Исследование спонтанного и индуцированного апоптоза методом проточной цитофлуориметрии при раке молочной железы

Кудинова, Елена Александровна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Исследование спонтанного и индуцированного апоптоза методом проточной цитофлуориметрии при раке молочной железы

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Кудинова, Елена Александровна Москва 2005 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Исследование спонтанного и индуцированного апоптоза методом проточной цитофлуориметрии при раке молочной железы

На правах рукописи

Кудинова Елена Александровна

Исследование спонтанного и нндуцированнного апоптоза методом проточной цитофлуориметрии при раке молочной железы

(специальность 14.00.14 - онкология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Российском научном центре рентгенорадиологии МЗ и СР РФ (директор—академик РАМН, профессор В .П.Харченко)

Научный руководитель

доктор медицинских наук, В.К.Боженко

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, профессор Н.Е.Кушлинский доктор медицинских наук, профессор Н.И.Рожкова

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский онкологический институт им. ПАГерцена МЗ и СР РФ

Защита диссертации состоится «_»_2005 г.

в "_" часов на заседании диссертационного совета (К.001.17.01) при

Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН

Автореферат разослан «_»_2005 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Ю.А.Барсуков

Актуальность проблемы

Современные представления о патогенезе рака молочной железы включают, как необходимый этап, нарушение регуляции двух клеточных функций: пролиферации и программированной клеточной гибели - апоптоза. В многочисленных исследованиях показано, что генетические или эпигенетические изменения регуляции этих процессов закономерно наблюдаются в абсолютном большинстве опухолей молочной железы (Lipponen P. и др., 1994; Chappuis P.O., Kapusta L., 2000). Изменения могут заключаться в мутациях онкогенов или генов супрессоров опухоли ( Hellquist Н.В, 1997; Kumar S., 1999; Evan G.I., Vousden K.H., 2001; Копнин Б.П., 2000; Канцерогенез / Под.ред Заридзе Д.Г., 2004) метилировании их промоторов, изменении уровня экспрессии их продуктов в результате изменения времени жизни м-РНК или ее процессинга и др. (Лихтенштейн А.В., Киселева Н.П., 2001). Использование этих изменений для диагностики рака молочной железы (Kerr J.F.R. и др., 1994), мониторинга и прогноза опухолевого процесса (Kallioniemi O.P. и др., 1987), а также попытки построения лечебных алгоритмов, обеспечивающих коррекцию этих изменений (Слонимская Е.М., 1999; Фильченков А.А., 1998; Camplejohn R.S.H др., 1995; Ewers S.B. и др., 1993), являются основным направлением исследовательского процесса в настоящее время. Однако, несмотря на достижения в исследовании процессов патогенеза, практические задачи диагностики, прогноза и мониторинга остаются нерешенными, что подтверждается ростом заболеваемости и смертности от рака молочной железы во всем мире и в России в том числе (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2003). Поэтому разработка новых методов прогноза является актуальной задачей современной онкологии.

В серии работ (Барышников А.Ю., 1996, Богатырев В.Н, 1996; Mendelson J. 2001; Кушлинский Н.Е., 2003) показано, что показатели экспрессии генов, контролирующих процессы апоптоза, являются прогностически значимыми.

Однако, апоптоз -многостадийный процесс, регулируемый большим количеством молекул и исследование изменения отдельных молекул -регуляторов может не в полной мере отражать весь сложный процесс его реализации. В тоже время, имеется небольшое количество работ, в которых исследуется прогностическая значимость непосредственно уровня апоптоза в опухолевой ткани (R.Gonsales-Campora R. и др.,2000; Rouleau-Dubois С. и др.,2004), а полученные результаты дают противоречивые выводы. В основном эти работы исследуют закономерности апоптоза в культуре клеток (линии рака молочной железы MCF-7 и др.) или краткосрочных клеточных культур из биопсийного материала (Mundle S.D^ др., 1995) или основаны на оценке уровня апоптоза микроскопическими методами. Имеются только единичные работы, исследующие диагностическую значимость уровня апоптоза в опухолевой ткани методами проточной цитометрии или лазерной конфокальной микроскопии (Wu J . и др., 1997; Bedner Elzbieta и др, 1999; R.GonsaIes-Campora R. и др.,2000).

Цель работы

Изучить прогностическую и диагностическую значимость показателей апоптоза в ткани опухоли молочной железы.

Задачи исследования

1. Исследовать соотношение процессов апоптоза и пролиферации в тканях патологически измененной молочной железы, включая различные нозологические формы рака методом проточной цитофлуориметрии.

2. Сравнить показатели апоптоза и пролиферации в ткани неизмененной и патологически измененной ткани молочной железы.

3. Изучить связь показателей спонтанного апоптоза в ткани рака молочной железы с распространенностью и размером опухоли.

4. Изучить связь показателей спонтанного апоптоза с уровнем экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона.

5. Изучить прогностическую ценность соотношения показателей пролиферации и апоптоза при различных патологических состояниях молочной железы.

Научная новизна.

Впервые, на большом клиническом материале исследована прогностическая значимость показателей спонтанного и индуцированного апоптоза в ткани патологически неизмененной молочной железы, фиброаденомы, простой протоковой гиперплазии и ткани рака молочной железы. Показано, что уровень спонтанного апоптоза коррелирует со степенью местного распространения опухоли. Впервые изучена связь уровня спонтанного апоптоза и активности пролиферации опухоли, экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона.

Научно-практическая значимость.

Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых критериев прогноза при раке молочной железы на основании соотношения показателей спонтанного апоптоза и показателей пролиферации клеток опухоли. Относительная оценка процессов пролиферации и апоптоза может быть способом оценки скорости обновления ткани и отражать степень злокачественности. Использование комплекса показателей апоптоза, пролиферации и уровня экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона при протоковом раке молочной железы позволяет с высокой вероятностью прогнозировать поражение регионарных лимфатических узлов.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации были доложены:

на конференции «Национальные дни лабораторной медицины», Москва в 2001г., на VI Ежегодной Российской онкологической конференции, Москва,

в 2002г., на конференции с международным участием «Научно-организационные аспекты и современные лечебно-диагностические технологии в маммологии, Москва,2003г., на конференции молодых ученых «Медицинские технологии на рубеже Ш тысячелетия, Москва, 2003. Апробация работы прошла на научно-практической конференции в ГУ РНЦРР МЗ и СР РФ в 2004 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 119 страницах и состоит из введения, обзора литературы, глав: Материалы и методы, Результаты собственных исследований, Обсуждение, Выводы, Список литературы. Указатель литературы содержит ссылки на 36 отечественных и 91 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 24 рисунками.

Материалы и методы исследования.

Характеристика клинического материала.

В настоящем исследовании проанализирован операционный материал 140 пациенток с гистологически подтвержденным диагнозом - рак молочной железы (рмж), в возрасте от 27 до 90 лет, средний возраст 55,8 лет, получавших лечение в РНЦРР.

Распределение больных раком молочной железы по состоянию первичной опухоли было следующим: Т1 - 38 (20,3%), Т2 - 82 (43,9%), Т3 - 9 (4,8%), Т4 —11 (5,9%). В исследуемой группе (п=140) метастазы в регионарные лимфатические узлы выявлены в 61 случае, в 79 случаях метастазы обнаружены не были.

Инфильтрирующий протоковый (далее протоковый) рак был выявлен в 110 случаях, инфильтрирующий дольковый (далее дольковый) в 26 случаях, слизистый в 4 случаях (таблица. 1).

Таблица 1. Распределение больных по гистологической форме рака молочной железы.

Гистологическая форма рака Количество Процент наблюдений

протоковый рак 110 78,1

дольковый рак 26 19,0

слизистый 4 2,9

Сумма 140 100,0

В предоперационном периоде 36 пациенткам была проведена химиотерапия, у остальных - 104 пациенток дооперационная химиотерапия отсутствовала.

В отдельную группу были включены 16 пациенток в возрасте от 15 до 46 лет (средний возраст 31,6 года) с гистологически подтвержденным диагнозом фиброаденомы и 11 пациенток в возрасте от 19 до 53 лет (средний возраст 40,6 лет) с простой протоковой гиперплазией (ППГ). В 20 случаях оценке подвергалась неизмененная ткань (далее норма) железы из биоптата пациенток раком молочной железы, находящаяся за пределами гистологически подтвержденной опухоли (Таблица 2.) Таблица 2. Количество обследованных больных в зависимости от вида

патологии молочной железы.

Вид патологии Количество Процент наблюдений

Неизмененная ткань 20 10,7

Фиброаденома (ФА) 16 8,5

Простая протоковая гиперплазия (ППГ) 11 5,9

Рак молочной железы 140 74,8

Всего 187 100

Обработка тканей и проточно-цитометрический анализ.

Клеточная суспензия приготавливалась из операционного материала пациентов с исследуемыми новообразованиями молочной железы. Срез биоптата новообразования по большему диаметру толщиной 2-4мм разделяли на мелкие фрагменты в 500 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) (рН=7,4), затем измельчали в гомогенизаторе Medimachine (Dako, Дания) в течение 2 минут с 1,5 мл ФСБ. Полученную суспензию фильтровали через 50 мкм фильтр и отмывали в 1,5 мл ФСБ центрифугированием в течение (710 мин, 300xg). После удаления супернатанта объем осадка удваивался добавлением ФСБ. Фиксация осуществлялась 70% этанолом (-20°С) по стандартной методике. 200мкл фиксированной клеточной суспензии отмывали в 1мл ФСБ (7-10 мин, 300xg). После удаления супернатанта клетки инкубировали в защищенном от света месте 30 минут при комнатной температуре с 5 мкл антител к цитокератинам АЕ1/АЕЗ, мечеными FITC (F 0859, DAKO), чтобы идентифицировать эпителиальные клетки. Затем при тех же условиях клеточную суспензию инкубировали в течение 10 мин с 15мкл р-ра РНКазы (концентрация Юмг/мл в дистиллированной воде). Для определения индекса плоидности и показателей клеточного цикла в полученную клеточную суспензию вносили 50 мкл 2тМ раствора йодида пропидия (PI) в дистиллированной воде («Sigma», США) с добавлением 500 мкл ФСБ и инкубировали в течение 40 минут в защищенном от света месте. Непосредственно перед анализом клеточную суспензию фильтровали через 50мкм нейлоновый фильтр, вносили 1 мл ФСБ.

Одновременное использование антител к цитокератинам и PI позволило исследовать не только показатели клеточного цикла, но и оценить уровень спонтанного апоптоза.

Окрашенная клеточная суспензия анализировалась при помощи проточного цитофлюориметра DAKO Galaxy. При обработке гистограмм распределения

опухолевых клеток по содержанию ДНК получали информацию о плоидности, содержании клеток в определенных фазах клеточного цикла ^0/1, S, G2+M), а также количестве клеток, находящихся в апоптозе. Обработку клеточного цикла проводили с использованием программ ModFit 2.0 и FlowMax 2.0.

Общий уровень апоптоза оценивался как субдиплоидный пик на ДНК-гистограмме при окрашивании раствором йодида пропидия (Рис.1).

интенсивность фпоуресценцим

Рисунок 1. Уровень апоптоза (субдиплоидный пик). По оси X-интенсивность флуоресценции (окраска PI), по оси Y- количество проанализированных частиц.

Уровень апоптоза эпителиальных клеток оценивался, как регион на двухпараметрических гистограммах, как показано на рис.2

Рисунок 2. Двухпараметрическая цитограмма клеток молочной железы. По оси X - окраска PI, по оси Y- окраска цитокератином. Выделенный регион -«цитокератин-положительный»апоптоз.

Иммуногистохимический метод

В группе больных раком молочной железы рецепторы эстрогена были определены в 120 случаях, рецепторы прогестерона - 46 случаях. Для этого образцы тканей РМЖ фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин с точкой отвердения 56°С, готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм, а затем их депарафинировали по стандартной методике. Иммуногистохимическое исследование проводили методом ПАП с применениме антител к рецепторам эстрогена (клон 1Д5, DAKO) и к рецепторам прогестерона клон (PgR 636, DAKO). Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали раствор диаминобензидина с доокрашиванием ядер клеток гематоксилином Майера. Положительным признавалось ядерное окрашивание опухолевых клеток, расчет производили в процентах при анализе 100 опухолевых клеток.

Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программ «Statistica for Windows, Version 6.0», достоверность отличия исследуемых показателей оценивали с помощью параметрических и непараметрических тестов. Во всех случаях различия считались достоверными при уровне вероятности выше 95%, т.е. р<0,05.

Результаты собственных исследований

Уровень спонтанного апоптоза в ткани молочной железы

По общепринятой в настоящее время концепции клеточный баланс ткани поддерживается соотношением скорости пролиферации клеток и их гибели -апоптоза. Мы исследовали изменение этих показателей при развитии различных патологических состояний в ткани молочной железы. При этом оценивался уровень суммарного апоптоза всех типов клеток в ткани молочной железы (по величине субдиплоидного пика при окраске PI) и уровень апоптоза клеток эпителиальной природы при двойной окраске цитокератином и PL Анализ зависимостей распределения уровня апоптоза показал, что распределения имеют ненормальный характер. Таким образом, при оценке различий уровней апоптоза в различных группах необходимо использовать соответствующие статистические критерии.

Таблица З.Уровень суммарного апоптоза при различных патологиях рака молочной железы и достоверность отличия для разных групп.

Уровень апоптоза, % Достоверное ть отличия с нормой, Р Достоверность отличия с фиброаденомой ,Р Достоверное ть отличия с ППГ, p

Неизмененная ткань м. ж. 16З -

Фиброаденома 73 0,015 -

ппг 10,5 0,18 0,12 -

Рак 16,2 0,98 0,0002 0,04

Т.к. ткань молочной железы в норме и при различных патологических состояниях состоит из различного типа клеток интересно оценить уровень апоптоза именно в эпителиальных клетках. С этой целью при анализе уровня апоптоза, проводили дополнительную окраску клеток антителами к цитокератину и из общей фракции апоптоза выделяли цитокератин положительную фракцию. В таблице 4. приведены средние значения и достоверности отличий для спонтанного апоптоза в цитокератин-положительных клетках молочной железы при различных патологических процессах.

Таблица 4. Сравнение уровня спонтанного апоптоза (критерий Стьюдента) в цитокреатин-позитивных клетках рака молочной железы, фиброаденомы и простой протоковой гиперплазии (ППГ).

Уровень апоптоза, % Достоверность отличия с нормой, Р Достоверность отличия с фиброаденомой Р Достоверность отличия с ППГ, Р

Неизмененная ткань м.ж. 2,24 -

Фиброаденома 2,32 0,91 -

ППГ 4,23 0,32 0,31 -

Рак 7,14 0,02 0,02 0,23

Сравнение отличия групп непараметрическим критерием Манна-Уитни дают аналогичные результаты. На рисунке 3 показано сравнение показателей апоптоза для цитокератин-положительной фракции при различных патологиях молочной железы.

Рисунок 3. Сравнение уровня спонтанного апоптоза в цитокератин положительных клетках ткани молочной железы. (норма-патологически неизмененная ткань, фа- фиброаденома, ппг - простая протоковая гиперплазия, рмж -рак молочной железы).

Приведенные результаты показывают существенные отличия в уровнях спонтанного апоптоза в ткани молочной железы при его оценке различными методами. Так, суммарный уровень достоверно не отличается от уровня апоптоза при других патологических формах, в тоже время, выделение только цитокератиновой фракции апоптоза обнаруживает достоверные отличия с группой простой протоковой гиперплазии и рака молочной железы. Сравнение уровня спонтанного апоптоза при различных патологиях показывает увеличение его в ряду фиброаденома, простая протоковая гиперплазия — рак молочной железы. Причем, эта закономерность характерна как для суммарного апоптоза, так и для апоптоза в фракции цитокератин-положительных клеток.

Зависимость уровня апоптоза от гистологического типа рака молочной железы

Нами проанализирован уровень спонтанного апоптоза в различных гистологических группах рака молочной железы. Инфильтрирующий протоковый рак — 110 (78,6%) случаев, инфильтрирующий дольковый — 26 (18,6%) случаев, слизистый тип рака составлял 4 (2,9%) случая и в последующий анализ включен не был, из-за малого числа наблюдений. В таблице 5. приводятся отличия в уровне спонтанного апоптоза в группах с различной гистологической формой рака молочной железы.

Таблица 5. Сравнение уровня апоптоза при различных гистологических формах рака молочной железы.

Уровень апоптоза (среднее), % |

Группа/гистологиче екая форма Протоковый Дольковый 1-знач. Р

Суммарный апоптоз 17,08 13,33 1,690 0,092

Цитокератиновый апоптоз 7,92 3,88 2,101 0,038

Обращает внимание, что дольковая форма рака характеризуется более низким уровнем апоптоза как суммарного, так и для фракции клеток имеющих эпителиальную принадлежность.

Сравнения достоверности отличия с применением непараметрических критериев, дают аналогичные оценки.

Таким образом, можно сделать вывод что протоковый и дольковый рак молочной железы достоверно отличаются как по уровню суммарного апоптоза, так и уровню апоптоза клеток эпителиальной природы.

Сравнение уровня апоптоза в зависимости от экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона

Нами обнаружена прямая корреляционная зависимость между выраженностью экспрессии рецепторов эстрогена и уровнем апоптоза в эпителиальных (цитокератин-положительных) клеток в суммарной группе рака молочной железы.

Таблица 6. Коэффициенты корреляции между уровнем апоптоза и уровнем экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона для суммарной группы

Коэффициенты корреляции между уровнем экспрессии рецепторов гормонов и уровнем общего и «цитокератинового» апоптоза Отмеченные' корреляции значимы на уровне р<0,05

ЕЙ Апоптоз Цитокерат. Суммарный | апоптоз |

ЕЯ 1,00 0,24* 0,12

РИ 0,26 -0,28 -0,02

Апоптоз Цитокерат. 0,24* 1,00 0,54*

Суммарный ] апоптоз 0,12 0,54* 1,00

Также нами проведена оценка взаимосвязи уровня апоптоза и экспрессии рецепторов эстрогена для отдельных гистологических форм рака молочной железы. Полученные результаты приведены в таблицах 7 и 8. Таблица 7. Корреляция показателей апоптоза и уровня рецепторов эстрогена

Отмеченные корреляции значимы на уровне р <0<05

11 * I ЕК ! Апоптоз Цитокерат. Суммарный Апоптоз

ЕИ 1,00 0,28* 1 0,21*

РН. !| озб* | -0,32 -0,11

Апоптоз Цитокерат. 0,28* 1,00 ! 0,54*

Суммарный апоптоз 0,21* 0,54* ! 1,00

Таблица 8. Корреляция показателей апоптоза и уровня рецепторов эстрогена и прогестерона при дольковом раке молочной железы.

Отмеченные корреляции значимы на уровне р<0,05

ЕЙ ! Апоптоз Цитокерат. Суммарный апоптоз

ЕЙ 1,00 -0,07 -0,66* !

Р1* 0,14 0,15 -0,15

Апоптоз Цитокерат. -0,07 | 1,00 0,37 |

Суммарный апоптоз -0,66*! 0,37 1,00

Интересно, что при оценке корреляций в различных гистологических группах обнаруживается обратная зависимость между уровнем рецепторов эстрогена и апоптоза, при этом дольковый рак имеет отрицательную корреляцию, а протоковая форма - положительную.

Изменение уровня апоптоза после предоперационной (адьювантной) химиотерапии

Известно, что большинство химиопрепаратов имеют цитотоксический эффект и приводят к активации процессов апоптоза в опухолевых клетках. Мы сравнили уровни апоптоза в образцах ткани рака молочной железы в группах с проведенной дооперационной химиотерапией и без неё. В таблицах 9 и 10 сравниваются уровни общего и «цитокератинового» апоптоза.

Таблица 9. Изменение уровня «цитокератинового» апоптоза после предоперационной химиотерапии.

Уровень апоптоза цитокератин положительных клеток (среднее), % 5

Группа/гистологиче екая форма протоковый дольковый ^знач. ! Р

Сумма 7,92 3,88 2,101 0,038 I

С предоперационной химиотерапией 8,84 1,40 1,955 ; 0,060

Без химиотерапии 7,61 __ 4,77__ 1,269; __0,207__|

Не отличаются Р=0.032

Таблица 10. Изменение уровня общего апоптоза после предоперационной химиотерапии.

Уровень общего апоптоза (среднее), %

Грунпа/гистологиче екая форма протоковый дольковый 1-знач. Р

Сумма 17.01 13,33 1.699 0,092^

С предоперационной химиотерапией 17.39* 12.30* 1,011 0,32

Без химиотерапии 16.98* 13.65* 1,34 0,18 1

*-Не отличаются *-Не отличаются

Интересно, что дольковый и протовый рак обнаруживают различные закономерности на фоне предоперационной химиотерапии. Если в ткани протокового рака уровень апоптоза практически не меняется, то предоперационная химиотерапия при дольковом раке приводит к снижению уровня «цитокератинового» апотопза. Изменение уровня общего апоптоза на фоне предопреационной химиотерапии не происходит.

Интересно, что в группе без предоперационной химиотерапии зависимость уровня экспрессии рецепторов прогестерона и «цитокератинового» апоптоза

становится достоверной и равной г= -0.37, в то время как связь уровня рецепторов эстрогена и апоптоза в этой группе исчезает. Однако, в группе с предоперационной химиотерапией экспрессия рецепторов эстрогена имеет высоко достоверную положительную корреляцию с уровнем "цитокератинового" апоптоза.

Сравнение уровня апоптоза в зависимости от плоидности

опухоли

Анализ плоидности в зависимости от гистологического типа рака молочной железы показал, что для протоковой формы наиболее характерен вариант анеуплодиного рака, тогда как для долькового рака - диплоидный (Таблица 11.). Тетраплоидные варианты более часто встречаются при протоковой форме рака молочной железы (15% против 4%).

Таблица 11. Частота встречаемости различных типов плоидности опухолей в зависимости от его гистологического типа.

Вид рака \ плоидность Анеу плоид ные Тетра плоид ные Диплоид ные Всего

Частота Протоковый 57 16 37 110

% 52% 15% 33%

Частота Дольковый 9 1 16 26

% 35% 4% 61%

Частота Слизистый 2 1 1 4

% 50% 25% 25%

Всего 68 (49%) 18(13%) 54 (39%) 140

Для оценки зависимости уровня апоптоза от плоидности и гистологического типа был использован дисперсионный анализ, который показал, что внутри каждой нозологической группы уровень апоптоза в зависимости от плоидности достоверно не отличается.

Сравнение уровня апоптоза и пролиферативной активности в ткани рака молочной железы

Мы исследовали также корреляции показателей апоптоза и пролиферации в зависимости от гистологической формы, наличия региональных метастазов и предопреационной химиотерапии.

Результаты для суммарной группы рака молочной железы показаны в таблице № 12.

Таблица 12. Корреляции показателей апоптоза и активности пролиферации в ткани молочной железы (группа без предоперационной химиотерапии).

Отмеченные корреляции значимы на уровне р >0,05

в в2М Э_С2М Апоптоз Цитокерат. Суммарный апоптоз

61 1,0 -0,69* -0,47* -1,0 -0,21* -0,28* |

Б -0,7 1,00 -0,31* 0,7* 0,05 0,30*

С2М -0,5* -0,31* 1,00 0,5* 0,23* 0,00

8 в2М -1.0 0,69 0,48 1,0....... 0,24* 0,28*

Апоптоз ! Цитокерат. -0,2 0,05 0,23* 0,24* 1,00 0,58*

Суммарный апоптоз -0,3* 0,30* 0,00 0,3* 0,58* 1,00

Из приведенной таблицы видно, что в группе без предоперационной химиотерапии уровень апоптоза имеет положительную корреляцию с пролиферативной активностью - количеством клеток в G2M и G2M+S фазах клеточного цикла. В тоже время, в группе с химиотерапией достоверных корреляций между уровнем апоптоза и пролиферации не обнаружено.

Сравнение апоптоза и пролиферативной активности при различных патологиях молочной железы

Известно, что постоянство клеточного состава обеспечивается балансом процессов пролиферации и апоптоза. Принято считать, что патологические процессы, сопровождающиеся увеличением клеточной массы (доброкачественные и злокачественные) сопровождаются нарушением такого баланса. Однако в литературе до настоящего времени не разработаны методы оценки такого баланса, несмотря на многочисленные методики оценки интенсивности и процессов пролиферации и апоптоза.

Мы оценили оба процесса при различных патологиях молочной железы, а также в ткани патологически неизмененной молочной железы, прилежащей к ткани опухоли.

норма фа ппг рмж

Рисунок 5. Сравнение уровня апоптоза в цитокератин- положительных клетках молочной железы при различных патологических состояниях, (норма-неизмененная ткань молочной железы, фа- фиброаденома, ппг-простая протоковая гиперплазия, рмж -рак молочной железы).

"Г

-о- Среднее

~Т" Среднее±0,95*Стош.

норма фа

ппг

рмж

Рисунок 6. Сравнение уровня пролиферации в цитокератин- положительных клетках молочной железы при различных патологических состояниях, (норма - не измененная ткань молочной железы, фа- фиброаденома, ппг - простая протоковая гиперплазия, рмж -рак молочной железы; S_G2M - суммарное количество клеток в S и G2M фазах клеточного цикла).

Приведенные графики (рис.5,6) показывают, что по уровню апоптоза, только рмж достоверно отличается от нормы и других патологических состояний, при этом, уровень апоптоза при рмж существенно выше (рис 5). В тоже время оценка интенсивности пролиферации по величине S+G2M показывает увеличенный уровень при всех патологических состояниях. При этом уровень пролиферации при раке молочной железы достоверно выше по сравнению как с простой протоковой гиперплазией, так и с фиброаденомой. Мы попытались оценить баланс обоих процессов - апоптоза и пролиферации. С этой целью были произведены оценки разности величин количества клеток в разных фазах клеточного цикла ^^^ S-ac, G2M-ac, S+G2M-ac) и уровня апоптоза (в процентах), а также их отношения G2M/ac, S+G2M/ac), где ас-«цитокератиновый» апоптоз. Наиболее информативным, с нашей точки зрения оказался индекс, оцененной как разница количества клеток в G1 фазе и уровня апоптоза в процентах к общему количеству цитокератин-положительных клеток. Полученный таким образом индекс отражает соотношение процессов деления клеток и их гибели апоптозом в

исследуемой ткани Эта величина наименьшая для нормальной ткани и увеличена при всех патологических процессах (достоверны отличия для рака молочной железы и фиброаденомы).

Сравнение пролиферации и апоптоза при различных гистологических формах рака молочной железы.

На рис 7. приводятся значения индекса пролиферации для различных гистологических форм рака молочной железы. Видно, что они практически не отличаются.

ПрОТОКОВЫИ дольковый слизистым

Рисунок 7. Сравнение пролиферативного индекса (количества клеток в S и G2M фазах клеточного цикла) при различных формах рака молочной железы

(з-слизистый рак)

В тоже время, учет одновременно обоих процессов, регулирующих клеточный состав, показывает, что дольковый рак должен иметь большие скорости интегрального накопления количества клеток по сравнению с протоковым раком.

На рисунке 8 показано сравнение уровня апоптоза для двух гистологических форм. Видно, что хотя пролиферативная активность для этих форм рака не отличается, уровень апоптоза достоверно выше для протокового рака, и если учесть его (например, оценить разность (в2М+8) - пролиферирующих и апоптозных клеток) то, по-видимому, можно будет оценить относительный баланс клеток.

с о

-о- Среднее

~Т~ Среднее±0 95Дов интервал

протоковый долысовый

Рисунок 8. Сравнение уровня апоптоза эпителиальных (цитокератин-положительных) клеток молочной железы при различных гистологических формах рака молочной железы.

протоковыи дольковыи слизистыи

Рисунок 9. Сравнение разности уровня пролиферации и апоптоза в эпителиальных (цитокератин- положительных) клетках молочной железы при различных гистологических формах рака молочной железы).

Приведенные данные показывают (рис.9), что дольковый рак имеет более положительный клеточный баланс, по сравнению с протоковым и по этому свойству может являться более злокачественным.

Корреляция местной распространенности и уровня апоптоза в первичной опухоли

Анализ корреляций показателей проточной цитометрии (пролиферации и апоптоза), а также экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона и местной распространенности показал, что зависимости в общей группе рмж, и при различных его гистологических вариантах существенно отличаются. Так, в общей группе и группе протокового рака местная распространенность коррелирует только с уровнем экспрессии рецепторов прогестерона (г=0,29). В то же время как в группе долькового рака достоверных корреляций не обнаружено. Кроме того, в суммарной группе диплоидного рака обнаруживаются достоверные корреляции с величиной S-фазы (г= -0,29) и имеет положительную корреляцию с величиной отношения активности

пролиферации и апоптоза (величинами G2M/ac, G2M+S/ac, Б/ас где ас -уровень апоптоза цитокератин положительных клеток). Интересно, что если в группе диплоидного протокового рака достоверной остается только зависимость от Б стадии, то в группе диплоидного долькового рака наибольший коэффициент корреляции наблюдается для параметра спонтанного апоптоза (г=-0,6).

Мы проанализировали возможность построения математических моделей для оценки метастазирования в регионарные лимфоузлы на основании комплекса исследованных показателей.

Анализ с помощью обобщенной линейной модели показал, что

использование комбинаций таких показателей как величина Б фазы, уровня

спонтанного («цитокератинового» апоптоза) и их соотношения дает наиболее

перспективные результаты. Мы использовали дискриминантный анализ для

построения классифицирующей модели для суммарной группы рмж по

признаку местной распространенности. Использование анализа с пошаговым

включением переменных позволил получить модель, включающую в

качестве предикторов только четыре показателя: уровень рецепторов

эстрогена и прогестерона, величины G2M фазы и спонтанного апоптоза. В

таблице 13 приведены результаты классификации на основании этой модели.

Таблица 13. Матрица классификации на основании дискриминантной функции по признаку наличия и отсутствия местных метастазов больных раком молочной железы.

Строки: наблюдаемые классы. Столбцы: предсказанные классы

Наличие метастазов в регионарные лимфатические узлы нет есть

Процент правильной, классификации !

Нет 68,4 13 6

Есть 84,2 | 3 16 1

Всего 763 _ | 16 1 22 I

Т.к. анализируемые показатели существенно отличаются в различных гистологических подгруппах, мы применили дискриминантный анализ отдельно для протокового и долькового рака. Переменные, вошедшие в модель, для протокового рака приведены в таблице 14.

Таблица 14. Итоговая таблица дискриминантного анализа, уровни значимость вошедших в модель переменных, где: PR - уровень рецепторов прогестерона, ER — уровень рецепторов эстрогенов, g2m/ac -отношение количества клеток в g2m фазах клеточного цикла и уровня апоптоза, АРО_а_с - разность уровня общего апоптоза и апоптоза "цитокератин положительных" клеток.

Итоги анализа. Функций, Шаг 5, Переменных в модели: 5; Группир.: наличие метастазов (2 гр.) р< ,0024

| || Уилкса II Частная I Р-исключ || р-уров _|1_. Т0ПеР" - || 1-толер. ,

1 РИ _))0,655562 ||0,713353 ¡¡9,24200 ¡|0,0058 ¡¡0,731381 ¡¡0,268619 |

| Е1* ||0,692433 ||0,675370 ||11,05539 _||0,0029 1|0,629686 _||0,370314 |

| д2т/ас ¡¡0,534108 ПО,875568 ¡¡3,26865 | ¡0,0837 ¡¡0,850384 ¡¡0,149616 |

| АРО_а_с ||0,526763 |]0,887778 ¡¡2,90738 ||0,1016 !|0,752845 ¡¡0,247155 |

| Возраст [[0,498210 ¡¡0,938657 ¡¡1,50309 Л®'2326 ¡¡0,908018 ¡¡0,091982

В таблице 15 приведены результаты классификации.

Таблица 15. Матрица классификации больных раком молочной железы (протоковая форма) на основании дискриминантных функций, включающих уровень экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, отношения пролиферации и апоптоза и возраста.

Строки: наблюдаемые классы. Столбцы: предсказанные классы

Наличие метастазов в регионарные лимфоузлы нет есть

Процент правильной классификации

нет 87,5 14 2 1

есть 84,6 2 н ;

Всего 86,2 16 13 1

Для долькового рака, адекватной модели получить не удается, возможно, из-за недостаточного количества случаев.

Подтверждением значимости показателя уровня апоптоза цитокератин-положительных клеток для определения наличия регионарного метастазирования являются также результаты анализа методом деревьев классификации. Метод, в наиболее оптимальных вариантах, дает эффективность классификации 74%. Однако, важно, что оценка предсказательной значимости всех проанализированных признаков указывает на высокую значимость уровня апоптоза (Рисунок 10).

Рисунок 10. Ранги предсказательной значимости в классифицирующей модели анализа местной распространенности при использовании метода деревьев классификации где: ER - уровень рецепторов эстрогенов, S-количество клеток в S фазе клеточного цикла, APO_CYT -уровень "цитокератинового" апоптоза, g2m/ac -отношение количества клеток в g2m фазах клеточного цикла и уровня "цитокератинового" апоптоза, S/ac -отношение количества клеток в S фазе клеточного цикла и уровня "цитокератинового" апоптоза.

При этом, в модели в качестве предикторов используются такие показатели, как отношение уровня S-фазы и апоптоза, «цитокератиновый» апоптоз, уровень S-фазы. Использование только этих трех показателей позволяет достичь указанной эффективности.

Выводы

1. Уровень спонтанного апоптоза, определяемый как субдиплоидный пик, с двойной окраской по цитокератину в гистологически неизмененной ткани молочной железы, ткани фиброаденомы и простой протоковой гиперплазии не отличается и составляет в среднем 2,24%, 2,32% и 4,23% соответственно. Уровень спонтанного апоптоза в ткани рака молочной железы достоверно выше, чем при других патологических изменениях (7,14%).

2. Протоковая форма рака молочной железы имеет уровень спонтанного апоптоза достоверно выше, чем дольковая 7,9 и 3,9 % соответственно.

3. Уровень апоптоза в ткани рака молочной железы имеет достоверную положительную корреляцию с уровнем экспрессии рецепторов эстрогена в группе протокового рака молочной железы.

4. Уровень апоптоза цитокератин положительных клеток в ткани рака молочной железы достоверно не зависит от размеров опухоли, плоидности опухоли и не меняется на фоне предоперационной химиотерапии. Однако в группе долькового рака предоперационная химиотерапия снижает уровень апоптоза в клетках опухоли.

5. Спонтанный апоптоз имеет положительную достоверную корреляцию с уровнем пролиферативной активности в ткани рака молочной железы (коррелирует с величиной G2M).

6. В группе анеуплоидных опухолей спонтанный апоптоз имеет положительную достоверную корреляцию с индексом плоидности. Однако, уровень спонтанного апоптоза не отличается в группах диплоидных и анеуплодидных опухолей.

7. Отношение уровня пролиферации и апоптоза, отражающее скорость обновления клеточной популяции, выше в ткани рака молочной железы и в ткани фиброаденомы, это значение достоверно ниже при простой протоковой гиперплазии. Кроме того, дольковый рак имеет более высокую скорость обновления, чем протоковая форма рака молочной железы.

8. Показатели апоптоза (уровень «цитокератинового» апоптоза, отношение уровня пролиферации и апоптоза) являются достоверными предикторами регионарного метастазирования. Использование их в многомерных методах классификации (дискриминантный анализ, деревья классификации) позволяет получить эффективные модели оценки местной распространенности опухоли на основании исследования показателей проточной цитометрии основного опухолевого узла.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Галил-Оглы Г. А., Боженко В. К., Кудинова Е.А., Мельникова Н. В., Олферьев М. А. Анализ спонтанного апоптоза и показателей клеточного цикла при раке молочной железы: Тез. докл. VIII Всероссийского съезда рентгенологов и радиологов.- М- 2001. С.52.

2. Боженко В. К., Кудинова Е. А., Мельникова Н. В., Олферьев М. А. Оценка показателей клеточного цикла и апоптоза при раке молочной железы: Тез. докл. Всерос. конф. «Национальные дни лабораторной медицины».- М: Клин. лаб. диагн-2001 .-№ 9.-С. 32

3. Галил-Оглы Г.А., Боженко В.К., Кудинова Е.А., Мельникова Н.В., Олферьев М.А. Анализ спонтанного апоптоза и показателей клеточного цикла при раке молочной железы: Тез. докл. VIII Всероссийского съезда рентгенологов и радиологов. "Рентгенорадиология XXI века. Проблемы и надежды...".- Челябинск.-Москва.- 2001.-С.127

4. Кудинова Е.А., Боженко В.К., Галил-Оглы Г.А., Мельникова Н.В., Олферьев М.А. Прогностическое значение уровня апоптоза при раке молочной железы: Тез. докл. VI Ежегодной Российской онкологической конференции.-М.-2002.-С. 185.

5. Галил-Оглы Г.А., Чазова Н.Л., Алипченко Л.А., Берщанская A.M., Яровая Н.Ю., Мельникова Н.В., Паклина О.В., Большун Д.Г., Кудинова ЕА, Прокопенко СП. Возможности комплексной оценки биологических

факторов прогноза при раке молочной железы по материалу биоптатов, полученых аппаратом для вакуумной аспирационной биопсии "Мамотомом": Тез. докл. II Всеросийской научно-практической конференции с международным участием "Научно-организационные аспекты и современные лечебно-диагностические технологии в маммологии".- М.- 2003.- С.41.

6. Кудинова Е.А., Прокопенко СП., Галил-Оглы ГА, Боженко В.К., Мельникова Н.В. Оценка показателей клеточного цикла и апоптоза в материале биоптатов рака молочной железы, полученных аппаратом для вакуумной аспирационной биопсии "маммотом": Тез. докл. II Всеросийской научно-практической конференции с международным участием "Научно-организационные аспекты и современные лечебно-диагностические технологии в маммологии".- М.- 2003.-С.42.

7. Кудинова Е.А., Мельникова Н.В. Возможности метода проточной цитофлуорометрии в определении уровня апоптоза при раке молочной железы: Тез. докл. Конф. Мол. Ученых "Медицинские технологии на рубеже III тысячелетия".- М.- 2003 г.- С.83-85.

8. Кудинова Е.А., Боженко В.К., Галил-Оглы ГА, Мельникова Н.В. Определение апоптоза методом проточной цитофлуоррометрии при раке молочной железы: Тез. докл. конфер. «Научно-технический прогресс отечественной лучевой диагностики и лучевой терапии»: сб. под ред. В.П.Харченко.- Москва, «Вече», 2004.- С.135-136

9. Кудинова Е.А., Боженко В.К., Галил-Оглы Г.А., Мельникова Н.В. Определение апоптоза методом проточной цитофлуорометрии при раке молочной железы. Вестник РНЦРР МЗ РФ.-2004.-Вып.З. Доступно по URL http://vestnikmcrr.m/vestfflk/v3/papers/kud v3 .htm

10. Кудинова Е.А., Мельникова Н.В., Боженко В.К. Возможности метода проточной цитофлуориметрии для анализа показателей клеточного цикла по материалу парафиновых блоков рака молочной железы.

Вестник РНЦРР МЗ РФ.-2004.-Вып.4: Доступно по URL http://vestnik.mcrr.ru/vestnik/v4/papers^/bozhen 1 v4.htm

11. Кудинова Е.А., Мельникова Н.В., Галил-Оглы Г.А., Боженко В.К. Оценка уровня спонтанного апоптоза при доброкачественных и злокачественных новообразованиях молочной железы. Вестник РНЦРР МЗ РФ.-2004. Вып.4. Доступно по URL http: //vestnik.mcrr.ru/vestnik/v4/papers/bozhen v4.htm

Служба множительной техники ГУ РОНЦ им. Н Н- Елохина РАМН Подписано » пстап < jj-i . О ? Заказ Я» ( Q Тираж 100 за

1802

-il ÍU¡J

Оглавление диссертации Кудинова, Елена Александровна :: 2005 :: Москва

Введение.

Глава 1. Современное состояние проблемы.

1.1 Молекулярные механизмы апоптоза

1.2 Показатели клеточного цикла и их прогностическое значение при раке молочной железы.

1.3 Методы исследования апоптоза.

1.4 Исследование прогностической значимости показателей апоптоза.

Глава 2. Собственный клинический материал и методы исследования

2.1 Характеристика клинического материала.

2.2 Метод проточной цитофлуорометрии.

2.3 Методики приготовление клеточной суспензии.

2.4 Анализ гистограмм.

2.5 Иммуногистохимический метод.

2.6 Статистическая обработка.

Глава 3. Результаты собственных исследований.

3.1 Сравнение уровня спонтанного апоптоза в ткани нормальной и патологически измененной молочной железы.

3.2 Сравнение уровня апоптоза и пролиферативной активности при различных патологиях молочной железы.

3.3 Зависимость уровня апоптоза и пролиферативной активности от гистологического типа рака молочной железы.

3.4. Сравнение уровня апоптоза в зависимости от экспрессии эстроген и прогестероновых рецепторов.

3.5 Изменение уровня апоптоза в ткани рака молочной железы после предоперационной химиотерапии.

3.6 Сравнение уровня апоптоза и плоидности опухоли при раке молочной железы.

3.7 Влияние гистологического типа, плоидности и предопреационной химиотерпии на уровень апоптоза и пролиферативую активность в ткани рака молочной железы.

3.8 Использование показателей пролиферации и апоптоза для оценки местной распространенности.

Глава 4. Обсуждение результатов исследования.

Выводы.

Введение диссертации по теме "Онкология", Кудинова, Елена Александровна, автореферат

Формирование концепции апоптоза и осознание роли апоптоза в многочисленных физиологических процессах привело к активному исследованию нарушений и роли этого процесса при различных патологических состояниях. Особый интерес представляет изучение патологии апоптоза как стадии онкогенеза. Общепринятой точкой зрения в настоящее время считается концепция, согласно которой, нарушение равновесия (гармонии) между процессами пролиферации и апоптоза является главной причиной формирования опухоли. Эта парадигма является основной отправной точкой для разработки новых методов диагностики и лечения в онкологии. Исследование молекулярных факторов, отвечающих за контроль процессов пролиферации и апоптоза позволило выявить ряд диагностически значимых маркеров для различных нозологических форм рака (таких как рак желудка, толстой кишки, легкого, мочевого пузыря и др.). В тоже время, исследование этих маркеров в случае рака молочной железы, не выявило их диагностической эффективности по сравнению с клиническими факторами и такими показателями как уровень экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона (Volpi A., De Paola F.,Nanni О., 2000, Chappuis P.O., Kapusta L. 2000). В практическом плане кажется перспективным, наравне с исследованием молекулярных маркеров процесса апоптоза исследование непосредственно количественных его показателей в ткани. Наличие, как минимум, двух пусковых механизмов апоптоза и сложной сети его регуляции позволяет говорить о возможной неоднозначности полученных результатов при исследовании только уровня экспрессии или наличия мутации ряда молекулярных компонентов.

Разработано несколько способов регистрации процессов апоптоза в тканях и клеточных культурах (Mundle S.D. и др., 1995, Ornberg R.L., 2001, Barret K.L., и соавт. 2001, Darzynkiewicz Z. и др. 2000,). С клинической точки зрения практический интерес представляет индекс апоптоза (АИ) - индекс, учитывающий процентное количество клеток, имеющих морфологические признаки апоптоза при микроскопическом исследовании ткани. Другим, наиболее употребимым способом регистрации уровня апоптоза является метод проточной цитофлуорометрии (Богатырев В. Н, 1991, Darzynkiewicz Z., 2000). Использование метода проточной цитофлуорометрии может быть основано на различных принципах окраски, так использование только красителей, специфичных к ДНК основано на феномене образования апоптозных частиц, содержащих уменьшенное количество ДНК,по сравнению с исходным количеством и регистрируется как субдиплоидный пик на ДНК гистограмме. Метод регистрирует в основном поздние стадии апотпоза. Однако последний метод практически не используется для анализа клинического материала, хотя является основным в экспериментальных исследованиях. Оба метода имеют свои преимущества и недостатки. Первый представляется предпочтительным благодаря своей относительной простоте и доступности, второй более информативен, однако требует анализа только свежего операционного материале и невыполним на фиксированном материале (таком как парафиновые блоки). В тоже время, возможность одновременной оценки показателей пролиферации и количественных и качественных аспектов апоптоза позволяет говорить о большей информативности метода, основанного на использовании проточной цитометрии. Следует упомянуть также работы, использующие TUNEL метод. Метод основан на использовании антител к бромдиоксиуридину, специфически связывающемуся с двунитевыми разрывами ДНК. Следует сказать, что этот метод регистрирует в основном ранние стадии апоптоза. Этот подход может быть реализован как в варианте с регистрацией сигнала методом проточной цитофлуорометрии, так и цитофотометрии, т.е. на гистологических или цитологических срезах. Однако, в настоящее время, основное количество экспериментального материала получено с использованием морфологического подхода, регистрирующего цитологические особенности апоптозных изменений. При этом показано, что в случае рака молочной железы, имеют место противоречивые данные о прогностической значимости уровня апоптоза. По данным разных авторов он может иметь как положительное, так и отрицательное прогностическое значение.

Актуальность проблемы

Современные представления патогенеза развития рака молочной железы включают, как необходимый этап нарушение регуляции двух клеточный функций: пролиферации и программированной клеточной гибели - апоптоза. В многочисленных исследованиях показано, что генетические или эпигенетические изменения регуляции этих процессов закономерно наблюдаются в абсолютном большинстве опухолей молочной железы (Chappuis P.O., Kapusta L., 2000, Lipponen P. и др., 1994.). Изменения могут заключаться в мутациях онкогенов (Kumar S,1999, Mendendelsohn J. и др.,2001) или генов супрессоров (Hellquist Н.В, 1997) метилировании их промоторов, изменении уровня экспрессии их продуктов в результате изменения времени жизни мРНК или процессов ее процессинга и др. Использование этих изменений для диагностики рака молочной железы (Kerr J.F.R. и др., 1994,), мониторинга и прогноза опухолевого процесса (Kallioniemi О.Р. и др., 1987), а также попытки построения лечебных алгоритмов направленных на коррекцию этих изменений (Слонимская Е.М.,1999; Фильченков А.А.,1998; Camplejohn R.S.h др., 1995, Ewers S.B. и др., 1993) являются основным направлением исследовательского процесса в настоящее время. Однако, несмотря на достижения в исследовании процессов патогенеза, практические задачи диагностики, прогноза и мониторинга остаются нерешенными, что подтверждается ростом заболеваемости и смертности от рака молочной железы во всем мире и в России в том числе. Поэтому разработка новых методов прогноза является актуальной задачей современной онкологии.

В работах (Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 1996; Богатырев В.Н., 1996; Кушлинский Н.Е и др., 2003) показано, что такие показатели уровня экспрессии генов, контролирующих процессы апоптоза являются прогностически значимыми. Однако, апотоз -многостадийный процесс, регулируемый большим количеством молекул и исследование изменения отдельных молекул -регуляторов может не в полной мере отражать весь сложный процесс его реализации. В тоже время, имеется небольшое количество работ, в которых исследуется непосредственный уровень апоптоза в опухолевой ткани (R.Gonsales-Campora R. и др., 2000; Rouleau-Dubois С. и др., 2004) и полученные результаты дают противоречивые выводы. В основном эти работы исследую закономерности апотоза в культуре клеток (линии рака молочной железы MCF-7 и др.) или краткосрочных клеточных культур из биопсийного материала (Mundle S.D.h др., 1995) или основаны на оценке уровня апоптоза микроскопическими методами. Имеются только единичные работы, исследующие диагностическую значимость непосредственно уровня апоптоза в опухолевой ткани (Wu J . и др., 1997; Bedner Elzbieta и др, 1999; R.Gonsales-Campora R. и др.,2000).

Цель работы

Задачи исследования

4. Изучить связь показателей спонтанного апоптоза с уровнем экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Уровень спонтанного апоптоза достоверно выше в ткани опухоли молочной железы по сравнению с нормальной тканью и тканью фиброаденомы.

2. Уровень спонтанного апоптоза отличается в зависимости от гистологической формы, уровня экспрессии эстроген рецепторов и пролиферативной активности опухоли.

3. Уровень спонтанного апоптоза не зависит от размеров опухоли и состояния региональных лимфоузлов.

4. Относительная оценка процессов пролиферации и апоптоза может быть способом оценки скорости обновления ткани и отражать степень злокачественности.

Научная новизна.

Научно-практическая значимость.

Апробация материалов диссертации.

Материалы диссертации были доложены: на конференции «Национальные дни лабораторной медицины», Москва в 2001г., на VI Ежегодной Российской онкологической конференции, Москва, в 2002г., на конференции с международным участием «Научно-организационные аспекты и современные лечебно-диагностические технологии в маммологии, Москва,2003г., на конференции молодых ученых «Медицинские технологии на рубеже Ш тысячелетия, Москва, 2003. Апробация работы прошла на научно-практической конференции в ГУ РНЦРР МЗ и CP РФ в 2004 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Объем и структура диссертации.

Заключение диссертационного исследования на тему "Исследование спонтанного и индуцированного апоптоза методом проточной цитофлуориметрии при раке молочной железы"

Выводы

Практические рекомендации.

1. Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых критериев прогноза при раке молочной железы на основании соотношения показателей спонтанного апоптоза и показателей пролиферации клеток опухоли.

2. Относительная оценка процессов пролиферации и апоптоза может быть способом оценки скорости обновления ткани и отражать степень злокачественности.

3. Использование комплекса показателей апоптоза, пролиферации и уровня экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона при протоковом раке молочной железы позволяет с высокой вероятностью прогнозировать поражение регионарных лимфатических узлов на основании проточно цитофлуорометрических характеристик основной опухоли.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Кудинова, Елена Александровна

1. Аббасов С.Г., Кушлинский Н.Е., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Факты и перспективы изучения Fas-FasL-системы в норме и при патологии// Успехи соврем. Биол.-2000.-т.120,№3.-с.303-318.

2. Абелев Г.И. Механизмы дифференцировки и опухолевый рост// Биохимия. -2000.-Т.65.- № 1.-е. 127-138.

3. Абраменко И.В., Фильченков А.А. Прогностическое значение апоптопического и пролиферативного индексов при солидных новообразованиях// 0нкология.-2002.-т.4.-№3.-с. 165-170.

4. Абраменко И.В., Фильченков А.А. Оценка параметров апоптоза в диагностике онкологических заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии// Вопросы онкологии.-2003.-т.49.-№1.-с.21-30.

5. Акимов А.А., Иванов С.Д., Хансон К.П. Апоптоз и лучевая терапия злокачественных новообразований// Вопросы онкологии.-2003.-т.49.-№3.-с.261-269.

6. Акоев И.Г., Мотлох Н.Н. Биофизический анализ предпатологических и предлейкозных состояний.-М.: Наука, 1984.-с.78-124.

7. Артамонова Е.В., Овсянников С.В., Тупицын Н.Н., Кадагидзе З.Г., Летягин В.П., Ермилова В.Д., Огнерубов Н.А., Паниченко А.В. Иммунологическая диагностика метастазов рака молочной железы и рака желудка в лимфатические узлы// Врач.-2003.-№1.- с.34-35.

8. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В .//Российский онкологический журнал.-1996.-№ 1.-С.58-61.

9. Богатырев В. Н.Значение количественных методов исследования (морфометрии, проточной цитометрии, сканирующей микрофотометрии) в клинической онкоцитологии//Автореф. дисс. доктора мед.наук.-Москва.-1991.- с. 78-111.

10. Богатырев В.Н., Портной С.М., Лактионов К.П., Летягин В.П. Проточная цитометрия при раке молочной железы T1-2N0M0: анализ 10-летних наблюдений//Материалы 1 съезда онкологов стран СНГ.-Москва.: 1996.- т.2.-с.482-483.

11. Владимирская Е.Б., Масчан А.А., Румянцев А.Г. Апоптоз и его роль в развитии опухолевого роста//Гематол. и трансфузиол.-1997.- т.42.-№ 5.-С.4-9.

12. Добрынин В.Я., Николаева Т.Г. Метод проточной ДНК-цитометрии в прогнозировании течения опухолевого процессов при опухолях человека. В кн.: Экспериментальная онкология на рубеже веков./Под. ред. М.И. Давыдова, А.Ю. Барышникова/, 2003.-c.483-510.

13. Дубров A.M., Мхитарян B.C., Трошин Л.И. Многомерные статистические методы. М.: Финансы и статистика, 1998.- 352с.

14. Епифанова О.И. Лекции о клеточном цикле.-М.:1997.

15. Епифанова О.И., Полуновский В.А., Терских В.В.Регуляторные механизмы пролиферации клеток//ВИНИТИ, Итоги науки и техники.-М.:1988.-т.Ю.

16. Епифанова О.И., Полуновский В. А., Терских В.В.Регуляция размножения клеток в процессе специализации, старения и неопластической трансформации//ВИНИТИ, Итоги науки и техники.- М.:1988.-т.11.

17. Заридзе Д.Г. Эпидемиология и этиология злокачественных новообразований. В кн. Канцерогенез./ Под. ред. Д.Г.Заридзе/М.,Медицина.-2004.- с.29-85.

18. Зубрихина Г.Н. Проточная цитометрия в диагностике и прогнозе злокачественных новообразований человека. Док. дисс. 1990.

19. Кайряк О.В., Лисовская Н.Ю., Семикоз Н.Г. Частота спонтанного апоптоза периферических лимфоцитов опухоленосителей как критерий прогноза эффективности специфического лечения// Цитол.генетика.-1999,- т.ЗЗ .-с.23-6.

20. Копнин Б.П. Основные свойства неопластической клетки и базовые механизмы их возникновения. В кн. Канцерогенез./ Под. ред. Д.Г.Заридзе/М.,Медицина.-2004.- с.86-102.

21. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза//Биохимия.-2000.-т.65.-№ 1.-е.5-33.

22. Коршунов А.Г., Сычева Р.В., Голанов А.В. Иммуногистохимическое изучение апоптоза в глиобластомах больших полушарий головного мозга// Арх. пат.1998.-т.60.-№ 3.-С.23-27.

23. Котов Ю. Б. Новые математические подходы к задачам медицинской диагностики. М: Едиториал УРСС, 2004.- 328с.

24. Кушлинский Н.Е., Зборовская И.Б. Молекулярно-биологические исследования при раке молочной железы.: В кн. Первичные опухоли молочной железы . Практическое руководство по лечению./Под. ред. ЛетягинаВ.П./, 2004.-С.23-55.

25. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Гибель клетки (апоптоз).-М.: Медицина.-2001.- с.81-110.

26. Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю. Сравнительная морфология апоптоза и некроза клеток опухолей // Тезисы 1 Белорусского съезда патологоанатомов и судебных медиков.-Минск.-1990-1991.-Т.2-с.299-300.

27. Нейштадт Э.Л., Воробьева О.А. Патология молочной железы.-Санкт-Петербург.: Фолиант.-2003.-с.90-94.

28. Новиков B.C. (ред). Программированная клеточная гибель.-Санкт-Петербург. :Наука.-1996.-c.256.

29. Ориновский М.Б., Ожерельев А.С., Кушлинский Н.Е. Рак молочной железы. Тканевые маркеры в оценке метастазирования и прогноза (монография)//Издательская группа РОНЦ им. Блохина РАМН.-ББК 55.6.081.-М.-2003.- с.250.

30. Портной С.М. Рак молочной железы (факторы прогноза и лечение)//Автореф.дисс. доктора мед. наук.-Москва.-1997.

31. Робинсон М.В., Труфакин В.А. Апоптоз клеток иммунной системы. Успехи соврем биол.-1991.-т.111.-№ 2.-С.246-259.

32. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека//под ред. С.В.Петрова, Н.Т.Райхлина.:Казань.-2000.-с.250-265.

33. Слонимская Е.М. Прогнозирование исхода заболевания у больных раком молочной железы//Автореф. дисс. доктора медицинских наук.-Томск.-1999.-с.48.

34. Фильченков А.А. Современные представления о роли апоптоза в опухолевом росте и его значение при противоопухолевой терапии//Эксперим. онкол. -1998.-т.20.-с.259-270.

35. Фильченков А.А., Стойка Р.С. Апоптоз и рак.:Киев.- Морион.-1999.-С.-184.

36. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины/Пер. с англ.- М.:Медиа Сфера, 1998. -352с.

37. Хансон К.П. Апоптозховременное состояние проблемы//Изв. РАН. Серия биол.-1998.-№2.-с. 134-141.

38. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах//Иммунология.-1996.-№ 1.-е. 10-23.

39. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме//Патол. физиол. экспер. тер. -1998.-т.2.-с.38-48.

40. Abdel-Moneim I., Melamed M.R., Darzynkiewicz Z., Gorczyca W. Proliferation and apoptosis in solid tumors. Analysis by laser scanning cytometry//Anal. Quant. Cytol.Histol.-2000.-v.22.-p.393-7.

41. Allred D.C., Harvey J.M., Berardo M., Clark G.M. Prognostic and predective factors in breast cancer by immunohistochemical analysis//Mod. Pathol.-1998.-vol. 11 .-p. 155-168.

42. Anderson T.J. Pathological studies of apoptosis in the normal breast// Endocr Relat Cancer. -1999.- V6.- № 1,- p. 9-12.

43. Barret K.L., Willingham J.M., Garvin A.J., Willingham M.C. Advences in cytovhemical methods for detection of apoptosis//J.Hist.Cytoch.-2001.-v.49.-p.821-832.

44. Bedner Elzbieta et al. Analysis of apoptosis by Laser Scanning Cytometry//Cytometry.-l 999 -vol.3 5.-p. 181-195.

45. Ben-Hur H., Mordechay E., Halperin R., Gurevich P., Zandbank J., Herper M., Zusman I. Apoptosis-related proteins (Fas, Fas ligand, bcl-2 and p53) in different types of human breast tumors// Oncol Rep. 2002.-V. 9.- № 5.- P. 977-80.

46. Bertho L., Santiago M.A., Coutinho S.G. Flow cytometry in the study of cell death// Mem Inst Oswaldo Cruz. 2000.- V. 95.- № 3.- p.429-33.

47. Bertram J.S. The molecular biology of cancer//Molecular aspect of medicine.-2001.- vol.21 .-p. 167-223.

48. Carter C.L., Allen C., Henson D.E. Relation of tumor size, lymph node status and survival in 24,740 breast cancer cases//Cancer.-1989.-vol.63.-p.181-187.

49. Chappuis P. O., Kapusta L., Begin L.R., et al. Germinal BRSA1/2 mutations and p27bpJ protein levels independently outcome after breast cancer// J. Clin. 0ncol.-2000.-v.l8.-p.4045-4052.

50. Chen T.L., Luo I., Mikhail N., Raskova J., Raska К Jr. Comparison of flow and image cytometry for DNA content analysis of fresh andformalin-fixed, paraffin-embedded tissue in breast carcinoma// Cytometry.-1995.-vol.22.- №3 .-p. 181-9.

51. Clark G.M., Mathieu M-C., Owens M.A., et al. Prognostic significance of S-phase fraction in good-risk, node-negative breast cancer patients//J Clin Oncol.-1992.-vol.lO.-p.428-432.

52. Clayton F., Hopkins C.L. Pathologic correlates of prognosis in lymph node-positive breast carcinomas//Cance.-1993.-vol.71.- p. 1780-1790.

53. Cook D.L., Weaver D.L. Comparison of DNA content, S-phase fraction, and survival between medullary and ductal carcinoma of the breast//Am J Clin Pathol.-1995.-vol. 101№ 1 .-p. 17-22.

54. Crissman A. and T. Hirons G. Staining of DNA in live and fixed cells/ZMethods in Cell Biology. Academic Press, San Diego.- 1994.-p. 195-209.

55. Cuello-Carrion F.D., Ciocca D.R. Improved detection of apoptotic cells using a modified in situ TUNEL technique//J.Hist.Cytoch.-1999.-v.47.-p.837-839.

56. Cummings M.C., Winterford C.M., Walker N.I. Apoptosis//Am J Surg Path.- 1997.-vol.21.-p.88-101.

57. Darzynkiewicz Z. Apoptosis in antitumour strategies: modulation of cell cycle or differentiation//! Cell Biochem.-1995.-vol.58.-p.l51-59.

58. Darzynkiewicz Z., Bedner E. Analysis of apoptotic cells by flow and laser scanning cytometry/ZMethods Enzymol.- 2000.-.v322.-p. 18-39.

59. DNA Cytometry Consensus Conference. Consensus review of the clinical utility of DNA cytometry in carcinoma of the breast/ZBreast Cancer Res Treat.-1993.-vol.28.- №1.-p.55-9.

60. Dressier L.G. Controls, standards, and histogram interpretation in DNA flow cytometry//Biology.-1990.-vol.33 .-p. 157.

61. Ehemann V., Sykora J., Vera-Delgado J., Lange A., Otto H.F. Flow cytometric detection of spontaneous apoptosis in human breast cancer using the TUNEL-technique// Cancer Lett.-2003.-v.8.-p. 125-31.

62. Esteban J.M., Felder В., Ahn С., et al. Prognostic relevance of carcinoembryonic antigen and estrogen receptor status in breast cancer patients//Cancer.-l 994.-vol.74.-p. 1575-1583.

63. Farber E. Programmed cell death: necrosis versus apoptosis//Mol. Pathol-1994.- vol.7-p.605-609.

64. Ghali V.S., Liau S., Teplitz C., Prudente R. A comparative study of DNA ploidy in 115 fresh-frozen breast carcinomas by imege analysis versus flow cytometry//Cancer.-1992.-vol.70.-p.2668-2672.

65. Glogovac J.K., Porter P.L., Banker D.E., Rabinovitch P.S. Cytokeratin labeling of breast cancer cells extracted from paraffin-embedded tissue for bivariate flow cytometric analysis//Cytometry.-1996.-vol.24.- №3.-p.260-7.

66. Gonzalez-Campora R., Galera Ruiz M.R., Vazkez Ramirez F., Rios M.J.J., Fernandes S.J.M., Ramos M.M.M., Gomez P.A. Apoptosis in breast carcinoma// Pathol Res. Pract.-2000.-v.196.-p. 167-74.

67. Gorczyca W., Bedner E., Burfeind P., Darzynkiewicz Z., Melmed M.R., Analysis of apoptosis in solid tumors by laser-scanning cytometry//Mod. Pathol.- 1998,-v. 11 .-p. 1052-8.

68. Gorczyca W., Tuzyak Т., Kram A., Melamed M.R., Darzynkiewich Z. Detection of apoptosis-associated DNA strand breaks in fine-needle aspiration biopsies by in situ end labeling of fragmented DNA//Cytometry.- 1994,-v 15 .-N2.-p. 169-175.

69. Gross A., McDonnell J.M., Korsmeyer S.J. BCL-2 family members and mitochondria in apoptosis//Gen. Dev.-1999.-vol.13-p. 1899-1911.

70. Hasebe Т., Sasaki S., Imoto S., Ochiai A. Prognostic significance of the intra-vessel tumor characteristics of invasive ductal carcinoma of the breast: a prospective study//Virchows Arch.-2004.-v.444.-p.20-7.

71. Hedley D.W. DNA analysis from paraffin-embedded blocks//Methods Cell Biol.-1994.-vol.41.-p.231-40.

72. Heiden Т., Castanos-Velez E., Andersson L.C., Biderfeld P. Combined analysis of DNA ploidy, proliferation, and apoptosis in paraffin-embedded material by flow cytometry//Lab. Invest.-2000.-v.80.-p.1207-13.

73. Henson D.E., Ries L., Freedman L.S.,Carriaga M. Relationship among outcome, stage of disease, and histologic grade for 22,616 cases of breast cancer//Cancer.-l 991 .-vol. 68.-p.2142-2149.

74. Kallioniemi O.P., Blanco G., Alavaikko M., Hietanen Т., Mattila J., Lauslahti K., Koivula T. Tumour DNA ploidy as an independent prognostic factor in breast cancer//Br J Cancer.-1987.- №5.-p.637-42.

75. Kerr J.F.R., Winterford C.M., Harmon B.V. Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy//Cancer.-1994.-vol.73.-p.2013-26.

76. Kimmig R., Spelsberg H., Kapsner Т., Untch M., Hepp H. Flow cytometric DNA analysis of breast cancer by two colour method using cytokeratin labeling for identification of tumour cells//Anal Cell Pathol.-1994.-vol.7.- №3.-p.205-15.

77. Kroemer G., Reed J.C. Mitochondrial control of cell death//Nat. Med — 2000.-vol.6-p.513-519.

78. Maciorowski Z., Klijanienko J., Padoy E., Mosseri V., Fourquet A., Chevillard S., El-Naggar A.K., Vielh P. Comparative image and flow cytometric TUNEL analysis of fine needle samples of breast carcinoma// Cytometry.-2001 .-v.46.-p. 150-6.

79. Manon van Engeland et al. Annexin V-Affinity Assay: A Review on an Apoptosis Detection System Dased on Phosphatidylserine Exposure//Cytometry.-1998.-v.31- p. 1-9.

80. McCormick S.R., Peters A.A., Schrauth J.B. Flow cytometric DNA analysis with cytokeratin gating of formalin-fixed deparaffinized breast cancer nuclei//Am J Clin Pathol.-1998.-vol. 110.-№ 2.-p.227-37.

81. McCoy J.P. Medicaid and Medicare Reimbursement for Flow Cytometry//Am J Clin Pathol.- 2001.-vol.15.-№ 5.-p.3-12.

82. Medina D. Biological and molecular characteristics of the premalignant mouse mammary gland// Biochim. Biophys.Acta.-2002.-p.l-9.

83. Mendendelsohn J. et al. The molecular Basis of Cancer-2001.-2nd edition.- p. 19-40.

84. Michels J.J., Duigou F., Marnay J. Flow cytometry in primary breast carcinomas. Prognostic impact of proliferative activity//Breast cabcer Res Treat.-2000.- vol.62.-№ 2.-p.l 17-26.

85. Nagata S., Goldstein P. The Fas death factor// Science.-1995.-v.267 — p.1449-1456.

86. O'Donovan N., Crown J., Stunell H., Hill A.D., McDermott E., O'Higgins N., Duffy M.J. Caspase 3 in breast cancer// Clin Cancer Res. 2003.- V. 9.- № 2.- P. 738-42

87. Ormerod M. G., Payne A.W.R. and Watson J.V. Improved program for the analysis of DNA histograms//Cytometry.-1987.-v.8.-p.637-641.

88. Ormerod M.G.(ed). Flow cytometry; A practical approach//IRL Press, Ozford.-1990.-p.69-87.

89. Ormerod. M.G., Analysis of DNA -general methods, in Flow Cytometry: a Practical Approach, M. G. Ormerod, ed. 2nd edition//IRL at Oxford University Press, Oxford.-1994.-p.l 19-135.

90. Ornberg R.L. Proliferation and apoptosis measurements by color image analysis based on diferential absorption//J.Hist.Cytoch.-2001.-v.49.-p.1059-1060.

91. Overton W.R. Modefied histogram subtraction technique for analysis of flow cytometry data//Cytometry.- 1988.-vol.9.-p.319-326.

92. Peng L, Jiang H, Bradely C. Detection of В lymphoma cells undergoing apoptosis by Annexin-V assay// Chin Med Sci J. 2002.- V. 17.- № 1.-P. 17-21.

93. Pillai M.R., Kesari A.L., Chellam V.G., Madhavan J., Nair P., Nair M.K. Spontaneous programmed cell death in infiltrating duct carcinoma: association with p53, bcl-2, hormone receptors and tumor proliferation// Pathol. Res. Pract.-1998.-v.l94.-p.549-57.

94. R.Gonsales-Campora R.,Galera Ruiz M.R., Vazquez Ramirez F. et al. Apoptosis in breast carcinoma // Path. Res. Pract.-2000.-v.196.-p.167-174.

95. Raff M.C. Social controls on cell survival and cell death// Nature.-1992.-v.356.-p.397-400.

96. Redkar A.A., Balsara B.R., Bhisey A.N., Sampat M.B., Mittra I. DNA analysis of breast cancer by flow cytometry and correletion with other prognostic parameters//Indian J. Med. Res.-1992.-v.96.-p.223-9.

97. Redkar A.A., Krishan A. Flow cytometric analysis of estrogen, progesterone receptor expression and DNA content in formalin-fixed, paraffin-embedded human breast tumors//Cytometry.-1999.-v.38.-№2.-p.61-9.

98. Rouleau-Dubois С., Cuny M., Ferreires G.,Simony-Lafontaine G.,Rouanet P., Greiner G.,Jeanteur P.,Baldet P., Escoat C. Spontaneous apoptosis in the intra-ductal component's stroma of breast invasive carcinoma//Anticancer Res.-2004.-24.-№l.- p.53-7.

99. Rzymowska J., Skierski J., Kurylcio L., Dyrda Z. DNA index as prognostic factor in breast cancer//Neoplasma.-1995.-v.42.-№5.-p.239-42.

100. Sabe I., Andritsch I., Mangoud A., Awad A.S., Khalifa A., Krishan A. Flow cytometric analysis of estrogen receptor expression in isolated nuclei and cells from mammary cancer tissues//Cytometry.-1999.-v.36.-№2.-p. 131-9.

101. Samoszuk M.K., Sallash G., Chen K., Carlton E., Oldaker T. Association between flow cytometric S-phase fraction and apoptotic rate in breast cancer// Cytometry.-1996.- v.26.-№ 4.-p. 281-5.

102. Schultz D.S., Zarbo R.J. Comparison of eight modifications of Hedley's method for flow cytometric DNA ploidy analysis of paraffin-embedded tissue//Am J Clin Pathol.-1992.-v.98.- №3.-p.291-5.

103. Schwandner O., Schiedeck Т.Н., Bruch H.P., et al . Apoptosis in rectal cancer: prognositic in comparison with clinical histopathologic, and immunohistochemical variables// Dis Colon Rectum.- 2000.-v. 43.-p. 1227-36.

104. Sun S., Li L., Sun D. In situ observation of apoptosis and proliferation in breast cancer and its precancerous lesions//Zhonghua Zhong Liu Za Zhi.-1999.-v.21.-№6.-p.447-9.

105. Talieri M, Diamandis EP, Katsaros N, Gourgiotis D, Scorilas A. Expression of BCL2L12, a new member of apoptosis-related genes, in breast tumors// Thromb Haemost. 2003.- V. 89.- № 6.- P. 1081-8.

106. Thompson C.B. Apoptosis in patogenesis and treatment of disease// Science.-1995.-v.267.-p. 1456-1462.

107. Thorud E., Fossa S.D., Vaage S., Kaalhus O., Knudsen O.S., Bormer O., Shoaib M.C. Primary breast cancer. Flow cytometric DNA pattern in relation to clinical and histopathologic characteristics//Cancer.-1986.-v.57.- №4.-p.808-11.

108. Uzarevic В., Petroveski M., Jakic-Razumovic J., Hutinec Z., Sabioncello A., Gamulin S. Prognostic significance of cell cycle parameters in infiltrative ductal breast carcinoma//J Clin Lab Anal.-1998.-v. 12.- №3.-p.131-6.

109. Vakkala M., Lahteenmaki K., Raunio H. et al. Apoptosis during carcinoma progression//Clin. Cancer Res.-1999.-v.5-p.319-324.

110. Van Diest P.J., Risse E. K. J., Schipper N. W., Baak J. P. A. Comparisson of light microscopic grading and morfometric features in cytological breast cancer specimens//Path. Res. Pract.-1989.-v.l85.-p.612-616.

111. Volpi A., De Paola F.,Nanni O. Prognostic sugnificance of biologic markers in node-negative breast cancer patients: a prospecctive study// Breast Cancer Res.-2000.-v.63.-p.l81-192.

112. Wijsman J.H. et al. A new method to detect apoptosis in paraffine sections: in situ endlabelling of fragmentet DNA//J.

113. Histochim.Cytochim. 1994. - v.41.- № 1-p.7-12.

114. Willingham M.C. Cytochemical methods for the detection of apoptosis// The Journal of Histochemistry and Cytochemistry.-1999.- V. 47.- № 9.-P. 1101-1109.

115. Wingren S., Stal O. Flow cytometric gating on cytokeratin-containing DNA aneuploid breast cancer cells improves the prediction of recurrence//Eur J Cancer.-1995.-v.31 A.- №11.-p. 1893-5.

116. Wingren S., Stal O., Nordenskjold B. Flow cytometric analysis of S-phase fraction in breast carcinomas using gating on cells containing cytokeratin//South East Sweden Breast Cancer Group. Br J Cancer.-1994.-v.69.- №3.-p.546-9.

117. Wu J., Shao Z., Jiang M. In situ DNA labeling apoptosis in breast cancer as related to prognosis//Chung Hua Chung Liu Tsa Chih.-1997.v.l9.-p. -100-102.

118. Yuan J., Hennesy C., Corbett IP, et al. Node negative breast cancer: The prognostic value of DNA ploidy for long-term survival//Br J Surg.-1991.-v.78.-p.844-848.

119. Zhang S.Q., Qiang S.Y., Yang W.B., Jiang J.T., Ji Z.Z. Expression of survivin in different stages of carcinogenesis and progression of breast cancer// Ai Zheng.-2004.-v.23.-№6.-p.697-700.

Автореферат диссертации по медицине на тему Исследование спонтанного и индуцированного апоптоза методом проточной цитофлуориметрии при раке молочной железы

Оглавление диссертации Кудинова, Елена Александровна :: 2005 :: Москва

Введение диссертации по теме "Онкология", Кудинова, Елена Александровна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2005 года, Кудинова, Елена Александровна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций