Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Значение количественных методов исследования (морфометрии, проточной цитофлуорометрии, сканирующей микрофотометрию в клинической онкоцитологии)

АКАДЕШЯ ЦЩЭДИШКИХ НАУК СССР ВСЭС08ВНЫЯ ОНКОЛОГИЧ0СКИЯ НАУЧНЫЙ ЦЕШР

На правах рукописи УДК 616-006-07Р 5

БОГАТЫРЕВ Бладапго Николаевич.

ЗНАЧЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ (1ЮРЖШЕТРШ, ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМУОРОНЕТРИИ, СКАНИРУЮЩЕЙ ШйРОЮТОУЕТРИЮ В КЛИНИЧЕСКОЙ

онтоцитологж

14.00.14 - онкология

14.00.15 - патологическая анатоная

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Шсива - 1991г.

Работа выполнена во Всесоюзном онкологическом научном центре АМН СССР (директор - академик АМН СССР Е Е Трапезников).

Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор А. С. Петрова

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук Е А. Шапиро Доктор медицинских наук, профессор Г. А. Сранк . Доктор медицинских наук, профессор JL Е. Денисов

Ведущие учреждение - Онкологический научный центр МЬ Республики Уолдова

Защита состоится "30" г igg г. в часов

на заседании специализированного copera Д. 001.17.01 по защите докторских писсертгцкй пря Всесоюзной онкологическая Коу^нон центре АМН СССР /115478,Москва,Каширское воссе, 24/.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР.

Автореферат разослан "26 Ученый секретарь специализированного совета, к. м. н.

199 i г. 11Е Шндоик

Ж -'TüHf Г _ з

I. тдвл 1

^ссутг.циу ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность. Одна из центральных проблем современной клинической цитологии опухолей связана с изучением возможностей количественных методов исследования кяетки-морфометрией,проточной цито-флуорометрией,сканируацей микрофотометрией. В специальной литературе до настоящего времени неполно отражены вопросы, касающиеся количественных параметров клеток при доброкачественных заболеваниях и раке молочной яелевы,легкого,лимфосаркомах. Работу в данном направлении проводились лишь отдельными авторами [Гасюк A.n. .1982; Даниленко Е И., 1983; Галина К IL ,1985; Baak J. Р. А. и соавт. ,1983.1985; Komltowski D. и соавт. .1985,1989; Marchevsky А. и соавт.,1988;Sugiura T. соавт. ,19881 и детально не раскрыли:возможности морфомотрии для уточнения степени выраженности предраковой пролиферации эпителия молочной лелезы;сведения о разрешающей способности метода при определении степени дифференцировки клеток рака молочной железы, легкого и улучшении цитологической диагностики отдельных морфологических вариантов рака и лимфосарком. Практически отсутствует в отечественной литературе данные об информативности и достоверности морфометрических параметров для оценки рецепторного статуса опухоли,степени выраженности лучевого и лекарственного патомор-фозе,количественных параметров первичной опухоли и ее метастамов, прогноза заболевания.

Нельзя не признать,что несмотря на более чем двацатилетнпо историю применения метода проточной цитометрии в клинической цитологии [Петрова A.C. и соавтр. ,1977;3убрихина Г. Н. и соавт., 1989;Dittrich V. .Gohde V. ,1969;Barlo(fle В., и соавтр. ,1978; 1980; 1983; 1985; Ms lan»d M.R. и соавтр. ,197В; Laeruun O.D. и соавтр. ,1981;Hedley D. и ссавтр. ,1984;1987;1991;Fallenlus А. 1986;Comellisse С. J. и соавтр. ,1987;Kallloniemi О. -Р. и соавтр. ,

1987; 1988;КогБ и соавтр. ,1989;Уо1т М. И ссавт. .1985.1088] ДО настоящего времени многие вопросы при исследовании пролиф-ратквной активност.. и плоидности доброкачественных заболеваний и рака молочной яелезы и легких остается недостаточно изученными, и,судя по данным литературы.носят противоречивый характер.

Морфологические особенности неходдаинскшг лиыфоы даэт возюк-ность предположить, что иг-ва различия в размерах клеток и ядер, особенностях структуры хродатина,испольгсзэнкэ шрфоштриа и модифицированного метода сканирующая мйкрофотоыетрии поавоха® с воль-шей степенью достоверности проводить по цазкаи-отпечаткам яиифэ-узлов дифференциальную цитологическую диагностику вариантов лнн|э-саркои и продвинуться с помощью комплекса ИЦ; этва- Ш1 - Эле га1 ро-ника 60-Рубин Ц-201-БС-1011-ЕС 1045" в решении проблемы бето!:^:-зации цитологических исследований.

•Существует и необходимость нэ основе количественного анализа углубленно изучить морфологические и биологические особенности клеток данных новообразований не только для улучшения I» цитологической диагностики,но и расширения возможностей цитологического метода при определении прогноза заболевания.

На основании изложенного, представляется актуальный исследовать данную проблему на достаточном обьеме клинического цитологического материала у больных раком молочной кэлезы,легкого и лимфосаркомаыи, как одних из ведущих локализаций в структура заболеваемости злокачественными новообразованиями в СССР.

В связи с этим,ДЕЛИ настоящей работы является создание с помощью количественных методов исследования банка параметров клеток для последующего использования его для объективизации я улучшении дифференциальной цитологической диагностики, прогноза заболевания и автоматизации цитологических исследований.

Для достигення поставленной цели решались следующие ЗАДАЧЦ-

1.Изучить ыорфометрические и проточно цитометрические характеристики клеток и оценить возможность использования полу-ченнных показателей для объективизации и улучшения цитологической диагностики доброкачественных эабо-еваний, рака молочной гэлезы.

. 2. Разработать на основании полученных количественных характеристик клеток возможные алгоритмы распозиования степени выраженности пролиферативных изменений эпителия и клеток р&ка молочксй делезы.

л Исследовать при раке молочной гглезы различие иорфометрических и проточно цитоштрических параметров клеток в зависимости, от локализации,стадии,морфологической формы, уровня рецепторов стероидных гормонов и степени дифференцировки клеток опухоли. Сравнить количественные параметры клетск первичной о1./холи и метастазов.

5. Проанализировать изменение количественных показателей (ыорфо-м&трическнтс и содержания ДНК) в процессе лечеиня больних с целью объективной оценки лучевого и лекарственного патоиорфоза.

6. Выявить признаки или совокупность количественных признаков, имеющих прогностическое значение у больных при раке молочной яел?эа

7. Изучить количественные параметры клеток новообразований лт-кого и определить их значимость для уточнения степени дифференцировки опухоли и улучшения цитологической диагностики низко. дифференцированных аденокарцином.зпидермоидного рака и недифференцированного! мелкоклеточного и крупноклеточного) рака.

■8. Выявить возможности иорфометрического метода для дифференциальной цитологической диагностики морфологических вариантов

на ходГ'-.лнеких лимфом.

9. Определить значение модифицированного метода сканирующей микрофотометрии для возможной автоматизации цитологической диагностики отдельных вариантов лимфосарком.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА исследования заключается в том,что на основании коулексного изучения создан банк количественных показателей клеток новообразований молочных желез,легких и лимфосарком и разработана классификация ДНК-гистограмм.

Показано,что комплекс количественных параметров клеток объективно и точно указывает степень дифференцирован опухоли.

Выявлено,что количественные параметры клеток опухоли и ее размер не связаны между собой прямо пропорционально.

Установлена закономерность ь изменениях количественных показателей в зависимости от гормонального статуса опухоли.

.Доказано,что полиморфизм клеток и ядер,размеры ядер при диплоидном раке достоверно меньше,чем в анеуплоидных новообразованиях.

Выявлено,что метастатические клетки анеуплоидных новообразований менее дифференцированы и с большей пролиферативной активностью,чем клетки первичных опухолей и диплоидных метастазов.

Использование специальных толстых игл (или трепана) дало возможность изучать параметры клеток опухоли в динамике,до и после лечения, что позволило объективизировать 'степень выраженности постлучевого и лекарственного патоморфоза.

Уст ловлено.что количественные параметры клеток опухоли могут служить дополнительными критериями отбора больных раком молочной железы для назначения лучевой и лекарственной терапии с адриамицином.

Впервые показана ценность модифицированного метода сканирующей микрофотометрии в комплексе с ЭВМ для возможной автоматизации начального этапа цитологической диагностики лимфосарком.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Использование в качестве дополнительных (фитериев количественных параметров клеток и разработанных на их основе алгоритмов,повышает точность цитологической диагностики-степени выраженности пролиферативных изменений эпителия, высоко дифференцированного рака молочной железы,морфологических вариантов низкодиференцнрованного и недифференцированного река легкого и лимфосарком.

Отработаны методики проведения проточной цитсф-луорометрии сразу после получения материала (с помопью детергента тритон Х-100),черев 2-3 дня иля позднее (после фиксации клеток) и на материале,из хранившихся годами парафиновых блоков,что дает возможность post factum установить плоидность к пролиферативную активность опухоли.

Установлено,что морфометрические и проточно цитометрические показатели иьзеют достаточную дискриминантную силу.для точного определения степени дафференцировки опухоли.

Показано,что диплоидные опухоли хуже поддается лучевой терапии, чем ане'илоидные. При химиотерапии с адриамицином плоидность опухоли не влияет на патоморфоз.но он более выражен в диплоидных и анеуплоидных новообразованиях с низким числом клптгж r ^ ннтотичус-кого цикла (cVZ).

Основные морфометрические и проточно цитометрические параметры в сочетании или в отдельности могут быть использованы в качестве объективных дополнительных показателей прогноза при раке молочной железы.

ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ. Результаты исследований внедрены в практику в ряде клинических отделений ВОНЦ АМН СССР, используются в лекциях на кафедре лабораторной диагностики ЦОЛИУВ VO СССР. Имеется 4 акта о внедрении в практику результатов диссертацион-

ЮЙ работы.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ состоялась £5 июня 1991 года на совместной научной конференции лабораторий клинической цитологии,клинико-диагностической, клинической радиоиммунологии,патологической анатомии опухолей человека с прозектурой,отделений опухолей молочных желез,диагностического НИН КО ВОНЦ АМН СССР,лаборатории морфологических исследований НИИ Лазерной медицины КЗ СОСР.

Основные положении диссертации доложены на: I Республиканской конференции врачей-лаборантов ЛатЕ. ССР,г. Рига, 1984г.; III Всесоюзном совевший по проточной цитометрни.г. Ленинград, 1086г.; III Респуб- . ликанском съезде враче й-лаборантов БССР, г. Минск, 1986г.; IV Всесоюзной конференции "Современные методы морфологического исследования в теоретической и практической онкологии, г. Тбилиси, 1988 г.; III Республиканской научно-технической конференции "Автоматизация цитологических исследований",г. Киев,1988 г.;международном симпозиуме "Проблеем клинической энзимологии",г. Ужгород, 1989 г.; симпозиуме "Гематологические и цитологические исследования в клинической лабораторной вкагностике", г. Ивантеевка. 1 сюп г..

Фрагменты диссертационной работы были удостоены премии Ленинского комсомола по науке за 1987 год.

ПУБЛИКАЦИИ: по теме диссертации опубликовано 18 научных работ, получено положительное решение на заявку К 4673292/14(035452) с просьбой выдать авторское свидетельство на изобретение.

СТРУКТУРА И ОБЬЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на VaScTp. машинописного текста.состоит из введения,обзора литературы,описания материалов и методов исследования,5 глав результатов собственных исследований,раздела обсуждения результатов и заключения, выводов, указателя литературы. Работа иллюстрировала ЗГрисун-kqmmи 54 таблицами. Список литературы включает S04 источнике^из них

Л0.2 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Исследование выполнено на базе лаборатории клинической цитологии (научный консультант-профсссор А. С. Петрова) и в ряде клинических подразделений Всесоюзного онкологического научного центра АМН СССР в период с 1984 по 1990 г. г.

Материал и методы исследования. Для выполнения поставленных

о

задач было обследовано -1053 больных.среди которых у 169 были чиагностированы доброкачественные заболевания молочной железы, у 526- рак молочной железы,у 1 - фибросаркома молочной железы, у 8 - карциноид легкого,у 7 - гамартома легкого,у 216 - рак легкого,у 9 -доброкачественные заболевания предстательной железы,у 14 - рак предстательной железы и у 103 - различные варианты лкмфосарком.

Для изучения количественных параметров клеток был использован комплекс иеследояаиий.в !»торый входили морфологические, морфо-

Ппо'гпинп шлгпг^п^пппип'т'пиийг'и-ил ^ТОДЫ " '^Д1/'!?1/'

ронянный метод сканнрующс-й иикрофотометрии.

1. МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД: рутинное цитологическое исследование лункгатов,мазков-отпечатков,окрашенных по Лейшману.с последующей гистологической верификацией диагноза и сопоставлением цитологических и гистологических заключения. Морфологические варианты,степень дифференцировки и злокачественности опухолей устанавливались в соответствии с критериями цитологической и гистологической классификаций [/хамова К. А. ,ВОЗ.Ы 17, 1982;СЭВ,1983,ВОЗ,N 1,1957;ВОЗ,N 14,1981 в модификации Пробато-вой а А. ,1982).

2. ДОРФОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД: при режиме работы "маркер" цитологический телевизионный анализатор "Интеграл-2МГ" (СССР) выдавал

на экран дисплея в ыкм и »ш2 результаты расчета площади и пери-летра клетки (соответственно S1 и Р1) и ядра (S2 и Р2).отношения площаей (S) и периметров ( Р), коэффициенты формы клетки( FI -Pi /4nSl ) и ядра(F2-P2/4nS2 ).а такне статистические характеристики: математическое ожидание(Х) и средкеквадратическое отклонение^) с последующи обработкой полученных числовых показателей методами вариационной статистики. В каждом исследованном цитологическом препарате морфометрические параметры определяли в 100 исследованных подряд верифицированных клетках (объектив 9Ох, окуляр 8х).

3. МЕТОД ПРОТОЧНОЙ ЩГГОФЛУ'ОРОЫЕТРИй окраса клеточной суспензии фдуорохромами для последующего количественного анализа Л!К и РНК гистограмм исследованных клеток на приборах ICP-1К ФРГ), FACS( США) с ртутно-кварцевой лампой и БОН (США) с лазерным источником излучения.

Материал для исследования на проточном анализаторе получали: 1) посредством пункции опухолей специальным! толстыми иглами, 2)методом трепанобиопсии;3)при операции; 4)из парафиновых блоков ранее удаленных тканей и опухолей.

При этом была показана возможность проведения анализа сразу после получения материала (с помощью детергента тритон Х-100), через 2-3 дня или позднее (после фиксации клеток) и на материале из хранившихся годами парафиновых блоков,что давало возможность post factum установить плоидность и пролиферативную активность клеток.

Для оценки результатов проточной цитофлуорометрии.с учетом данных литературы,разработана классификация ДНК-гистограмм. Выде--лены, диплоидные; тетраплоидные; многоклсно«ые: анеуплоидные опухоли с индексом ДНК (ИДНК) от 1,1 до 1,84 и больше 2.15.

С помощью РНК гистограмм определялось число клеток с повышен-

ms¡i содержанием рибонуклеиновой кислоты и на основании этого ориентировочно вычислялось количество клеток в G1 фазе клеточного цикла.

Таким образом, на основании типа гистограмм, при строгом цитологическом контроле, выделены группы больных с диплоидными и аиеушюкдяйа» новообразованиями. Подтип гистограмм дал возможность учесть количество анеуплоздных популяций в опухоли,число анеуплоидных клеток, их пролиферативную активность и установить по йдПК отепеяъ авеуплоидич.

4. НОДШЦИРОВАНКЫЙ УККРСЙОТОЫЕТРИЧЕСКИЯ МЕТОЛ (распознавание образа клетки): запись с помоцьо сканкруюзего устройства, управляемого мини-ЭВУ "Электроника-60",с оптического светового микроскопа "Протва-HIP с фотометрической насадкой, информации о клетках

с последупзей передачей и обработкой данных на ЭВМ ЕС-1011,ЕС-1045. В качестве устройства визуализации клетки используется цветной телевизор "Рубин-11-201".

5. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОБУАШТКА количественных характеристик клеток проводилось на ЭВМ методами вариационной етатиьм-впя l псяогьв стандартных пакетов программ Statgraphics (Version 2.5;N 710240, 1986)-.Super Culc 4 (Version 1.00.S/N 1010-.096104,1986).

РЕЗУЛЬТАТЫ ЮСЛЕД0ВШЯ 1. Изучение морфометрических и проточно цитометричесгая параметров клеток яри доброкачественных заболеваниях молочной железы.

Установлено, что при доброкачественных заболеваниях молочной железы (мастопатии и фиброаденоме) периметр,площадь клеток и ядер, ит. число в G1.S.G2+M фазах митотического цикла позволили объективизировать и более четко разграничить степень пролиферативных изменений зйктедая молочной вглезы.

Кластерный анализ всех 8 морфометрических параметров позволил получить б информативных алгоритмов.с высоким коэффициентом эффективности (до-98».На рис.1 в графической форме при доброкачественных заболеваниях молочной яелезы показан один из них,отражающий зависимость среднего арифметического площади ядер от среднего квадратического отклонения пленит ядер. Особо следует подчеркнуть, что в 97.92 наблюдений клетки были диплоидны*;:. Только в 2, IX случаев предраковой пролиферации эпителия и при слоистой фиброаденоме выявлены аиеуплоидные ДНК гистограммы (рис.2). Такие больные, особенно при сочетании анеуплоидии с большими,чем в среднем по группе, основными морфометрическими параметрами клеток должны быть,по нашему мнению,дополнительно обследованы для исключения злокачественности процесса. В случаи подтверждения доброкачественного характера новообразования за ними необходимо устанавливать тщательный динамический контроль.

Пролиферируюадй эпителий выстилки кисты по своим морфометрически и параметрам существенно отличался (р<0,05) от эпителия протоков и альвеол с различной степенью пролиферации. Во всех изученных на проточном анализаторе случаях был выявлен диплоидный характер гистограмм,индекс ДНК (ВДНК)-1,0,статистически достоверно большее (р<О,05).относительно группы с умеренно выраженной пролиферцией эпителия, число клеток в Б-фазе митотического цикла и с повышенным содержанием РНК

Морфометрический анализ клеток эпителия при плазмоклеточном мастите показал их умеренно выраженную степень пролиферации. Исследование клеточной суспензии (анализировались не только клетки эпителия, но и плазматические клетки,гистиоциты и другие) выявило ее . диплоидный характер (ИДНК - 1,0). 5 мазках-отпечатках плазматические клетки составляли в среднем 28-301. Метод проточной цитометрик быстро и точно псказал.что только 28.4+-3.2Х клеток суспензии было

А

- la

• - Ьегроифаративая 4сриа мастепата» , Ч

о- 4»ípoa»acii»l0ea проиграй«») . \

А - Про«я1«рвтг»Е11| öopua \ »•CtOIUT«»(ï*. 1кр.) >f

*íOpcai««o»a(jtii. í^p.npoi; \

V - ДролаС-арать^тгйггФоэиа

IMC?2£¿.(1«{M»0 lup.npoj,'

; - «1бро^иаом(?1мо zup. eu aoicKMol unu у

-йгорлтм^рае^зсааакал „„

1. D.IWTt* .«^««frnW ¿¡7>?î.7*

^tirtr^flrtHi-riiSf б?3 EHSSIÍCC*-

J. 3-"¿I5'-ív-n[)os«'t"p«ti4Ma S,6¡f

ív'jfl ur.lï0IJI»»(»i<. ïap.)

» îuopcojjHoyaiî«. »up.npc.Bj _

3. гчв;»- ре»ко II,«* 7,<.л 90,M

»upjrrVi.ji! гр;2»г«рат»8>«я

iOJтП ИОСТОГЗГЯ* »

Bjt«o¥at?'3iio вир.прол.} b сстгльпих ел уча гас ¡шеоко-

ojaiiiiuíl ^ак ЫОЛО'ШОЯ »елаэи

рис. I. Загисиюст» срегсего арифметического моей* яа«р от срелкегс кгадр«ти\кскаго отюскеки« шюзшя «г»р г баинчх при íoCpca'jerrttHXM» аайолвваи*«« я висода-1КФСер*мц*[ованном раке побочной мел*ал

с повышенным содержаниеи РНК,что объективно отражает особенность плазматических клеток, которые активно синтезирует белов.

2. Количественные параметры клеток опухоли при раке молочной желеек (морфометрическое н проточно цето-метрическое исследование).

У 526 больных (1025 цитологических препаратов) при раке молочной железы были изучены морфометрические особенности клеток опухоли, их пролкферативная активность и плоидвость.

Основные морфометрические показатели клеток рака были достоверно больше(р <0,05),чем параметры эпителия ыэлочной галезы при пролиферации по типу предрака (на рис. 1 предс-авлена одна из зази-симостей).

Проведенный кластерный их анализ подтвердил этот вывод и позволил разработать три диагностических алгоритма с коэффициентом эффективности 84-90,52;,и выделением "зоны риска",при попадании в которую морфоыетрическш: параметров клеток проли-ферируюзего эпителия за этой больной, по наше ¡¿у ынению.долвев устанавливаться регулярный цитологический контроль.

Тот факт, что морфометрические параметры клеток при доброкачественных заболеваниях (ДЗМЖ) и раке молочной железы (Р® не полностью отличаются друг от друга,показывает предел диагностических возможностей морфометрии,и,с нашей точки зрения,отражает трудности диффгтенциальной цитологической диагностики,коте¿ые,частично могут быть преодалены с учетом анализа ве только иерфоыатри-ческих.но и проточно цитомзтричееккх параметров.

Оказалось,что при раке шлочпсЯ лелеза 72,2Х опухолей бши анеуплоидными и,соответственно,диплоидными были 27,новообра зований (рис.2). Наличие часто встречаемого диплоидного рака,и, пусть редко, но выявляемой анеуплоидии при доброкачественных забо-

ВЕ31 I ШЁ г анеупловдние днплоидние

.'рис. 2. Частота выявления диплоидных и янруплоидньк й0£002рЗо0ьанпй молочной железы, левая«» (2,IX всех наблюдений) резко ограничивает.в отличии от иорфоыетрии,диагностические возможности проточной цитофлуоро-меТрии.а сочетание осоих методов способствует улучшению цитологической диагностики высоко дифференцированного рака молочной железы (табл. :).

йэ при этом,особо следует отметить,что не было выявлено различия между параметрами клеток диплоидного ВД долькового рака н резко выраженной пролиферативной формой мастопатии.

Таким образом,объективизация основных параметров клеток и ядер с помощью морфометрии и проточкой цитометрии позволила внести при различных вариантах высокодифференцированных опухолей молочной железы четкие количественные критерии,которые -яюжно исиол-гсвять в качестве дополнительных яри проведении

Т-Ллип.ч 1

Количественные параметры,которые можно использовать в качестве дополнительных для дифференциальной цитологической диагностики высокодифференцироЕанного рака и резко выраженной пролифератиьксЯ Формы мастопатии с атипией ядер части клеток.

Характер процесса ! йолг-ественные параметры

Внутрипротоковый Основные морфометрические параметры

рак с началом инвазии и индекс пролиферации

Инфильтративный протоко-вый рак

1) диплоидный Основные морфометрические параметры

2) анеуплоидный Основные морфометрические параметры,

плоидность,индекс пролиферации

Инфильтративный долько-вый рак

1) диплоидный НЕТ ОТЛИЧИЙ

2) анеуплпияный Ядерные морфометри* )ские параметры,

плоидность

Папиллярный рак Ядерные морфометрические параметры,

плоидность

Тубулярный рак Периметр клеток, их полиморфизм.

ядерные морфометрические параметры, плоидность

дифференциальной цитологической диагностики между ВД раком и резко выраженной пролиферацией эпителия молочной железы с атипией ядер части клеток.

Следует также отметить,что на основании проведенных нами исследований было показано,что у больных с диплоидными опухолями пролиферативная активность (ИП - индекс пролиферации) клеток выше (р <0,05),чем при доброкачественных процессах и нияе(р <0,05), чем при анеуплоидном раке молочной железы (рис.3).

Кроме того параллельно выполненный морфометрический анализ показал, что полиморфизм клеток и ядер размеры яяер.гои диплоидном раке молочной железы достоверно (р <0,05) меньше,чем в анеуплоидньа опухолях.

Диплоидные высокпдифференцированные новообразования при Т1МоМэ

х - 1? -

рак рак

рис. 3. Пролиферативная активность при р^эко вираженной

пролиферативной форме мастопатии с атипией ядер

части плеток, диплоидном и анеуг^оидном ;>аке

и ТЗИоМо стадиях рака молочной железы составляет примерно половину всех случаев, в то время как при других стадиях и. даже при ТгМоКЬ. процент анеуплоидных,менее дифференцирования опухолей,с высокой пролиферативной активностью достоверно выэ? (р <0,05).

При этом в 86,72 наблюдений диплоидного и 78,92-анеуплоидного рака ИДНК метастазов соответствуй показателям первичных новообразований. В ряде случаев (13,37.) диплоидные опухоли молочной железы метастазируют клетками с околодиплоидным ИДНК.

Клетки диплоидных мртастазов меныго,и,соответственно,в них выве, чем в первичной диплоидной опухоли ядернсклеточное соотношение и соотношение периметров,а их пролиферативная активность одинакова. Мгтаитасы янеуплоидного рака по основным иорфометрическим

параметрам крупнее,полиморфкее и обладают большей пролиферативной активностью,чем клетки первичной анеуплоидной опухоли, г. 2. Ивучение количественных особенностей клеток опухоли в зависимости от величины уровня рецепторов стероидных гормонов.

Последние годы при раке молочной железы для отбора групп больных,которым показана гормональная терапия вироко используется количественная оценка рецепторов эстрогенов (РЭ) и прогестерона (PID в цитозолях опухолей молочной железы.

Проведенное нами на цитологическом уровне изучение иорфо-метрических особенностей клеток опухолей, их пролиферативной активности и плоидностк с учетом возраста больных,их менструального статуса,величины уровня рецепторов стероидных гормонов показало,что параметры клеток рака,особенно морфометрические, могут быть использованы для ориентировочной оценки рецепторного статуса опухоли.

У Сймън ых мололе öü лет, с ccxpai;c<x*c£ iE не трузлькой и старше 60 лет,в глубокой менопаузе клетки и ядра РЭ+РП+ новообразований имеют наименьшую площадь,периметр и полиморфизм,а в РЭ-РП- опухолях наибольшие значения этих параметров. При анеуплоид-ном раке четкость этих различий менее выражена, чем при диплоидном. У пациенток же в возрасте от ¿0 до 60 лет в климактерическом периоде определить даже ориентировочно по количественным показателям гормонозависимость опухоли трудно (рис.4).

2.3. Объективизация степени выраженности патоморфоза.

Пункция опухолей специальными толстыми иглами или трепаном дает возможность получить до лечения необходимое количество материала, взятке его из новообразования после лечения,во время саерции, позволяет изучать в динамике количественные параметры клеток у больных при раке молочной железы.

Анализ количественных показателей клеток опухоли до и после предоперацинной крупнофракционной лучевой терапии (7ГРх2--СОД 14ГР и 5ГРх4-СОД 20ГР) или лекарственной терапии с адриамицином позволил объективизировать,в основном с помощью-мор-фометрических параметров,степень выраженности постлучевого и лекарственного патоморфоза.

е

При резко выраженных изменениях морфометрически» параметры кчеток и ядер достоверно (р <0,001) больше парам-? ров клеток пря слабо и умеренно выраженном патомсрфозе.

Кроме того было выявлено,что диплоидные опухоли хузе.чем анеуплондные поддавались лучевой терапии.

При химиотерапии с адриамицином плсидность опухоли не влияла на степень выраженности патоморфоза,но как в диплоидных.так и анеутиюидчых новообразованиях лекарственные изменения были вьппе в опухолях с низким числом клеток в 3 митотичоского цикла

Г { •7Г\ Тп ОЛЧ11, ШйПЛшииа ^«.пппич вютютм,«,^..«.«

• —' • Ч - - - — » ^ —---- - ... - - ......- - . • • ...... ^ Р."^ _«

сопровождалось достоверным уменьшением пролиферативной активности клеток рака молочной железы.

Полученные данные гакже свидетельствует, что после 1-2 курсог лекарственной терапии по схемам УСАР и СКРА.при слабой и умеренной степени выраженности патоморфоза,уменьшается площадь клеток опухоли,периметр и площадь ядер,полиморфизм этих показателей,что объективно свидетельствует о возрастании степени дифференцировки новообразований.

При этом особо следует отметить,что плоидность опухоли не влияла на степень выраженности лекарственного патоморфоза.

Таким образом,проведенное исследование показало неодинаковый характер изменений количественных параметров клеток опухоли при лучевом (облучение крупными фракциями) и лекарственном (схемы х/т с адриамицином) патоморфозе в зависимости от степени его выраженности.

Морфометрическв* пок&эатети

Проточно цвтоивтрвческяе параметры

рэ-рп-

рэ+рп+

рэ-рп-

рэ+рп+

рис.4 Отличив количественны* параметром клеток опухоли у вольная при РЭ-РП- и К?*РП+ рак« молочко.* железы.

«

2.4. Прогностическое значение отдельных количественных параметров клеток опухоли при раке молочной хелезы.

Проведенный статистический анализ показал, что сочетает« морфометрических и проточно щггоиетркческпх показателей имеет достаточную дисхримияантную силу, чтсоы уточнить степень дяфферен-цировки и злокачественности клеток рака ызлочной «левы.и,поэтому, оба метода могут быть полезны для классификации трудных случаев.

Увеличение основных морфометрических параметров плотни (st>

с

>255,3 мкм2),периметра (Р1>бЗЛ мкм) опухолевых клеток и ядер (J2>170,1 mkm2;P2>4S,2 мхм).их полиморфизма (F2>1,155) свидетельствует о i«eнее благоприятном прогнозе.

На рис. 5 графгшески показана дииачика выживаемости боль-

120 я

103' 92.С»

00 ЗОхЧ'-. $1.7и

во - (reta)

40 - маГ~— ♦4.7»

го -

0 • Í >......' ■ ■ 1 -

I г 5 а в 7 в

паям

рис.5. 8-летняя выживаемость больных при диплоидном (— ;п-180) й анеуплоидном (— ;п-429) раке молочной аелезы; (гг число набгодений).

них при диплоидном и аяеуплоидном раке молочной железы в течение 8-летнего периода наблюдения. Проведенный статистический анализ показал, что пациенток с диоаокдндог опухолями (38,3Z) уперло ва годы наблюдения достоверно меньве (р <0,001),чем с аяеутшэидными новообразования»»« (55,3t),но при этом следует отметать,что данное различие стало достоверным, только у больных переживших трехлетний рубеж.

Диплоидные и анеуплоидные новообразования (1,4 <ИШ< 1,84) с высокой пролиферативной активностью (ИП >202) является прогностически неблагоприятными,а сочетание таких проточно цитометрических показателей с перечисленными морфометрическимм параметрами еде более отягощает прогноз.

Следует также отметить,что тетраллоидные опухоли (II тип ДНК гистограмм) и карциномы с ИДНК от 1,1 до 1,3 с ни*кой и умерев-ной пролиферативной активностью клеток (III тип ДНК гистограш) являются более благоприятными в прогностическом плане анеуплоид-ньод новообразованиями,а редкие виды - многокяоновый рак (V тип ЛНК гястсграмм) в опухоли с резко вираггаюЯ сагуггсяхйэ»,«225 > >2,15 (IV тип ДНК гистограмм) самыми неблагоприятными с точки зрения прогноза (рис.6).

Количество анеуплоидных клеток в новообразовании не влияло на скорость прогрессировать заболевания,в отличии от высокого уровня пролиферации,которая лаблюдалсь у больных с ранним метаста-зированием опухоли.

Анализ данных показал,что индекс РНК (ИРНК) является менее точным прогностическим иараыетром.чем ИДНК. Так, у больных без прогрессировав»! и с прегрессированием заболевания одинаково часто встречаются минимальные,средние и максимальные значения ИРНК, но при этом отмечается тенденция к увеличению числа пациенток с худшим

Джпложпжий АшуяловдасцЗ ра* иолочяов сел«п| 16

11-1.1 1Л-И |-М-П> ».I» «»от-о >»ояо

1 ЕЗ г СИ з

БРМ р«акя«ш. уж рспн ыгтпо«>и

ВРУ

2 -*- 5 негсстми

рис.6. Распределение опухолей в соответствии с индексом

дан (8-летний пеоиод наблюдения!. Примечание:темные столбики-больные раком полочной железы без рецидивов и отдаленных метастазов (БРМ); заитрихсванные с реци-хивами и отдаленными метастазами:с точками-умерсие.

По оси абсцисс-индекс ДНК;по оси ординат-число случаев рака молочной мяюзы в I

ИРНК

ИРНК

» 5 М О.Т«.в 9.9 1.0 1.1 1.8 1.8 1.« 1.« 1.« 1.7 1.6 1.0 8.0 >4.С

ое 0.« «.? 0.8 0 9 1 1.1 1» 1.4 13 !.в 1.Т 1Л 1.« М >»•

1 Шг СЗ з

БРМ рвцкдяв, умгршав мвтаетааы

— I 4—а -а БРМ решал кг. ти*р ыатеставы

Рис.7. Распределение опухолей в соответствии с индексом РНК (8-летний период наблюдена.*).

Примочаниэ: темные гтолбики- больные раком молочной железы без рецидивов и

отдаленных метастазов заштрихованные- с рецидивами и отдх:->1-

иыми мэгастазамл; с точками- умершие.

По оси Юсцисе- илцекс Р11К; по оси ординат- число случаев рака молочнэ^ I элезы ( в процентах).

прогнозом при ИРНК >1,1 'рис. 7).

Отдаленные результаты так» показали, что в группе пациенток с прогрессировавкем заболевания и у умерших больных.клетки регионарных метастазов менее дифференцированы.чем первичная опухоль,а в акеуплоидных метастазах,р большинстве наблюдений.кроме того с повышенной проли4*»ративной активностью (р <0,06). В то время как в группе больнда без прогрессировалия заболевания количественные параметры

клеток опухоли и метастазов практически идентичны (р >0,05).

с

Анализ количественных параметров клеток до к после 2-х курсов УСАТ показал,что после лечения в группе пациенток без рецидивов и метастазов не было достоверного изменения морфометрических и проточно цитометрических показателей.В первичных опухолях больных,умерших в течение восьмилетнего срока наблюдения, обнаружено после химиотерапии достоверное уменыэение средних яначоккй ядррноклеточного соотно-вения и соотношения периметров,« статистически значимое увеличение '«ела клеток в Б-фазе митотичлского цикла.что объективно указывает на одновременное возрАгтг^чи^ степени дкЭД*гр<;нцировки и синтетической активности клетгж ИПППОЛПЯДПВл ни» _ и _ гуч- о »¡^¡.гу, 2 "П : ТС л ГрСГКГЛ-7л ческим признаком.

При этом,при любой стадии процесса.вне зависимости от морфологического варианта опухоли и проведенного лечения выявлен комплекс параметров свидетельствующий о неблагоприятном прогнозе рака (табл.«;).

Таблица 2

Прогностически неблагоприятные количественные параметры клеток опухоли у больных при раке молочной железы.

Стадия I Количественные параметры

«

-1-!---с--.

"ТГ"Н{ПГГ ' 51 >245икм2; 32 >160 мкм2; 5 >0,6ЬЗ; анеупл.,

п-54_в Б фазе О X; ИДНК > 1.35 _

"12 НОТВ Б1 >260 мкм2;Ь'1<? >120 мкм2;Р1 >65 мкм;

п-111 52 >200 мкм2;32& >70 мкм2; Р2 >50 мкм; _ анеупл. , ИДНК > 1,6 ;ИП >231__

"ТЗ ИЛВ--51 >215»вш2; анеупл.; НДНК > i,1

п-21

Т1-2 НГШ анеупл. , ЩК > 1,3--

1^106 ____

Tl-2 н?-злй Sfti >51мкм2; Р2 >42 мкм; Р2& >ömkm;F2>U85m»«;

п-51 ИП >ia.SS: КДНК >1.5_

тЭ-4 N1 МЭ Умеренно кли низкоднфференцированныа по данным

_ п-44_морфометрии опухоли с ИИ > 21*__

¿3-4 N2-3M0 S1 >285мкм2;Р1 >54 mkm;S2 >180"мой!;К >SÖ ыкм;

_п-101__анеупл., ИДНК > 1,3;ИП>19Х_

IV анеупл.

п-8 _ * _;_

отечно-инф.анеупл. ,ИП > 2iX форма рака

гу-4 _.____

Условные обозначения: п - число наблюдений; Тй.гупл. - анеуплоид-ная опухоль; Sie, S28 н тд.- среднеквадатн-ческие отклонения параметров (т.е. полиморфизм признака).

3. Количественные параметры клеток рака легкого (морфометрическсе и проточно цитометрическое исследование).

известно,что менее дифференцированные варианты аденокарциноы и плоскоклеточного рака в отличии от высокодифференцированных форм цитологически верифицируется в мазках-отпечатках как таковые лиль предположительно [Шапиро ЕА. .1985]. Поэтому,одной из задач проведенного исследования было создание банка количественных параметров клеток рака легкого для объективной характеристики различных морфологи* >ских вариантов злокачественных новообразоьаний и,особенно, низкой степени дифференцировки.

Для решения поставленной задачи у 231 больных с новообразованиями легких были параллельно кзучены из отологические,иэрфометри-ческие характеристики клеток опухоли,их плоидность и пролифераткг-ная активность.

Полученные после статистической обработки данные позволяют утверждать,что такие основные количественные параметры,как площадь,периметр клеток,полиморфизм ядер.ядерноклеточкое со-

отношение,соотношение периметров,коэффициент формы клеток и .ядер,индексы ДНК и пролиферации,могут быть использованы в качестве дополнительных дифференциально диагностических критериев при распознавании высокодифференцированных аде :окарцином легких (ВДА).

Особо следует отметить,что 752 изученных ЕДА были анеуплоид-ньми.с невысоким средним значением ИДНК 1,30+-0,07 и значительна« числом (66,3+-7,72) анеуплоидных клеток в опухоли. °

• Соответственно,в 252 случаях ЕДА были диплоидными,в среднем по группе,с достоверно более вьяокой (р <0,05) пролиферлтивной активностью клеток,чем при гиперплазии бронхиального эпителия,все случаи которой были диплоидными (рис.8).

Как известно,из-за отсутствия в клетках структурных и функциональных признаков дифференцировки наиболее сложным радделом цитологической диагностики является нипко и недиф>!ретм-рованные формы опухолей легких.

Проведенный статистический анализ показал,что снижение степени дифференцировки опухолей как при аденокарциномо.так и при плоскоклеточном раке сопровождается достоверным увеличением площади,периметра клеток и ядер,а при эпидермоидных новообразованиях и возрастанием ядерноклеточного соотношения,и соотношения периметров (табл.3). В анеуплоидных опухолях.указанные изменения морфометрических параметров коррелируют с увеличением значений индекса ДНК и пролиферативной активности клеток рака. Особо следует отметить,что анеуплоидньге опухоли в'ивлялись достоверно чаще (р <0,05) при низкодифференцированных новообр.1зова-ниях.чем при внеокодифференцированных.и составляли при ИДА -952 (при ВД-752),плоскоклет чном раке-972 (ЕД-79,42).

В 85-902 случаев изученные количественные параметры обладают достаточной дискриминантной склсй для уточнения степени дифферен-

- 28 -

X х«рохтер

iso

100

ео

во

40

го

и

О I НЯ г

дкпяоидяые апеуплсяякиА

рис. 8. Частота диплоидных и анеуплоидных аденокарцином в зависимости от степени диффренцировки опухоли. Условные : ВДА-высокодиффренцированая аденокарцинома; обозначения УДА-уме реннодиффренцированная аденокарцинома;

ПдА- НИЗК0ДИ™)реНЦИр0ВЯВНВЯ яп^моКЛишгшОМа.

ГКБЗ-гиперплазия клеток бронхиального эпителия (контрольная группа);

светлые столбики-диплоидные; темные-анеушаэидные новообразования.

цировки клеток рака легкого.

Основные иорфометрические параметры, полиморфизм клеток и ядер мелкоклеточного рака достоверно меньше,а ядеркоклеточное соотнояе-ние и соотноешние периметров статистически значимо больве соответствующих показателей при аденокарциноме и плоскоклеточном раке с низкой степенью дифферекиировки.

При мелкоклетсчксм раке 80% опухолей были анеушюидньыи с небольшим средним значением ШШК 1,34+-0,08. ре иной проли-ративной активностью (И1Ы 6,5+-1,31) и большим числом анеу-плоидных клеток в опухоли (65,1+-9,II).Соответсвенно,диплоидные новообразования встречались в 201 случаев,пролиферагавнак их активность Оылг ниже,чем у анеуплоидного мелкоклеточного

Таблица 3

Информативные морфометрические и проточно цитометрические параметры для уточнения степени дифференцировки клеток рака легкого.

Характер I Количественные параметры

процесса_I__

АДЕЮКАРЦШ58А

1. БД 230 <S1< 300 МКМ2-.58 <Р1< 67 мкм;125 <S2< 162 мкм2;

41 <Р2< 47 мкм; _анеупл.-752; ИП <212; ИДНК< 1.37 ___

2. УД 500 <S1 <382 мкм2; 1G3 <S2< 185 мкм2; 49 <Р2< 53~мкм;

анеупл. -702____ ________

3. НД S1 >305 мк»£;~55" >185мкм2; увеличение S> 659; анеупл. -

-952;ИДНК> 1.55 ;в S фазе 10.3+-1,02;ИП >26,52

\жшжшш~тж-------

1. ВЦ 266 <S1< 342 МКМ2-.52 <Р1< 69 мкм; 138'<S2< 155 мкы2;

43 <Р2< 46 мкм; _анеупл. -792; ИП < 232; ИДНК< 1.35 _

2. УД 343 <S1< 482мкм2;70 <Р1<83 mkm;lE>6 <S2< IQOmkm?;

46<Р2 >51 мкм;

_анеупл.-712; КДНК- 1.41+-0.05 ___ _______

Si >365 мкмй; Р1 >72 мкм; 52 >Г7\Гмкм?ГТ52 Япв мкм;

3. НД Увеличение S> 0,560; Р> 0,722;.больной полиморфизм

(ув. S1«,P19,F1) .чем при аденокарцитгаме; анеупл.-992; ИДНК >1,53; в S-фааа >13.92; ИП >272

Условные обозначения: ВД - в не о кед яффре н ни ро~в aiion ГУд-У*-] н но /; и<#>рс ¡i -цированная; НД-низкодишФронцироваиная опухоль:анеупл. - анеуялоидныЯ рак

рака легких.

При крупноклеточноь. раке почти все из восьми изученных морфэ-метрических параметров клеток были достоверно больше (р '0,001) соответствующих значений при мелкоклетечном раке.

Особо следует отметить, что все изученные на проточном анализаторе случаи крупноклеточного рака были анеуплоидными.с достоверно меньшим,чем при мелкоклеточном раке числом анеу-пдоидныт клеток в опухоли (соответственно 23,0+-3,22 и 65,1+-+-9,12,р<0,01),но более интенсивной пролиферативной активностью клеток. Возможно, ч/о небольшое число анеуплоидных клеток г опухоли при крупноклеточном раке является одним из факторов свидетельствующем о лучшем,чем при мелкоклеточном раке прогнозе заболевания.

со -

Таким образом, банк количественных параметров клеток новообразований легкого позволил в комплексе с известными цитологическими признаками более точно устанавливать степень дяф-ференцировки опухоли,обгектгамаировать дифференциальную диагностику высокодифференцированных,низкодиффарекц«тхзва иых аде-нокарцином.низкодиффгренцированного элидериэидяого ;рака -и недифференцированных раков- -мелкоклеточвото ш Яфупноиютоодого.

4. Количественные параметры клеток при лияфосарксме Сморфометрический анализ и использование модифицированного метода сканирующей микро^ютометрии).

Общепризнано, что точная морфологическая "верификация варианта лимфосаркомы и ее стадии являются важнейшими факторами Щя выбора тактики лечения.оценки выживаемости и длительности 'безрецидивного периода болезни.

Из-за различия в размерах я ггер Зфя нетсдескксккх

лимфомах, использование морфоыетрии позволило с 'большей степенью достоверности проводить по мазкам-отпечаткам лимфоузлов дифференциальную цитологическую диагностику вариантов лимфосарком.

Наименьшие морфометрические показатели лимофидных клеток были отмечены при пролимфоцитариой люяфосаркоме. Ядра клеток в зависимости от подварианта были или с раещэпленнием.или округлые. При расщеплении ядер отмечается увеличение коэффициента их формы (Пг-=1.152+-0,109) и показателя отнооевия периметра ядра к периметру клетки.

Лимфобластяая лнмфосаркома, как извесгис.таюве имеет два подварианта: микролим&областвый и макролимфобластный. При первом преобладают мономорфные относительно небольшие клетки о гипохромными ядргчи,окруженные узким ободком цитоплазма Раз-

меры клеток я ядер второй обшрной группы лии}осаркоы,как

свидетельствует терминология,и.как показали данные морфомет-

рического исследования,с последуете статистическим анализом,

больвеСр <0,05),чем параметры клеток при микролямфлЗластной лимфо-

саркоме. Подученные показатели позволяют не только статистически

достоверно различать по значениям площади,периметра клеток и

ядер оба подварианта лиьфэбластной лиыфосаркомы,но и с боль-

а

згй точностью проводить дифференциальную диагностику микро--ккфобластного варйзята яимфосаркомы от пролимфоцитарного.

По основным морфометрическим показателям (плооади,периметру клетки и ядра) иммунобластная лимфосаркома статистически достоверно не отличалась (р >0,05) от иакролк^бластксй лимфосаргамы.

На основе выявленных достоверных различий,по ядерным мор-фометрическии параметрам,с помощью кластерного анализа были разработаны алгоритмы диффере"Циальной диагностики вариантов лшфосаркоы, е коэффидиейтс.ч эффективности расгтссмспалкя гглзс 03,8% ДД.З от "ялтрпяаиДг-Ллплтной и 9Я. 12-

пролкн{юцитарной от микроли1ф>0ластной лкмфосаркомы (на рис. 9 в графической форме представлен один из них).

Таким образом,используя на цитологическом уровне полученные морфомэтрические параметры клеток,как дополнительные критерии, можно более достоверно установить морфологический вариант лимфо-сарком.

Однако,следует помнить,что морфометрические критерии не позволяют оценить структуру ядер клеток.

Восполнить этот пробел позволила совреденная методика распоэноваяия образа клетга создаваемая на основе модифицированного метода сканирующей микрофотоыетрин (комплекс"Протва--ШЬСлектроника -60-Рубин Ц-201-ЕС 1011-ЕС 1045"), которая

«ч

-19)

» - Пгелкчфекетврпап *1Р»!ос«р-

коае сг ипи с г^гдим

ядра»»

* - Врояаифоцатаряа« «шйосар-

коиа шз клато* в р*с&*<|-

5 «ниш» шрама »»¡юсакока со сяатавэ-махочиы* светало«

• - ВтролимфоОмспая «тафо-

саркова

О- Накроламфо&мстмя ггг^ь-

Тт с*пкоиа

» - ИцвдноЛггстЕв* хпа(ввасю> , ■а I

О ,9

О

а (

I ■

« ° • 1

го о

о в | о

Дауоращ распозяа»аввя

I. г,* • С^'З»- кшсрмввфо-Слвстяак лгазосаокома ш давфзоаркоиа со екввавио-ял»точным составом г. ♦ 83-мн|фОЛянфо-

властная « прсликфоцнтар-яая и«и4рос«рг.оиа. В остал»вюс случаях- аакро-,хг»фоСласгная в вштпоСласт-ая лянфоссркомн.

«И?

до 6%

п

93,4»

2,3* 98,1*

рис. В. Завискиэсть среднего ари$ыгтичесгого оаоаадм «лер от среднего кьалраткческого отклокекия пдоавдм ядер пра различных вариантах л»фх:армж

дала возможность выделить "а телевизионном экране ядра от цитоплазмы лимфойдньпс клеток и фона препарата и точно отразить в числовых значениях зернистость и грубость хроматина.

До начала распознавания ядер,по обучающим выборкам нормальных лимфокдных клеток и клеток различных морфологических вариантов лимфосарком был создан банк данных,включающий в себя полученные как геометрические признаки,характеризующие форму,размеры,

изрезанность границ,так и статистические параметры оптической

о

плотности (корреляция;дисперсия;дисперсия суммы;дисперсия разности; с применением метопа экзалязации изображения: второй угловой момент; среднее суммы;энтропия суммы;контрастность),которые достаточно точно характеризовали свойства изображения структуры хроматина ядер лимфсндкьи клеток.

Цитологические препараты предназначенные для распознованкя после морфологической верификации были закодированы, ййор их для анализа проводился "слепым методом". Полученные значения текстурных и геометрических параметров распозковас-мых клеток, ЭВМ сравнивала с банком данных, а затем про ил ли ля «•пя.-оу^к0,-цию клеток на два класса: "нормальные лнмфоидные клетки" и "клетки лимфосяркош",с последующим определением ее морфологического варианта Во _сех случаях машина правильно провела дифференциальную диагностику медду "кормой" и злокачественным процессом. При определении морфологических вариантов лимфосар-кош в 962 случаев ЭВМ точно поставила диагноз пролимфоцитар-ной лимфссаркомы; в 89Х-микролимфобластной и в 947. мзкролим-фобластной неходлкинской лимфомы. Кроме того с помощью этой программы были выявлены наиболее информативные геометрические и текстурные параметры ядер для каддого класса клеток.

Таким обрззом.с помощь-» ЭВМ .на основе геометричеких и текстур-

ных параметр ядер,возможно»по мазкам-отпечаткам лимфатических уз-ов,проводить не только альтернативную (норма-«шмфооаркома),но, с определенной долей вероятности,и дифференциальную диагностику морфологических вариантов лкуфэсаркои. Кроме того.шяно утверзкдать, что существует вычисляемая информация о состоянии хроматина,которая вероятно, не воспринимается с такой тонкостью визуально.

Однако,мы считаем необходимым подчеркнуть,что полученные результаты на комплексе "Протва М-11 - Электроника- 60- Рубин Д-201-- ЕС-1011-ЕС-1045",это только научный эксперимент, аоказа-ваадий возможности, которые открывает синтез «гз: эштикн и количественного анализа параметров клеток в клинической цитологии.

Пэдводя итоги работы можно прийти к заключении,что применение количественных методов в клинической онкоцитологии,с кспагьзоваляем компьютерной обработки данных математическими мгтодаш, позволяет на принципиально новой основе объективизировать и улучшить: цитологическую диагностику,оценку лечебного воздействия лучэвой,лекарственной терапии и прогноза у большого контингента боль еж и приблизиться к решению проблемы автоматизации цитологических наследований.

ВЫВОДЕ.

1.Использования количественных методов исследования в клинической цито-.огии показало несомненную ценность: морфом- трии для диагностики и прогноза заболевания;протечной нитофлуорометрни - для быстрого и точного определения плоидности новообразований,распределения клеток по фазам шт этического цикла к грогноза эаболевашш; модифицированной сканирушрй микрофотометрии- для возможной автоматизации цитологической диагностики.

2. Параллельное морфометрическое и проточно ютго&дуоромэтричес! je изучение новообразований молочной железы и легких,позволяет охарактеризовать клетки по геометрическим показателям,содержанию днк. и ИГЛ, создать банк количественных параметров и разработать классификацию ЛНК гистограмм.

3. фи доброкачественных заболеваниях морфометричэские алгоритмы, число клеток в G1.S.62+M фазах митотического цикля позволяют объективизировать и более четко разграничить степень продлФератицных изменений эпителия молочной железы (коэффициент эффективности 98-1007.).

4. Основные морфометрэтеские показатели клеток рака достоверно больсе,чем параметры эпителия молочной железы при пролиферации по типу предрака. На основе этих данных с помощью кластерного анализа разработаны восемь инфорьативиых алгоритмов распознавания клеток рака с коэффициентом эффективности (ГО) 91,Б-97,5Ь,7лучшие из которых (КЭ-П5,5-97,5Х) построены на параметрах ядер.

При этом 72,2Z опухолей б^ли анеуплоидными,и,соответственно, 27,41-диплоидными, наличие часто встречаемого диплоидного рака. и. пусть редко, но выявляемой анеуплоидии при доброкачисть^инах jüC».j леваннях (2.1Z всех наблюдений) резко ограничивает,в отличии от морфометрии,диагностические возможности проточной цитефлуоромет-рии.

Сочетанке обоих методов улучшает цитологическую диагностику высокодифференцированного рака молочной железы.

5. Вне зависимости от гистологической .формы рака молочной железы сочетание морфометрических и проточно цитометрических показателей имеет достаточную дискриминантную силу,чтобы уточнить степень дифференцировки опухоли.

6. Количественные параметры клеток опухоли и ее макроскопический размер не связаны между собой прямо пропорционально. При прогнозе

заболевания необходимо учитывать,что уже опухоли до 1,0 см в диаметре бывают анеуплоидными.с увеличенными морфометрическими показателя-¡Д'. клеток.

7. Параметры клеток рака молочной железы,особенно морфометркчес-кие,могут быть использованы для ориентировочной оценки рецепторного статуса опухоли. У больных моложе 50 лет,с сохраненной менструальной функцией и старше 60 лет,в глубокой менопаузе,клетки и ядра РЭ+РП+ новообразований имеют наименьшую площадь,периметр и полиморфизм,а в РЭ-РП- опухолях наибольшие значения этих паречетров. При акеуплоидном раке четкость этих различий менее выражена,чем при диплоидном. У пациенток в возрасте от 50 до 60 лет,в климактерическом периоде, определить даже ориентировочно по количественным показателям гормоно-зависимость опухоли трудно.

8. Сравнение показателей клеток опухоли до и после предопераданной лучевой терапии или химиотерапии позволяет объективизировать,в основном с помощью морфоыетрических параметров,степень выраженности пост-¿учигсгс :: лекарственного патс-орфоьа.

Диплоидные опухоли хуже поддаются лучевой тераЬии.чем анеуплоидные.

При химиотерапии с адриамицином плоидность опухоли не влияет на патоморфоз,но как в диплоидных,так и анеуплоидных новообразованиях лекарственные изменения выше в опухолях с низким числом клеток в S фазе митотического цикла (<■/%).

9 При любой стадии рака молочной железы,вне ^висимости от морфологического варианта опухоли и проведенного лечения,увеличение основных морфометрических параметров - площади (Sl>264,3 икм2),периметра ( Pl>63,1 мкм) опухолевых клеток и ядер (S2>170,1mkm2;P2>49,2 мкм),их полиморфизма (F2>1,155) свидетельствует о неблагоприятной прогнозе.

Диплоидные и анеуплоидные новообразования (1,4 <ИДНК< 1,84) с выражрнной пролиферативной активностью (ИП> 20%), редкие виды -- многоклоновый рак л опухоли с резко выраженной анеуплоидиёй

( ИДНК> является тага® прогностически неблагоприятными.

Сочетание перечисленных морфометрических и проточно цитометри-ческих параметров ещэ более отягоиает прогноз при раке молочной железа

10. Созданный банк количественных параметров кле-ок новообразований легкого позволяет в комплексе с известными цитологическими признаками точно устанавливать в 85-931 случаев степень диффере нцировки опухоли,объективизировать дифференциальную диагностику высокодифференцирован.-;ых, низкодифференцированных °ще-нокарцином,л:"кодифференцированного эпидермоидного рака и недифференцированных раков-мелкоклеточного и крупноклеточного,

что крайне важно для выбора тактики лечения.

11. Использование алгоритмов,разработанных на основе морфомотри-ческих параметров клеток неходжкинских лимфом.дает возможность, с учетом цитологических признаков, достоверно проводит}, дифференциальную диагностику вариантов лимфосарком с коэффициентом эффективности 98,li- для пролимфоцитарной от микролимфобластной, и выше 93,8Z- для кякрслимфсблас'тной о? мшфолитфзбласткой.

12. Анализ модифицированным методом сканируются микрофотометрии в мазках-отпечатках лимфоузлов морфометрических и текстурных пзраштров ядер позволяет ЭВМ определенной долей вероятности,проводить дифференциальную диагностику морфологических вариантов неходжкинских лимфом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ТО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Содеражание ДНК и РНК в клетках опухоли до и после проведения лучевой и лекарственной терапии по схеме VCÁF.-B сб.: "Современные методы лабораторных исследований".-Рига, 1984.ст. 53-54 /соавт.: А. С. Петрова, Т. JL Колосова/.

2. Лазерная проточная цитофлуорометрия как дополнительный метод

определения степени дифференцировки опухоли у больных раком молочной железы.- Архив патологии.1986,т.XLVIII.Nl.CTp.44-48 /соавт.: Е Д. Ермилова, А. С. Петрова/.

3. Определение содержания ДНК и РНК в клетках ткани лимфатических узлов при раке молочной железы с целью возможной дифференциальной диагностики процесса.-Депонирована в PI, 1986,раздел VI,N 8,публ. 1976.

... Показатели содержания ДНК и РНК в клетках при мастопатии и фиброаденоме. -В сб.: НШ Республиканский сьеад врачей-лаборантов 2ССР". --Шнек, 1986, стр. 174-175/соавт.: А. С. Петрова/.

5. Содержание ДНК в клетках при доброкачественных и злокачественных процессах различной локализации.-Архив патологии, 1986,т.XLVIII,К 4, стр. 8б-90/соавт.: А. С. Петрова/.

6. Количественная оценка цнтоморфологическиг изменений у больных раком молочной железы до и после лучевой терапии.-В сб.:"III Республиканский сьезд врачей-лаборантов ЕОСР".-Минск, 19öö,стр. 193-194 /соавт.: Т. Н. Страхова, Е Г. Читириди/.

7. Лечебно-диагностическая роль секторальной резекции молочной

же левы, выполненой амбулаторно. - В кн.: "Актуальные вопросы совершенствования поликлинического обслуживания онкологических больных". --Материалы Всесоюзной конференции.-Винница, 1987,стр. 43-45/соавт.: Р. К Пропп, JL И. Чеботарева, Е П. Летягин.Е. Н. Малыгин, Е Ы. Иванов, Т. R Страхова/.

8. Применение телевизионного анализатора "Интеграл-2ИТИ в целях цитологической диагностики новообразований.-Лабораторное дело, lb<á8,N З.стр. 64-67/в соавт.А. С. Петрова, В. Л LjaKOB, Л Ы. Исакова, А. А. Павлихин/.

9. Предварительные результаты цктоморфометрических .параметров клеток при доброкачественных заболеваний и раке молочной железы. --В сб.: "Диагностика злокачественных новообразований".- BOHS.hL ä

1988, стр. 95-98/соавт.: Н. Г. Читириди, Т. Е Страхова/.

10. Гистогенетические взаимоотношения между периферическим мелкоклеточным раком и карциноидом легких по данным электронномикро-скопического и морфометрическпго исследования. -В С.: "Современные методы морфологического исследования в теоретической и в практической онкологии". Материалы Всесоюзной конференции. -Тбилиси: Мецниереба, 1988, стр. 125-126/соавт.: С. М. Секамова,

Е. А. Ксгаи, Л. Е Конюхова, И. И. Кодолова/. . - °

11. Использование цитологического анализатора "Интеграл-2МТ"для анализа морфометрических параметров клеток рака легкого.-В сб.: "Современные методы морфологического исследования в теоретической и в практической онкологии". Материалы Всесоюзной конференции, --Тбилиси: Уецниереба.1988, стр. 155-156/соавт.: Е Г. Читириди, Л Е Карева, Т. Н. Страхова/.

12. Прогнатическая важность определения плоидности ДНК в клетках опухоли у больных раком молочной железы. -В сб. :'"Пооблемы клинической анаимологии". - Цатериали Всесоюзного симпозиума,Ужгород.

1989, стр. 17/соавт.: А. С. Петрова/.

13. Анеуплоидные и диплоидные новообразония молочных желез и их связь с прогнозом заболевания.-Лабораторное дело,1989,N 11,стр. -56.

14. Цитоморфомет^ические параметры клеток при доброкачественна процессах, и раке молочной железа-В сб.: "Автоматизация цитологических исследований". -111 Республиканская научно-техническая конференцияи. -Киев: Наукова думка, 1990, стр. 27-28/соавт.: Е Г. Читириди, О. Ы. Топуридзе/.

15. Мэтоды и алгоритмы классификации цитологических препаратов лимфосарком. -В сб.: "Автоматизация цитологических исследований". -- III Республиканская научно-техническая конференции.-Киев: Наукова думка, 1990, стр. 25-27/соявт.: И. С. Еиольяненко, Е Е Иваниц-

кая, А. С. Петрова, Ь П. Пьггьев,Т. П. Штьева, Л. Ы. Родионова/. 16. Значена морфометрического метода для дифференциальной диагностики и оценки степени дифферренцировки клеток рака молочной лглеза- В сб.: Гематологические и цитологические исследования в клинической лабораторной диагностике. Штериалы Всесоюзного симпозиума, Ивантеевка, 1вй0, стр. 54.

1 Создание банка морфометрических данных при заболениях молочной железы с помощью анализатора "Интеграл-2Ш"\ -Лабораторное дело, 1990, N 8, стр. 49-51/соавт.: А. С. Петрова, Я А. Михайлова, Д. А. Ломтадае, В. Н. Паншова/.

18. Периферический мелкоклеточный рак,атипиче-кий и типичный карци-ноиды легких (морфологические особенности,экспрессия клеточных онкогенов и гистоспектрофотоыетрия ДНК).-Архив патологии,1991, т. 53,N 7,стр. 42-48/соавт.: Е. А. Коган,С. М. Секамова,Н. Е Шзуренко/.

ИЗОБРЕТЕНИЯ:

1. Способ определения клеток крови на пазках .Изобретение

за N 4673292/14(035452) от 10 карта 1989 года./соавт.: И. С. Емель-

яненко.С. С. Задорояный, Н К Иваницкаа, й. И Пыгьев.Т. а штьева/.

участок! множительной техники вони амн СССР ПОДП. К ПЕЧАТИ 11.9.91 П - -. ЗАК.$05 . ТИРАЖфО