8/0,8 +Х9/1,7);

Таблица 2

Биохимические, иммунологические параметры (X) и их константы (С*) исследуемых групп больных детей раннего возраста.

Показатель Код ООБ ООБиАТ БА

X С X С X С

ß-Арм X, 42,1 2,3 42,7 2,3 51,6 2,8

ХЭ х2 6088,1 1,7 6522,6 1,82 6575,5 1,84

IL2 х3 5,1 0,41 4,5 0,3 3,8 0,3

ILIO х4 40,6 36,3 26,4 23,6 20,0 17,8

КД + СТ гептан х5 0,09 1,8 0,09 1,8 0,08 1,6

КД + СТ изопро- пан х6 0,7 1,8 0,3 0,75 0,3 0,75

каталаза х7 1,2 0,5 0,9 0,41 1,24 0,56

ФЭА х8 20,6 0,8 22,7 0,84 23,5 0,87

ЛФХ X, 7,9 1,7 9,5 2,02 9,5 2,02

К| -0,015; К2-0,014; К3-0,006; - коэффициенты, рассчитанные для каждой модели.

При Р,(54,01)> Р2(52,6) > Р3(21,9) прогнозируется развитие БА.

При Р] < Р2 < Рз отсутствие прогноза формирования БА.

Верификация каждой модели проводилась путем сравнения реальных (фактических) предложенных иммунологических и биохимических показателей с полученными долженствующими показателями. Совпадение диагноза и прогноза модели для БА (Р|) составило 79,7%. Совпадение диагноза и прогноза модели для ООБ с аллергической предрасположенностью (Р2) - 83,3%. Совпадение диагноза и прогноза модели в группе ООБ (Р3) - 79,2%. В группе исследуемых детей с диагнозом ООБ с аллергической предрасположенностью представленная модель дает прогнозируемый результат в 44,4 %, т.е. из 18 случаев у 8 детей прогнозируется формирование БА.

Примеры расчета верификации модели

1. Больная О., 3 года. Диагноз Бронхиальная астма средней степени тяжести. Персистирующая. Обострение на фоне ОРЗ. Х!=41,2; Х2=7019; Х3=3,77; Х4=22,5 Х3=0,06; Х6= 0,13; Х7=1,96; Х„=0,122; Х,= 0,039.

Пример 1: Р„ссл.1(57,0)>Р2(52,6)>Р3 (21,9). Учитывая, что Р,= 54,01, то совпадение модели и диагноза БА составляет 105,5%.

2. Больная 3., 11 мес. Диагноз. ООБ с аллергической предрасположенностью. Первый БОС. Х,=35,2; Х2=6405; Х3=17,26; Х„=45,47; Х5=0,13; Х6=0,13; Х7=0,77; Х8=0,342; Х9=0,038.

Пример 2: Р,(54,01)>Риссл 2 (52,3)>Р3 (21,9). Учитывая, что Р2(52,6), то совпадение модели и диагноза ООБ с аллергической предрасположенностью составило 99,4%.

3. Больная 3. 10 мес. Диагноз: ООБ. Второй эпизод БОС. Х1=9,13; Х2=6887; Х3=5,69; Х4= 3,57; Х5=0,09; Х6=0,41; Х7=0,52; Х8=0,086; Х9=0,049.

Пример 3: Р,(54,01)> Р2(52,6)>РИССЛ. 3 (24,4). Учитывая, что Р3 (21,9), то совпадение модели и диагноза ООБ составило 111,4%.

Расчет прогноза формирования БА у ребенка с ООБ и аллергической предрасположенностью

Пример 1: У ребенка К., 1г 7 мес. Х,=50,0; Х2=8159; Х3=0,6; Х4=17,8; Х5=0,029; Х6=0,07; Х7=0,58; Х8=0,87; Х9=42,37.

Р) иссл (67,3)> Риссл 2(54,8) > РИссл.з(25,1), следовательно у ребенка прогнозируется развитие БА. В настоящее время ребенок К., (возраст 3 года) наблюдается у аллерголога с диагнозом БА. Легкая степень тяжести. Персистирующее течение.

Экономические затраты на определение биохимических и иммунологических показателей для включения в математическую модель составили на 1 больного 650 рублей.

Катамнестические наблюдения за детьми с ООБ и аллергической предрасположенностью

Из 18 детей исследуемой группы катамнестическое наблюдение проводилось за 11 пациентами (0,61) в течение 2-х лет. Все дети в 100% наблюдаются у аллерголога с диагнозом БА легкой или средней степени тяжести. Диагноз был поставлен в соответствии с критериями диагностики бронхиальной астмы согласно национальной программе «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика», 2012г.

Учитывая данные катамнеза и апробацию математической модели прогноза формирования БА, совпадение диагноза и прогноза составило 72,7% (из 11 детей с поставленным диагнозом БА у 8 детей прогнозировалась БА).

Таким образом, использование предложенных биохимических и иммунологических показателей для прогнозирования БА позволяет оценить риск развития БА и проводить профилактические мероприятия по соблюдению гипоаллергенного быта, гипоаллергенной диеты и назначению базисной терапии уже на 1-м году жизни при 1-м эпизоде ООБ с наличием аллергической предрасположенности.

выводы

1. Активность IL2 и ILIO в группе детей с вирус-ассоциированным обострением БА и ООБ с аллергической предрасположенностью может служить ранним маркером развития Б А у детей до 3-х летнего возраста.

2. Высокий уровень ß -АРМ Эц и сывороточной ХЭ у больных как с БА, так и с БОС приводит к нарушению адаптационно-трофических процессов в организме, вегетативному дисбалансу бронхиального дерева, ведет к развитию гиперреактивности бронхов, что необходимо учитывать при диагностике БОС у детей раннего возраста, особенно в случае скрытого бронхоспазма.

3. Развитие инфекционных бронхитов и вирус-ассоциированной БА у детей характеризуется мембрано-патологическими процессами, особенно выраженными при ООБ с атопией и БА со значительным накоплением уровня ЛФХ.

4. Установлена высокая активность ПОЛ, преимущественно в ненасыщенных липидах мембран эритроцитов при различных формах бронхитов и БА. Выявленные изменения уровня продуктов ИДС, КТ+СТ в ненасыщенных липидах мембран Эц зависят от выраженности гипоксии и от наличия неблагоприятного аллергофона, что подтверждается увеличенным ИОЛ в изопропаноле, особенно для ДК, а также сниженными показателями СННожк липидов мембран эритроцитов для КТ+СТ.

5. Выраженные процессы мембранодестабилизации, особенно у детей при ООБ с аллергической предрасположенностью и БА, обусловлены низкой активностью антиперекисной защиты клеточных структур организма ребенка, о чем свидетельствуют показатели каталазы.

6. Для прогноза формирования БА у детей раннего возраста с ООБ и наличием семейного и аллергологического анамнеза могут быть использованы биохимические и иммунологические показатели, участвующие в аллергическом воспалении слизистой бронхиального дерева, с эффективностью прогноза до 72,7%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. На основании полученных клинико-биохимических исследований рекомендовано всех детей с обструктивным бронхитом и отягощенным семейным и аллергологическим анамнезом, даже после первого эпизода заболевания, относить в группу риска по развитию БА и рассчитывать прогноз формирования БА.

2. Принципы ранней дифференциальной диагностики с использованием анамнестических, клинических и дополнительных биохимических маркеров БА у детей раннего возраста включить в учебные программы подготовки педиатров, врачей общей практики, пульмонологов, аллергологов на базовом и последипломном этапе.

3. Для своевременной диагностики Б А у детей раннего возраста рекомендовано определение соотношения степени ненасыщенности липидов в гептановой и изопропанольной фазе, а также сывороточной холинэстеразы, как высокозначимых и недорогостоящих показателей.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Показатели провоспалительных цитокинов и уровня гиперреактивности бронхов при инфекционном бронхообструктивном синдроме у детей раннего возраста / И.Д. Кайб, А.С Никогосян, А.Д. Петрушина, Н.С. Киянюк // Медицинская наука и образование Урала. - 2011. - №3. - С. 67-69*.

2. Структурно-функциональные изменения фосфолипидов мембран эритроцитов и их роль в патогенезе бронхообструктивного синдрома у детей раннего возраста / И.Д. Кайб, А.С Никогосян, А.Д. Петрушина, Т.Д. Журавлева // Медицинская наука и образование Урала. - 2011. - №4. - С. 69-71 *.

3. Уровень продуктов переоксидации и индекс окисленности липидов мембран эритроцитов у детей с заболеваниями органов дыхания / И.Д. Кайб, A.C. Никогосян, А.Д. Петрушина, Т.Д. Журавлева // Медицинская наука и образование Урала. - 2012. - №4. - С. 23-25*.

4. Алгоритм диагностики бронхиальной астмы у детей и подростков в условиях стационара Результаты апробации / И.Д Кайб., А.Д Петрушина., Н.Н Самодурова, Л.Н Куличенко, А.С Никогосян, Н.С Габараева // Алгоритмы для врача первичной медико-санитарной помощи. - Москва, 2009,- С. 21-23.

5. Показатели провоспалительных цитокинов при бронхиальной астме и обструкгивном бронхите у детей раннего возраста/ И.Д Кайб, А.С Никогосян. А.Д Петрушина // Проблемы здоровьесбережения дошкольников, учащихся и студентов. Новые здоровьесберегающие тенденции в фармации и медицине. - Воронеж, 26-27 апреля 2011. - С. 209-212.

6. Показатели ß - адренергической реактивности мембран эритроцитов при бронхообструктивном синдроме у детей раннего возраста / И.Д Кайб, А.С Никогосян, АД Петрушина // Актуальные проблемы педиатрии. Тюмень, 2011. - С 60-61.

7. Определение индекса окисленности липидов мембран эритроцитов у детей с заболеваниями органов дыхания / И.Д. Кайб, A.C. Никогосян, А.Д. Петрушина, Т.Д. Журавлева // Вестник УГМА выпуск 24 Тезисы. Екатеринбург. - 2012г. - С. 75.

8. Процессы переоксидации липидов мембран эритроцитов у детей с бронхообструктивным синдромом / И.Д. Кайб, A.C. Никогосян, А.Д. Петрушина, Т.Д. Журавлева // Актуальные вопросы современной педиатрии. Межрегиональный Сборник научных работ с международным участием. Ярославль, 2012г. - С. 167-169.

9. Интенсивность переоксидации в ненасыщенных липидах мембран эритроцитов у детей с заболеваниями органов дыхания / И.Д. Кайб, A.C. Никогосян, А.Д. Петрушина, Т.Д. Журавлева // Материалы VII Терапевтического форума «Актуальные вопросы диагностики и лечения наиболее расространенных заболеваний внутренних органов». Тюмень, 2013. - С. 48-49

*- опубликовано в издании, входящем в Перечень ведущих рецензируемых научных изданий и журналов, рекомендованных ВАК.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЦХ - ацетилхолин

БА - бронхиальная астма

БОС - бронхообструктивный синдром

ДК - диеновые конъюгаты

ИДС вещества с изолированными двойными связями ИЛ - интерлейкины(1Ь)

ИОЛ - индекс окисленности липидных компонентов

Кат - каталаза

КД -кетодиены

ЛФХ - лизофосфатидилхолин

ОБ - острый бронхит

ООБ - острый обструкгивный бронхит

ОРИ-острая респираторная инфекция

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СНН - степень ненасыщенности липидов

СННожк - степень ненасыщенности остатков жирных кислот

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободнорадикальное окисление

СТ- сопряженные триены

СФМ - сфингомиелин

ФС - фосфатидилсерин

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭА - фосфатидилэтаноламин

ХЭ - холинэстераза

ШО - шиффовы основания

Эц- эритроцит

вПЧА - междунородный консенсус по бронхиальной астме ^Е - иммуноглобулин Е

Р -АРМ Эц - бета-адренергическая реактивность мембран эритроцитов

Никогосян Анна Спартаковна

ЗНАЧЕНИЕ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРОЦЕССОВ ПЕРОКСИДАЦИИ ЛИПИДОВ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ВОСПАЛЕНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА

14.01.08 - педиатрия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени .кандидата медицинских наук

Подписано в печать: 5 декабря 2013 года Формат 60x84/16. Печ. п. 1,0. Печать ризограф. Тираж 100. Заказ №1567.

Отпечатано в типографии ООО «Печатник», лицензия ПД № 17-0027 Тюмень, ул. Республики, 148 корп. 1. Тел. (3432) 20-31-13, тел./факс (3452) 32-13-86