Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Значение белков и пептидов цереброспинальной жидкости в клинической лабораторной диагностике и патогенезе нейроинфекционных заболеваний у детей

На правах рукописи

АЛЕКСЕЕВА Лидия Аркадьевна

ЗНАЧЕНИЕ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ И ПАТОГЕНЕЗЕ НЕЙРОИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У ДЕТЕЙ

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2003

Работа выполнена в биохимической группе лаборатории функциональных и лучевых методов диагностики НИИ детских инфекций Минздрава России, г.Сашсг-Петербург

Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор ¡Сорокина Маргарита Николаевна доктор медицинских наук Скрипченко Наталия Викторовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Зыбина Наталия Николаевна

доктор медицинских наук профессор Эмануэль Владимир Леонидович

доктор медицинских наук профессор Гузева Валентина Ивановна

Ведущая организация - Военно-медицинская академия им. С М. Кирова

Защита состоится « » 2003 г. в « »часов на заседании

диссертационного совета Д 205.001.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук во Всероссийском центре экстренной и радиационной медицины МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Лебедева, 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, улЛебедева, 4/2.

Автореферат разослан « 2Р 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

Алексанин С.С.

S7G&

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение молекулярных основ патогенеза нейро-инфекционных заболеваний обусловлено тяжестью течения вирусных и бактериальных менингитов и энцефалитов у детей, высокой летальностью (до 36 %) и формированием инвалидизирующих последствий у каждого третьего пациента (Зинченко А.П. 1986; Сорокина М.Н., 1992, 1999; Гузева В.И.,1998; Протас И.И., 2000; Chang Y.C. et al„ 1998; Roos K.L., 1999; Spach D.H., 1999). Течение и исход заболеваний зависят от взаимодействия вирулентных и патогенных свойств возбудителя и компенсаторных реакций макроорганизма (Покровский В.И.,1993; Кветная A.C.,1995; Коспокова H.H., 2001). Тяжесть нейроинфекций обусловлена выраженностью воспалительного процесса в оболочках и ткани мозга, сопровождающегося увеличением проницаемости гематоэнцефаличе-ского барьера (ГЭБ), проникновением возбудителя в ликворные пространства и шпратекальным развертыванием инфекционного процесса (Скрипченко Н.В.Д993; Braun J.S., Tuomanen EX, 1999; Leib S.L., Tauber V.G., 1999 ). Известно, что в начальной стадии нейроинфекций вследствие увеличения проницаемости ГЭБ в ликворе повышается содержание острофазных белков, цитоки-нов, ферментов и их ингибиторов, иммуноглобулинов и других компонентов (Цветанова Е.М., 1986; Рослый И.М., 1991; Пилипенко В.В., 1995; Бабич Г.Н., 2003; Azuma Н. et al., 1997; Takeoka Т., 1997; Reiber Н., 1998; Saunders N.R., 1999). Основой скрининговой ликворной диагностики является анализ содержания общего белка, плеоцитоза, реже содержания лактата, хлоридов и глюкозы, однако эти исследования не позволяют уточнить молекулярные основы патогенеза, степень поражения мозга и прогнозировать течение заболевания (Макаров А.Ю., 1984; Мошкин A.B., Бурмакова Л.М., 1997; Лобзин Ю.В., 2000; Schmidt Н., 1987, Watson М.А., Scott M.G., 1995, ZuntJ.R., 1999).

По современным представлениям, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) принадлежат важные функции по поддержанию работы мозга в норме и при патологии - трофической, дренирующей, механической и иммунной защиты, нейрогуморальной регуляции (Малашхия Ю.А., 1986; Макаров А.Ю.,1992; Одинак М.М.,2001; Fishman R.A., 1992;). Доказательством важной роли ЦСЖ в генезе многих заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) являются экспериментальные исследования по «переносу» с ликвором состояний сна и бодрствования, боли и анальгезии, двигательных функций и их нарушений, а также клинические работы, подтверждающие эффективность ликворотерапии, включающей очистку ликвора от токсичных субстанций, дренирование ликворных пространств, итрацистернальное и интраназальное введение донорского лик-вора (Басс Р.Л., 1988; Судаков К.В., 1992; Варганян Г.А.,1994; Шпрах В.В. и соавт., 1997; Пономарев В.В., 1999; Гомазков O.A.,2002). Предполагается, что восстановление нарушенных функций мозга осуществляется благодаря регулирующему действию компонентов ликвора. Вьтол?фяи«> « ^рюгюобразни*

библиотека СПетербург

■жь* к__j

функций ЦСЖ в значительной мере обеспечивается полифункциональными белковыми и пептидными молекулами. Особое значение в регуляции деятельности мозга принадлежит нейропептидам, способным оказывать многостороннее влияние на функции многих органов и систем организма, в том числе осуществлять нейроиммунное взаимодействие (Крыжановский ГЛ. и соавт., 1995; Столяров И Д., 1996; Корнева Е.А. и соавт., 1999; Ашмарин Й.П., Королева С.В., 2002; Гомазков O.A., 2002). Образование пептидов происходит внутри-клеточно путем ограниченного протеолиза (процессинга) высокомолекулярных белковых предшественников либо внеклеточно при протеолитическом распаде белков, в том числе сыворотки крови и ЦСЖ. Хотя сведения о нейропептидах в биологии многочисленны, их значение в развертывании воспалительного процесса и процессах саногенеза остается нераскрытым. Несмотря на информативность исследования белкового состава ЦСЖ, большинство существующих методов не нашло широкого применения в клинике из-за трудоемкости и ограниченной доступности оборудования и тест-систем, что диктует целесообразность усовершенствования методических приемов. Сведения о пептидном составе ликвора при нейроинфекциониых заболеваниях фрагментарны и носят описательный характер, неясна их роль в патогенезе инфекционных заболеваний нервной системы, в связи с чем проведение данного исследования является актуальным.

Цель исследования - определить значение белков и пептидов ЦСЖ в клинической лабораторной диагностике и генезе нейроинфекционного процесса путем анализа патобиохимических изменений состава ЦСЖ и экспериментального изучения биологической активности фракций для усовершенствования диагностики, прогноза течения и исходов острых инфекционных заболеваний центральной и периферической нервной системы у детей.

Задачи исследования:

1. Изучить молекулярно-массовое распределение компонентов ЦСЖ и уточнить качественные и количественные характеристики белкового и пептидного спектров ЦСЖ при различных нозологических формах инфекционных заболеваний нервной системы у детей.

2. Разработать экспресс-метод фракционирования ЦСЖ путем гель-фильтрации на сефадексе и определить содержание белкового и пептидного пулов при различных инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей.

3. Определить диагностическую и прогностическую значимость пептидного и белкового спектров ЦСЖ и их составляющих в генезе нейроинфекционного процесса, выявить маркеры повреждения мозга и варианты интратекального ответа на вирусную и бактериальную инфекцию.

4. Разработать алгоритм патобиохимической оценки ЦСЖ ври вирусных и бактериальных нейроинфекциях у детей.

5. Изучить экспериментальным путем иммуномодулирующее действие компонентов ЦСЖ при нейроинфекциях у детей.

6. Определить бактерицидную активность фракций ликвора на клинических штаммах менингококка, пневмококка и гемофильной палочки.

7. Уточнить патогенез инфекционных заболеваний нервной системы и механизмы пато- и саногенетического воздействия ЦСЖ в клинике и эксперименте для усовершенствования терапии острых нейроинфекций у детей.

Научная новизна. С использованием высокоразрешающих методов биохимического анализа получены новые данные о молекулярно-массовом распределении компонентов ЦСЖ, охарактеризован спектр низкомолекулярных компонентов, качественный и количественный белковый состав при инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей.

Разработан экспресс-метод фракционирования ЦСЖ при инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей путем гель-фильтрации на сефадексе G-50 для определения белкового и пептидного пулов с подсчетом их абсолютного содержания и соотношения.

Показано значение определения белков и пептидов ЦСЖ в клинической лабораторной диагностике нейроинфекционных заболеваний у детей для дифференциации вирусной и бактериальной природы заболевания, прогнозирования характера его течения и исхода, уточнения ведущих патогенетических механизмов.

Установлены качественные и количественные особенности белкового и пептидного спектра ликвора при менингитах и энцефалитах, определены маркеры повреждения мозга и варианты интратекального ответа на вирусную и бактериальную инфекции.

Выявлено в эксперименте in vitro и in vivo регулирующее влияние высоко- и низкомолекулярных фракций ЦСЖ на системные реакции крови и бактерицидное действие на основные возбудители бактериального менингита.

Разработан алгоритм патобиохимической оценки ЦСЖ и уточнены ин-тратекальные механизмы пато- и саногенетического воздействия ликвора, позволяющие усовершенствовать терапию нейроинфекционных заболеваний у детей.

Практическая значимость работы. Разработанный экспресс-метод фракционирования ЦСЖ гель-фильтрацией на сефадексе G-50 доступен для применения в клинике, позволяет определять белково-пептидный состав ликвора, коррелирующий с характером и выраженностью нейроинфекционного процесса. Исследование особенностей качественного и количественного состава высоко- и низкомолекулярных компонентов ЦСЖ при различных нозологических формах инфекционных заболеваний нервной системы способствует не только ранней объективной оценке тяжести интратекального воспаления, прогнозированию течения и исходов заболевания, но и определению тактики дифференцированной терапии с применением дезинтоксикационных, дегидратаци-онных и антибактериальных средств, что позволяет снизить летальность и частоту инвалидизирующих нарушений при нейроинфекциях у детей.

Результаты работы использованы при разработке методических рекомендаций: «Ликворотерапия в комплексном лечении сверхострых и тяжелых

форм нейроинфекций у детей»; «Диагностическое значение исследований клеточных реакций и белков ликвора при гнойных менингитах у детей»; «Прогнозирование течения и исходов острых бактериальных менингитов у детей», пособий: «Ранние и поздние дифтерийные полияейропатии у детей»; «Гемофиль-ные менингиты у детей: эпидемиология, клиника, диагностика, лечение, профилактика». По результатам исследования получен патент на изобретение: «Способ прогнозирования течения и исходов бактериальных менингитов у детей» [№2141668 (1999 г.)].

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1. Особенности белково-пептидного состава ЦСЖ, спектра высоко- и низкомолекулярных компонентов зависят от этиологии нейроинфекционного заболевания и тяжести повреждения нервной системы у детей, с чем связаны различные варианты интратекального ответа.

2. Экспресс-метод фракционирования ЦСЖ на основе гель-фильтрации на сефадексе 6-50 позволяет определять белковый и пептидный пул ликвора, характер изменения которых коррелирует с нозологической формой и особенностями течения инфекционных заболеваний центральной и периферической нервной системы у детей.

3. Исследование качественного и количественного белково-пептидного состава ЦСЖ при нейроинфекциях у детей позволяет дифференцировать вирусную и бактериальную природу заболевания, уточнять ведущие патогенетические механизмы, прогнозировать течение и исход заболеваний.

4. ЦСЖ оказывает иммуномодулирующее действие на системные реакции крови и бактерицидное - на актуальные возбудители бактериальных менингитов, наиболее выраженное в отношений менингококка.

5. В патогенезе инфекционных заболеваний нервной системы большое значение имеют белковые и пептидные компоненты ЦСЖ, которые оказывают как повреждающее действие за счет избыточного поступления в ЦСЖ высокомолекулярных компонентов (белки зоны медленных посттрансферринов и макроглобулинов) и гидрофобных пептидов, способствующих нарастанию общемозговой, менингеальной и очаговой симптоматики, так и реабилитационное, благодаря наличию белков, обладающих антиоксидантной, ингибиторной и транспортной функцией, регуляторных нейропетидов, восстанавливающих функциональную активность иммунокомпетентных клеток и ассоциативные связи.

Апробация работы и внедрение в практику. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на 31 Всесоюзной, Всероссийской и Межрегиональной научно-практической конференции: г. Звенигород - Всесоюзная конференция «Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний» (1990); г. Новосибирск - конференция «Менингококковые инфекции и гнойные менингиты» (1990); г. Суздаль - Съезд врачей-инфекционистов (1992); г. Санкт-Петербург - Международный симпозиум «Эндогенные интоксикации» (1994); г. Москва - Конгресс педиатров России «Современные технологии в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний у детей»

(1995); г. Нижний Новгород - VIT Всероссийский съезд неврологов (1995); г. Москва - Ш Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (1996); г. Саратов - П Всероссийская конференция «Гомеосгаз и инфекционный процесс» (1998); г. Санкт-Петербург- П Международная конференция «Идеи Пас-тера в борьбе с инфекциями» (1998); г. Санкт-Петербург - Конференция «Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика» (1999); г. Санкт-Петербург - Конференция «Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней» (1999); г. Москва - Дни национальной лабораторной медицины ( 1999 ); г Москва — VI конгресс педиатров России «Неотложные состояния у детей» (2000); г. Москва - Конференция «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (2000); г. Санкт-Петербург - 10 совместная конференция «Нейроиммунология» и научно-практическая конференция неврологов (2001), г. Санкт-Петербург - Всероссийская конференция « Дни иммунологии» ( 2001); г. Санкт-Петербург - Межрегиональная научно-практическая конференция «Современные проблемы детской инфекгологии» (1997); г. Санкт-Петербург - 10-я Юбилейная Республиканская научно-практическая конференция «Проблема гастроэнтерологических и целевых капельных инфекций», посвященная 70-летию НИИДИ (1997); г. Санкт-Петербург - Всероссийская научно-практическая конференция «Детские инфекции на рубеже XXI века: настоящее и будущее» (1999); г. Санкт-Петербург - Юбилейная научно-практическая конференция, посвященная 140-летию кафедры душевных и нервных болезней BMA, «Современные подходы к диагностике и лечению нервных и психических заболеваний» (2000); г. Санкт-Петербург - итоговые научно-практические конференции «Актуальные вопросы детской инфекгологии» (ежегодно с 1990 по 2002 г.), на заседаниях биохимического общества (СПб., 1999), общества инфекционистов (СПб, 2000, 2002 г.); общества педиатров СПб (2001), ассоциации детских и взрослых неврологов (СПб.,1999, 2000, 2001,2002 г.).

Результаты исследования апробированы и используются при обследовании больных в лаборатории функциональных и лучевых методов диагностики, на отделении нейроинфекций и реанимации НИИ детских инфекций г. Санкт-Петербурга; в биохимических лабораториях городской больницы г.Череповца Вологодской области; инфекционной больницы № 21 г. Волгограда; детской инфекционной больницы г. Краснодара; Российского нейрохирургического института им. A.JI. Поленова; областной клинической больницы Оренбургской области. Материалы диссертации используются при обучении ординаторов, аспирантов и врачей на рабочих местах в НИИ детских инфекций, при проведении лекционных и практических занятий ФПК и ТТЛ СП6ГТ1МА.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 работы, в том числе 9 - в центральных журналах, в главе монографии «Бактериальные менингиты у детей», 3 - в методических рекомендациях, 2 - в пособиях для врачей, утвержденных Минздравом России. Получен патент на изобретение.

Связь с планами НИР Работа выполнена в соответствии с государственной научно-исследовательской тематикой (№ государственной регистрации

01.9.80003542), плановыми темами НИР НИИ детских инфекций (1989-1999

„г

Структура диссертации. Диссертация изложена на-^3 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя использованной литературы (384 источника). Текст иллюстрирован 41 таблицей и 22 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

С использованием различных методов биохимического анализа проведено исследование свыше 800 образцов ЦСЖ, полученных при диагностической люм бальной пункции от 500 детей, больных вирусными и бактериальными инфекциями центральной и периферической нервной системы (табл. 1). Среди бактериальных менингитов (ЕМ) преобладали менингиты менингококковой этиологии (п = 146), а среди вирусных энцефалитов - герпетические поражения головного мозга (п = 37). В структуре инфекционных заболеваний периферической нервной системы (ПНС) были дифтерийные полинейропатии (ДПНП, " п = 20), инфекционно-аллергические полирадикулоневриты (ТЕРН, п = 12), спи-нальные вялые парезы (п = 4), полиомиелит ( п = 1), поражения периферической нервной системы, вызванные вирусами клещевого энцефалита (КЭ, л = 4) и боррелиями (КБ, п = 5).

Обследованные больные были в возрасте от 2 мес до 14 лет, при этом бактериальный менингит переносили преимущественно дети в возрасте от 1 до 5 лег (50 %), вирусные менингиты (ВМ), энцефалиты (ВЭ) и полинейропатии (ПНП) - дети старше 5 лет (59,7 % и 72,5 % соответственно). Больные БМ обследованы от 2 до 4 раз на протяжении заболевания, вирусными нейрон нфек-циями и заболеваниями ПНС - однократно в острый период при выраженных клинических проявлениях. Контрольную группу составили 45 детей, из них 20 человек - больные острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ), поступившие в НИИ детских инфекций с подозрением на менингит, и 25 человек - реконвалесценты менингококового менингита при отсутствии в их неврологическом и общесоматическом статусе выраженных отклонений. Общее содержание белка и цитоз в ликворе у пациентов контрольной группы соответствовали возрастной норме. Биологическая активность фракций ЦСЖ в эксперименте in vitro исследована у 88 больных БМ в динамике заболевания и 29 детей контрольной группы.

Изучение молекулярно-массового распределения компонентов ЦСЖ проведено с использованием модификаций метода гель-фильтрации на сефадексах различных марок (Детерман Г., 1971). Фракционирование ЦСЖ осуществляли в двух вариантах: 1) аналитический - на сефадексе G-25 superfine с величиной столба сефадекса 38x2,6 см; 2) экспресс-метод - на сефадексе G-50 fine размером 12 х 1,2 см. Аналитический вариант был использован дня первичной характеристики качественного и количественного состава ликвора.

Экспресс-метод, доступный для использования в клинике, был разработан для определения содержания двух основных пулов ЦСЖ- высокомолекулярного (белкового) и низкомолекулярного (пептидного) при различных нозологических формах острых нейроинфекций у детей. Элюцию компонентов ЦСЖ проводили дистиллированной водой, измеряя оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, г.Санкг-Петербург) при длине волны 200 нм. Подсчет содержания компонентов ЦСЖ в каждой пробе и во всем пуле веществ осуществляли на основании сопоставления оптической плотности элюи-руемых компонентов с данными калибровочной кривой, построенной на результатах спектрофотометрии при длине волны 200 нм разведений стандартного раствора бычьего сывороточного альбумина (исходная концентрация 1 мг/ мл, разведения от 5 до 100 мкг/мл). Подсчитывали абсолютное содержание двух основных фракций - высокомолекулярной (ВМФ) и низкомолекулярной (НМФ), учитывая объем нанесенного на колонку ликвора.

Таблица 1

Количество больных инфекционными заболеваниями нервной системы, обследованных с применением различных методов биохимического анализа при учете нозологической формы

Нозологическая форма Количество больных, обследованных с применением различных методов биохимического анализа

Гель-фильтрация ДЭФв ПААГ ВЭЖХ Масс-спектрометрия Итого

Бактериальный менингит: |

менингококковый 71 49 7 19 146

пневмококковый 12 25 2 39

гемофильный 43 15 2 1 61

неясной этиологии 38 25 5 8 76

Вирусный менингит 13 17 6 36

Вирусные энцефалиты:

клещевой 19 7 26

герпетический 22 7 8 37

ветряночный 15 15

неясной этиологии 18 18

Инфекционные заболевания периферической нервной системы:

дпнп 10 10 20

ПРН 9 3 12

кэ 4 4

КБ 5 5

вялые парезы 3 1 4

полиомиелит 1 1

Всего 283 159 30 28 500

Для экспресс-метода использовалось не более 0,2-0,4 мл ЦСЖ, что в пересчете на количество белка составляло от 80 до 150 мкг на колонку. Предложенный способ расчета абсолютного содержания ВМФ и НМФ позволил варьировать наносимые объемы в зависимости от имеющейся в распоряжении ЦСЖ и общего содержания белка. Время проведения анализа не превышало 1,5-2 ч.

Исследование белкового состава ЦСЖ проведено методом диск-элеетрофореза в полиакриламидном геле (ДЭФ в ПААГ) в собственной модификации (Алексеева Л.А., Вальберг А.Ю., 1985). Электрофорез проводили на приборе фирмы «Реанал» (Венгрия) или ПЭФА 1 (Россия). Белковые фракции после электрофореза фиксировали и окрашивали амидо черным 10В в 7 % уксусной кислоте с последующим отмыванием избытка красителя. Количественную оценку производили на денситометре ДМ 1 («Красногвардеец», Ленинград) в режиме интегрирования, предполагающем соответствие концентрации отдельных фракций величине отрезка базовой линии и на приборе «Хромо-скан» (Англия) с подсчетом площадей отдельных фракций. Подсчитывали относительное (в %) и абсолютное (в г/л) содержание 6 основных белковых зон и 8 фракций. Абсолютное содержание белковых фракций рассчитывали, умножая относительные показатели на величину общего содержания белка ЦСЖ.

Исследование состава низкомолекулярной фракции ликвора проведено совместно с НИИ экспериментальной медицины РАМН методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в модификации, разработанной в физиологическом отделе им. И.П. Павлова (Шаток C.B., 1985). Анализ проводили при помощи хроматографического комплекса, состоявшего из насосов высокого давления и программатора градиента хроматографа «Цвет-3110» и многоволнового ультрафиолетового детектора «Миллихром 1». В инжектор хроматографа вместо петли для пробы была вмонтирована концентрирующая микроколонка с сорбентом «Силасорб С-8». Низкомолекулярную фракцию отделяли методом ультрафильтрации с помощью мембраны DIAFLO РМ-10 (AMICONE) и 100 - 250 мкл ультрафильтрата наносили на концентрирующую колонку с сорбентом «Силасорб С-8». При дозировании сконцентрированная проба наносилась на аналитическую колонку (использовались колонки диаметром 1 мм и длиной 150 мм и диаметром 2 мм и длиной 100 мм ) с сорбентом «Силасорб С-18». Элюцию проводили в градиентном режиме, параметры градиента варьировали в зависимости от типа колонки и необходимой степени разрешения. Стартовым элюенгом служил натрий-фосфатный буфер (50 ммоль/л, рН 2,5) с 5 % ацетонитрила, финишным - тот же буфер с добавлением 50 % ацетонитрила. Детектирование проводили по ультрафиолетовому поглощению при двух длинах волн: 200 нм («универсальная» длина волны, характерная почти для всех веществ, в том числе и для пептидных связей) и 250 нм (длина волны, характерная в основном для ароматических соединений), что позволяло более надёжно идентифицировать вещества с близким временем удерживания из различных образцов ЦСЖ. Также для более надёжной идентификации пиков, представленных на хроматограммах, применялся метод внутреннего стандарта: к каждому образцу добавлялось 200 нг кофеина и для каж-

дого пика рассчитывалось отношение времени удерживания пика ко времени удерживания кофеина - коэффициент удерживания относительно кофеина или относительное время (Т отн.). В каждой из выборок пики с близким относительным временем удерживания, отличающимся друг от друга не более чем на 0,005-0,01 ед., объединены в единый класс с подсчетом среднего значения (М) и ошибки среднего значения (ш). Достоверность отличий средних значений для разных классов проверена с помощью t-критерия Стыодента. Оценивали также частоту встречаемости пиков, средние значения их высоты и достоверность их различий при разных нозологических формах и вариантах течения заболевания.

Идентификация компонентов низкомолекулярной фракции ЦСЖ по молекулярной массе проведена методом масс-спекгрометрии ЭРИАД (экстракция ионов при атмосферном давлении) совместно с НИИ аналитического приборостроения после предварительной гель-фильтрации образцов ЦСЖ на сефадексе G-25 superfine и отбора проб с максимальной оптической плотностью в объёмах элюции, соответствующих низкомолекулярным фракциям.

Экспериментальные исследования биологической активности высоко- и низкомолекулярных фракций ЦСЖ in vitro включали определение их бактерицидных свойств, влияния на метаболические процессы в лимфоцитах крови и их пролиферативную активность, процессы интерферонообразования. ВМФ и НМФ ликвора получали экспресс-методом гель-фильтрации, используя в качестве элюента фосфатный буфер (0,1моль/л, pH 7,4). Перед исследованием пулы ВМФ и НМФ стерилизовали, пропуская через фильтр аналитический ФА-45 с использованием лавсановых мембран с диаметром пор 0,2 мкм (Тензор -Дубна).

Исследование бактерицидного действия фракций ЦСЖ проведено совместно с сотрудниками бактериологической лаборатории НИИ детских инфекций (с.н.с. к м.н. М.О. Волкова, руководитель лаборатории д.м.н. A.C. Кветная.) Изучали бактерицидные свойства фракций ликвора на клинических штаммах пневмококка, менингококка и гемофильной палочки по методу Л.В. Пархоменко (1987). Концентрацию микроорганизмов оценивали по среднеарифметическому числу колониеобразующих единиц (КОЕ), выросших из последних разведений. Индекс бактерицидности — показатель 10-кратного изменения концентрации микроорганизмов через 3 ч инкубации с фракциями ЦСЖ - рассчитывали по разнице между опытными и контрольными пробами.

Экспериментальное исследование иммуномодулирующей активности фракций ЦСЖ в культуре клеток крови проведено совместно с сотрудниками иммунологической лаборатории НИИ детских инфекций (руководитель лаборатории д.м.н. Г.Ф. Железникова.) В качестве модельной тест-системы выбрана реакция фитогемагглютинин-стимулированной бластгрансформации лимфоцитов (ФГА-РБТЛ). Исследование фракций ЦСЖ, полученной как в остром периоде, так и в стадии реконвалесценции, проводили в культуре крови того же ребенка перед выпиской. Инкубацию осуществляли в течение 3 дней с дальнейшим морфологическим подсчетом числа бластных форм в пробах (Новиков

Д.К.,1996). Рассчитывали индекс иммуномодуляции - отношение числа бластов при добавлении ВМФ или НМФ в культуру клеток крови к числу бластов в контрольной пробе. При его увеличении свыше 1,1 результат оценивали как стимулирующий, при снижении меньше 0,9 - как ингибирующий пролифера-тивную активность лимфоцитов.

Исследование воздействия фракций ликвора на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) лимфоцитов крови проведено совместно с руководителем биохимической лаборатории НИИ детских инфекций д.б.н. Л.В. Говоровой. Исследование проводили на взвеси лимфоцитов крови, отобранных в стадии реконвалесценции у больных БМ детей, фракции ликвора которых тестировали. Лимфоциты выделяли из 3,0 мл гепаринизированной крови по методу Mendes et al. (1974) на градиенте фиколл-верографин (1,076 г/см ) с последующей четырехкратной промывкой 0,75 % NaCl. После инкубации взвеси лимфоцитов с добавленными фракциями ликвора или фосфатным буфером (контрольная проба) проводили экстракцию липидов 20-кратным объемом хлороформ-метаяоловой смеси 2:1 при пролревании при 55°С в течении 15 мин. с последующей фильтрацией и очисткой от нелипидных примесей по методу Folch et al. (1957). Концентрацию диеновых конъюгатов и диенкетонов в ли-пидном экстракте измеряли про методу Plazer (1968). Для определения концентрации диеновых конъюгатов (ДК) измеряли оптическую плотность экстракта при длине волны 233 нм (на СФ-16 или СФ-46), а для измерения уровня диенкетонов (К) - при длине волны 270 нм. Концентрацию общих ненасыщенных липидов (ОЛ) исследовали сульфофосфорнованилиновым методом в модификации Н.П.Тарановой и Л.В.Говоровой (1985), используя упаривание досуха липидного экстракта, с последующим гидролизом в минимальном объеме концентрированной серной кислоты (0,2 мл). Фотометрировали с использованием микрофотоколориметра МКМФ-1 с рабочим объемом кюветы 1,0 мл и толщиной слоя 1,0 см. Для оценки воздействия фракций ликвора на ПОЛ лимфоцитов рассчитывали соотношение показателей оптической плотности общих липидов, диеновых конъюгатов и диенкетонов опытной пробы к контрольной. В качестве ведущего показателя использованы относительные величины ДК, отражающих начальные стадии активации ПОЛ. При соотношении ДК опыта / ДК контроля, превышающем 1,1, эффект фракций ликвора оценивали как активирующий ПОЛ лимфоцитов крови, при соотношении меньше 0,9 - как ингибирующий.

Исследование способности лейкоцитов к выработке интерферона (ИНФ) при воздействии фракций ЦСЖ проведено в культуре клеток крови совместно с сотрудниками вирусологической лаборатории НИИ детских инфекций (руководитель лаборатории д.м.н., профессор ОААксенов.). Содержание ИНФ во фракциях ликвора и в надосадках 72-часовых культур с добавлением фитоге-магглютинина и без него определяли разновидностью классического метода задержки цитопатогенного эффекта тест-вируса в тканевых культурах при предварительном праймировании культуры образцами ликвора (Аксенов O.A., 1988). В качестве контрольных использовали надосадки 72-часовых культур

крови без добавления фракций ликвора. Воздействие фракций на ИНФ-продуцирующую способность лейкоцитов крови рассчитывали по разности показателей между опытной и контрольной пробами.

Экспериментальное исследование биологической активности фракций ЦСЖ in vivo проведено на модели пневмококкового менингоэнцефалита (ПМЭ) у 100 кроликов при включении в терапию цельного ликвора и его высоко- и низкомолекулярной фракций (совместно с сотрудниками отделения нейроин-фекций, бактериологической, вирусологической, иммунологической и паго-морфологической лабораторий НИИ детских инфекций). ПМЭ воспроизводился путем инхрацистернального введения взвеси пневмококка 1 серотипа (10s КОЕ/мл) животным обоего пола массой 1,5-2,0 кг. Введение взвеси пневмококка и извлечение биологических жидкостей проводили при обезболивании 0,5 %-м раствором тиопентала натрия с 20 %-м оксибутиратом натрия.

Исследованы биохимические, иммунологические, бактериологические, вирусологические и морфологические показатели у кроликов до заражения и в период развития ПМЭ при традиционном лечении путем применения антибиотиков и в сочетании с ликворотрансфузией. Исследованы качественный и количественный клеточный и белковый состав крови и ликвора, содержание ИНФ и его тип, определена функциональнаяакгивность лимфоцитов крови в реакции бласпрансформации (БТЛ) и антителозависимой цитотоксичности (АТЦЛ). В крови и ликворе 20 кроликов, предварительно (за 6 нед до заражения пневмококком) иммунизированных апатогенным штаммом вируса болезни Ньюкасла (ВБН), определяли титр антител к этому вирусу. Патоморфологические исследования включали оценку секционного материала оболочек и ткани мозга кроликов с окрашиванием гистологических срезов по Ван-Гизону и Нисслю. Исследование белкового состава крови и ликвора проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле в собственной модификации. Осуществляли подсчёт процентного содержания белковых фракций после денситометр™ окрашенных амидо чёрным 10В электрофореграмм на денситометре ДМ-1 в режиме интегрирования у 27 кроликов до и после интрацистернальной ликворотрансфузии.

Статистическая обработка данных клинических и экспериментальных исследований проводилась на персональном компьютере IBM «Pentium 1», параметрическими методами описательной статистики на основании критериев Стьюдента с учетом характера изучаемых явлений, используя стандартный пакет прикладных программ Excel 97 фирмы «Microsoft». Различия сравниваемых лабораторных показателей считали достоверными при р < 0,05. При проведении корреляционного анализа связь оценивали как сильную при абсолютном значении г > 0,7, среднюю - при г = 0,69-0,3, слабую - при г < 0,2. Используемый математический аппарат также позволяет определять достоверность коэффициента корреляции.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Молекулярно-массовое распределение компонентов ЦСЖ при исследовании методом гельфильтрации на сефадексе. Исследование распределения компонентов ЦСЖ по молекулярной массе с использованием аналитического метода гель-фильтрации на сефадексе &-25 показало многокомпонент-ность и значительную вариабельность состава ЦСЖ при БМ у детей. В норме лйквор разделялся на 2 основных достаточно симметричных пика веществ с постоянными объемами элюции и максимумами оптической плотности. В острой стадии БМ в 30 % случаев отмечали появление дополнительных, промежуточных фракций, коррелирующих с осложненным течением заболевания - развитием инфекционно-токсического шока (ИЛИ), либо отека головного мозга (ОГМ). В 60 % случаях фиксировали сдвиг максимума пика НМФ в сторону более высокомолекулярных соединений. Количественный подсчет показал увеличение в 2-3 раза по сравнению с контролем, содержания ВМФ и НМФ в остром периоде БМ (0,60±0,16) и (0,52 ±0,04) г/л для ВМФ и НМФ соответственно с постепенным исчезновением промежуточных компонентов и нормализацией состава ликвора в стадии реконвалесценции.

Информативность оценки содержания двух основных фракций ликвора в динамике нейроинфекционного процесса послужила основанием для разработки экспресс-метода фракционирования ликвора гель-фильтрацией на сефадексе 0-50, с использованием колонок небольшого размера, позволившего оценивать абсолютное содержание ВМФ и НМФ в течение 1,5-2 ч. Благодаря разработанному методу выявлено, что содержание белкового и пептидного пулов ликвора различалось в зависимости от нозологической формы, этиологии, тяжести поражения мозга, ведущего патогенетического синдрома и прогноза заболевания. Максимальное увеличение абсолютного содержания белкового и пептидного пулов ликвора наблюдалось в остром периоде БМ, особенно пневмококковой и гемофильной этиологии (табл.2). В стадии реконвалесценции происходила постепенная нормализация белково-пептидного состава ЦСЖ, однако сроки нормализации значительно варьировали и были минимальными при менингококковом менингите (к 10-14-му дню от начала заболевания), максимальными - при пневмококковом (к 20-30-му дню).

Достоверные коэффициенты линейной корреляции между основными клинико-невролошческими симптомами (интоксикацией, выраженностью внутричерепной гипертензии, менингеальной и очаговой симптоматикой) и содержанием фракций ликвора колебались в пределах от 0,41 до 0,81 (анализ проведен совместно с д.м.н. проф. МЛ.Сорокиной, д.м.н. Н.В.Скрипченко, к.м.н В.В. Карасевым). Установлена прямая зависимость между степенью тяжести гнойного менингита и содержанием фракций ЦСЖ, максимальные значения которых имели место при крайне тяжелых состояниях с выраженным отеком головного мозга и угрозой витальных функций (табл.3). Обнаружены также различия в содержании ВМФ, НМФ в зависимости от ведущего синдрома, определяющего тяжесть состояния. Так, при БМ, осложненных ИТШ, в ЦСЖ превали-

Таблица 2

Содержание высоко- и низкомолекулярной фракций цереброспинальной жидкости при бактериальных менингитах разной этиологии в зависимости от периода заболевания

Этиология бактериальных менингитов Содержание ВМФ (г/л) Содержание НМФ (г/л) Соотношение ВМФ/НМФ

Острый период

Менингококковый 0,77 ±0,101 0,60 + 0,06 х 1,31 ±0,11

Гемофильный 0,85 ± 0,09 х 0,80 ± 0,08 х 1,09 ±0,09

Пневмококковый 1,37 ± 0^9 * 1,03 ±0,16" 1,51 ±0,34

Неясной этиологии 0,72 ±0,11х 0,46 ± 0,06 * 1,60 ±0,24

Период реконваяесценции

Менингококковый 0,29 ±0,05 0,23 ± 0,02 1,28 ±0,14

Гемофильный 0,28 ±0,03 0,29 ±0,03 0,99 ±0,09

Пневмококковый 0,30 ±0,08 0,30 ±0,04 0,98 ±0,35

Неясной этиологии 0,29 ±0,07 0,27 + 0,02 1,01 ±0,29

Контроль 0,21 ±0,02- 0,22 ±0,01 0,90 ±0,08

х - различия достоверны по сравнению с контролем (р < 0,05).

Таблица 3

Содержание высоко- и низкомолекулярных фракций ЦСЖ при бактериальном менингите различной степени тяжести, в том числе протекающих с ИТШ и ОГМ

Группы больных БМ разной степени тяжести Содержание фракций ЦСЖ г/л(М±ш)

ВМФ НМФ

1-я - среднетяжелая 0,39±0,02* 0,28±0,03х

2-я-тяжёлая 0,8110,09 х" 0,7910,06""

3-я - крайне тяжёлая 1,66^,16™ 1,0110,11х"

4-я-ИТШ 0,53 ±0,06 0,6110,04

5-я-ОГМ 1,58±0,10 0,80 ± 0,12

Контроль 0,21±0,02 0,22±0,01

Р 1-2 <0.05 <0,05

Р2-3 <0,05 <0,05

Р4-5 <0,001 <0,05

Р 1-2 и Р 2-3, Р 4-5 - уровень достоверности различий между группами, х, хх, ххх - различия достоверны по сравнению с контролем (р < 0,05, р< 0.01, р <0.001 соответственно).

ровало увеличение НМФ. Напротив, при выраженном воспалительном процессе и отеке головного мозга многократно возрастало содержание ВМФ с одновременным увеличением белково-пептидного соотношения (табл.3).

Проведенные исследования позволили определить патобиохимические критерии прогноза течения и исходов БМ. Содержание в остром периоде заболевания высоко- и низкомолекулярных компонентов в диапазоне 0,3-0,5 г/л коррелировало со среднетяжелым течением БМ и полным выздоровлением, в диапазоне 0,51-1,0 г/л - с тяжелым, с нестойкими неврологическими нарушениями. При увеличении высоко- или низкомолекулярной фракции выше 1,1 г/л БМ протекал в крайне тяжелой форме с грубым неврологическим дефицитом. Содержание каждого пула в диапазоне 0,18-0,25 г/л являлось нормальным.

При фракционировании экспресс-методом ЦСЖ больных вирусными энцефалитами и серозными менингитами с анализом содержания белкового и пептидного пулов не выявлено значительных отклонений от контрольных показателей, однако обнаружено достоверное увеличение фракций при герпетических и ветряночных энцефалитах, что свидетельствует о значимой роли этиологического фактора в изменении состава ЦСЖ (табл. 4). У 70 % больных вкусными энцефалитами детей отмечено более высокое значение НМФ по сравнению с ВМФ.

Таблица 4

Содержание высоко- и низкомолекулярных фракций ЦСЖ при острых вирусных нейроинфекциях у детей

Нозологическая форма и этиология п Средние значения содержал ликвора (М±ш' ия фракций

ВМФ, г/л НМФ, г/л ВМФ/НМФ

Вся группа больных 86 0,25 ±0,01 %,30 ± 0,02 0,91 ± 0,04

Менингиты 11 0,25 ± 0,02 0,26 ± 0,04 1,25 ±0,12

Энцефалиты:

герпетические 22 0,32 ± 0,05х 0,39 ± 0,05 х 0,81 ±0,05

ветряночные 15 0,31 ± 0,04 х 0,30 ± 0,04 1,00 ± 0,12

клещевые 19 0,19 ±0,01 0,25 ± 0,03 0,86 ±0,11

неясной этиологии 18 0,20 ±0,02 0,24 ±0,03 0,70 ± 0,07

ОРВИ с нейроток-сикозом 10 0,15 ±0,02 0,23 ±0,03 0,61+0,08

Группа сравнения 20 0,21 ± 0,02 0,22 ± 0,01 0,90 ± 0,08

х - достоверно отличается от группы сравнения (р < 0,05).

В ходе клинико-биохимических сопоставлений выявлена зависимость изменений белково-пептидного состава ЦСЖ от тяжести течения и исходов вирусного нейроинфекционного процесса. Минимальные изменения обнаружены при серозных менингитах, что коррелировало с благоприятным течением

заболевания и полным выздоровлением детей. У больных ОРВИ, протекающей с нейротоксикозом, достоверно по сравнению с контролем и вирусными менингитами снижено содержание ВМФ, что может быть использовано в качестве дополнительного дифференциально-диагностического критерия серозного воспаления оболочек мозга.

При анализе белково-пептидного состава ЦСЖ у больных с инфекционными заболеваниями периферической нервной системы установлены различия в изменении состава ЦСЖ в зависимости от клинической формы заболевания (табл.5).Так, при ДПНП снижение содержания белкового пула (у 40 % больных) и увеличение пептидного (у 30 % пациентов) приводили к уменьшению белково-пептидного соотношения у половины больных. Вероятно, выраженная интоксикация при ДПНП сопровождается увеличением токсических низкомолекулярных компонентов в сыворотке крови и их проникновением в ЦСЖ, тогда как блокирование дифтерийным токсином белкового синтеза приводит к снижению пула белковых молекул.

Таблица 5

Содержание высоко- и низкомолекулярных фракций ЦСЖ при инфекционных заболеваниях периферической нервной системы у детей

Группы больных п Средние значения содержания фракций(М±ш)

ВМФ, г/л НМФ, г/л ВМФ/НМФ

ДПНП 10 0,18±0,03 0,25±0,02 0,78±0,014

ПРН 9 0,25±0,07 0,23±0,08 1,21±0,2

Вялые парезы 3 <Г,07±0,008Х 0,25±0,11 0,34±0,17х

КЭ 4 0,23±0,05 0,18±0,01 1.32±0,32

КБ 5 0,34±0,11 0,35±0,08 1,01±0,46

Контроль 20 0Д1±0,02 0Д2±0,01 0,90 ±0,08

х - достоверно отличается от группы сравнения (р < 0,05).

При ПРН, напротив, чаще наблюдали увеличение белково-пептидного баланса, в основном за счёт снижения НМФ (у 37,5 % больных), связанного, вероятно, с угнетением синтеза регуляторных олигопептидов, и возрастания ВМФ (в 37,7% случаев), обусловленного воспалительными невральными процессами и повышением проницаемости гематонервного и гематоэнцефаличе-ского барьеров. При вялых парезах, полиомиелите у всех больных обнаружено снижение белкового пула, приводящее к уменьшению соотношения фракций. Вероятно, это происходит за счет усиленной ликвороциркуляции и недостаточного поступления белков в ЦСЖ.

Сопоставление патобиохимических изменений с клиническими особенностями инфекционных заболеваний ПНС также выявило достоверные корреляционные зависимости. Так, при ДПНП обнаружена прямая зависимость между содержанием белкового и пептидного пулов и выраженностью бульбарной, краниальной, вегетативной симптоматики, двигательных расстройств, продолжительностью пребывания больных в стационаре (коэффициенты линейной

корреляции равны 0,5-0,7). Тогда как при ПРН установлен отрицательный коэффициент линейной корреляции между содержанием ВМФ, НМФ и выраженностью двигательных нарушений, вегетативной симптоматикой, чувствительными расстройствами (г = - 0,3-0,6). Количество койко-дней прямо коррелировало с белково-пептидным сотношением (г = 0,5), свидетельствуя о важной роли баланса белков и пептидов в ликворе. Проведенные исследования доказывают, что при инфекционных заболеваниях ПНС имеются различные отклонения в белково-пептидном составе ЦСЖ, что предполагает системный процесс с заинтересованностью ЦНС, особенно высших центров, осуществляющих общий гомеостаз в организме.

Таким образом, исследование содержания белкового и пептидного пулов ликвора при нейроинфекциях у детей информативно для объективной оценки тяжести заболевания, прогнозирования характера его течения и исхода, уточнения ведущего патогенетического механизма, контроля за проводимой терапией.

Качественный и количественный состав высокомолекулярной (белковой) и низкомолекулярной (пептидной) фракций ЦСЖ при инфекционных заболеваниях нервной системы у детей. При анализе белкового спектра ЦСЖ при острых бактериальных и вирусных инфекциях центральной и периферической нервной системы у детей выявлены качественные и количественные отличия от белкового спектра контрольной ipynnbt (табл. 6). Его основными белками в «норме» являлись альбумин, преальбумин и трансферрин. В зоне медленных посттрансферринов белки были сосредоточены в области, прилегающей к IV зоне, в виде диффузной полосы, идентифицированной как иммуноглобулин G, в катодной части зоны белки отсутствовали. В макрогло-булиновой зоне фиксировали только фракцию «8» - альфа-2-макроглобулин.

Минимальные отличия обнаружены при вирусных менингитах и поли-нейропатиях (ПНП), максимальные - при бактериальных менингитах и вирусных менингоэнцефалитах, особенно в случае их осложненного течения. При вирусном менингите в составе белковых зон не выявлено качественных отличий от контрольной группы. Однако количественный подсчет показал незначительное снижение относительного содержания преальбумина и увеличение абсолютного содержания альбумина, преальбумина, фракций «2», «3», «4» и «5» по сравнению с контролем (табл. 6). Выявлено более значительное увеличение белков постальбуминовой зоны в случае тяжелого течения вирусного менингита.

Характерным для БМ являлось появление в протеинограммах ликвора дополнительных белковых фракций в зоне медленных посттрансферринов (гаптоглобины типа 2-1) и макроглобулиновой зоне ( гаптоглобины типа 2-2, бета-липопротеид - фракции «8а» и «9»), снижение относительного содержания преальбумина, увеличение альфа-2-макроглобулина и острофазных белков постальбуминовой зоны. С целью оценки связи белкового спектра ЦСЖ с клиническими особенностями проанализированы его изменения при среднетяжелом, тяжелом, а также осложненном ИТШ или ОГМ течении БМ (табл. 7).

Таблица б

Содержание белковых фракций ЦСЖ в остром периоде бактериальных и вирусных менингитов, полинейропатий и у детей контрольной группы

Наименование Относительное, % (а) и абсолютное, х М"4 г/л (б) содержа-

белковых зон и ние белковых фракций ликвора (М± т)

фракций а; БМ ВМ ПНП контроль

б (п = 88) (п = 17) (п= 18) (п = 37)

I - альбуминовая зова

«1а»- а 5^5±0Д7ХЗК 6,7210,48® 8,1710,52 8,8 ±0,26

преальбумин б 4,45±0,46 ш 2,01±0,2Г 1,3810,15 1,24±0,10

«1 »-альбумин а 36,55±0,82 ™ 41,2211,83 37,0511,5 40,611,04

б 40,27±5,48 ххх 11,3511,53х51 7,0111,45 6Д1Ю,51

П - постальбуминовая зона

«2» а 7,79±0,16хх 6,2±0,39 6,5810,48 5,85 ±0,2

б 9,0311,25 х" 1,8710,33х 1,4210,32х 0,78Ю,10

«3» а 3,1740,16"* 5,4410,28 5,0810,19 4,89Ю,21

б 2,89±0,35 ххх 1,6±0,26хх 0,9710,14 0,8±0,06

«4» а 4,76±0,18 ххх 3,91Ю,55 4,6310,57х 3,68 ±0,16

б 5,44±0,73 ххх 1,39±0,36х 0,9710,2х 0,51±0,06

Ш-трансфер- а 10,46+0,19 9,58±0,41 11,4810,73 10,34±0,26

риновая зона б 11,48±1,51 ш 2,74±0,46х 2,3310,47х 1,44±0,15

(«5»)

IV - зона бы- а 5,19±0,18 * 5^110,4 5,8810,45 5,97±0,28

стрых пост- б 5,95±0,87И£Х 1,1610,22 1Д±0,26 0,85±0,10

трансферринов

(«6»)

V- зона мед- а 20,31+0,57 17,511,16 18,011,01 17,1610,88

ленных пост - б 25,66±4,19 4,0810,77 3,610,65 2,64±0,28

трансферринов

(«7»)

VI - макроглобулиновая зона

«8»-альфа-2- а 3,45±0,13 "" 1,910,22 2,2110,20 2,4±0,15

макроглобулин б 4,64±0,79 ххх 0,6310,13 0,4110,06 0,36±0,04

х, хх, ххх - отличия от контроля достоверны; х- р<0,05; хх-р <0,01; ххх-р< 0,001.

Таблица 7

Содержание белковых фракций ЦСЖ детей при бактериальных менингитах различной степени тяжести, осложненных инфекционно-токсическим шоком и 1 ' отеком головного мозга

Наименование белковых зон и фракций Относительное (а) и абсолютное, х 10"2 г/л (б) содержание белковых фракций ЦСЖ в остром периоде БМ (М ± т)

а; б среднетя-жёлое течение (л = 5) тяжелое течение (п = 36) осложненное ИТШ (п=26) осложненное ОГМ (п = 48)

I - альбуминовая зона

«1а»-преальбу-мин а 8,37±1,06 4,95±0,34х 7,3110,6 3,7910,19°

б 1,66±0,43 3,32±0,54х 3,2110,55 6,4510,91°

«1»-альбумин а 34,05±1,79 33,98±1,37 35,7311,6 36,5111,17

б 7,5512,51 25,39±4,25* 25,6616,89 69,07110,3

II - постальбуминовая зона

«¿2» а 8,5510,76 7,91±0,31 7,4110,33 7,8110,26

б 1,81Ю,52 19,47±0,75х 5,711,77 15,1612,33°

«3» а 542±0,42 3,2110,28х 3,6810,26 3,2310,25

б 1,0810,27 7,910,69х 2,8210,94 5,0210,65

«4» а 4,3810,51 4,99±0,32 4,4710,25 4,7310,27

б 0,8610,24 12,2910,78х 3,2710,96 9,5511,85°

Ш — трансферри-новая зона, «5» а 9,9610,32 10,3210,33 11,110,37 10,6010,34

б 1,59Ю,4 25,39Ю,82Х 8,012,24 18,5112,46°

IV- зона быстрых поспрансферри-нов, «б» а 5,69±0,63 6,0810,3 4,9910,42 5(42Ю,29

б 1,13±0,29 14,9бЮ,74х 4,2411,51 10,0911,74

V - зона медленных пост-трансферринов, «7» а 18,1411,31 20,6910,81 20,0611,36 20,7410,76

б 3,6311,08 50,8912,0х 16,5415,82 39,7616,55°

VI - макроглобулиновал зона

«8» -альфа-2- МГ а 3,11Ю,28 3,4610,15 3,7910,44 3,8710,21

б 0,68±0,24 8,510,36х 4,1611,97 8,2311,44°

«8а» + «9» а 2,81±0,32 2,5810,92 2,84Ю,33 4,09Ю,41°

б 0,62±0,19 9,7011,93х 1,9310,99 7.6411,5°

х - различия достоверны между среднетяжелой и тяжелой формами БМ; (р < 0,05);

о - различия достоверны между БМ, осложненным ИТШ или ОГМ (р < 0,05).

Установлено, что чем тяжелее течение БМ, тем более значительны изменения белкового спектра: возрастают диспротеинемические сдвиги, нарастает

абсолютное содержание белковых фракций. При БМ, осложненном ОГМ, наблюдалось резкое увеличение содержания высокомолекулярных белков зоны медленных посттрансферринов и макроглобулиновой, что свидетельствует о значительном увеличении проницаемости ГЭБ, вероятной потере его селективности, сопровождающейся поступлением в ликвор высокомолекулярных продуктов метаболизма и распада мозговой паренхимы, белков сыворотки крови, тогда как при ИТШ эти изменения были достоверно меньше. Представленные данные позволяют использовать белковый спектр ликвора для объективизации тяжести течения БМ и уточнения ведущего патогенетического механизма.

Благодаря исследованию состава НМФ ликвора у больных инфекционными заболеваниями нервной системы установлено, что хроматографическая картина отличалась значительным качественным и количественным разнообразием (рис.1). Число пиков в отдельных хроматограммах колебалось от 8 до 30, а высота пиков - от 0,02 до 6,0 усл.ед. оптической плотности (у.е.). Визуальная оценка хроматограмм НМФ ликвора позволила выделить 3 основные зоны, претерпевающие различные изменения при вирусных и бактериальных нейро-инфекциях у детей: зона 1-я, включала гидрофильные вещества, фиксируемые до выхода кофеина, с Т ото. от 0,5 до 1,05 ед.; зона 2-я - промежуточная, содержала вещества с Т отн. от 1,05 до 2,05; зона 3-я - гидрофобные вещества с Т отн. больше 2,05. При БМ в остром периоде выделено 32 класса, в стадии реконвалесценции - 20, при вирусных нейроинфекциях - 26 (табл.8 и 9).

В остром периоде БМ максимальное (41,1 %) количество пиков оказалось сосредоточено в зоне гидрофильных веществ, 37,7 % - в промежуточной зоне, в 3 зоне - лишь 21,1 %. При менингококковом менингите (ММ) число пиков было выше, чем при менингитах другой этиологии, объединенных в единую группу. Из сопоставления относительных частот встречаемости пиков (табл.8) следует, что для ММ характерно появление в хроматографическом профиле пиков №№ 4,8 в 1-й зоне, всех пиков во 2-й зоне и 6 пиков в 3-й зоне ( №№ 26-29,31,32), частота встречаемости которых в 2-3 раза превышала таковую при менингитах другой этиологии. Т отн. большинства пиков в остром периоде БМ и в стадии реконвалесценции не имела достоверных различий. В ходе проведенного анализа выявлены маркеры тяжести бактериального нейроин-фекционного процесса. При бактериальных менингитах, осложненных ИТШ, выраженной внутричерепной гипертензией и отеком головного мозга, в 1-й зоне чаще присутствовал пик № 6, во 2-й зоне - пики №№ 13,14,16,17,19, в 3-й зоне - пик №26 (табл.8). В то же время при неосложненном течении БМ фиксировали преимущественно гидрофильные пики (№№ 2,5,8 и 9 в 1-й зоне), а также №15 - во 2-й. Кроме различия в частоте встречаемости пиков, при осложненном течении обнаружено увеличение высоты большинства пиков, что приводило к возрастанию их суммарной высоты в выделенных зонах. Средние значения 1-й, 2-й и 3-й зон составили при осложненном течении 0,117±0,010; 0,058±0,012 и 0,079+ 0,026 у.е., тогда как при неосложненном - 0,081±0,010, 0,052±0,008 и 0,035±0,004 у.е. соответственно.

Рис. 1. Хроматографический профиль низкомолекулярной фракции ЦСЖ при бактериальных и вирусных нейроинфекциях у детей.

Бактериальные менингиты у детей:

а - менингококковый менингит, среднетяжелое течение,

б - мениигококковый менингит, осложненный ИТШ,

в - гемофильный менингит, осложненный отеком головного мозга

г-1 Д-1

е - тяжелые неврологические последствия вирусной нейроинфекции По оси абсцисс - номера пиков, по оси ординат - оптическая плотность I - 1-я хроматографическая зона, П - 2-я, Ш - 3-я.

Таблица 8

Частота встречаемости пиков низкомолекулярной фракции ЦСЖ у детей при бактериальных менингитах различной этиологии и тяжести течения

Частота встречаемости пиков *в остром периоде БМ, %

№ пика Тотн. Вся группа Менинго- Иная эти- Ослож- Неосло-

(М±ш) больных кокковый ология ненное жненное

менингит БМ течение течение

1-я зона — гидрофильные пептиды

1 0,59410,003 50,0 16,7 87,5 33,3 57,1

2 0,664*0,002 64,29 66,7 62,5 50 87,5

3 0,69710,003 28,57 16,7 37,5 16,7 28,6

4 0,740Ю,005 35,71 50 25,0 50 57,1

5 0,788Ю,003 71,43 83,3 62,5 50 87,5

6 0,81910,002 57,14 6,7 50,0 66,7 42,85

7 0,86110,005 35,71 16,7 50,0 33,3 42,85

8 0,90010.003 35,71 50 25,0 16,6 42,85

9 0,92210,002 64,29 66,7 62,5 16,6 87,5

10 0,94210,001 71,43 83,3 62,5 83,3 100

11 1,03110,002 57,14 .66,7 50,0 83,3 71,43

2-я зона—промежуточная

12 1,10710,006 64,29 83,3 50,0 66,7 57,1

13 1,17210,005 35,71 50 25,0 66,7 42,8

14 1Д2910,002 42,86 66,7 25,0 66,7 42,8

15 1,30110,008 21,43 50 0 16,6 42,8

16 1,34310,005 42,86 66,7 25,0 66,7 28,6

17 1,42210,004 50 66,7 37,5 50 28,6

18 1,45610,007 42,86 66,7 25,0 50 42,8

19 1,56810,005 64,29 83,3 50,0 100 71,43

20 1,67610,005 57,14 83,3 37,5 50 57,1

21 1,73310,007 21,43 50 0 16,6 28,6

22 1,82010,009 35,71 66,7 12,5 33,2 42,8

23 1,90310,02 14,28 33,3 0 16,6 14,3

24 2,00110,005 42,86 66,7 25 50 42,8

3-я зона- гидрофобные пептиды

25 2.06410,01 28,57 16,7 37,5 33,3 28,6

26 2,17210,02 21,43 50 0 33,3 0

27 2,34410,007 50,0 83,3 25,0 50 42,8

28 2,42810,02 21,43 33,3 12,5 33,3 28,6

29 2,58810,01 57,14 83,3 37,5 33,3 57,1

30 2,66610,005 21,43 16,7 25,0 33,3 42,8

31 2,74210,007 21,43 33,3 12,5 33,3 14,3

32 2.830Ю.01 35,71 50 25,0 33,3 28,6

* - рассчитана как отношение числа больных с наличием данного пика в хроматогра-фическом профиле к общему числу больных данной труппы.

На основании проведенного анализа можно полагать, что маркерами осложненного течения БМ являются пики №№ 13,14,16,26. Вероятно, низкомолекулярные компонента, характерные для неосложненного течения БМ, не оказывают существенного повреждающего действия на паренхиму мозга и, возможно, обладают протективным действием, тогда как фиксируемые чаще и в более высоких концентрациях при осложненном течении оказывают повреждающее действие.

Исследование динамики хроматографических профилей показало, что при благоприятном течении болезни в стадии реконвалесценции число и оптическая плотность пиков незначительны и хроматограмма ликвора практически «пуста». Суммарная высота пиков для трех основных хроматографических зон в этот период составила (0,05±0,01); (0,02+0,00) и (0,05±0,01) у.е. для 1-й, 2-й и 3-й зон соответственно. При затяжном, осложненном течении к стадии реконвалесценции сохранялись отдельные пики во всех областях хроматограммы, свидетельствуя, вероятно, о продолжающемся воспалительном или деструктивном процессе мозговой паренхимы, несмотря на клиническое выздоровление. Значительные изменения пептидного спектра ликвора при тяжелой форме БМ предполагают глубокие нарушения метаболизма и повреждение ткани мозга, приводящие к появлению в хроматографическом спектре более гидрофобных пептидов.

При вирусных нейроинфекциях качественный и количественный состав НМФ ликвора также значительно варьировал в зависимости от тяжести поражения мозга. Большинство пиков у больных этой группы находилось в 1-й и 3-й зонах (39,6 % и 39,0 % соответственно), тогда как во 2-й зоне - только 21,4 %. Максимально часто встречались пики №№ 5,8,9 - в 1-й зоне (гидрофильные петнды), №№ 12,15 - во 2-й, №№ 16, 18,19,20,22,24 - в 3-й (гидрофобные пептиды) (табл.9). Причем при вирусных менингитах чаще (в среднем 60-100 % случает) встречались пики №№ 2,5,8,9 в 1-й зоне, №№ 15 - во 2-й, №№ 18,19,22 - в 3-ей, при энцефалитах - пики № № 5,9 в 1-й зоне, пик № 14-во 2-й, пики №№ 16,18,19,22 - в 3-й. Установлено, что некоторые пики характерны, преимущественно, для менингитов (пики №№ 2,3,8,11,15), другие - для энцефалитов (пики №№ 4,7,10,14,16,21,23-26). Следует отметить, что хромато-графический профиль у больных с тяжелыми неврологическими последствиями вирусных нейроинфекций характеризовался наличием пиков №№ 4,5,8,9,12, причем у больных этой группы высота некоторых пиков достигала 4-6 ед. оптической плотности, указывая на значительные изменения метаболизма нервной ткани, деструктивные поражения мозговой паренхимы с выходом патологических продуктов метаболизма в ЦСЖ.

Проведенный анализ свидетельствует о том, что острые вирусные и бактериальные нейроинфекции у детей сопровождаются значительными изменениями качественного и количественного состава низкомолекулярной фракции ликвора в зависимости от этиопагогенетических особенностей течения заболевания.

Таблица 9

Частота встречаемости пиков низкомолекулярной фракции ЦСЖ при вирусных

нейроинфекциях у детей

№ пика Т отн. (М±т) Частота встречаемости пиков, %

Вся группа Менишиты Энцефалиты Последствия нейроинфекций

1-я зона - гидрофильные пептиды

1 0,47610,009 23,08 20 20 33,3

2 0,585±0,007 38,46 60 20 33,3

3 0,640±0,004 30,77 40 20 33,3

4 0,692±0,004 38,46 0 40 100

5 0,76410,004 92,31 80 100 100

6 0,81910,011 23,08 20 20 33,3

7 0,89710,006 23,08 20 40 0

8 0,93010,002 76,92 100 40 100

9 0,96010,001 76,92 80 60 100

2-я зона - промежуточная

10 1,16910,004 23,08 0 40 33,3

И 1,40410,021 15,38 20 0 33,3

12 1,525Ю,009 38,46 20 20 100

13 1,742Ю,021 7,69 0 0 33,3

14 1,92610,017 30,77 20 60 0

15 1,99610,004 61,54 80 40 66,66

3-я зона-гид рофобные пегггиды

16 2,03610,005 61,54 40 80 66,66

17 2,19710,013 23,08 20 20 33,33

18 2,27010,006 76,92 80 100 33,33

19 2,47110,015 53,85 80 60 0

20 2,52610,003 92,31 20 0 66,66

21 2,58810,003 30,77 20 40 33,33

22 2,64310,009 69,23 80 60 66,66

23 2,745+0,006 30,77 20 40 33,33

24 2,80010,005 38,46 20 40 66,66

25 2,83210,005 23,08 20 40 0

26 2,94010,018 23,08 20 40 0

* - рассчитана как отношение числа больных с наличием данного пика в хроматснра-фическом профиле к общему числу больных данной группы.

Хроматографический профиль ЦСЖ отражает основные патогенетические аспекты острых нейроинфекций - нарушение метаболизма нервной ткани, ликворологические изменения, увеличение проницаемости гемагоэнцефаличе-

ского барьера. Выявленные различия хроматографического профиля НМФ лик-вора при неосложненном и осложненном течении яейроинфекционного заболевания указывают на возможное повреждающее, защитное или регулирующее действие отдельных пептидов ликвора.

С целью идентификации компонентов НМФ ликвора проведено исследование методом масс-спектрометрии ЭРИАД образцов ЦСЖ, полученных у больных нейроинфекциями. Для исследования были отобраны гель-фильтраты, полученные при фракционировании ликвора на сефадексе С-25 с максимальной оптической плотностью в объёмах элюции, соответствующих выходу низкомолекулярных компонентов. В остром периоде БМ обнаружено до 100 отдельных пиков в диапазоне молекулярных масс от 300 до 2000Д, число которых значительно снижалось в стадии реконвалесценции. Сравнительный анализ масс-спектров позволил выявить во всех исследованных образцах ликвора наличие пиков с молекулярной массой 577, 615, 690 и 765 Д, присутствующих на всех стадиях болезни, что позволяет предположить их специфичность для ЦСЖ и выполнения ликвором своих функций. Сопоставление молекулярных масс регистрируемых в ликворе пиков с молекулярной массой нейропептидов выявило идентичность некоторых из них ангиотензину, брадикинину, глутагаону окисленному и восстановленному, что не исключает их патогенетическую роль в развитии инфекционного интратекального процесса.

На основе сопоставления данных, полученных методом гель-филырациии на сефадексе С-50 йяе, методом диск-электрофореза в ПААГ, с общепринятыми ликворологическими показателями установлено, что при нарастании содержания ВМФ происходят углубление диспротеинемических сдвигов и увеличение абсолютного содержания белковых фракций. При ранжировании данных по величине ВМФ выделено 5 подгрупп с различными диапазонами ВМФ: в 1-й подгруппе содержание ВМФ было ниже условной нормы (< 0,16 г/л), во 2-ой - равно норме (0,16-0,26 г/л), в остальных 3 группах - с различной степенью увеличения по сравнению с нормой (в 3-й подгруппе содержание ВМФ колебалось в пределах 0,30-0,50 г/л, в 4-й-0,51-1,0 г/л, в 5-й - превышало 1,0 г/л). Сопоставление белкового спектра в выделенных подгруппах обнаружило, что при нарастании содержания ВМФ происходит углубление диспротеинемических сдвигов и увеличение абсолютного содержания белковых фракций. Так, от 1-й к 5-й подгруппе уменьшалось относительное содержание ликвороспецифичных фракций («1а», «3» и «6») с одновременным увеличением содержания высокомолекулярных белков (фракции «7», «8», «9»). В 1-й подгруппе, характеризующейся снижением общего пула ВМФ, обнаружено увеличение относительного содержания преальбумина, очевидно связанное с гиперсекрецией ликвора. Степень увеличения абсолютного содержания белковых фракций варьировала: ликвороспецифичные фракции («1а», «3») увеличивались незначительно (приблизительно в 2 раза от 2-й к 5-й подгруппе), тогда как фракции, имеющие преимущественно сывороточное происхождение (альбумин, фракции «2», «4», «7», «8», «9»), возрастали многократно (от 6 до 10 раз). Подобное нарастание патобиохимических изменений при увеличении

содержания ВМФ свидетельствует об увеличении проницаемости барьера кровь-ликвор, обусловленном воспалением оболочек и ткани мозга Представленные данные отражают взаимосвязь основных характеристик состава ликвора (уровня белкового, пептидного пула и их соотношения) с выраженностью изменений белкового спектра ликвора и основными ликворологическими показателями, что позволяет уже при проведении 1-го этапа исследований (геяь-филырации на сефадексе) предположить степень нарушения проницаемости ГЭБ, а следовательно выраженность воспалительных процессов в мозговых оболочках и ткани мозга. Анализ частоты встречаемости пейроинфекционных заболеваний в выделенных подгруппах подтвердил эти предположения. Установлено, что при вирусных нейроинфекциях и заболеваниях ПНС у большинства (90 %) обследованных детей содержание фракций ликвора находятся в диапазонах 1-3-й подгрупп, т.е не превышает 0,5 г/л. При этом изменения белкового спектра незначительны. В 10 % случаев у пациентов с крайне-тяжелым течением (менингоэнцефалигы и энцефаломиелоиолирадикулоневриты) содержание ВМФ и белковый спектр ликвора соответствовали показателям 4-й и 5-й подгрупп. При БМ, напротив, у 90 % обследованных детей содержание фракций ликвора находилось в 3-й, 4-й и 5-й подгруппах, причем для пневмококкового менингита, протекающего в тяжёлой форме с ОГМ - в 4-й и 5-й. Следует отметить, что только в единичных случаях при среднетяжелом течении БМ уровень ВМФ соответствовал 1-й и 2-й подгруппам.

Проведенные исследования позволили разработать алгоритм патобиохи-мической оценки ЦСЖ, предполагающий на 1-м этапе ее исследование экспресс-методом гель-фильтрации на сефадексе G-50 fine с определением содержания белкового и пептидного пулов ЦСЖ, что позволяет дифференцировать вирусную или бактериальную природу заболевания, а при диагностике БМ прогнозировать его течение и исход. Однако в сложных для диагностики случаях, когда содержание фракций ЦСЖ находится в диапазоне 0,3-0,5 г/л, необходимо проведение 2-го этапа обследования - исследование белкового спектра ЦСЖ методом диск-элетрофореза в полиакриламидном геле. Наличие в про-теинограммах высокомолекулярных гаптоглобинов типа 2-1 и 2-2, бета-липопротеида, свидетельствующих о выраженном нарушении проницаемости ГЭБ, является значимым отличием бактериального процесса от вирусного. Количественный подсчет относительного и абсолютного содержания белковых фракций также способствует уточнению тяжести течения БМ Максимально высокое увеличение макроглобулярных белков и снижение уровня дреальбу-мина характерны для крайне тяжелого течения БМ. Разработанный алгоритм патобиохимической оценки ЦСЖ позволяет не только оптимизировать диагностический процесс, но и уточнить ведущий патогенетический механизм БМ.

В ходе проведенного исследования белково-пептидного состава ЦСЖ при инфекционных заболеваниях нервной системы установлено 3 варианта ин-тратекального ответа на вирусные или бактериальные возбудители. Первый, патогномоничный для вирусных нейроинфекций и полииейропатий, характеризовался нормальным или сниженным содержанием ВМФ (диапазон до 0,3 т/л) с

незначительным преобладанием пула низкомолекулярных компонентов, не превышающем 0,5 г/л. В белковом спектре ЦСЖ изменения также минимальны и проявляются небольшим увеличением (в среднем до 1,8 -10~2 г/л) содержания преальбумина. В низкомолекулярной фракции в случае вирусного менингита наблюдали пики в гидрофильной области хроматограммы, при вирусном энцефалите - пики в гидрофобной области. Анализ патобиохимическо-го ответа по 1-му варианту позволяет предполагать его формирование при незначительном воспалении оболочек мозга и нормальной проницаемости ГЭБ. Основным патофизиологическим механизмом, направленным на защиту от проникновения вируса в мозг, является гиперсекреция ликвора, сопровождающаяся снижением общего содержания белка и ВМФ, увеличением синтеза, а следовательно, и содержания в ликворе преальбумина и других ликвороспеци-фичных фракций. Не исключено, что основными механизмами, ответственными за изменения в составе ЦСЖ при 1-м варианте иятратекального ответа, являются метаболические и дисциркуляторные расстройства, процессы демиели-низации, компенсаторный синтез регуляторных пептидов.

При 2-м варианте иятратекального ответа, типичном для БМ, отмечалось параллельное увеличение высоко- и низкомолекулярных фракций ликвора (диапазон - от 0,31 до 1,0 г/л) с выраженными изменениями качественного и количественного белкового и пептидного состава ликвора. В НМФ во всех случаях определялось множество пиков в гидрофильной и промежуточной областях хроматографического спектра. Можно предположить, что у больных, патобиохимический ответ которых соответствовал 2-му варианту, основными механизмами патогенеза являются выраженное воспаление оболочек мозга, увеличение проницаемости ГЭБ, нарушение ликворо- и гемоциркуляции, интоксикация, что сопровождается усилением поступления в лшсвор белков и пептидов сыворотки крови, приводящих к изменению качественного и количественного белкового и пептидного состава ЦСЖ.

Третий вариант интратекального ответа был характерен для крайне тяжелых форм бактериальных и вирусных менингоэнцефалитов, осложненных ОГМ и отличался многократным (до 5-7 раз) увеличением белкового и / или пептидного пулов, значительными диспротеинемическими сдвигами - снижением относительного содержания преальбумина (до 2-4 % вместо 8,8 % в контроле) и нарастанием высокомолекулярных белковых фракций (до 28-30 % по сравнению с 19-20 % в «норме»), выраженными изменениями пептидного состава (увеличение высоты пиков во всех областях хроматографического спектра), которые являлись маркерами деструктивных процессов в мозговой паренхиме. Обнаружение 3 варианта интратекального ответа в остром периоде заболевания, длительное отсутствие нормализации белково-пептидного состава ликвора (свыше 3-4 нед) являются прогностическими маркерами развития неврологического дефицита не только в стадии ранней реконвалесценции, но и в отдаленном резидуальном периоде. Можно полагать, что формирование вариантов интратекального ответа является отражением основных механизмов патогенеза вирусных и бактериальных нейроинфекций, а патогенетической основой явля-

ется повреждение мозговой паренхимы, обусловленное воспалительным процессом, отеком головного мозга, нарушениями ликворо- и гемодинамики вплоть до блокады ликворных путей. Эта патофизиологические механизмы сопровождаются значительным увеличением проницаемости ГЭБ с потерей его селективности и проникновением в ликвор макроглобулярных белков сыворотки крови и продуктов метаболизма и деградации мозговой паренхимы в случаях крайне тяжелого течения острого нейроинфекционного процесса.

Экспериментальное изучение биологической активности фракций ЦСЖ при нейроинфекционном процессе. В ходе изучения бактерицидных свойств ВМФ и НМФ на рост клинических штаммов менингококка серогрупп В и С, пневмококка 1-го и 19-го серотипов и гемофильной палочки типа Ь, обнаружено, что фракции ЦСЖ больных БМ в значительной степени подавляют рост менингококка (в среднем на 5 Сд) и почта не ингибируют рост пневмококка и гемофильной палочки.

Сопоставление бактерицидного эффекта фракций при БМ разной этиологии позволило обнаружить, что рост менингококка чаще (в 80—100 % случаев) и с большей интенсивностью ингибировали фракции ЦСЖ при менингококковом менингите (индексы бакгерицидности ВМФ и НМФ в остром периоде и в стадии реконвалесценции составляли в среднем 5-6 тогда как при гелиофильном и пневмококковом менингите ингибирование роста менингококка происходило с меньшей частотой и интенсивностью (в среднем на 3-4 Анализ данных позволил предположить возможность подавления роста возбудителей как высоко-, так и низкомолекулярными компонентами, усиливающими или дополняющими действие друг друга. Бактерицидное действие фракций ЦСЖ при БМ было сопоставимо с результатами группы сравнения, выявившими выраженное бактерицидное действие на штаммы менингококка (в среднем на 67 1§) и незначительное - в отношении ппаммов пневмококка и гемофильной палочки (в среднем на 2,2 и 1,51% соответственно).

Исследование воздействия фракций ликвора на пролиферативную активность лимфоцитов крови в тесте ФГА-РБТЛ выявило полярные эффекты, направленные как на увеличение образования бластов по сравнению с контролем ( индекс иммуномодуляции выше 1,1), так и на его снижение (индекс иммуно-модуляции меньше 0.9). При менингококковом менингите преобладал стимулирующий эффект ВМФ и НМФ (в 65 и 86 % соответственно), при БМ иной этнологии - супрессорный. У 85 % больных высоко- и низкомолекулярные фракции ликвора действовали однонаправленно (либо в сторону супрессии, либо стимуляции), н только у 15 % эффекты были разнонаправленны. Исследование в динамике показало, что у одной группы больных под влиянием фракций ЦСЖ нарастал стимулирующий эффект на ФГА-РБТЛ, у другой - подавляющий (табл.10).

Таблица 10

Особенности пролиферагавной активности лимфоцитов в ФГА-РБТЛ в присутствии фракций ЦСЖ у детей с различной динамикой иммуномодулирую-щего эффекта фракций цереброспинальной жидкости

Фракции ЦСЖ Число (%) бластов в присутствии ЦСЖ острого периода и периода реконвалесценции в группах с различной динамикой иммуномо-дулирующего эффекта фракций (М ± ш)

«1»- нарастание супрессорного эффекта «2» - нарастание стимулирующего эффекта

Острый период Реконвалес-ценция Острый период Реконвалес-ценция

ВМФ 62,5 ±5,8 45,7 ±6,7* 40,5 ±6,4 57,1 ±6,1*

НМФ 55,2 ± 7,3 43,5 ±6,7" 47?4±5?8 61,9 ±5,1'

* - различия достоверны по сравнению с острым периодом (р < 0,05)

При клинико-биохимических сопоставлениях выявлено, что иммуностимулирующий эффект фракций ЦСЖ острого периода БМ в 70 % случаев наблюдался при среднетяжелой форме менингококкового менингита с незначительными признаками интоксикации, внутричерепной гипертензии, без присоединения вторичного очага инфекции и заканчивался в 86 % случаев полным выздоровлением. В периоде реконвалесценции у этих больных фракции ЦСЖ оказывали либо слабый стимулирующий эффект (у 80 %), либо были неэффективны (у 20 %). Супрессорный иммуномодулирующий эффект фракций ликвора, особенно при резко сниженном индексе иммувомодуляции, сопровождался затяжным течением болезни в 58 % случаев с выраженными признаками интоксикации, отеком мозга, частым присоединением вторичной инфекции, формированием неврологического дефицита в периоде ранней реконвалесценции. В группе сравнения фракции ЦСЖ чаще супрессировали образование бла-стных форм лимфоцитов (63,6 % ВМФ и 80 % НМФ), в остальных случаях -либо не оказывали эффекта, либо незначительно его стимулировали, что, вероятно, объясняется отсутствием стимулирующих факторов либо их блокированием другими компонентами, в том числе белковыми. Целесообразность этого явления, очевидно, заключается в сохранении изолированности мозговой ткани от проникновения системных повреждающих факторов крови.

При исследовании воздействия ЦСЖ на процессы ПОЛ лимфоцитов крови выявлено, что фракции ликвора, больных БМ, могли либо ингибировать их (от 60 до 80 % исследованных фракций), либо активировать. Активацию существенно чаще оказывали фракции ЦСЖ при менингококковом менингите (71,4 % ВМФ и 55,6 % НМФ) по сравнению с БМ иной этиологии (27,3 % для ВМФ и НМФ). Отмечено, что ингибирующий эффект ВМФ и НМФ превалировал при осложненном течении БМ. У 90 % больных высоко- и низкомолекулярные фракции ликвора действовали однонаправленно, однако выраженность эффекта была различной. В остром периоде БМ у 70 % обследованных инкубация лим-

фоцитов крови с ВМФ приводила к меньшему уровню ДК, чем инкубация с НМФ, тогда как в стадии реконвалесценции, наоборот, у 70 % больных ВМФ вызывала большее образование ДК, чем НМФ того же больного. Можно полагать, что в составе ЦСЖ острого периода БМ прооксидантные факторы преобладали в НМФ, а периода реконвалесценции - в ВМФ. В группе сравнения фракции ЦСЖ не оказывали влияния на ПОЛ лимфоцитов крови.

Анализ связи эффекта воздействия ЦСЖ на ПОЛ лимфоцитов крови и их пролиферативную активность с белково-пептидным составом исследуемых образцов ликвора позволил выявить следующие закономерности. В группе с нн-гибирующим и супрессорным эффектом фракций ликвора обнаружена тенденция к увеличению средних значений общего белка, цитоза, уровня ВМФ и НМФ, выраженные диспротеинемические сдвиги, свидетельствующие о нарастании интратекальных патобиохимических изменений у этих больных. Выявленные корреляционные зависимости позволяют высказать предположение, что увеличение содержания высоко- и низкомолекулярных компонентов ликвора в остром периоде БМ приводит к ингибированаю липидной пероксидации лимфоцитов, что, вероятно, оказывает негативное влияние на течение бактериального процесса. С другой стороны, подобные закономерности в стадии реконвалесценции, очевидно, биологически -оправданы, поскольку в этот период дополнительной стимуляции метаболизма лимфоцитов не требуется.

Исследование содержания ИНФ во фракциях ликвора в остром периоде БМ выявило широкий разброс показателей (от 0 до 37, 4 МБ), составивший в среднем для ВМФ (19,9 ± 5,55) ед., для НМФ - (11,9 ± 2,81) ед. У большинства обследованных содержание ИНФ в ВМФ фракции превышало содержание в НМФ. Исследования в динамике показали снижение количества ИНФ к стадии реконвалесценции, составившего для ВМФ (13,83 ±3,09) ед,, для НМФ (9,57 ± 4,91) ед. Обнаружение термолабильных антивирусных субстанций в НМФ ликвора, возможно являющихся активными фрагментами гамма-ИНФ, обусловлено синтезом низкомолекулярных активных лигандов, способных проходить через ГЭБ и оказывать защитное действие мозговой ткани вне- и внутрюслеточ-но. Воздействие фракций ликвора на интерферонпродуцирующую способность лейкоцитов крови резко различалось в пробах крови с добавлением и без добавления ФГА. В культурах крови без добавления ФГА фракции ликвора оказывали преимущественно стимулирующее действие, тогда как при одновременном добавлении ФГА и НМФ - ингибирующее, причем у больного с крайне тяжелым течением БМ НМФ ликвора полностью блокировала выработку ИНФ, при среднетяжелом течении БМ практически не меняла уровня ИНФ в надосад-ке, тогда как при ОРВИ отмечалась активизация синтеза ИНФ (до 42,3 МЕ/мл). Можно предположить, что, выявленные в НМФ лигаиды ИНФ являются структурной частью гамма-ИНФ и блокируют рецепторы этого белка на лимфоцитах крови. Выраженная блокада рецепторов, вероятно, оказывает негативное влияние на течение БМ. Проведенные эксперименты доказывают, что компоненты ЦСЖ не только пассивно отражают изменения внутричерепного гомеостаза при нейроинфекционном процессе, но и участвуют в организации защитных

реакций мозга. Наиболее адекватным является стимуляция синтеза ИНФ в остром периоде БМ, с постепенным снижением этого процесса к стадии реконва-лесценции. В то же время недостаточная выраженность этого эффекта в остром периоде болезни ассоциируется с крайне тяжелым течением БМ. Следует подчеркнуть, что данные эксперимента указывают также на возможность регулирующего действия компонентов ликвора на системные реакции крови.

Биологический эффект компонентов ликвора исследован на модели пневмококкового менингоэнцефалита (ПМЭ) у кроликов, у которых уже на 23-и сутки после заражения отмечались значительные сдвиги клеточного состава крови и особенно ликвора. В белковом составе ликвора обнаружены увеличение содержания острофазных белков постальбуминовой зоны, снижение содержания белков с относительно небольшой молекулярной массой (зона I), увеличение содержания высокомолекулярных компонентов (белки V и VI зон). В целом эти изменения были аналогичны наблюдаемым у человека при развитии гнойного менингита и свидетельствовали о нарушении проницаемости гемато-энцефалического барьера.

При сравнительном анализе результатов лечения экспериментального ПМЭ у кроликов в зависимости от включения в терапию интрацистернальной ликворотрансфузии (ЛТ) цельного ликвора или его фракций выявлено, что течение заболевания было более благоприятным, по сравнению с кроликами, получавшими только антибактериальные препараты. Отмечалась быстрая нормализация диагностически значимых иммунологических и биохимических показателей ликвора кроликов, претерпевающих значительные отклонения в остром периода ПМЭ. На 2-е сутки после ЛТ цельного ликвора выявлено значительное снижение (в 8 раз) цитоза с одновременным увеличением в клеточном составе лимфоцитов и в меньшей степени макрофагов, что наблюдалось и у кроликов, получавших ВМФ, тогда как введение НМФ вызывало более значительное снижение цитоза при усиленном выходе в ликвор макрофагов, преобладающих в этом случае над лимфоцитами. Значительное увеличение содержания общего белка ликвора и изменения в составе белковых фракций, наблюдаемые в острый период ПМЭ, уже на 2-4-е сутки после ЛТ сменялись чёткой тенденцией к нормализации этих показателей. Почта в 2-2,5 раза уменьшалось общее содержание белка, количество макроглобулярных компонентов, увеличивалось содержание белков альбуминовой зоны. В 70 % случаев на 7-е, в остальных на 10-е сутки заболевания наблюдалась нормализация белкового спектра ликвора. Выявленная динамика показателей белкового спектра свидетельствовала о нормализации проницаемости гематоэнцефалического барьера.

Информативными для оценки механизмов терапевтического действия ЛТ явились данные изучения интерфероногенеза и антителообразования. Подъём уровня ИНФ сразу после заражения кроликов поддерживался на высоком уровне в группах животных, получавших ЛТ, в особенности цельным ликвором и его НМФ. У павших кроликов наблюдали падение концентрации ИНФ как в ликворе, так и в крови. Перед смертью ИНФ ¡фактически не определялся. Введение цельного ликвора и ВМФ вызывало образование ИНФ гамма-типа, тогда

как НМФ - альфа-типа, продуцируемого, вероятно, клетками ЦНС. Выработка гамма-ИНФ осуществлялась, вероятно, лейкоцитами, проникающими в ликвор из крови. Ликворотрансфузия вызывала также стимуляцию антителообразова-ния. Титр антител к ВБН до заражения ПМЭ составлял в ликворе 0-10 ед./мл. Сразу после заражения выявлен подъём титра до 16-40 ед./мл с дальнейшим его нарастанием в случае применения ЛТ. Изменения исследованных показателей в крови животных разных групп были менее значительны и в ряде случаев не фиксировались вовсе. Однако терапевтический эффект ЛТ сопровождался нормализацией картины крови и стимуляцией функций лимфоцитов в реакции БТЛ и АТЦЛ к 10-м суткам ПМЭ.

Эффективность ЛТ была подтверждена и более благоприятными исходами экспериментального ПМЭ. По сравнению с контрольной группой летальность была снижена в 3 раза (20,6 % против 62,5 %), увеличилось число выживших кроликов (79,2 % против 37,5 %), в том числе без симптомов поражения ЦНС -29,2 %, чего не наблюдалось в контрольной группе.

Отчётливый терапевтический эффект обнаружен и у части больных с крайне тяжелым течением БМ, осложнившимся ОГМ, которым в остром периоде была проведена ликворотрансфузия донорского ликвора (доноры - родители или реконвалесценты менингококкового менингита). Сопоставление показателей белкового спектра ЦСЖ до ЛТ и спустя 2-4 дня после ее проведения фиксировало четкую тенденцию к нормализации белкового спектра, заключающуюся в увеличении относительного содержания преальбумина, уменьшении высокомолекулярных белков. Эти изменения коррелировали с улучшением клинического состояния больных. Совокупность полученных данных свидетельствует, что терапевтический эффект ЛТ осуществляется различными механизмами, включающими раннее появление в ликворе иммунокомпетеитных клеток, нормализацию белкового и клеточного состава ликвора, стимуляцию выработки ИНФ и антителообразование, появление местной иммуноморфоло-гической реакции в нервной ткани. Все эти процессы носят преимущественно интратекальный характер. Вероятно, ликвор реконвалесцента гнойного менингита содержит ряд защитных и регулирующих факторов, находящихся в основном в НМФ, что открывает в дальнейшем перспективы усовершенствования лечения заболеваний, сопровождающихся интратекальными изменениями, путем применения нейропептидов.

Таким образом, на основании литературных данных и собственных исследований (Лобзин B.C., 1990; Сорокина М.Н., 1992, 1999; Скрипченко Н.В., 1993; Quagliaiello V, Scheid W.M., 1997; Leib М.Н., Tauber M.G., 1999) современную концепцию пато- и саногенеза острых нейроинфекций можно представить следующим образом: в результате бактериальной или вирусной инвазии через слизистые назофарингеального тракта и последующей бактериемии, ток-синемии или вирусемии происходит гиперпродукция цитокинов стимулированными клетками эндотелия мозговых сосудов, микроглии, астроцитов. Цитоки-ны, с одной стороны, активируют фосфолипазу А2 и рецепторы адгезии на эндотелии, что приводит к повышению проницаемости ГЭБ и проникновению

лейкоцитов, белков в ЦСЖ, с другой, повреждая церебральный микроваскуляр-ный эндотелий, запуская цикл арахидоновой кислоты с её метаболитами (лей-котриены, простагландины), индуцируя хемотаксис, способствуют воспалению в ЦСЖ, повышению ВЧГ, развитию вазогенного ОГМ, церебрального васкули-та, инфарктов мозга. Следствием этих патологических процессов является снижение церебрального кровотока и мозговой перфузии, приводящих к острой ишемии и метаболическим нарушениям с накоплением внутриклеточного Са2+, свободных радикалов, оксида азота, продуктов протеолиза и катаболизма, которые способствуют развитию цитотоксического ОГМ, что ещё больше нарушает цереброваскулярную ауторегуляцию, усугубляет ишемию и вызывает повреждение мозговой ткани, гибель нейронов и апоптоз. Следствием этих пато-биохимических и патофизиологических процессов является усиленное поступление в ЦСЖ высоко- и низкомолекулярных белков и пептидов, действие которых, с одной стороны, положительно и направлено на ингибирование роста микроорганизмов, устранение токсинов и патологических продуктов метаболизма, стимуляцию функциональной активности лимфоцитов, регуляцию кровотока и трофику нервной ткани, с другой - избыточное их поступление оказывает не компенсаторное, а повреждающее действие, способствуя чрезмерному, неконтролируемому воспалению, отёку головного мозга, повреждению мозговой паренхимы. Наличие достоверных корреляционных соотношений позволяет утверждать высокую значимость белково-пептидного состава ЦСЖ в течении и исходах инфекционных заболеваний нервной системы у детей. Проведенные исследования свидетельствуют о значимости патобиохимических изменений ЦСЖ в генезе инфекционных заболеваний нервной системы, таз определяет тактику ведения и исходы нейроинфекционного процесса.

ВЫВОДЫ

1. Разработан экспресс-метод фракционирования ЦСЖ на основе гель-фильтрации на сефадексе 0-50, позволяющий исследовать молекулярно-массовое распределение компонентов ликвора, определять абсолютные значения белкового и пептидного пулов при инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей. Исследование содержания фракций ЦСЖ может быть использовано для оценки тяжести заболевания, дифференциальной диагностики вирусной или бактериальной природы нейро-инфекционного процесса и уточнения основного патогенетического механизма.

2. Характер изменений белкового и пептидного пулов ЦСЖ при нейро-инфекциях у детей зависит от этиологии, периода инфекционного процесса, тяжести течения, осложнений и коррелирует с исходом заболевания. Наиболее выраженные нарушения в сторону их увеличения до 1,1 г/ л и более отмечаются в остром периоде заболевания при бактериальных гнойных менингитах гемо-фильной и пневмококковой этиологии, осложненных отеком головного мозга, тогда как при вирусных энцефалитах отмечается их максимальное отклонение до 0,5 г/л с преимущественным увеличением НМФ, ассоциирующихся с тяжелой очаговой симптоматикой. При инфекционных заболеваниях периферической нервной системы дифтерийной этиологии преимущественно наблюдается увеличение пептидов до 0,4 г / л при сниженном или нормальном содержании белкового пула, а при полирадикулоневритах, напротив, в 60 % случаев отмечается увеличение содержания высокомолекулярных компонентов при нормальном или сниженном содержании низкомолекулярных.

3. Благодаря исследованию белкового спектра ЦСЖ методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле возможно выявление характерных особенностей протеинограмм при различных нозологических формах нейроин-фекций: для бактериального гнойного менингита типично появление полос гап-тоглобинов типа 2-1 и 2-2, бета-липопротеида, отсутствующих в норме и при вирусных менингитах и энцефалитах; для полинейропатий и вирусных нейро-инфекций характерно увеличение содержания преальбумина, альбумина, острофазных белков постальбуминовой зоны.

4. В составе низкомолекулярных компонентов ЦСЖ с помощью метода обращеннофазной ВЭЖХ обнаружено до 40 пиков, отличающихся по степени гидрофобности и отражающих степень интратекального воспаления. Преобладание гидрофобных пиков коррелирует с осложненным течением и резидуаль-ными проявлениями бактериального менингита и вирусного энцефалита, что свидетельствует об их повреждающем действии на мозговую паренхиму, тогда как преобладание гидрофильных пептидов сопровождается транзиторной очаговой неврологической симптоматикой, обусловленной нарушением ликворо-

динамики й свидетельствует о воспалении преимущественно в оболочках моз-

больных вирусными и бактериальными нейроинфекциями формируются 3 варианта интратекального ответа, различающихся значением и соотношением белкового и пептидного пулов ЦСЖ, качественными и количественными особенностями их состава: при бактериальном менингите отмечается преимущественно 2-й тип интратекального ответа, при крайне тяжелых формах, осложненных ОГМ, - 3-й тип, а при вирусных энцефалитах и полинейро-патиях— 1-й.

6. Алгоритм патобиохимической оценки состава ЦСЖ включает на 1-м этапе исследование содержания белкового и пептидного пулов ликвора экспресс-методом фракционирования, на 2-м - исследование белкового спектра методом диск-электроофреза в полиакриламидном геле. Определение в остром периоде бактериального менингита степени увеличения белкового и пептидного пулов ликвора позволяет прогнозировать течение и исход заболевания: при нахождении в диапазоне 0,3-0,5 г/ л прогнозируют средне-тяжелое течение с полным выздоровлением; в диапазоне 0,51-1,0 г/л - тяжелое с незначительными резидуальными последствиями, в диапазоне, превышающем 1,1 г/л, - крайне тяжелое с выраженными неврологическими последствиями.

7. Высоко- и низкомолекулярные компоненты ликвора в эксперименте in vitro и in vivo оказывают как иммуномодулирующее воздействие на метаболические процессы лимфоцитов крови, их пролиферативную активность, способность к интерферонообразованию, синтезу антител, так и бактерицидное действие, максимальное в отношении менингококка и минимальное в отношении пневмококка и гемофильной палочки, что доказывает их участие в процессах пато- и саногенеза и объясняет терапевтический эффект ликворотрансфузии.

8. В патогенезе острых нейроинфекций у детей значимую роль имеют белки и пептиды ЦСЖ, изменение которых отражает степень интоксикации, воспаления оболочек и ткани мозга, нарушения ликворо- и гемодинамики, увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера и коррелирует с клиническими особенностями течения заболевания, что позволяет использовать их оценку не только для проведения дифференциальной диагностики вирусного и бактериального процесса, прогнозирования течения и исхода бактериального менингита, но и для определения терапевтической тактики с учетом ведущего патогенетического синдрома.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для исследования белкового и пептидного пулов ЦСЖ при нейроин-фекциях у детей рекомендуется применять экспресс-метод гель-фильтрации на сефадексе G -50 fine, позволяющий в течении 2 ч после проведения люмбаль-ной пункции определять патобиохимическую направленность инфекционного процесса.

2. Для объективизации оценки степени интоксикации и воспаления оболочек и ткани мозга, нарушения ликворо- и гемодинамики, увеличения проницаемости ГЭБ при первой люмбальной пункции у больных с нейроинфекциями необходимо определение уровня белкового и пептидного пулов ЦСЖ методом гель-фильтрации на сефадексе G -50 fine с расчетом их соотношения, а также оценка относительного и абсолютного содержания белковых фракций методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле, что позволяет провести комплексную оценку интратекальных процессов.

3. Для прогнозирования характера течения и исходов бактериальных гнойных менингитов у детей в остром периоде заболевания параллельно с клиническим анализом цереброспинальной жидкости необходимо исследование содержания высоко- и низкомолекулярных компонентов ликвора. При значении содержания белковых и / или пептидных компонентов в диапазоне 0,3-0,5 г/л прогнозируется среднетяжелое течение болезни с полным выздоровлением, в диапазоне 0,51-1,0 г/л - тяжелое течение с резидуапьными проявлениями, при увеличении одного или обоих пулов свыше 1,1 г/л - очень тяжелое течение со стойким неврологическим дефицитом. При значении каждого из пулов в диапазоне 0,18-0,25 г/л диагностируют норму.

4. Коррекцию терапии при нейроинфекциях необходимо проводить с учетом характера дисбаланса белково-пептидных компонентов ЦСЖ и степени увеличения абсолютного содержания белковых фракций. При наличии дисбаланса белково-пептидных компонентов в сторону повышения высокомолекулярных компонентов, которые являются результатом проникновения в цереброспинальную жидкость острофазных белков и способствуют развитию внутричерепной гипертензии и отека мозга, в комплексе терапии необходимо применять осмо- и онкодегидратанты, нейрометаболиты. При дисбалансе с увеличением низкомолекулярных компонентов, являющихся следствием распада белков, микроорганизмов, клеток ЦСЖ, что усугубляет тяжесть интоксикации, показано усиление дезгогтоксикационной терапии на протяжении всего острого периода бактериального гнойного менингита.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Монография, патенты:

Глава в коллективной монографии

1. Сорокина М.Н., Алексеева Л. А. Исследование ЦСЖ при бактериальных менингитах // Бактериальные менингиты у детей. - М.: Медицина, 2003. -С. 108-127.

Патент на изобретение:

2. Алексеева Л.А, Сорокина M. Н., Карасев В В. Способ прогнозирования течения и исходов бактериальных гнойных менингитов у детей / Патент №2141668, зарегистрирован 20 ноября 1999 г.

Ведущие научные журналы (по перечню ВАК Минобразования РФ):

3. Алексеева Л.А., Вальберг А.Ю. Качественное и количественное распределение белков нормальной спинномозговой жидкости по данным диск-электрофореза в полиакриламидном геле // Лаб. дело. -1985. - №4. - С.204-207.

4. Майорова Н.Ф., Александрова Н.П., Алексеева Л.А Влияние фракций лик-вора больных с церебральной патологией на локальный мозговой кровоток экспериментальных животных // Журн. невропатологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. -1989. - №7. - С.104-109.

5. Сорокина М.Н., Зинченко А.П., Басс Р.Л., РосинЮ.А., Алексеева Л.А. и др. Субдуральный выпот при бактериальных менингитах у детей // Журн. нев-ропатологии.и психиатрии им. С.С. Корсакова. -1993 - Т.93., №4. - С.28-31.

6. Алексеева Л.А Фракционирование цереброспинальной жидкости в диагностике и прогнозе острых нейроинфекций у детей // Клин. лаб. диагностика. -1999. - №10. - С.35-36.

7. Волкова М.О., Алексеева Л.А. Влияние фракций цереброспинальной жидкости на рост бактериальных культур // Клин. лаб. диагностика. -1998. -№12.-С.12.

8. Алексеева Л.А., Железникова Г.Ф., Монахова Н.Е., Сорокина М.Н. Имму-номодулирующая активность фракций ЦСЖ при бактериальных менингитах у детей // Мед. иммунология. - 2001. - Т.З., №2. - С.211.

9. Алексеева Л.А., Сорокина М.Н. Диагностическое значение белкового спектра ЦСЖ при бактериальных и вирусных менингитах у детей // Клин. лаб. диагностика. - 2001. - №7. - С.215-219.

Ю.Алексеева Л.А., Шатик C.B., Сорокина М.Н., Карасёв В.В. Хроматографи-ческое определение состава низкомолекулярной фракции ЦСЖ при острых нейроинфекциях у детей // Клин. лаб. диагностика. - 2002. - №5. - С. 15-19.

Методические рекомендации, пособия:

11. Сорокина М.Н., Зинченко А.П., Аксенов O.A., Алексеева Л.А и др. Ликво-ротерапия в комплексном лечении сверхострых и тяжелых форм нейроинфекций у детей // Методические рекомендации. - СПб., 1992. -12 с.

12. Сорокина М.Н., Зинченко А.П., ТТафифова A.C., Алексеева Л.А. и др. Диагностическое значение исследований клеточных реакций и белков ликвора

при гнойных менингитах у детей // Методические рекомендации. - СПб., 1993. -10 с.

13. Сорокина М.Н., Иванова В В., Скрипченко Н.В., Алексеева JLA. и др. Ранние и поздние дифтерийные полинейропатии у детей: Пособие для врачей. -СПб., 1997. - 5 с.

14. Алексеева Л. А., Сорокина М.Н., Скрипченко Н.В., Карасёв В.В., Иванова М.В. Прогнозирование течения и исходов острых бактериальных менингитов у детей // Сборник методических рекомендаций и пособий для врачей «Прогнозирование течения и исходов капельных инфекций у детей».- СПб., 2001. -С.15-25.

15. Сорокина М.Н, Скрипченко Н.В., Вильниц A.A., Кветная A.C., Алексеева Л.А. и др. Гемофильные менингиты у детей: эпидемиология, клиника, диагностика, лечение, профилактика: Пособие для врачей. - СПб., 2003. - 46 с.

Статьи в научных журналах, тезисы докладов и статей:

16. Alekseyeva L.A., Sorokma M.N., Karasyev W.W. et al. The types of cellular reactions and molecular mass distribution of cerebrospinal fluid components in purulent meningitis // J. Neurochem.. -1996. - Vol.66. Suppl. 2. - P.27.

П.Алексеева JLA., Сорокина M.H. Белки цереброспинальной жидкости при острых нейроинфекциях у детей // Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний» .Звенигород, 1990. - С.6-7.

18. Сорокина М.Н., Басс Р.Л., Алексеева JI.A. и др. Экспериментальные исследования воздействия ликвора на биохимические и иммунологические показатели при гнойном менингите // Тезисы докладов Всесоюзной конференции « Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний». - Звенигород, 1990.-С. 109.

19. Сорокина М.Н., Басс Р.Л., Алексеева Л.А. и др. Пневмококковый менинго-энцефалит у детей // Сб. «Детские инфекции». - Л., 1990 - №2. - С.73-80.

20. Сорокина М.Н., Басс Р.Л., Зинченко А.П., Мосенков В.В., Алексеева Л.А. и др. Диагностика и лечение субдуральных выпотов при гнойных менингитах у детей раннего возраста // Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Ме-нингококковая инфекция и гнойные менингиты (диагностика, профилактика, лечение)». - Новосибирск, 1990. - Т.2. - С.83-86.

21. Зинченко А.П., Сорокина М.Н., Басс Р.Л., Алексеева Л.А. и др. Современная интенсивная терапия гипертоксических форм менингокковой инфекции и бактериальных менингитов у детей II Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Менингококковая инфекция и гнойные менингиты (диагностика, профилактика, лечение)». - Новосибирск, 1990. - Т.2. - С. 73-75.

22. Алексеева Л.А., Белозерова Л.А., Сорокина М.Н. и др. Перспективы изучения пептидного состава цереброспинальной жидкости при нейроинфекциях у детей // Детские инфекции: Сб.науч.тр. - Л., 1991,- №3. -С.14-18.

23. Белозерова Л.А., Галль Л.Н., Алексеева Л.А., и до SIA АР MASS Spectrometry Study of Peptide Structure of Biological Liquids // Тезисы докладов

ХП Международного симпозиума по масс-спектрометрии. - Амстердам, 1 1991.-С.19.

24. Алексеева Л.А., Домкина JI.K., Сорокина М.Н и др. Пептиды цереброспинальной жидкости при нейроинфекциях у детей // Тезисы докладов съезда врачей-инфекционистов. - Суздаль, 1992. - Т.2. - С.131-133.

25. Сорокина МН., Аксенов O.A., НовоселоваМ.В., Алексеева Л.А. и др. Лик-воротрансфузия в комплексной терапии тяжелых форм нейроинфекций у детей ft Тезисы докладов съезда врачей-инфекционистов. - Суздаль, 1992 . -Т.2.- С. 129-131.

26. Алексеева JLA., Сорокина М.Н., Монахова Н.Е и др. Биохимические и иммунологические показатели крови и ликвора при экспериментальном пневмококковом менингоэнцефалиге // Сб. «Бактериально-вирусные инфекции (патоморфология, патогенез, клиника, лечение)». - Саратов: Саратовский мед.ин-т, 1993.-С.85-86.

27. Сорокина М.Н., Алексеева Л. А., Аксенов O.A. и др Молекулярные механизмы терапевтического действия ликворотрансфузии при экспериментальном пневмококковом менингоэнцефалиге // Сб. «Бактериально-вирусные инфекции (патоморфология, патогенез, клиника, лечение)». - Саратов: Саратовский мед.ин-т, 1993. - С. 81-84.

28. Алексеева Л.А., Сорокина М.Н., Карасев В.В. Пептиды цереброспинальной жидкости как показатель тяжести эндогенной интоксикации при бактериальных гнойных менингитах у детей // Тезисы докладов Международного симпозиума «Эндогенные интоксикации». - СПб., 1994. - С. 19.

29. Sorokina М. N. Rosin Y.A., Besuch P.M., Alekseyeva L.A. et al // Pathogenesis mechanisms in acute cerebral infectious diseases in children // The international symposium Physiological and biochemical basis of brain activity. - St. Petersburg, 1994. - P.96.

30. Алексеева JLA., Сорокина M.H. Современные исследования белково-пептидного состава цереброспинальной жидкости в диагностике осложненного течения гнойных менингитов у детей И Материалы конгресса педиатров России «Современные технологии в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний у детей». - М., 1995. - С.86-88.

31.Сорокина М.Н., Давыдовская MB., Ромаиюк А.Г., Алексеева JI.A., Иванова М.В., и др. Значение полипептидных факторов в цереброспинальной жидкости ври острых нейроинфекциях у детей // Материалы VII Всероссийского съезда неврологов. - Нижний Новгород, 1995. - С.28-30.

32. Алексеева Л.А., Сорокина М.Н., Карасев В.В., Бессонова Т.В. Пептиды средней массы цереброспинальной жидкости при бактериальных гнойных менингитах у детей // Сб. «Актуальные вопросы клиники, лечения и профилактики инфекционных заболеваний у детей». - СПб., 1996 - С. 70-73.

33. Сорокина М.Н., Скрипченко Н.В., Карасев В.В., Алексеева JLA. и др. Принципы диагностики и стартовой терапии коматозных форм бактериальных менингитов у детей // Материалы Ш Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - М, 19%. - С.118.

34.Скрипченко Н.В., Сорокина М.Н., Алексеева Л.А., Давыдовская М.В. Дифтерийные нолинейропатии у детей: клиника и ликворологические находки // Тезисы докладов Юбилейной научной конференции, посвященной 100-летию первой в России кафедры инфекционных болезней. - СПб., 1996. -С. 189.

35. Алексеева Л.А., Сорокина М.Н. Белковый спектр цереброспинальной жидкости в диагностике острых нейроинфекций у детей // Тезисы докладов Юбилейной научной конференции, посвященной 100-летию первой в России кафедры инфекционных болезней. - СПб., 1996. - С.25.

36. Карасев В.В., Алексеева Л.А., Сорокина М.Н. Типы молекулярно-массового распределения компонентов цереброспинальной жидкости при различных вариантах течения бактериальных гнойных менингитов у детей // Тезисы докладов 1-й Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс». - Саратов, 1996. - С. 32.

37. Алексеева Л.А., Сорокина М.Н., Карасев В.В., Бессонова Т.В. Роль белко-во-пептидного состава цереброспинальной жидкости в течении бактериального гнойного менингита у детей // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Современные проблемы детской инфектоло-гии». - СПб., 1997. -С.191-197. -

38. Алексеева Л.А., Волкова М.О., Бессонова ТВ. Влияние компонентов цереброспинальной жидкости на рост бактериальных культур // Тезисы докладов X Юбилейной республиканской научно-практической конференции «Проблема гастроэнтерологических и целевых капельных инфекций», посвященной 70-летию НИИ детских инфекций. - СПб., 1997. - С.10.

39. Алексеева Л .А., Скрипченко Н.В. Биохимические показатели цереброспинальной жидкости при инфекционных заболеваниях периферической нервной системы И Тезисы докладов X Юбилейной республиканской научно-практической конференции «Проблема гастроэнтерологических и целевых капельных инфекций», посвященная 70-летию НИИ детских инфекций. -СПб., 1997.-С.11.

40. Сорокина М.Н., Зинченко А.П., Скрипченко НВ., Алексеева Л.А. и др Эгаопатогенетическая характеристика нейроинфекций в детском возрасте, принципы неврологической диагностики и лечения // Детские инфекции: Сборник, посвященный 70-летию НИИДИ. - СПб., 1997. - С.79-85.

41. Буловская Л.Н., Говорова Л.В., Перова Н.С., Алексеева Л.А. и др. Биохимические аспекты патогенеза инфекционных нозоформ у детей // Детские инфекции: Сборник, посвященный 70-летию НИИДИ. - СПб., 1997. - С.38-46.

42. Алексеева Л.А., Юренкова С.В. Белковый спектр цереброспинальной жидкости в диагностике тяжести нейроинфекционного процесса // Материалы 2-й Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс». -Саратов, 1998. -С.5.

43. Карасев В.В., Алексеева Л.А., Сорокина М.Н. Зависимость изменений бел-ково-пептидного состава цереброспинальной жидкости от клинических осо-

бенностей течения бактериальных гнойных менингитов у детей // Материалы 2-й Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс». -Саратов, 1998.-С. 32.

44. Алексеева JLA., Сорокина М.Н., Скрипченко Н.В., Шатик C.B. Патогенетическое значение белково-пешидного состава цереброспинальной жидкости при острых вирусных нейроинфекциях у детей // Материалы конференции «Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика».- СПб., 1999.-С.180.

45. Сорокина М.Н., Скрипченко Н.В., Иванова М.В., Росин Ю.А., Алексеева Л.А. Алгоритм диагностики и неотложной терапии острых нейроинфекций у детей // Материалы VI конгресса союза педиатров России «Неотложные состояния у детей». - М., 2000. - С.269-270.

46. Карасёв В.В., Алексеева Л.А., Шатик C.B., Сорокина М.Н. Белково-пешидный состав ЦСЖвгенезе бактериального гнойного менингита у детей // Материалы Юбилейной научно-практической конференции, посвя-щённой 140-летию кафедры душевных и нервных болезней BMA «Современные подходы к диагностике и лечению нервных психических заболеваний». - СПб., 2000. - С.553.

47. Сорокина М.Н., Скрипченко Н.В., Иванова М.В., Алексеева Л.А. и др. Принципы диагностики, патогенеза и лечения мозговой комы при острых нейроинфекциях у детей // Материалы Юбилейной научно- практической конференции, посвдщённой 140-летию кафедры душевных и нервных болезней BMA «Современные подходы к диагностике и лечению нервных психических заболеваний». - СПб., 2000. - С.579.

48. Алексеева Л.А., Сорокина М.Н. Дифференциально-диагностическое значение исследования белкового спектра ЦОК при острых менингитах у детей // Материалы конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века»,-М-, 2000,-4.1.-С.6.

49. Сорокина М.Н., Трофимова Т.Г., Скрипченко Н.В., Алексеева Л.А. Хронический нейроборрелиоз у детей //Материалы конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века». - М., 2000. - Ч.П. - С.50-51.

50. Алексеева Л.А., Иванова М.В. Патогенетические основы восстановительной терапии при нейроинфекциях у детей // Материалы ХХП итоговой научно-практической конференции «Актуальные вопросы детской инфектоло-гии»,— СПб., 2000. - С.31-38.

51. Карасёв В.В., Алексеева ЛА., Шатик C.B., Сорокина М.Н. Особенности белково-пешидного состава ЦСЖ при различных формах тяжести бактериальных гнойных менингитов у детей // Материалы конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века». - М., 2000. - 4.1. - С.47.

52. Иванова М.В., Алексеева Л .А., Сорокина М.Н. Критерии прогнозирования исходов острых нейроинфекций у детей // Материалы конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века». - М., 2000. - 4.1. - С.45-46.

Подписано в печать

Тираж 100 экз. Заказ N»799 Санкт-Петербург, ООО "АБЕВЕГА", Московский пр., д. 2/6 Лицензия на полиграфическую деятельность ПЛД № 69-299

РНБ Русский фонд

2006-4 5762

2 9 СЕН 2003

Актуальность темы. Изучение молекулярных основ патогенеза нейро-инфекционных заболеваний обусловлено тяжестью течения вирусных и бактериальных менингитов и энцефалитов у детей, высокой летальностью (до 36 %) и формированием инвалидизирующих последствий у каждого третьего пациента [47, 125, 147, 168, 170, 221, 325, 346]. Течение и исход заболеваний зависят от взаимодействия вирулентных и патогенных свойств возбудителя и компен-ц саторных реакций макроорганизма [75, 85, 139]. Тяжесть нейроинфекций обусловлена выраженностью воспалительного процесса в оболочках и ткани мозга, сопровождающегося увеличением проницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), проникновением возбудителя в ликворные пространства и ин-тратекальным развертыванием инфекционного процесса [162, 214, 278]. Известно, что в начальной стадии нейроинфекций вследствие увеличения проницаемости ГЭБ в ликворе повышается содержание острофазных белков, yi цитокинов, ферментов и их ингибиторов, иммуноглобулинов и других компонентов [9, 133, 156, 188, 209, 351, 321, 329]. Основой скрининговой ликворной диагностики является анализ содержания общего белка, плеоцитоза, реже содержания лактата, хлоридов и глюкозы, однако эти исследования не позволяют уточнить молекулярные основы патогенеза, степень поражения мозга и прогнозировать течение заболевания [99, 104, 114, 331, 348, 371].

По современным представлениям, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) принадлежат важные функции по поддержанию работы мозга в норме и при патологии - трофической, дренирующей, механической и иммунной защиты, нейрогуморальной регуляции [106, 107, 123, 235]. Доказательством важной роли ЦСЖ в генезе многих заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) являются экспериментальные исследования по «переносу» с ликвором состояний сна и бодрствования, боли и анальгезии, двигательных функций и их нарушений, а также клинические работы, подтверждающие эффективность ликворо-терапии, включающей очистку ликвора от токсичных субстанций, дренирование ликворных пространств, интрацистернальное и интраназальное введение донорского ликвора [12, 141, 174, 195, 368;]. Предполагается, что восстановление нарушенных функций мозга осуществляется благодаря регулирующему действию компонентов ликвора. Выполнение многообразных функций ЦСЖ в значительной мере обеспечивается полифункциональными белковыми и пептидными молекулами. Особое значение в регуляции деятельности мозга принадлежит нейропептидам, способным оказывать многостороннее влияние на функции многих органов и систем организма, в том числе осуществлять нейроиммунное взаимодействие [8, 42, 43, 82, 88, 173]. Образование пептидов происходит внутриклеточно путем ограниченного протеолиза (процессинга) высокомолекулярных белковых предшественников либо внекле-точно при протеолитическом распаде белков, в том числе сыворотки крови и ЦСЖ. Хотя сведения о нейропептидах в биологии многочисленны, их значение в развертывании воспалительного процесса и процессах саногенеза остается нераскрытым. Несмотря на информативность исследования белкового состава ЦСЖ, большинство существующих методов не нашло широкого применения в клинике из-за трудоемкости и ограниченной доступности оборудования и тест-систем, что диктует целесообразность усовершенствования методических приемов. Сведения о пептидном составе ликвора при нейроинфекционных заболеваниях фрагментарны и носят описательный характер, неясна их роль в патогенезе инфекционных заболеваний нервной системы, в связи с чем проведение данного исследования является актуальным.

Цель исследования - определить значение белков и пептидов ЦСЖ в клинической лабораторной диагностике и генезе нейроинфекционного процесса путем анализа патобиохимических изменений состава ЦСЖ и экспериментального изучения биологической активности фракций для усовершенствования диагностики, прогноза течения и исходов острых инфекционных заболеваний центральной и периферической нервной системы у детей.

Задачи исследования:

1. Изучить молекулярно-массовое распределение компонентов ЦСЖ и уточнить качественные и количественные характеристики белкового и пептидного спектров ЦСЖ при различных нозологических формах инфекционных заболеваний нервной системы у детей.

2. Разработать экспресс-метод фракционирования ЦСЖ путем гель-фильтрации на сефадексе и определить содержание белкового и пептидного пулов при различных инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей.

3. Определить диагностическую и прогностическую значимость пептидного и белкового спектров ЦСЖ и их составляющих в генезе нейроинфекцион-ного процесса, выявить маркеры повреждения мозга и варианты интратекального ответа на вирусную и бактериальную инфекцию.

4. Разработать алгоритм патобиохимической оценки ЦСЖ при вирусных и бактериальных нейроинфекциях у детей.

5. Изучить экспериментальным путем иммуномодулирующее действие компонентов ЦСЖ при нейроинфекциях у детей.

6. Определить бактерицидную активность фракций ликвора на клинических штаммах менингококка, пневмококка и гемофильной палочки.

7. Уточнить патогенез инфекционных заболеваний нервной системы и механизмы пато- и саногенетического воздействия ЦСЖ в клинике и эксперименте для усовершенствования терапии острых нейроинфекций у детей.

Научная новизна. С использованием высокоразрешающих методов биохимического анализа получены новые данные о молекулярно-массовом распределении компонентов ЦСЖ, охарактеризован спектр низкомолекулярных компонентов, качественный и количественный белковый состав при инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей.

Разработан экспресс-метод фракционирования ЦСЖ при инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей путем гель-фильтрации на сефадексе G-50 для определения белкового и пептидного пулов с подсчетом их абсолютного содержания и соотношения.

Показано значение определения белков и пептидов ЦСЖ в клинической лабораторной диагностике нейроинфекционных заболеваний у детей для дифференциации вирусной и бактериальной природы заболевания, прогнозирования характера его течения и исхода, уточнении ведущих патогенетических механизмов.

Установлены качественные и количественные особенности белкового и пептидного спектра ликвора при менингитах и энцефалитах, определены маркеры повреждения мозга и варианты интратекального ответа на вирусную и бактериальную инфекции.

Выявлено в эксперименте in vitro и in vivo регулирующее влияние высоко- и низкомолекулярных фракций ЦСЖ на системные реакции крови и бактерицидное действие на основные возбудители бактериального менингита.

Разработан алгоритм патобиохимической оценки ЦСЖ и уточнены ин-тратекальные механизмы пато- и саногенетического воздействия ликвора, позволяющие усовершенствовать терапию нейроинфекционных заболеваний у детей.

Практическая значимость работы. Разработанный экспресс-метод фракционирования ЦСЖ гель-фильтрацией на сефадексе G-50 доступен для применения в клинике, позволяет определять белково-пептидный состав ликвора, коррелирующий с характером и выраженностью нейроинфекционного процесса. Исследование особенностей качественного и количественного состава высоко- и низкомолекулярных компонентов ЦСЖ при различных нозологических формах инфекционных заболеваний нервной системы способствует не только ранней объективной оценке тяжести интратекального воспаления, прогнозированию течения и исходов заболевания, но и определению тактики дифференцированной терапии с применением дезинтоксикационных, дегидратационных и антибактериальных средств, что позволяет снизить летальность и частоту инвалидизирующих нарушений при нейроинфекциях у деТ тей.

Результаты работы использованы при разработке методических рекомендаций: «Ликворотерапия в комплексном лечении сверхострых и тяжелых форм нейроинфекций у детей»; «Диагностическое значение исследований клеточных реакций и белков ликвора при гнойных менингитах у детей»; «Прогнозирование течения и исходов острых бактериальных менингитов у детей», пособий: «Ранние и поздние дифтерийные полинейропатии у детей»; «Гемо-^ фильные менингиты у детей: эпидемиология, клиника, диагностика, лечение, профилактика». По результатам исследования получен патент на изобретение: «Способ прогнозирования течения и исходов бактериальных менингитов у детей» [№ 2141668 (1999 г.)].

Основные научные положения, выносимые на защиту:

1. Особенности белково-пептидного состава ЦСЖ, спектра высоко- и низкомолекулярных компонентов зависят от этиологии нейроинфекционного ^ заболевания и тяжести повреждения нервной системы у детей, с чем связаны различные варианты интратекального ответа.

2. Экспресс-метод фракционирования ЦСЖ на основе метода гель-фильтрации на сефадексе G-50 позволяет определять белковый и пептидный пул ликвора, характер изменения которых коррелирует с нозологической формой и особенностями течения инфекционных заболеваний центральной и периферической нервной системы у детей.

3. Исследование качественного и количественного белково-пептидного

11 состава ЦСЖ при нейроинфекциях у детей позволяет дифференцировать вирусную и бактериальную природу заболевания, уточнять ведущие патогенетические механизмы, прогнозировать течение и исход заболеваний.

4. ЦСЖ оказывает иммуномодулирующее действие на системные реакции крови и бактерицидное - на актуальные возбудители бактериальных менингитов, наиболее выраженное в отношении менингококка.

5. В патогенезе инфекционных заболеваний нервной системы большое значение имеют белковые и пептидные компоненты ЦСЖ, которые оказывают как повреждающее действие за счет избыточного поступления в ЦСЖ высокомолекулярных компонентов (белки зоны медленных постгрансферринов и макроглобулинов) и гидрофобных пептидов, способствующих нарастанию общемозговой, менингеальной и очаговой симптоматики, так и реабилитационное, благодаря наличию белков, обладающих антиоксидантной, ингибиторной и транспортной функцией, регуляторных нейропептидов, восстанавливающих ^ функциональную активность иммунокомпетентных клеток и ассоциативные связи.

Апробация работы и внедрение в практику. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на 31 Всесоюзной, Всероссийской и Межрегиональной научно-практической конференции: г. Звенигород - Всесоюзная конференция «Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний» (1990); г. Новосибирск - конференция «Менингококковые инфекции и гной-^ ные менингиты» (1990); г. Суздаль - Съезд врачей-инфекционистов (1992); г.

Санкт-Петербург - Международный симпозиум «Эндогенные интоксикации»

1994); г. Москва - Конгресс педиатров России «Современные технологии в диагностике, профилактике и лечении инфекционных заболеваний у детей»

1995); г. Нижний Новгород - УП Всероссийский съезд неврологов (1995); г. Москва - III Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (1996); г. Саратов - II Всероссийская конференция «Гомеостаз и инфекционный процесс» (1998); г. Санкт-Петербург- II Международная конференция «Идеи Пас-тера в борьбе с инфекциями» (1998); г. Санкт-Петербург - Конференция «Вирусные инфекции на пороге XXI века: эпидемиология и профилактика» (1999); г. Санкт-Петербург — Конференция «Современные технологии диагностики и терапии инфекционных болезней» (1999); г. Москва - Дни национальной лабораторной медицины ( 1999 ); г. Москва - VI конгресс педиатров России «Неотложные состояния у детей» (2000); г. Москва - Конференция «Инфекционные болезни на рубеже XXI века» (2000); г. Санкт-Петербург - 10 совместная конференция «Нейроиммунология» и научно-практическая конференция неврологов (2001), г. Санкт-Петербург - Всероссийская конференция « Дни иммунологии» ( 2001); г. Санкт-Петербург - Межрегиональная научно-практическая конференция «Современные проблемы детской инфектологии» (1997); г. Санкт-Петербург - 10-я Юбилейная Республиканская научно-практическая конференция «Проблема гастроэнтерологических и целевых капельных инфекций», посвященная 70-летию НИИДИ (1997); г. Санкт-Петербург — Всероссийская научно-практическая конференция «Детские ин-^ фекции на рубеже XXI века: настоящее и будущее» (1999); г. Санкт-Петербург

- Юбилейная научно-практическая конференция, посвященная 140-летию кафедры душевных и нервных болезней ВМА, «Современные подходы к диагностике и лечению нервных и психических заболеваний» (2000); г. Санкт-Петербург - итоговые научно-практические конференции «Актуальные вопросы детской инфектологии» (ежегодно с 1990 по 2002 г.), на заседаниях биохимического общества (СПб., 999), общества инфекционистов (СПб, 2000, 2002 ^ г.); общества педиатров СПб (2001), ассоциации детских и взрослых неврологов

СПб.,1999, 2000,2001, 2002 г.).

Результаты исследования апробированы и используются при обследовании больных в лаборатории функциональных и лучевых методов диагностики, на отделении нейроинфекций и реанимации НИИ детских инфекций г. Санкт-Петербурга; в биохимических лабораториях городской больницы г.Череповца Вологодской области; инфекционной больницы № 21 г. Волгограда; детской инфекционной больницы г. Краснодара; Российского нейрохирургического инО статута им. A.JI. Поленова; областной клинической больницы Оренбургской области. Материалы диссертации используются при обучении ординаторов, аспирантов и врачей на рабочих местах в НИИ детских инфекций, при проведении лекционных и практических занятий ФПК и ГТП СПбГПМА.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 52 работы, в том числе 9 - в центральных журналах, в главе монографии «Бактериальные

13 менингиты у детей», 3 - в методических рекомендациях, 2 - в пособиях для врачей, утвержденных Минздравом России. Получен патент на изобретение.

Связь с планами НИР. Работа выполнена в соответствии с государственной научно-исследовательской тематикой (№ государственной регистрации 01.9.80003542), плановыми темами НИР НИИ детских инфекций (1989-1999 гг.)

Структура диссертации. Диссертация изложена на 225 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных ц исследований, заключения, выводов, указателя использованной литературы

ВЫВОДЫ

Mt

1. Разработан экспресс-метод фракционирования ЦСЖ на основе гель-фильтрации на сефадексе G-50, позволяющий исследовать молекулярно-массовое распределение компонентов ликвора, определять абсолютные значения белкового и пептидного пулов при инфекционных заболеваниях центральной и периферической нервной системы у детей. Исследование содержания фракций ЦСЖ может быть использовано для оценки тяжести к заболевания, дифференциальной диагностики вирусной или бактериальной природы нейроинфекционного процесса и уточнения основного патогенетического механизма.

2. Характер изменений белкового и пептидного пулов ЦСЖ при нейроинфекциях у детей зависит от этиологии, периода инфекционного процесса, тяжести течения, осложнений и коррелирует с исходом заболевания. Наиболее выраженные нарушения в сторону их увеличения до 1,1 г/ л и более ь отмечаются в остром периоде заболевания при бактериальных гнойных менингитах гемофильной и пневмококковой этиологии, осложненных отеком головного мозга, тогда как при вирусных энцефалитах отмечается их максимальное отклонение до 0,5 г/л с преимущественным увеличением НМФ, ассоциирующихся с тяжелой очаговой симптоматикой. При инфекционных заболеваниях периферической нервной системы дифтерийной этиологии преимущественно наблюдается увеличение пептидов до 0,4 г/л при сниженном или нормальном содержании белкового пула, а при полирадикулоневритах, напротив, в 60 % случаев отмечается увеличение содержания высокомолекулярных компонентов при нормальном или сниженном содержании низкомолекулярных.

3. Благодаря исследованию белкового спектра ЦСЖ методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле возможно выявление характерных особенностей протеинограмм при различных нозологических формах нейроинфекций: для бактериального гнойного менингита типично появление полос гаптоглобинов типа 2-1 и 2-2, бета-л и п о проте и да, отсутствующих в норме и при вирусных менингитах и энцефалитах; для полинейропатий и вирусных нейроинфекций характерно увеличение содержания преальбумина, альбумина, острофазных белков постальбуминовой зоны.

4. В составе низкомолекулярных компонентов ЦСЖ с помощью метода обращеннофазной ВЭЖХ обнаружено до 40 пиков, отличающихся по степени гидрофобности и отражающих степень интратекального воспаления. Преобладание гидрофобных пиков коррелирует с осложненным течением и резидуальными проявлениями бактериального менингита и вирусного энцефалита, что свидетельствует об их повреждающем действии на мозговую паренхиму, тогда как преобладание гидрофильных пептидов сопровождается транзиторной очаговой неврологической симптоматикой, обусловленной нарушением л и кворо динамики и свидетельствует о воспалении преимущественно в оболочках мозга.

5. У больных вирусными и бактериальными нейроинфекциями формируются 3 варианта интратекального ответа, различающихся значением и соотношением белкового и пептидного пулов ЦСЖ, качественными и количественными особенностями их состава: при бактериальном менингите отмечается преимущественно 2-й тип интратекального ответа, при крайне тяжелых формах, осложненных ОГМ, — 3-й тип, а при вирусных энцефалитах и полинейропатиях - 1-й.

6. Алгоритм патобиохимической оценки состава ЦСЖ включает на 1-м этапе исследование содержания белкового и пептидного пулов ликвора экспресс-методом фракционирования, на 2-м - исследование белкового спектра методом диск-электроофреза в полиакриламидном геле. Определение в остром периоде бактериального менингита степени увеличения белкового и пептидного пулов ликвора позволяет прогнозировать течение и исход заболевания: при нахождении в диапазоне 0,3—0,5 г/ л прогнозируют средне-тяжелое течение с полным выздоровлением; в диапазоне 0,51-1,0 г/л - тяжелое

184 с незначительными резидуальными последствиями, в диапазоне, превышающем 1,1 г/л, - крайне тяжелое с выраженными неврологическими последствиями.

7. Высоко- и низкомолекулярные компоненты ликвора в эксперименте in vitro и in vivo оказывают как иммуномодулирующее воздействие на метаболические процессы лимфоцитов крови, их пролиферативную активность, способность к интерферонообразованию, синтезу антител, так и бактерицидное действие, максимальное в отношении менингококка и минимальное в отношении пневмококка и гемофильной палочки, что доказывает их участие в процессах пато- и саногенеза и объясняет терапевтический эффект ликворотрансфузии.

8. В патогенезе острых нейроинфекций у детей значимую роль имеют белки и пептиды ЦСЖ, изменение которых отражает степень интоксикации, воспаления оболочек и ткани мозга, нарушения ликворо- и гемодинамики, увеличение проницаемости гематоэнцефалического барьера и коррелирует с клиническими особенностями течения заболевания, что позволяет использовать их оценку не только для проведения дифференциальной диагностики вирусного и бактериального процесса, прогнозирования течения и исхода бактериального менингита, но и для определения терапевтической тактики с учетом ведущего патогенетического синдрома.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для исследования белкового и пептидного пулов ЦСЖ при нейроинфекциях у детей рекомендуется применять экспресс-метод гель-фильтрации на сефадексе G-50 fine, позволяющий в течении 2-х часов после проведения люмбальной пункции определять патобиохимическую направленность инфекционного процесса.

2. Для объективизации оценки степени интоксикации и воспаления к оболочек и ткани мозга, нарушения ликворо- и гемодинамики, увеличения проницаемости ГЭБ при первой люмбальной пункции у больных с нейроинфекциями необходимо определение уровня белкового и пептидного пулов ЦСЖ методом гель-фильтрации на сефадексе G-50 fine с расчетом их соотношения, а также оценка относительного и абсолютного содержания белковых фракций методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле, что позволяет провести комплексную оценку интратекальных процессов.

3. Для прогнозирования характера течения и исходов бактериальных гнойных менингитов у детей в остром периоде заболевания параллельно с клиническим анализом цереброспинальной жидкости необходимо исследование содержания высоко- и низкомолекулярных компонентов ликвора. При значении содержания белковых и / или пептидных компонентов в диапазоне 0,3-0,5 г/л прогнозируется среднетяжелое течение болезни с полным выздоровлением, в диапазоне 0,51-1,0 г/л - тяжелое течение с резидуальными проявлениями, при увеличении одного или обоих пулов свыше 1,1 г/л — очень тяжелое течение со стойким неврологическим дефицитом. При значении каждого из пулов в диапазоне 0,18-0,25 г/л диагностируют норму.

4. Коррекцию терапии при нейроинфекциях необходимо проводить с учетом характера дисбаланса белково-пептидных компонентов ЦСЖ и степени увеличения абсолютного содержания белковых фракций. При наличии дисбаланса белково-пептидных компонентов в сторону повышения высокомолекулярных компонентов, которые являются результатом проникновения в цереброспинальную жидкость острофазных белков и способствуют развитию внутричерепной гипертензии и отека мозга, в комплексе терапии необходимо применять осмо- и онкодегидратанты, нейрометаболиты. При дисбалансе с увеличением низкомолекулярных компонентов, являющихся следствием распада белков, микроорганизмов, клеток ЦСЖ, что усугубляет тяжесть интоксикации, показано усиление дезинтоксикационной терапии на протяжении всего острого периода бактериального гнойного менингита.