Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Значение лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии в дифференциальной цитологической диагностике и прогнозе рака предстательной железы

На правах рукописи

ТЕВРЮКОВА Надежда Сергеевна

ЗНАЧЕНИЕ ЛАЗЕРНОЙ ДНК-ПРОТОЧНОЙ ЦИТО ФЛ УО РО М ЕТ Р И И В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЦИТОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ И ПРОГНОЗЕ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ (14.01.12 - онкология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ИЮН ?/Щ

Москва-2010 г.

004605204

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН и ГУЗ Калмыцком республиканском онкологическом диспансере им. Э.СТимошкаевой МЗ Республики Калмыкии

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Владимир Николаевич Богатырев

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Наталья Юрьевна Полонская

доктор биологических наук, профессор Людмила Егоровна Комарова

Ведущее учреждение:

ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии "РНЦРР Росмедтехнологии"

Защита диссертации состоится " ЦНЭ¿Г2010 г. в /@часов

на заседании диссертационного совета Д.001.017.02 Учреждения Российской академии медицинских наук РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан "_"_2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Ю.А.Барсуков

Актуальность темы

Рост заболеваемости раком предстательной железы (РПЖ) обуславливает повышенный интерес к этой проблеме. Несмотря на улучшение методов диагностики и разработку программ, направленных на раннее выявление РПЖ, диагностика РПЖ на ранних стадиях остается наиболее актуальной (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008). Сегодня рак простаты является предметом тщательного изучения: ведутся работы по уточнению его этиологии, механизмов развития и диагностики, особенно на ранних стадиях.

Своевременная диагностика РПЖ сложная задача, которая наиболее точно решается с помощью комплекса клинико-лабораторных, морфологических, УЗИ, ТРУЗИ, КТ и ПРИ. Среди этих диагностических мероприятий в последние годы основное внимание уделяют методу морфологической диагностике материала трансректальной пункционной биопсии (ТПБ) предстательной железы и исследования простатоспецифического антигена (ПСА) (Матвеев Б.П.. 2004, Петров С.Б. и соавт., 2005, Пушкарь Д.Ю. и соавт., 2007, Чиссов В.И. и соавт., 2007, Лоран О.Б., 2007, Schroder F.H., et.al., 2009).

Тактика лечения больных с РПЖ решается на основании морфологической верификации патологического процесса. Морфологическое подтверждение рака может быть получено при диагностической ТПБ простаты, позволяющей получить материал для послёдующего цитологического исследования. Цитологическое исследование наряду с гистологическим - одно из основных методов диагностики, которое активно используется при обследовании больных с патологией простаты.

Использование лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии дает возможность получить важнейшие характеристики РПЖ, которые позволяют уточнить биологические особенности злокачественной опухоли, в значительной мере влияющие на прогноз болезни (Богатырев В.Н., 1991,1999,2008, Lorenzato M. et.al., 2004, Haggarth L. et.al., 2005, Sengupta S., et.al., 2006).

Возможность проведения анализа количественных параметров лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии в зависимости от клинико-лабораторных и морфологических параметров позволил по-новому взглянуть на эти данные и выявить некоторые особенности клинического течения при диплоидном и ане-уплоидном РПЖ.

Все выше изложенное позволяет считать, несомненно, актуальной проблему своевременной диагностики и прогнозирования клинического течения РПЖ.

Цель исследования

Определить значение данных лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии для диагностики и прогнозирования клинического течения РПЖ. Оценить возможности цитологического исследования в диагностике материала ТПБ предстательной железы. Определить цитологические дифференциально-диагностические признаки, характерные для ДГПЖ и РПЖ. Определить значимость цитологического метода в комплексной диагностике РПЖ. Проанализировать взаимосвязь плоидности и количественных параметров клеток опухоли со степенью морфологической дифференцировки РПЖ, с оценкой по шкале Глисона, с показателем уровня ПСА, а также стадии заболевания.

Задачи исследования

1. Определить значение данных лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии для диагностики и прогнозирования клинического течения РПЖ.

2. Изучить особенности цитологических картин опухолей предстательной железы.

3. Выявить цитологические дифференциально-диагностические признаки, характерные для различных новообразований предстательной железы.

4. Определить значимость цитологического исследования в комплексной диагностике РПЖ.

5. Провести комплексное клинико-морфологическое исследование, включающее цитологический (с данными Д НК-проточной цитофлуорометрии), гистологический метод диагностики, иммуноферментный метод определения ПСА.

Научная новизна

Впервые методом лазерной проточной цитофлуорометрии проведен анализ содержания ДНК в клетках РПЖ для диагностики и прогноза.

Проведено комплексное клинико-морфологическое исследование, включающее цитологический (с данными ДНК-проточной цитофлуорометрии), гистологический метод диагностики, иммуноферментный метод определения ПСА.

Впервые в данной работе проведен анализ цитологической диагностики РПЖ по материалам трансректальной мультифокальной пункционной биопсии.

В работе оценена значимость цитологического метода для диагностики по материалу ТПБ (209 больных) новообразований предстательной железы. Изучены особенности цитологических картин опухолей.

Впервые проведен анализ взаимосвязи плоидности и количественных параметров клеток опухоли со степенью морфологической дифференцировки РПЖ,

с оценкой по шкале Глисона, с показателем уровня ПСА, а также стадии заболевания.

Практическая значимость

Полученные данные позволили рекомендовать цитологическое исследование материала ТПБ в диагностике патологического процесса предстательной железы и лазерную ДНК-проточную цитофлуорометрию в качестве дополнительного метода для определения индивидуального прогноза у больных РПЖ.

Цитологическое исследование материала ТПБ простаты является неотъемлемым, а в некоторых случаях завершающим этапом диагностики РПЖ на доо-перационном уровне. Полученные данные количественных показателей клеток опухоли при РПЖ с помощью метода лазерной ДНК-проточной цитофлуоро-метрии представляют возможность получить важнейшие характеристики РПЖ, которые уточняют биологические особенности опухоли, очень сильно влияющие прогноз болезни.

Апробация работы состоялась 3 ноября 2009 года на совместной научной конференции с участием сотрудников лаборатории клинической цитологии, лаборатории клинической биохимии, лаборатории клинической иммунологии опухолей, отделения урологии, отделения патологической анатомии опухолей человека НИИ КО РОНЦ им H.H. Блохина РАМН, кафедры онкологии ФУВ РГМУ Росздрава.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 167 странице машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Иллюстрирована 13 таблицами и 81 рисунками. Указатель литературы содержит 166 источников, из которых 61 отечественных и 105 зарубежный.

Содержание работы

Клиническая характеристика больных и методы исследования

В основу работы положен анализ результатов клинико-морфологических исследований материала, полученного у 209 больных с заболеванием предстательной железы, находившихся на обследовании и лечении в ГУ Калмыцкого республиканского онкологического диспансера им. Э.С.Тимошкаевой и НИИ

КО РОНЦ им H.H. Блохина РАМН за период 1995-2005 гады. При комплексном обследовании у 160 больных выявлен РПЖ (76,6%), у 49 больных (23,4%) доброкачественная гиперплазия предстательной железы (ДГПЖ. Возраст больных колебался от 47 лет до 80 лет и более. Пик заболеваемости приходится на возрастную группу 60-69 лет, средний возраст больных составляет 67,3 лет.

Исследование ПСА выполняли твердофазным иммунопероксидазным методом типа "Сэндвич" на основе моноклональных антител к ПСА, использовались тест-системы Can Ag EIA фирмы Can Ag Diagnostics (Швеция). Для измерения результатов использован иммуноферментный анализатор "Униплан", фирмы "Пикон" (Москва).

ТПБ простаты выполнена с использованием современного автоматического устройства для биопсии "Magnum" фирмы "BARD", США, иглами 18 калибра, что позволяет выполнить безопасную манипуляцию и получить столбик ткани достаточного диаметра. Устройство для биопсии позволяет регулировать глубину и изменять длину получаемого столбика (16-22 мм соответственно). В нашем случае использовали 22 мм. Биоптаты брались из 6 точек, так называемая "секстантная " биопсия. Для цитологического исследования получали мазки - отпечатки с полученных столбиков ткани простаты на обезжиренное предметное стекло. После высушивания на воздухе препараты окрашивали по методике Паппенгейма, изучали в световом микроскопе. Принципы изучения мазка сводились к обязательному исследованию краев препарата по всему периметру и двухразовому перекрестному анализу его полей зрения.

При цитологическом исследовании в 99,4% наблюдений диагностирована аденокарцинома разной степени дифференцировки и в 0,6% случаев переход-но-клеточный рак. У всех пациентов диагноз установлен на основании данных цитологического исследования, подтвержденного гистологически. Цитологические препараты анализировались согласно классификации ВОЗ (2004).

С помощью лазерной ДНК-проточной цитофлуорометрии для оценки прогностической роли плоидности и пролиферативной активности опухолевых клеток при РПЖ были определены параметры клеток опухоли у 35 больных РПЖ разной степени морфологической дифференцировки. Материалом для исследования служили биоптаты архивного гистологического материала предстательной железы, полученного во время оперативного вмешательства. Для проведение анализа содержания ДНК в клетках опухоли из парафиновых блоков дела-

лись тонкие (4 мкм) и толстые (50 мкм) срезы по специальной технологи. Клеточную суспензию получали по методу Hedley D. W. и соавт., (1983) и Camplejonh R.S. и соавт., (1985) в модификации В.Н.Богатырева (1991). Для качественного проведения приточно-цитофлуорометрического анализа в исследования выбирались наиболее клеточные участки опухоли, составляющие более 50% площади гистологического среза. После такой оценки представилась возможность с уверенностью исследовать содержание ДНК в ядрах клеток 50 мкм срезов. Клеточный состав суспензии, ее гомогенность контролировали под микроскопом по методике Cytospin (Shandon Со., Великобритания). Концентрацию клеток в суспензии доводили до 12х106в 1 млидобавляли 1.0 флуоресцентного красителя пропидиум йодид (Sigma Chemical Со, США) и исследовали на лазерном проточном анализаторе EPICS-XL (Beckman-Coulter, США). В каждом образце анализировались не менее 50000 клеток. Содержание клеток с различным содержанием ДНК на гистограмме определялось как процент от общего числа исследованных клеток. Полученные данные анализировались с помощью современных компьютерных программ System II™ (version 3.0, Beckman-Coulter, США) и MultiCycle (Phoenix Flow Systems, США), позволяющих точно установить плоидность и распределение опухолевых клеток по фазам клеточного цикла и детализировать число опухолевых клеток в S-фазе и 02+М-фазах клеточного цикла. Проанализированы взаимосвязь количественных параметров клеток опухоли со степенью морфологической дифференцировки, оценкой по шкале Глисона, с показателем уровня ПСА и стадией РПЖ.

Статистический анализ данных

Степень линейной зависимости между переменными оценивалась при помощи коэффициента линейной корреляции Пирсона. Регрессионный анализ выживаемости по результатам полученных количественных параметров клеток опухоли у больных РПЖ выполнен с применением расчетов коэффициента параметрической корреляции, критерии Фишера и Стьюдента. Статистический анализ был проведен с помощью программы для компьютерной статистической обработки SPSS 11.0 для Windows. Графическая обработка данных производилась с использованием графических модулей пакета Microsoft Excel 2000.

Множественная линейная регрессия реализована в режиме "Регрессия" надстройки пакета анализа Microsoft Excell 2003.

Результаты исследования

Цитологическая диагностика ДГПЖ

Анализ данных клинико-морфологического обследования больных показал, что диагностика ДГПЖ и РПЖ возможна при использовании комплекса диагностических мероприятий. Основное внимание уделялось морфологическому анализу материала ТПБ предстательной железы. В настоящее время одним из морфологических методов является цитологическое исследование материала ТПБ. В клинической цитологии наибольший интерес представляет диагностика ДГПЖ (аденом и гиперплазии) и РПЖ. Тактика лечения больных с ДГПЖ и РПЖ решается на основании морфологической верификации патологического процесса. В связи с поставленными задачами изучались особенности цитологических картин опухолей предстательной железы. Полученные результаты сопоставлялись с данными гистологического исследования.

ДГПЖ цитологически диагностировано у 49 (24,5%) больных в материале ТПБ простаты. В наших исследованиях у больных с ДГПЖ цитологическая картина материала ТПБ простаты представлена большим количеством проли-ферирующих клеток мелких и средних рамеров, которые располагались небольшими группами, преимущественно скопления мономорфных клеток, в виде однослойных пластов. Клетки чаще располагаются беспорядочно, иногда с нагромождением клеток. Форма клеток округлая, овальная, высокий призматический эпителий с нечеткими границами, а также отмечаются клетки более крупных размеров, что характерно для пролиферирующего эпителия. Ядра клеток одинакового размера, округлой формы, с умеренно компактным равномерно распложенным хроматином, расположены центрально, чаще отмечатся эксцентричное их расположенное. Некоторые ядра содержат едва заметные, центрально расположенные ядрышки. Цитоплазма с четкими границами, чаще негомогенная, окрашена базофильно. В цитоплазме отдельных клеток обильные зернистые включения. Цитологическое исследование материала ТПБ предстательной железы позволило выявить степень выраженности пролиферации, что особенно важно - при дифференциальной диагностике ДГПЖ и РПЖ.

Цитологическая диагностика РПЖ

Цитологическое исследование материала, полученного при ТПБ простаты, позволило диагностировать у 160 больных (76,6%) РПЖ, из них у 13 больных (8,1 %) выявлен рак при клинической картине аденомы или гиперплазия проста-

ты. У данных больных получены высокие показатели ПСА более 20 п§/т1, которые ориентировали на углубленное цитологическое обследование.

Известно, что наиболее частый вид злокачественной опухоли предстательной железы - аденокарцинома. Основой достоверного диагноза аденокарцино-мы является обнаружение структурных признаков железистой дифференци-ровки. В исследованиях при изучении цитологических картин особое внимание обращали на морфологические признаки, характеризующие особенности клеток опухоли и степень их дифференцировки, которые позволили диагностировать высокодифференцированную аденокарциному - 44 случая (27,5%), умеренно дифференцированную аденокарциному - 67 случаев (41,9%), низкодиф-ференцированную аденокарциному -48 случаев (30,0%) из других форм - пе-реходно-клеточный рак - 1 случай (0,6%), рис. 1.

Цитологическая картина высокодифференцированных форм аденокарци-номы часто напоминает наблюдающуюся при аденоме (ДГПЖ).

0,6%

41,9%

В Высокодифференцированная аденокарцинома

В Умереннодифференцированная аденокарцинома

□ Низкодифференцированная аденокарцинома

□ Переходноклеточный рак

Рис. 1. Цитологическая диагностика РПЖ.

Характеризуется наличием относительно однотипных опухолевых клеток средних размеров, округлой, овальной или призматической формы, без выраженных признаков клеточной атипии и полиморфизма. Ядра интенсивно окрашены, имеют глыбчатое строение хроматина. По сравнению с клетками ДГПЖ цитоплазма раковых клеток содержит значительно большое количество мелких гранул. Высокодифференцированную аденокарциному иногда трудно отличить от ДГПЖ.

Умереннодифференцированная аденокарцинома представлена комплексами опухолевых клеток и значительным количеством разрозненных клеток. В комплексах опухолевые клетки располагаются тесно, не имеют четких границ. Ядра крупные, гиперхромные, с увеличенными ядрышками, много голых ядер. Выраженный клеточный и ядерный полиморфизм. Железистоподобные структуры имеют неправильные формы и встречаются реже, чем при высокодиффе-ренцированной аденокарциноме.

При низкодифференцированной аденокарциноме характерна выраженная ати-пия клеток, их разрозненное расположение, а также бесформенные, беспорядочные скопления. Клетки располагаются крупными железистоподобными комплексами, тяжами, форма их и размеры различны, чаще отмечаются мелкие группы с выраженным полиморфизмом, многие клетки располагаются изолированно друг от друга, много голых ядер. Отмечается стертость клеточных границ, беспорядочное расположение клеток в структурах. Ядра полиморфные, крупные, неправильных очертаний; выражены нуклеолы.

Нередко цитологическое исследование материала ТПБ являлось единственным морфологическим методом до начала лечения, в ряде случаев, когда в биопсийном материале не был получен материал, а в цитологических препаратах были единичные опухолевые клетки, по которым был поставлен диагноз. Подобная ситуация наблюдалась у 11 (6,9%) больных, у которых цитологическое исследование явилось основным методом в установлении диагноза РПЖ на дооперационном уровне. Из них у 2 (18.2%) больных диагностирована высоко-дифференцированная аденокарцинома, у 9 (81,8%) больных диагностирована умереннодифференцированная аденокарцинома.

Из 11 больных у 7 (63,6%) больных диагноз гистологически подтвержден на операционном материале, трое (27,3%) больных консультированы в РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, где подтвержден диагноз РПЖ и у одного (9,1 %) больного диагноз подтвержден на компьютерно-томографическом исследовании, выявлен метастаз в кости скелета остеобластического характера.

В наших исследованиях цитологически диагностирована одна из редких форм РПЖ - переходно-клеточный рак. Источником развития переходно-кле-точного рака являются резервные клетки, расположенные между дифференцированным переходным эпителием и базальной мембраной в крупных протоках. В цитологических препаратах переходно-клеточный рак представлен преимущественно полиморфными опухолевыми клетками с выраженными при-

и

знаками атипии. Очень важна и имеет значение точная диагностика переход-но-клеточного рака, так как эта форма РПЖ не поддается гормональному лечению.

Однако, как и любой диагностический метод, цитологический имеет свои возможности и пределы. В 2-х (1,3%) случаях у больных РПЖ был ложно-отрицательный результат при цитологическом исследовании материала ТПБ. В цитологических препаратах были представлены пролиферирующие клетки простаты. У этих больных в дальнейшем диагностирован РПЖ, а при цитологическом исследовании отпечатков операционного материала найдены клетки рака.

Цитологическое исследование позволило с достаточной высокой достоверностью не только констатировать наличие злокачественного образования, но и в большинстве случаев определить гистогенез и степень дифференци-ровки опухоли. Последнее весьма важно для клиники, так как известно, что выбор метода лечения определяется степенью дифференцировки новообразования.

Информативность цитологического метода в диагностике РПЖ в материале ТПБ составило: чувствительность-98,7%, специфичность-98,7%, точносгь-98,7%.

В наших исследованиях цитологический метод оптимизировал морфологическую диагностику РПЖ по материалам ТПБ. При исследовании мазков - отпечатков из биоптата предстательной железы не происходит деформация ткани, лучше определяется характер изменений клеток. Это относится к случаям, когда получено недостаточное количество биопсийного материала или когда в отпечатки попадают клеточные элементы рака, а в срезах они единичные и не могут быть достоверно оценены. Использование характерных цитологических признаков в диагностике РПЖ способствовало повышению информативности материала, полученного методом ТПБ простаты.

Таким образом, по результатам цитологического исследования материала ТПБ можно получить большой объем информативного материала. Цитологическое исследование оказывает существенную помощь в диагностике РПЖ по материалу ТПБ простаты. На основании цитологического исследования материала ТПБ можно установить не только правильный диагноз РПЖ, но и его степень дифференцироки. Цитологические признаки в случае сомнительных структурных нарушений приобретают решающее значение в установлении диагноза РПЖ в дооперационном периоде.

ПСА в диагностике РПЖ и ДГПЖ

Клиническую информативность ПСА оценивали у 170 больных: у 121 (71,2%) больных РПЖ, из них у 13 (10,7%) пациентов с ДГПЖ, получены показатели уровня ПСА выше 20 п§/т1 и у 49 (28,8%) больных - ДГПЖ. В исследованиях уровень ПСА у больных с РПЖ варьировал в пределах от4,0 п^т1 до 58 у больных с ДГПЖ от 4 п§/т1 до 13,8 п§/т1.

При цитологическом исследовании материала ТПБ простаты у 83 больных с показателем уровня ПСА от 4 до 10 п£/т1 диагностировано преимущественно ДГПЖ у 46 (55,4%) больных, РПЖ диагностирован у 37 (44,6%) больных. У 51 больного с показателем уровня ПСА от 10 п§/т1 до 20п§/т1 в материалах ТПБ превалировал РПЖ у 48 (94,1%) и у 3 (5,9%) больных ДГПЖ. При анализе у 36 больных с показателем уровня ПСА более 20 п§/т! цитологически диагностирован РПЖу 36 (100%) больных.

Низкие показатели уровня ПСА сочетались с высокой дифференцировкой опухоли и ранней стадией РПЖ. У 37 (30,4%) больных при показателе уровня ПСА от 4 до 10 п§/т1 с высокодифференцированной аденокарциномой (ВДА) простаты установленаиТ1 стадия.у 10 (27%) больных иТ2 стадию РПЖ 27 (73,0%) больных. С возрастанием показателей уровня ПСА снижалась степень диффе-ренцировки РПЖ и увеличивалась стадия РПЖ.

В 4-10 пд/т! (37 больных) ® 10-20 пдЛт>| {43 больной) ш 20 пдЛп! м > (36 бохьных)

Чувствительность - 71,1% Специфичность - 80,1% Точность-71,1%

Рис.2. Распределение морфологических форм и стадии РПЖ при показателе уровня ПСА.

При анализе показателей ПСА от 10 до 20 у 48 больных в материалах ТПБ простаты диагностирована высокодифференцированная аденокарциннома у 8

(16,7%) больных, отмечается заметное превалирование умереннодифференциро-ванной аденокарцинномы (УДА), которая составила 40 (83,3%) больных. В этой группе Т1 стадию РПЖ составили 2 (4,2%) больных, Т2 стадию РПЖ составили 24 (50%) больных иТЗ стадию РПЖу22 (45,8%) больных.

При показателях уровня ПСА выше 20п§/т1 диагностирована умереннодиффе-ренцированная аденокарцинномау 6 (16,6%) больных, низкодифференцированная аденокарциннома (НДА) у 30 (83,4%) больных. С высоким показателем уровня ПСА составили2 (5,5) больных стадииТ2, у 19 (52,8%) больных стадии ТЗ и 15 (41,7%) больных стадии Т4 РПЖ. Чувствительность ПСА в проведенных исследованиях со-ставила71,1%, специфичность- 80,1%, точность- 71,1%, рис. 2.

У 121 больного на основании повышенных показателей уровня ПСА выполнена ТПБ предстательной железы. В полученных материалах ТПБ цитологически диагностирована аденокарцинома разной степени дифференцировки: высо-кодифференцированная-у37(30,4%) больных, умереннодиф-ференцирован-ная -у 54 (44,6%) и низкодифференцированнаяу 30 (25,0%) больных. Морфологические формы РПЖ подтверждены гистологически, в биоптатах проведелена оценка опухоли по шкале Глисона.

У 39 (24,4%) больных без исследований ПСА. Цитологически диагностировано в материалах ТПБ простаты: высокодифференцированная аденокарцино-ма-у 7 (17,9%) больных, умереннодифференцированная аденокарцинома-у 13 (33,3%), низкодифференцированная аденокарцинома-у 18 (46,2%), переход-но-клеточный рак - у одного (2,6%) пациента. В этой группе отмечена низкая выявляемость ранних форм РПЖ, так стадия Т1 не была выявлена, стадия Т2 - у 11 (28,2%) больных, ТЗ-Т4 стадаиу 28 (72,1%) больных.

Таким образом, определение ПСА дополнительно с цитологическим исследованием эффективно использовать в диагностике рака предстательной железы на дооперационном периоде.

По данным изучения параметров ДНК - проточной цитофлуорометрии, диплоидные опухоли выявлены в 9 (25,7%) случаях (рис.3), анеуплоидные опухоли - у 26 больных РПЖ (74,3%).

Индекс ДНК (И ДНК) при диплоидных опухолях равнялся 1,0, а среднее зна-ченгие ИДНК при анеуплоидных опухолях-1,43 ± 0,7. У 2 (5,7%) больных ИДНК был меньше 1,0, в клетках опухоли наблюдалась потеря генетического материала. У 24 (68,5%) больных ИДНК был 1,1-1,8, т. е. отмечалась анеуплоидия в пределах митотического цикла.

Распределение по плоидности опухоли больных РПЖ

[□Диплоидные РАнеуплоидные |

Рис.3. Распределение по плоидности опухоли больных РПЖ

Следует отметить, что у больных РПЖ плоидность опухолевых клеток была связана с клиническими, морфологическими и клинико-лабораторными факторами прогноза при РПЖ, такими, как возраст больных, стадия РПЖ, степень морфологической дифференцировки, оценка по шкале Глисона и уровень ПСА.

Распределение больных РПЖ по содержанию анеуплоидных клеток в опухоли

Г

- Ш содержание анеуплоидных клеток менее 60% ЕЗ содержание анеуплоидных клеток 60-70% Р содержание анеуплоидных клеток более 70%

Рис.4. Распределение больных РПЖ по содержанию анеуплоидных клеток в опухоли (р<0,05).

При анализе количества анеуплоидных клеток в опухоли установлено, что при РПЖ у 13 пациентов из 26 (50,0%) больных опухоли содержали более 70%

анеуплоидных клеток, у 5 (19,2%) больных опухоли содержали 60-70% анеупло-идных клеток и у 8 (30,8%) больных опухоли содержали менее 60% анеуплоидных клеток (р<0,05), рис.4.

При анализе изучаемых параметров в зависимости от возраста больных РПЖ отмечено, что диплоидные опухоли наблюдались в 36,8% случаев в основном в возрасте от 60 до 70 лет. Анеуплоидные опухоли выявлены у 3 (100%) больных РПЖ в возрасте моложе 60 лет. Анеуплоидия чаще наблюдалась у больных в возрасте 60-70 лет, в этой возрастной группе выявлены анеуплоидные опухоли у 12 из 19(63,2%) пациентов. В группе больных РПЖ старше 70 лет диагностированы анеуплоидные опухолиу 11 (84,6%), диплоидные опухолиу 2 (15,4%).

Анализ изучаемых параметров клеток опухоли в зависимости от степени морфологической дифференцировки опухоли позволил обнаружить, что у 5 (45,5%) больных с высокодифференцированной аденокарциномой были диплоидные опухоли, у 6 (54,5%) - анеуплоидные. По мере снижения степени морфологической дифференцировки РПЖ чаще наблюдалась анеуплоидия клеток опухоли. Так у 3 (30,0%) больных с умереннодифференцированной аденокарциномой выявлены диплоидные опухоли, у 7 (70,0%) - анеуплоидные. При низкодифференциро-ванной аденокарциноме диплоидные опухоли выявлены у одного (7,1%) больного, анеуплоидные - у 13 (92,9%). При сравнении частоты диплоидных и анеуплоидных опухолей в группах с различными степенями морфологической дифференцировки получены достоверные различия (р < 0,05), рис.5.

Плоидность опухоли в зависимости от степени морфологической дифференцировки у больных РПЖ

54,5% 70,0% 92,9%

45,5%

30,0%

7,1% '

ВДА, п=11

УДА, п=10

□ Диплоидные □ Анеуплоидные

НДА, п=14

Рис.5. Плоидность опухоли в зависимости от степени морфологической дифференцировки у больных РПЖ (р<0,05).

Пятилетняя выживаемость больных с диплоидной высоко-дифференцированной аденокарциномой составила 67%, в группе больных с умеренно дифференцированной аденокарциномой - 50%. Самая низкая пятилетняя выживаемость отмечена у больных с анеуплоидными опухолями. Так выживаемость больных при высокодифференцированной аденокарциноме составила 50%, при умереннодифференцированной аденокарциноме - 40%, при низкодифферен-цированной аденокарциноме - 0.

По данным анализа количественных параметров клеток опухоли у больных РПЖ в зависимости от оценки по шкале Глисона наблюдается следующая зависимость, так по мере увеличения оценки по шкале Глисона растет частота ане-уплоидных опухолей. При оценке 1 - 4 балла по шкале Глисона РПЖ наблюдались с одинаковой частотой анеуплоидные опухоли и диплоидные опухоли - 4 (50%) и 4 (50%). В группе больных при оценке 5-7 балла по шкале Глисона выявлены анеуплоидные опухоли у 8 (66,7%), у 4 (33,3%) - диплоидные опухоли. Среди 15-ти больных при оценке 8-9 балла по шкале Глисона у одного выявлена диплоидная опухоль, у 14 (93,3%) - анеуплоидные (р < 0,05), рис. 6.

Плоидность опухоли в зависимости от оценки по шкале Глисона у больных

РПЖ

50,0% 66,7% 93,3%

50,0%

Л ШЫШШШЩ-33,3% > "К

твжж

1-4балла, п=8 5-7баллов,п=12 8-9баллов,п=15

[ □ Диплоидные □ Анеуплоидные

Рис. 6. Плоидность опухоли в зависимости от оценки по шкале Глисона у больных РПЖ (р<0,05).

При анализе пятилетней выживаемости больных РПЖ в зависимости от оценки по шкале Глисона и плоидности выявлено, что выживаемость больных с диплоидным РПЖ при оценке 1 - 4 балла по шкале Глисона составила 50%, при

оценке 5-7 балла по шкале Глисона -100%. Установлена более низкая пятилетняя выживаемость больных РПЖ при высокой оценке по шкале Глисона, так при оценке 8-9 балла по шкале Глисона составило 0%. Низкая пятилетняя выживаемость наблюдалась у больных с анеуплоидной опухолью. Так, выживаемость больных РПЖ при оценке 1 -4 балла по шкале Глисона составила 33,3%, у больных РПЖ при оценке 5-7 балла по шкале Глисона - 60%, при оценке 8 -9 балла по шкале Глисона - 0%.

Количественные параметры клеток опухоли были проанализированы в зависимости от показателя уровня ПСА. У больных с показателем уровня ПСА от 4 до 10 п{2/т1 обнаруживали у 6 (54,5%) диплоидные опухоли, анеуплоидные опухоли - 5 (45,5%). При показателе уровня ПСА от 10 до 20 анеуплоидные опухоли наблюдали у 6 (85,7%) больных, диплоидные опухоли у 1 (14,3%) больного. При показателе уровня ПСА более 20 гщ/т! диплоидные опухоли выявлены у 2 (11,8%) больных, при этом заметно увеличилось число пациентов — до 15-ти (88,2%) - с анеуплоидным РПЖ (р < 0,05), рис. 7.

Ппоидность опухоли больных РПЖ в зависимости от показателей уровня

ПСА

о

т 40%

4-10 пд/т|, п=11

10-20 пд/т1, п=7

54,8% 14 3% .. 11,8%

85,7 88 2

45,5%

шя ^^яя

более 20 пд/т1, п=17

□ Анеуплоидный тип опухолии о Диплоидный тип опухоли

Рис. 7. Плоидность опухоли больных РПЖ в зависимости от показателей уровня ПСА (р<0,05).

Пятилетняя выживаемость больных с диплоидным РПЖ при показателе уровня ПСА от 4 до 10 гщ/т1 составила 75%, опухолями при показателе уровня ПСА от 10 до 20 п^т1 составило 0%, в этой группе наблюдался один больной, при

показателе уровня ПСА более 20 п§/ш1 - 50%. Выявлена более низкая выживаемость больных с анеуплоидной опухолью при высоких показателях уровня ПСА. Так, выживаемость при показателе уровня ПСА от 4 до 10 п§/т1 составила 50%, при показателе уровня ПСА от 10 до 20 пд/т1 - 33,3%, при показателе уровня ПСА более 20 п^т1 -10% (р<0,05).

Количественные параметры клеток опухоли были проанализированы в зависимости от стадии РПЖ (классификация ВОЗ). Анализируемые группы больных были объединены в 2 подгруппы: с I - II стадией и с III - IV стадией РПЖ. При исследовании распределения больных в зависимости от ИДНК и степени распространения по системе ТИМ отмечено, что число диплоидных опухолей было максимальным при ранних стадиях РПЖ. У 6 (37,5%) больных при стадии Т1-Т2 выявлены диплоидные опухоли, у 10 (62,5%) - анеуплоидные. Как показал статистический анализ, частота анеуплоидных опухолей возрастала с увеличением стадии РПЖ. Так, при III - IV стадии РПЖ анеуплоидные опухоли выявлены у 16 (84,2%) больных, у 3-х (15,8%) диплоидные опухоли, (р<0,05), рис.8.

Плоидность опухоли в зависимости от стадии РПЖ

100%

80%

20%

62,5%

,37,5%

84,2%

Шй

15,8%

1-2 стадия, п=16

3-4 стадия, п=19

□ Диплоидные □ Анеуплоидные

Рис.8. Плоидность опухолив зависимости от стадии РПЖ (р<0,05).

При анализе пятилетней выживаемости больных в зависимости от стадии РПЖ и плоидности выявлено, что выживаемость больных с диплоидными опухолями при I - II стадии составила 66,6%, при III - IV стадии - 50%. Низкая

пятилетняя выживаемость наблюдалась у больных с анеуплоидной опухолью. Так выживаемость больных с анеуплоидным РПЖ при I - II стадии составила 33,3%, при III- IV стадии -18,1%, (р<0,05).

Таким образом, плоидность явилась прогностическим фактором у больных с поздней стадией РПЖ. Анеуплоидия значительно коррелирует с прогностически неблагоприятными стадиями РПЖ (р<0,05).

Исследование ДНК показало, что пациенты с диплоидным РПЖ имели более благоприятное клиническое течение заболевания и выше выживаемость, чем у пациентов с анеуплоидными опухолями. При анализе фаз клеточного цикла выявлены при диплоидном и анеуплоидном РПЖ статистически достоверные различия по процентному содержанию клеток опухоли в С0/1-,8-, С2+М фазах. Индекс пролиферации достоверно ниже в диплоидных опухолях по сравнению с анеуплоидными новообразованиями (р<0,05).

В нашем исследовании анеуплоидия коррелировала с любым из неблагоприятных клинико-морфологических факторов прогноза у больных РПЖ. У этих больных статистически достоверно чаще наблюдались опухоли, содержащие менее 80% клеток в С0/1-фазе клеточного цикла, более 6% клеток в Б-фазе и более 10% клеток в 02+М-фазе клеточного цикла, при индексе пролиферации более 25% (р<0,05). Выраженная пролиферативная активность указывает на более агрессивное биологическое поведение опухоли и объясняет высокий риск прогрессировать при наличии сочетания с известными классическими неблагоприятными факторами прогноза.

При сопоставлении отдаленных результатов лечения больных РПЖ с количественными параметрами клеток опухоли отмечено, что наиболее низкая выживаемость отмечена у больных с анеуплоидным РПЖ в возрастной группе старше 70 лет, при низкой степени морфологической дифференцировки, низкой степени Глисона, при высоких показателях уровня ПСА, при увеличении стадии РПЖ. Диплоидные опухоли у больных РПЖ протекали менее агрессивно, чем анеуплоидные.

Исследования параметров плоидности при РПЖ являются одним из звеньев, связывающих лабораторные и клинические исследования в онкологии, представляющие основные факторы прогноза при опухоли этой локализации. Полученные в результате проведенного исследования данные подтверждают прогностическое значение плоидности при РПЖ. Успех лечения РПЖ во многом зависит от учета клинико-морфологических характеристик и плоидности опухо-

ли, только эти факторы позволяют индивидуально подойти к каждому больному при выборе тактики лечении.

Выводы

1. Цитологическое исследование материала ТПБ простаты дает возможность не только констатировать наличие злокачественного новообразования, но и определить морфологическое строение опухоли.

2. Цитологическое исследование материала, полученного при трансректальной пункционной биопсии, явилось неотъемлемым, а в некоторых случаях завершающим этапом диагностики РПЖ на дооперационном уровне.

3. Использование метода лазерной ДНК - проточной цитофлуорометрии дает возможность получить важнейшие характеристики клеток РПЖ, которые позволяют уточнить биологические особенности злокачественной опухоли, очень сильно влияющие на прогноз болезни.

4. Неблагоприятные клинико-морфологические факторы прогноза у больных РПЖ сочетаются с несколькими количественными параметрами клеток опухоли: анеуплоидия, увеличение числа клеток в Б- и 02+М-фазах клеточного цикла, повышение их индекса пролиферации.

5. При РПЖ плоидность опухолевых клеток коррелировала с классическими клинико - морфологическими и клинико-лабораторными факторами прогноза, такие как возраст больных, степень морфологической дифференцировки клеток опухоли, степенью Глисона, показателем уровня ПСА и стадией заболевания.

6. Анеуплоидия клеток РПЖ является одним из самых неблагоприятных клинико-морфологических факторов прогноза. У этих больных статистически достоверно чаще выявлялись опухоли, содержащие в 00/1-фазе клеточного цикла менее 80% клеток, более 6% клеток в Б-фазе и более 10% клеток в С2+М-фазах клеточного цикла, при индексе пролиферации более 25% (р<0,05).

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Цитологическая диагностика рака предстательной железы (РПЖ) в

Калмыкии. //Мат. III съезда онкологов ирадиологов СНГ. Минск. -2004. - с. 322.

(с соавт. Богатырев В.Н.).

2. Цитологическая диагностика рака предстательной железы (РПЖ) в

Калмыкии. // Мат. III конгресса онкологов Закавказских государств. Ереван. -2004. - с. 223. (с соавт. Богатырев В.Н.).

3. Современные возможности цитологической диагностики рака предстательной железы (РПЖ). // Новости клинической цитологии России. Тезисы VI Всероссийского съезда клинических цитологов.-2004.-Т. 8,№3-4. -с. 68-69. (с соавт. Богатырев В.Н.).

4. Современные возможности цитологической диагностики рака предстательной железы (РПЖ). // Сборник научно-популярных статей "Современные микроскопические исследования в биологии и медицине". -Москва., Лабора. -2006. - с. 166-172 (с соавт. Богатырев В.Н.).

5. Современные возможности цитологической диагностики рака предстательной железы (РПЖ). // Актуальные вопросы онкологии: Мат. научно-практич. конф. - Москва- Ростов - Элиста. - 2007. - с. 21 -28 (с соавт. Богатырев В.Н., Очиргоряев А.Б.).

6. Современные возможности цитологической диагностики рака предстательной железы (РПЖ). // Вестник Российского онкологического научного центра им. Н.Н.БлохинаРАМН. Москва.-2008. -№..-с. 64-70 (с соавт. Богатырев В.Н., Очиргоряев А.Б.).

7. Цитологическая диагностика рака предстательной железы (РПЖ). // Мат. V съезда онкологов и радиологов СНГ. Ташкент. - 2008. - с.85 (с соавт. Богатырев В.Н., Очиргоряев А.Б.).

8. Диагностика рака предстательной железы. // Сибирский онкологический журнал. Томск. - 2009 - №2 (32) - с. 49-54 (с соавт Богатырев В.Н., Очиргоряев А.Б.).

Подписано в печать 22.04.2010 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. 1,18. Тираж 120 экз. Заказ 2110.

Издательство Калмыцкого университета 358000 Элиста, ул. Пушкина, 11.