Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Жизнеспособность гепатоцитов в монослойной культуре при воздействии витрифицирующих концентраций этиленгликоля и 1,2-пропандиола

На правах рукописи

РГБ ОД

Диалло Мухамаду 1 9 ОКТ 199У

ЖГОНЕСПОСОБНОСТЬ ГЕПАТОЦИТОВ в монослоинои КУЛЬТУРЕ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ВИТРИФИВДРУЮЩИИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ И 1,2 -ПРОПАНДИОЛА

14.00.23 - Гистология, Цитология, Эмбриология 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва- 1999

Работа выполнена в ИПК и К НАН Украшш.

Научный руководитель:

член-корр. НАНУ, проф.

А.М.Белоус

Официальные оппоненты:

член-корр. РАМН, проф. В.А.Шахламов

док.мед.наук, проф. В.Э.Торбек

Ведущая организация:

Российский Государственный Медицинский Университет им. Н.И.Пирогова

Защита состоится "30" сентября 1999г. в 12ч. на заседании диссертационного совета Д. 001.04.01 НИИ морфологии человека РАМН по адресу 117418, Москв; ул. Цюрупы, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека РАМН.

Автореферат разослан 27 августа 1999г.

Учёный секретарь, диссертационного совета

£<?*/,¿у, о

б:

канд. Ьиол. наук ИЛЛиельяненко

ГЛАВНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Большое значение в настоящее время представляют собой вопросы, которые связаны с определением особенности поведения биологических объектов разного уровня организации в присутствии витрифицирующих концентраций криопротекторов. При этом, на первом плане стоит определение принципов подбора композиционного состава среды насыщения, что в перспективе обеспечивает разработку оптимальных условий подготовки биообъектов к последующему замораживанию, гипотермическому или низкотемпературному хранению.

В современном представлении среди многих факторов, которые способны вызвать повреждение клеток, одним из первых является высокая осмолярность среды, которая способствует вымораживанию объемной воды при температурах, которые близки к евтетики. Повреждение клеток при воздействии высоких концентраций солей и неэлектролитов (а также криопротекторов) связано с ос' мотической деградацией и одновременно с изменением объема и формы клеток, а также с модификацией структурного состояния комплекса цитоскелет-мембраны. Степень этих изменений зависит от температуры, композиционного состава и осмолярности среды. Одновременно в каждом из этих факторов может быть изменение соответствующим образом, путем подбора компонентов среды, их концентрации и быстрого охлаждения. При этом важно обратить внимание на то, что осмотический эффект, который связан с естественной кристаллизацией, может быть отстранен при использовании высоких концентраций криопротекторов. В связи с этим большое внимание в этой работе уделялось определению осмотических и температурных параметров среды, которые обеспечивают жизнеспособность гепатоцитов при насыщении в присутствии вит-■ рификации концентрации криопротекторов и их стойкость при гипотермиче-ском сохранении и замораживании. Значение параметров среды обусловлено не только тем, что они обозначают следующую реакцию клеток на изменение параметров среды в процессе снижения температуры, а и тем, что они контроли-

руют сохранение жизнеспособности биообъектов при долгосрочной экспозиции в нефизиологических условиях.

В настоящее время практически отсутствуют данные о том, как начальные условия влияют на гепагодиты при их насыщении проникающими криопротек-торами в нитрифицирующих концентрациях. Также данные, которые указывают, как модифицирующие действия высоких концентраций этих сред реализуются в условиях длительной экспозиции при конечных температурах сохранения.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Актуальность проблемы связана с недостатком данных начальных параметров среды на процессе насыщения биообъектов витрифицирующими концентрациями проникающих ¡сриопротекторов в условиях долгосрочного экспонирования при гипотермическом сохранении и замораживании.

Последнее обстоятельство чрезвычайно важно для криобиологической практики, поскольку низкотемпературное экспонирование является основой консервирования клеток. Здесь особенно заметно отсутствие данных о характере влияния конечных состояний клеток на их стойкость к осмотической дегидратации в криозащитных средах, которые могут быть использованы для эффективного гипотермического сохранения и замораживания, а также обуславливают новые способы низкотемпературного сохранения суспензии клеток, клеток в культуре и органов. Кроме того, остаются неизученными вопросы, связанные с реализацией механизмов, которые обеспечивают повышение или снижение структурной стабильности клеток в условиях их насыщения высокими концентрациями (до 60%) проникающих крипротекторов. С другой стороны, модельное исследование позволяет ответить на вопрос, как начальные стадии определяют поведение биообъектов в процессе длительного контакта с высокими концентрациями криозащитных веществ, например, при гипотермическом сохранении или перфузии.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

С учетом вышеизложенного, целью этой работы является изучение влияния нитрифицирующих концентраций ЭГ и 1,2-ПД на жизнеспособность гепа-тоцитов в монослойной культуре при гипотермическом сохранении и замораживании.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить влияние среды насыщения, содержащей проникающие крио-протекторы с разным коэффициентом проникновения (этиленгликоль - 1Ü"3 и 1,2-пропандиол - 10'2), а также электролитов (75-450 мМ NaCJ) на барьерных функциях гепатоштов (по выходу флуоресцейна ЛДГ, лактата и 1С) при +20°С и +4°С.

2. Определить влияние начальных осмотических параметров растворов, содержащих NaCl, KCl, CaCl? и сахарозы, а также температурных условий, среды насыщения гепатоцитов витрифицирующими концентрациями (40-60%) ЭГ и 1,2-ПД на барьерных свойствах мембраны методами выхода флуоресцейна, ЛДГ, лактата и К\ и сохранности способности к биосинтезу белка и к эндогенному дыханию на этапе насыщения после гипотермического сохранения и замораживания.

3. Выяснить влияние условий удаления криопротекторов на морфофунк-циональное состояние изолированных гепатоцитов, например, при их использовании в клинической практике.

НАУЧНАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Установлено, что исходные условия среды насыщения криопротекторов определяют поведение клеток в условиях действия гипотермического (+4°С) и замораживании (-196 С).

Физико-химические характеристики криопротекторов обусловлены разной стойкостью клеток к действию повреждающих факторов температурного влияния. Повышение чувствительности клеток к смене осмотических условий срсд при насыщении клеток витрифицирующими концентрациями криопротекторов связано с нарушением барьерных функций мембран, т.е. развитием потери катионов. Эти изменения происходят на фоне изменения форм клеток. Проведен анализ, который показывает связь между проникающей способностью криопро-тскторов, которая оценивается коэффициентом проникновения, количеством связанной не выморажешюй воды и исходными условиями среди эквилибра-ции (композиционный состав и температура) на этапе насыщение гелатощггов витрифицирующими ЭГ' и 1,2-ПД.

Определение исходных параметров среды в условии насыщении гепатоци-тов витрифицирующими концентрациями криопротекторов, при которых происходит изменение стойкости к гипотермическому сохранению и замораживанию. Полученные данные могут быть использованы для разработки методов низкотемпературного консервирования биообъектов в верифицирующем состоянии при условии действия умеренных температур +4°С, что не требует использование дорогого оборудования, также они обуславливают подходы для разработки метода долгосрочного сохранения органов после после их насыщения витрифицирующими концентрациями криопротекторов в условиях действия гипотермической перфузии.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД СОИСКАТЕЛЯ.

Диссертационное исследование выполнено под научным руководством член. кор. Академий Наук Украины A.M. Белоуса, в сотрудничестве с канд. биол. наук В.А. Кош еловым, с которыми автор имеет совместные публикации. Все результаты, приведенные в рукописи, получены соискателем самостоятельно. Диссертантом лично проведены эксперименты и определение выбран-

ных для исследования биохимических показателей, проанализирована литература по теме исследования, обсуждены полученные результаты.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНЕСЕННЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Проникающие криопротекторы в витрифицирующих концентрациях (40-60%) позволяют сохранить клетку в жизнеспособном состоянии в условиях их насыщения криозащитными соединениями, гепотермического (+4°С) и замораживания (-196°С). Повреждающие эффекты высокой концентрации криопро-текторов могут быть сведены к минимуму путем вариаций температурой, осмо-лярностью и композиционным составом среды насыщения.

2. Действие витрифицирующих концентраций криопротекторов зависит от физико-химических особенностей криопротекторов - чем ниже коэффициент проникновения, тем выше процент сохраненных клеток. В диапазоне осмоляр-ности 75...150 мМ NaCl степень сохранения клеток в пристутствии витрифицирующих концентраций криопротекторов достигает максимального уровня. Введение в композиционный раствор ионов К+ и сахарозы позволяет поддерживать ионный гомеостаз клеток и сохранять их жизнеспособность в условиях продолжительного хранения и замораживания.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения работы изложены и оговорены на Международном симпозиуме по использованию низких температур в биологии (Belgium, Leuven,

1995), Международном 31 съезде общества криобиологов (Japan, Kyoto, 1994), I Украинском съезде физиологов (Киев, 1994), I Украинском съезде общества криобиологов (Харьков, 1995), I Украинском съезде трансплантологов (Запорожье, 1995), научной конференции молодых ученых-биологов ХГУ (Харьков,

1996), VII биохимическом съезде (Киев, 1997).

По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ.

Работа изложена на 130 страницах машинного текста, содержащая 20 рисунков и список литературы, который состоит из 319 работ (из них 249 зарубежных авторов).

ОБЪЕКТ'И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовали крыс весом 180-200 г.

Анестезированному животному вскрывали брюшную полость, вводили инъекционную иглу в воротную вену и закрепляли лигатурой. Нижнюю полую вену надсекали для оттока перфузата. Перфузию проводили через систему переливания крови с использованием перистальтического насоса. Нагретый до 37°С сахарозный раствор пропускали через орган в течение 15 мин. После окончания перфузии печень извлекали из брюшной полости и перфузировали средой, содержащей коллагеназу, в течение 30 минут в режиме рециркуляции. Диспсргацию проводили вручную, используя нейлоновую ткань. Отделение жизнеспособных гепатоцитов от поврежденных проводили путем центрифугирования первичной суспензии гепатоцитов в течение 1,5-2 мин. при 1000 об/мин. После разделения клетки промывали средой 199. Уровень структурно-функциональной сохранности клеток оценивали по исключению трипанового синего, выходу ионов калия, выходу молочной кислоты, выходу флуоресцеина и выходу ЛДГ; и к способности биосинтеза белка эндогенному дыханию.

Выход К+ регистрировали на пламенном фотометре. Количество молочной кислоты, флуоресцеина и ЛДГ определяли флуориметрически.

Культура гепатоцитов проводилась следующим путем:

Суспензию клеток полученной при выделении (смотри выше) наносят в чашку Петри, покрытую коллагеном. Предварительно в чашку Петри добавляется антибиотик для. предотвращения возможных цитотоксических эффектов. Затем чашка Петри устанавливается в термостате при 37°С в течение одного часа.

Способы насыщения криопротектором.

Стекло с монослоем поместить в различные изотонические среды с криопротектором и выдержать при +4°С в течение 10, 30, 60 и суток. Насыщения проводятся поэтапно в 10%, 20%, 40%, 60% соответствующего криопротектора.

1. Влияние концентрации №С1 и температуры среды на внутриклеточное содержание флуоресцейна, ЛДГ, лакгата и калия

Полученные результаты показали, что насыщение гепатоцитов как ЭГ так и 1,2-ПД приводит к достоверному снижению внутриклеточного уровня флуоресцена, ЛДГ, лактата и калия, независимо от температуры инкубации и концентрации ШС1 в используемых средах, причем снижение выше указанных веществ было максимально в 60% растворе ЭГ и 1,2-ПД.

Снижение температуры инкубации до +4°С увеличивало сроки возникновения везикул в среднем в 2 раза и также не зависило от содержания КаС1.

Наиболее чувствительным методом, характеризующим изменение клеточной мембраны явился показатель уровня внутриклеточного калия по сравнению с уровнями ЛДГ, лакгата и флуоресцина.

Наши результаты позволяют предположить, что взаимодействие таких высоко метаболизирующих ■ клеток, как гепатоциты с высокими концентрациями проникающих криопротекторов ЭГ и 1,2-ПД, вызывает снижение барьерных свойств мембраны клеток и потерю клеткой указанных выше веществ, причем это коррелирует и может быть связано с коэффициентом проницаемости используемых криопрогекторов через мембрану клеток. Коэффициент проницаемости для 1,2-ПД выше, чем для ЭГ (коэффициент проникновения ЭГ - 10"3, 1,2-ПД - 10"2). Подобным механизмом можно объяснить разницу во времени формирования везикул клеток, а также возникновение их в случае инкубации 40%-ном растворе 1,2-ПД по сравнению с 60%-ым ЭГ, а также при снижении температуры инкубации +4 С.

2. Распределение криопротекторов между средой и гепатоцитами при условии их насыщения возрастающими концентрациями криопротекторов

Защитное действие криопротектора на систему клеток включает в себя и модификацию состояния структурно-связанной воды. Использование метода ЯМР-спектроскопии позволяет наблюдать зависимость коэффициента распределения криопротектора Q между средой и клеткой при условиях их насыщения возрастающими концентрациями ЭГ и 1,2-ПД (10-20-40-60)% в среде экви-либрации, которая содержит разные концентрации NaCl (75-150 мМ), а также оценить уровень влияния криопротекторов на незамерзшем участке клеточной воды.

Полученные данные показали, что значение коэффициента Q для 1,2-ПД выше, ниже для ЭГ. Однако, изменение этих величин в зависимости от осмо-лярности среды имеет одинаковый характер. Снижение температуры насыщения до +4СС привело к уменьшению коэффициента.

Анализ уровня сохранения клеток показал, что оптимальной с точки зрения сохранения гепатоцитов есть эквилибрация в 60% растворе криопротектора в присутствии 150 мМ NaCl. Данные эксперименты показывают, что коэффициент распределения Q в этих условиях приближается к 1. Это может быть связано с гомогенностью фазы, что обеспечивает наиболыие благоприятных условий для витрификации.

Был проведен анализ состояния воды при 0°С, -30°С, -50°С в суспензии гепатоцитов, которая содержит 10% до 60% 1,2-ПД в среде с разным составом NaCl (75,150 и 450 мМ). Показано, что при насыщении гепатоцитов при +4°С растворами, которые содержат разные концентрации NaCl в присутствие 10% 1,2-ПД, в клетках остается значительное количество свободной воды, которая полностью замерзает при температуре -30°С. При этом участок незамерзшей воды при 0°С, 30°С и 50° С незначительно уменьшается при увеличении в среде эквилибрации концентрации NaCl, а при действии 450 мМ участок незамерзшей воды возрастает. При повышении концентрации криопротектора в среде до 60% вся клеточная вода находится в связанном состоянии.

Можно сказать, что есть четкая корреляция между параметрами, которые анализировались (барьерная функция мембраны, коэффициент распределения криопротектора, количество незамерзшей воды) и композиционным составом среды, а также осмолярносгью. Это означает, что нитрифицирующее действие криопротекторов на клетку в значительной мере зависит от исходных условий, при которых происходит насыщение клеток, а также физико-химических свойств криопротекторов. Изменение количества незамерзшей воды в условиях изменения концентрации криопротектора в среде говорит о том, что происходит изменение в водном балансе клеток и, соответственно изменяются объем и морфологичные характеристики клетки.

3. Влияние композиционного состава среды и температуры иикубации на внутриклеточное содержание флуоресцейна, ЛДГ, лактата и калия

Учитывая вышеизложенное, в последующих экспериментах насыщение клеток крнопротекторами проводили в условиях гипотермии, причем, в состав среды инкубации дополнительно вводили КС1 с целью предупреждения утечки внутриклеточного калия, Са2+ для поддержания гомеостаза, а также в качестве осостабилизатора 5% сахарозы.

Таким образом, концентрация внутриклеточного калия является гораздо более чувствительным критерием, оценивающим повреждение плазматической мембраны клеток и функциональное состояние гепатоцитов, нежели окрашивание трипановым синим, внутриклеточное содержание флуоресцейна, ЛДГ или лактата (Рис. 1-4).

Потеря К+ гепатоцитами и соответствующие изменения в отношении Ыа+/К+ начинаются до того, как наступают изменения в прокрашиваемости клеток трипановым синим или в содержании ЛДГ и лактата. Так, снижение концентрации внутриклеточного калия в течение многочасовой инкубации

ЭГ (+20 °С) ЭГ (+4 °С) 1,2-ПД (+20 °С) 1,2-ПД (+4 °С)

Рисунок JVa 1: Влияние качества криопротектора в S растворе на внутриклеточное содержание флуоресцейна: S (15ÖnMNaCl, 150 мМ KCl, 0,6 мМ Са2+и 150мМ сахарозы).

Рисунок № 2: Влияние качества криопротектора в S растворе на внутриклеточное содержание ЛДГ: S (150 мМ NaCl, 150 мМ КС1,0,6 мМ Са 2+ и 150 мМ сахарозы).

100 I I

90 80 О Контроль □ 20% 1П 60%

70 60 - -

ä? 50 - -

40 - Ш

30 - ffig Ж

20 " ш ш

10 - щ ■

ЭГ (+20 -С) ЭГ (+4 С) 1,2-ПД (+20 °С) 1,2-ПД (+4 °С)

Рисунок № 3: Влияние качества криопротектора в S растворе на внутриклеточное содержание лактата: S (150 мМ NaCl, 150 мМ KCl, 0,6 мМ Ca2f и 150 мМ сахарозы).

Рисунок № 4: Влияние качества криопротектора в S растворе на внутриклеточное содержание калия: S (150 мМ NaCl, 150 мМ КС1,0,6 мМ Са 2+ и 150 мМ сахарозы).

клеток почти на 40% проходило на фоне практически неизменного количества окрашенных клеток (6-8%).

Гепатоциты, изолированные из печени цыпленка перфузионным и неперфузионным (из срезов) методами, имели существенно разное содержание внутриклеточного калия (193 и 139 нМ/мг сухого веса соответственно), хотя они давали практически одинаковую реакцию на трипановый синий.

Так же хорошо известно, что Са2+ в среде консервации в пределах 0,3-0,6 мМ соответствует необходимой концентрации для оказания восстановительного эффекта. Са2+ проявляет свое защитное действие путем подавления перекисного окисления липидов во время гипотермического хранения, таким образом позволяет поддержать высокий уровень жизнеспособности.

Полученные результаты показали, что уровень внутриклеточного калия даже возрастал в среднем на 20-25%, а содержание флуоресцейна, ЛДГ и лактата снижалось. Параллельно увеличение концентрации криопротектора до 60% как ЭГ так и 1,2-ПД вызывает снижение содержания этих маркеров до минимальных значений. Визикуляция гепатоцитов наступило в случае 60%, а в случае ЭГ через 4 суток, 1,2-ПД через 6 суток (Рис. 5-8).

Величина и длительность изменений клеточного объема, вызванные изменениями клеточной концентрации проникающих растворов криопротекторов, зависят от осмотического градиента через клеточную мембрану и проницаемости мембраны. Возможность смягчения осмотических стрессов реально, если поэтапно насыщать гепатоциты растворами криопротекторов или добавлять в растворы для насыщения сахарозу. Степень сжатия, вызванная добавлением сахарозы не является повреждающей для гепатоцитов. Также, изменение в условиях насыщения с целью снизить токсичность, в частности путем снижения температуры на первом этапе разбавления, позволяет повысить устойчивость гепатоцитов.

Рисунок № 5: Влияние композиционного состава среды инкубации на внутриклеточное содержание флуоресцейпа: В(150 мМ NaCl) и S (150 мМ NaCl, 150 мМ KCl, 0,6 мМ Ca 2+ и 150 мМ сахарозы).

100 90 80 -70 -60 -^ 50 40 30 -20 -10 О

П Контроль □ 20% (ЭГ) 0 60% (ЭГ)

В (+20 °С)

S (+20 °С)

В (+4 °С)

S (+4 °С)

100 -| 90 -80 -70 60

^ 50 40 30 20 10 -0

□ Контроль

□ 20% (1,2-ПД) ЕЭ 60% (1,2-ПД)

В (+20 °С)

S(+20 °С)

В (+4 °С)

S (+4 °С)

Рисунок № 6: Влияние композиционного состава среды инкубации на внутриклеточное удержание ЛДГ: В(150 мМ NaCl) и S (150 мМ NaCl, 150 мМ КС1, 0,6 мМ Са 2+ и 150 мМ сахарозы).

Рисунок № 7: Влияние композиционного состава среды инкубации на внутриклеточное содержание лактага: В(150 мМ NaCl) и S (150 мМ NaCl, 150 мМ КС1,0,6 мМ Са 2+ и 150 мМ сахарозы).

100 90 80 70 60

¿s so ^

40 30 20 10 0

100 90 80 70 60

S? 50 40 30 20 10 0

fj .-а ^

В (+20 вС)

S (+20 »С)

* 1

«я

А

л

Stw

В (+4 "С)

5»К

□ Контроль

В 20% (ЭГ)

Ш60%(ЭГ)

S (+4 °С)

rt

□ Контроль

□ 20% (1,2-ПД)

□ 60% (1,2-ПД)

В (+20 °С)

S (+20 "О

В (+4 °С)

S (+4 °С)

Рисунок JVs 8: Влияние композиционного состава среды инкубации на внутриклеточное содержание калия: В(150 мМ NaCL) и S (150 мМ NaCl, 150 мМ КС1, 0,6 мМСаг+и 150 мМ сахарозы).

4. Морфофункциональное состояние гепатоцитов, использование их в клинической

практике

Микроскопическое исследование показало, что гепатоциты в монослойной культуре имели форму полигона и сохраняли поляризованную морфологию в течение несколько недель.

Экспозиция гепатоцитов при +4°С в В растворе приводит к появлению гранулированной цитоплазмы и потери четких границ межклеточных взаимодействий в монослойной культуре после 60 мин. Образование везикул происходит 30 мин. после разрыва плазматической мембраны (Рис. 10). Одни гепатоциты проявляли более высокую чувствительность к образованию везикул и лизиса под действием гипотермии, чем другие. Это происходит независимо от места расположения клеток в культуре: по центру или по краю. Экспозиция клеток в В растворе при +4°С в течение 24 часов показывает, что 90% гепатоцитов находятся в лизис состоянии.

При экспозиции гепатоцитов в 8 растворе образование везикул появляется намного меньше по сравнению с их экспозицией в В растворе. Признаки клеточной дегенерации, такие как пикнотичного ядра и потери четких границ клеток, не проявлялись раньше 4-6 часов гипотермической экспозиции. При экспозиции гепатоцитов в Б растворе при +4°С в течение 24 часов в присутствии 60% ЭГ клетки становятся все больше и больше гранулированными без образования везикул и лизиса. Признаки дегенерации проявляются только после 24 часов. Даже после 96 часов, клеточные границы и ядра клеток были еще четко видны, хотя в мембране везикулы начинают образовываться.

Рисунок № 9. Влияние гипотермии на морфологическое состояние гепатоцитов в монослойной культуре до и после 24 часов гипотермической экспозиции. (А) до экспозиции, (В) экспозиция в изотоническом растворе (150 мМ NaCl) без криопротектора. (С) до экспозиции, (D) экспозиция в S растворе (150 мМ NaCl, 150 мМ KCl, 0,6 мМ Ca и 150мМ сахарозы) без криопротектора. (Е) до экспозиции, (F) экспозиция в S растворе, содержащем 60% ЭГ. Бар= 25 мкш.

Рисунок № 10. Влияние гипотермии на морфологическое состояние гепатоцитов в монослойной культуре (7 дней культуры). (А) до экспозиции, (В) после 3 часов экспозиции в Ь растворе, (150 мМ NaCl, 150 мМ KCl, 0,6 мМ Са2+ и 150 мМ сахарозы), содержащим 60% ЭГ. После 3 часов, видны везикулы (вокруг) и гранулированная цитоплазма.

Сравнительное исследование функциональной активности деконсервированных гепатоцитов кадаверов и плодов человека выявило некоторые возрастные особенности. С увеличением сроков развития плодов от 16 до 26 недель отмечалась тенденция к увеличению уровня эндогенного дыхания и снижению стимуляции дыхательной активности экзогенным суксинатом.

Изучение влияния криоконсервации гепатоцитов в культуре каждой исследованной группы, показало угнетение способности исключать супавитальный краситель, включать меченые аминокислоты в суммарные белки, а также увеличивать скорость окисления экзогенного сукцината, что свидетельствует о нарушении целостности плазматической мембраны и изменении ее барьерных свойств. Включение меченных предшественников в суммарные белки деконсервированных гепатоцитов плодов человека 24-26 недель развития было значительно угнетено независимо от температуры +20 или +4°С.

Анализ изменений функциональной активности гепатоцитов плодов человека 24-26 недель развития, после криоконсервации показал, что

использование 20% ЭГ или 20% 1,2-ПД обеспечивает одинаковый эффект в отношении исследованных параметров. Однако, включение меченых аминокислот и скорость эндогенного дыхания были значительно выше в гепатоцитах плодов человека 24-26 недель развития. При этом следует отметить более выраженную криочувствительность гепатоцитов выделенных из печени плодов человека, чем из печени кадаверов.

Деконсервированные гепатоциты, после отмывки криопротекторов, применяли у больных с острой и хронической печеночной недостаточностью в качестве компонента диффузионной системы. Показанием к клеточному диализу явились тяжелые формы острой печеночной недостаточности с резко выраженным эндотоксикозом и нарушением основных показателей гомеостаза. Для приготовления биологического диализирующего раствора брали клеточную взвесь из расчета 5-10мл клеток на килограмм массы больного. Гепатоциты разводили в растворе Хенкса и помещали в капиллярный диализатор. Проводилось подключение с использованием артериовенозного шунта или кубитальных вен. С помощью аппарата "Искусственная почка" со скоростью 50-65 мл/мин в тчечение 1-1,5 часа осуществлялась перфузия.

Об эффективности применения гепатоцитов судили по уменьшению проявления токсичной энцефалопатии, улучшению клинического состояния больных, динамика снижения билирубина, фракции трансаминаз, уменьшению эндотоксикоза, который оценивался по уровню средних молекул.

Проводились клинические наблюдения. Больной А., 38 лет находился в отделении острой печеночно-почечкой недостаточности (ОППН) с диагнозом -"отравление дихлоридом. Острая печеночно-почечная недостаточность ОППН". Из анализа: с суицидальной целью принял 15 мл дихлорэтана.

Больному проведены лечебные мероприятия по выведению яда из организма. Несмотря на проводимую терапию у больного, однако, развилась ОППН. На 5-е сутки после отравления больному наряду с сеансами гемодиафильтрации, начато лечение диализом с использованием деконсервированных гепатоцитов, полученными нами из печени человека 24-26

недель развития. Было проведено 5 клеточных диализов с интервалом 2-х дней. По окончанию проведенного лечения больной стал активен, сознание ясное и аппетит появился. Также отмечена положительная динамика со стороны биохимических показателей: уровень общего билирубина снизился с 300 мкМ/л до нормального, аспаргатаминотрансфе-раза (АсАТ) с 3,2 до 0,5 мкМ час/мл, аланинаминотрасфераза (АлАТ) с 8,4 до 0,8 мкМ час/мл.

По данным доплерографии, также отмечено улучшение печеночного кровотока.

Больной В., 42 года, поступил с диагнозом "Биллиарный цирроз печени". При поступлении состояние средней тяжести. В анализах крови имелась выраженная билирубинемия и ферментемия. Больному проводили консервативные методы лечения, в том числе и некоторые хирургические плазмоферезы. Однако состояние больного не улучшалось, поэтому в комплекс проводимой терапии были включены клеточные гемодиализы со свиными гепагоцитами. Эти свиные гепатоциты были получены и консервированны нами по описанным выше методам.

После проведения 7 клеточных диализов значительно улучшилось самочувствие больного, улучшились биохимические показатели крови. Отмечается снижение билирубинемии и ферментемии, улучшилась экскреторная функция гепатоцитов по данным вофавердиновой пробы.

Надежность разработанных методов получения и криоконсервации гепатоцитов плодов человека и кадаверов в отношении сохранения их структурных и функциональных свойств подтверждена не только экспериментальными исследованиями, но и эффективностью их практического использования у 13 больных (отравление грибами и гепатотропными ядами -СС14, дихлорэтаном и др.) с фиксацией гепатоцитов на полупроницаемой мембране.

Более выраженная эффективность проведения "клеточной" терапии с применением гепатоцитов по сравнению с другими методами, используемыми с целью дотоксикации, требует тщательного выяснения их механизма действия,

поскольку он обеспечивается не высокой сорбционной способностью клеток, а другими механизмами, расшифровка которых пока не сделана. Таким образом, полученные результаты показали, что взаимодействие криопротекторов с клеточной мембраной приводит к увеличению ее проницаемости и определяется коэффициентом проницаемости, используемых криопротекторов. Подтверждением этого является утечка калия, флуоресцейна, лактата и ЛДГ способность к биосинтезу белка и к поддержке высокого уровня эндогенного дыхания при +4 С по сравнению с +20 С инкубации. Потеря внутриклеточных компонентов определяется их размерами, чем он меньше, тем быстрее выходит из клетки. Существенным моментом является время везикуляции клеток и концентрация криопрогектора, который также совпадает с проникающей способностью их для клеточной мембраны. Температура инкубации при насыщении клеток высокими концентрациями криопротекторов является одним из факторов, который позволяет уменьшить возникающие повреждения.

Дополнительное введение таких компонентов в среду насыщения, как калия, кальция и сахарозы в условиях гипотремии, позволяют предупредить потерю клетками калия и пролонгировать время возникновения везикул. Эти результаты позволяют предположить, что в основе повреждения клеток при насыщении их высокими концентрациями проникающих криопротекторов лежит осмотический диффузионный механизм, которым можно управлять, варьируя параметры инкубации, такие как температура, осмолярность, концентрация электролитов, с учетом коэффициента проницаемости используемых криопротекторов.

ВЫВОДЫ

1. При насыщении витрифицирующими концентрациями криопротекторов (ЭГ и 1,2-ПД) жизнеспособность гепатоцитов зависит от концентрации NaCl и температуры среды насыщения. Жизнеспособность гепацитов, при гипотермическом хранении и замораживании-отогреве достигает максимума при использовании 150 мМ NaCl.

2. Витрифицирующие концентрации криопротекторов приводят к потери внутриклеточных маркеров: флуоресцейна, ЛДГ, лактата и К+. Добавление в среду насыщения таких компонентов как К+ (150 мМ), Са2+ (0,6 мМ) и сахарозы (5%) обеспечивает поддержание уровня внутриклеточных маркеров в этапах насыщения и позволяет сохранить способность клеток к биосинтезу белка и к эндогенному дыханию при +20° и 4"С.

3. При инкубации клеток в присутствии витрифицирующих растворов криопротекторов наблюдается изменение коэффициента проницаемости криопротекторов Q между клетками и средой по мере увеличения концентрации NaCl в среду насыщения.

4. При насыщении витрифицирующими концентрациями криопротекто-ров (ЭГ и 1,2-ПД) отмечается возростная криочувствительность гепатоцитов. Была получена более выраженная криочувствительность гепатоцитов, выделенных из печени плодов человека (16-24 недель развития), чем из печени кадаверов.

5. Криопротекторы в витрифицирующих концентрациях (40-60%) противодействуют внутриклеточной и внеклеточной кристаллизации при замораживании до -100°С и отогреве.

6. Ступенчатая отмывка криопротекторов у гепатоцитов в монослойной культуре, ранее консервированных до -100°С в присутствии витрифицирующих концентраций ЭГ и 1,2-ПД (40-60%), позволяет получить морфологические и клинические результаты близкие к. результатам, полученных на нативных гепатоци-тах в монослойной культуре.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Diallo M., Koptelov V.A., Gerrario L., Dvortsevoy V.K., Kuleshova L.G. Effect of vitrifying concenrations of cryoprotectants on hepatocyte survival. // Proc. Internation. Meet. Soc. Low Temp. Biol., K.U. Leuven, Belgium. - 1994 -P. 17

2. Диалло М.,Дворцевой B.K., Кирошка В.В., Коптелов В.А. Повреждение биологических объектов при витрификации: роль температуры и композиционного состава среды. - Тез доп. «I Укр. з'Тзд тов. Крюбюл. Крюмед.», XapicÏB. - 1995 - С. 69-70

3. Белоус A.M., Дворцевой В.К., Диалло М., Кирошка В.В., Коптелов В.А. Механизм повреждения биологических объектов при использовании витрифицирующих сред. - Сучасш пробл. Клш. Експер. Трансплантологи, Кшв. - 1995 - С. 56

4. Белоус A.M., Диалло М., Дворцевой В.К., Кирошка В.В., Коптелов В.А. Сохранность клеток при витрификации: значение температуры и композиционного состава среды. - Сучасш пробл. Клш. Експер. Трансплантолога, Кшв. - 1995 - С. 95-96

5. Дворцевой В.К., Кирошка В.В., Коптелов В.А., Диалло М., Загнойко A.B. Флуоресцентный способ динамического контроля жизнеспособности органов и клеток. - Физика и химия органич. Люминофоров-95, Тез. Докл., Харьков.- 1995-С. 39

6. Зинченко A.B., Дворцевой В.К., Диалло М.,

О влиянии сахарозы на низкотемпературные фазовые переходы в растворах некоторых криозащитных веществ. - Проблемы криобиологии. - №2 - 1995 -С. 52-53

7. Диалло М.

Исследование действия этиленгликоля и 1,2-пропандиола на первичную культуру гепатоцитов крыс. - Подано к публикации.

8. Диалло М., Кулешовам Л.Г.

Структурные изменения первичной культуры гепатоцитов крыс в витрифицирующих растворах криопротекторов. - Подано к публикации.

Диаляо Мухамаду - жизнеспособность гепатощггов в монослойной культуре при воздействии витряфнцирующкх конценграцин этилен-гликоля и 1,2 -проиандиола.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальностям 14,00.23 - гистология, антология, эмбриология и 03.00.04 -биохимия НИИ морфологии человека РАМН, Москва, 1999г.

Защищается 8 научных работ, содержащих подробный анализ связи между исходными осмотическими и температурными условиями, а также электролитным н неэлектролитным составом среды насыщения на устойчивость гепатоцнтов в монослойной культуре к действ™ нитрифицирующих концентраций проникающих криопротекторов.

Установлено, что характер модификации клеток криозащитными веществами коррелируете* с направленностью и глубиной изменения их морфологии, а также с изменением барьерной функции мембраны, что сопровождается освобождением внутриклеточных электролитов.

Diallo Mouhamadou - Viability of frepatoeytes in monolayer culture exposed to vitrifying concentrations of ethylene glycol and 1,2-propane diol.

Thesis for Ph.D degree in 14.00.23-Histology, Cell biology. Embryology and 03.00.04 -Biochemistry. Reseach Institute of Human Morphology. Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 1999.

S scientific works are defended comprising the deiailled analysis of interaction between initial osmotic and temperature conditions, as well as electrolyte and non-electrolyte content of saturation medium on the hepatocyte resistance to the action of vitrifying concentration of penetrating eryoproiec-tants.

SUMMARY

The successful use of isolated hepatocytes for transplantation will, no doubt, require cryopreservation of the cclls. However, ciyopreservation results in the loss of viability of hepatocytes in monolayer culture. In this study, a method is described that allows recovery of viable hepatocytes after cryopreservation.

The study on hepatocytes in primary culture was carried out on slide-covers and Petri dishes which had been coated with collagen. The studied cryoprotectant solutions contained NaCl at various concentrations (75-450 mM), 5 mM phosphate buffer (pJH 7.4), or NaCl (150 mM), 5 mM phosphate buffer (pH 7.4), KC1 (150 mM) and sucrose 5%. Preservation of viability of hepatocytes -was assessed by the content of fluorescein, LDH, lactate, K* and also the protein synthesis and endogenous resperatory capacities of the hepatocytes. Saturation of primary culture of the hepatocytes with cryoprotectant solutions was a multistepped process-adding volume concentrations of 10, 20, 40 and 60% at each step at 20°C and 4°C- Attainment of vitreous state and morphological response of the cells to freeze-thaw at the rate of )0°C/min.to -100°C was monitored by cryomicroscopy. It has been established thai 60% solutions of ethylene glycol and 1,2-propane dio! rendered the achievement of vitreous state possible. The step-by-step saturation of hepatocytes with vitrifying concentrations of these cryoprotectants caused fall in barrier function of hepatocyte membrane and was expressed as loss of fluorescein, LDH, lactate and K~ and also decrease of protein synthesis and endogenous resperatory capacities of the hepatocytes. The highest outflux of the mentioned substances was observed in 60% cryoprotectant solutions and was medium component and temperature dependent. Levering the experimental temperature to 4°C and the use of complex medium containing NaCl, KG and sucrose brought about decrease in loss of the cell damage markers in use.

The results suggest that, at the basis of cell damage during saturation lies osmo-diffusional mechanism with can be regulated,by the modification of incubation parameters such us temperature, osmolality and concentrations of electrolytes with due regard to permeability coefficient of cryoprotectants

Key-words: hepatocyte, cryoprotectant, temperature, vitrification, freeze-thaw, cryopreservation.