Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Клеточная восстановительная регенерация как биомаркер вредного действия при гигиенической оценке факторов окружабщей среды

А, На правах рукописи

о-

•V

БЕЛЯЕВА Наталия Николаевна

КЛЕТОЧНАЯ ВОССТАНОВИТЕЛЬНАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ КАК БИОМАРКЕР ВРЕЛНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРИ ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКЕ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

14.00.07-Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н.Сысина РАМН

Научный консультант: академик РАМН, доктор

медицинских наук, профессор Г.И.СИДОРЕНКО

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Ю.П.ПИВОВАРОВ доктор медицинских наук, профессор С.М.НОВИКОВ доктор биологических наук И.В.УРЫВАЕВА

Ведущая организация: Московский НИИ гигиены

им.Ф.Ф.Эрисмана

Защита диссертации состоится^6ИЮНЯ 1997г.

в_10_ часов на заседании диссертационного совета

Д. 001.09.01 в Научно-исследовательском институте экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н.Сысина РАМН (119833, Москва, Погодинская ул..д.10).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭЧ И ГОС им.А.Н.Сысина РАМН.

Автореферат разослан 2,3 МО-Я_1997г.

I

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор В.С.КУРКОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ Проблема критериев вредности лежит в основе теории и практики оценки токсичности и опасности воздействия вредных факторов на организм. В развитии отечественной гигиены и токсикологии задача разработки и усовершенствования критериев оценки действия вредных Факторов всегда была ведущей.

Г.И.Сидоренко(1971. 1990. 1997) было обосновано новое направление в гигиенической науке-"гигиены окружающей среды", которое следует рассматривать как научную основу профилактики заболеваний, что требовало совершенствования теоретических и методологических основ гигиенического нормирования и выявления общих закономерностей биологического действия факторов окружающей среды на-организм на основе разработки критериеб и современных методов исследования. В этой концепции предусматривалось усиление медико-биологических исследований как фундаментальной основы гигиенической оценки.

Большинство гигиенистов и токсикологов придерживаются положения, что при оценке вредного действия факторов окружающей среды на организм следует учитывать критериально-значимые показатели (Голиков С.Н.и др.. 1986; Измеров Н.Ф.и др..1987; Каспаров A.A. и др.1986; Красов-ский Г.Н.и др..1992; Рязанова Р.А.и др..1978; Саноцкий И.В..1994; Тиунов Л.А..1987; Трахтенберг И.М.и др..1988; Zenlc H.et al.,1995). Однако, различные факторы окружающей среды влияют на организм различными путями, вызывая развитие неспецифических и специфических реакций, значимость которых для организма изучена недостаточно.

Научное обоснование токсикометрических параметров, в частности, порога вредного действия, остается далеко не решенным ( Новиков С.М..1988: Пинигип М.А., 1993; ). а расхождения при гигиеническом нормировании в ряде стран, как это проанализировано для химических соединений, происходят. в том числе, из-за применения различных критериев вредности (Каспаров A.A. и др., 1986). Кроме

того, до последнего времени существуют различия в трактовке критериев оценки ответных реакций организма по классификации общетоксического эффекта по 5 градациям от NOEL до FEL (Barnes D.G.et al..1988; Brown К.G..1989; Dourson M.L. et al.,1985; Lewis S.С,et al.,1990; Stara J. F. et al.. 1987).

Среди различных морфофункциональных показателей как критериев вредности в гигиенических исследованиях используются различные структурно-гистохимические повреждения (Бабаханян Р.В. и др.,1994; Бонашевская Т.И.,1987; Ортенберг Э.А.и др.,1984; Юрова A.B.,1989; Bagchi М. et al., 1995). Однако, предлагаемые показатели отражают разные ответные реакции организма, во многом носят субъективную оценку, описательный характер, часто не имеют количественного выражения и не все обоснованы в качестве критериев вредности, что затрудняет их применение в гигиенической практике.

В отличие от них. для решения гигиенических задач перспективным является изучение клеточной восстановительной регенерации,(BP), развитие которой определяется увеличением клеточной пролиферации, приводящей к образованию новых клеток, замещающих поврежденные или погибшие.

Вместе с тем, отсутствуют четкие представления о месте регенерации как показателе, регистрируемом при повреждающем действии, что приводит к крайне редкому его применению в гигиене; не установлены приоритетные показатели BP и .не определены количественные зависимости развития BP от воздействующих факторов. Кроме того, остаются не разработанными схемы оценки показателей • BP и приоритетные методы их определения. Все вышесказанное обосновывает актуальность изучения развития BP при различных вариантах действия факторов окружающей среды, а нерешенные вопросы являлись задачами, объединенными общей це^ью исследования.

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ являлось выявление в эксперименте закономерностей развития клеточной восстановительной регенерации (BP) при действии химических, физических, биологических факторов и обоснование её использования как

критерия вредного действия в гигиене окружающей среды. Решались следующие ЗАДАЧИ:

1.Изучить ВР различных клеточных популяций при воздействии на организм химических, физических и биологических факторов окружающей среды.

2.Выявить наиболее информативные показатели ВР печени.

3.Исследовать биологическую значимость изменения степени полиплоидизации гепатоцитов при действии различных факторов окружающей среды.

4.Оценить используемые морфофункционые показатели в качестве критериев вредного действия и разработать научно-обоснованную систему тестов и методов определения ВР.

5.Обосновать возможность использования показателя изменения степени полиплоидизации как биомаркера вредного действия в гигиенических исследованиях.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

работы заключается в том, что впервые -разработана система оценки ВР в различных клеточных популяциях эпителиальной и соединительной ткани печени, легких, почки, кишечника, желудка, поджелудочной,надпочечной и щитовидной желез с выбором наиболее информативных популяций для гигиенических исследований;

-доказана сопоставимость различной степени полиплоидизации гепатоцитов с уровнем вредного действия, которая позволяет устанавливать уровни эффекта по международной классификации: ЯОАЕЬ, ЬОАЕЬ и ЕЕЬ ( ИОАЕЬ как уровень необнаруживаемых вредных эффектов, ЬОАЕЬ-минимальный уровень обнаруживаемых вредных эффектов и ЕЕЬ- уровень явных эффектов);

-показано, что в систему токсикометрических параметров может быть введен показатель порога вредного действия на основе определения степени полиплоидизации гепатоцитов;

-определено , что степень поиплоидизации,отражающая эффект уровня ЬОАЕЬ, соответствует напряжению механизмов адаптации, а уровня РЕЬ-перенапряжению механизмов адаптации (неудовлетворительной адаптации). -показано, что полиплоидизация гепатоцитов зависит от

дозы и времени воздействия и характеризуется положительной корреляционной связью, для высокоплоидных гепатоцитов (г=+0,99) и отрицательной (г=-0,99) - для двуядерных с диплоидными ядрами;

-установлена высокая значимость показателей-индекса альтерации и степени полиплоидизации гепатоцитов (г=0,85) как критериев вредного действия для оценки состояния здоровья организма;

-определена стабильность выявления изменения степени полиплоидизации, сохраняющаяся в динамике воздействия и в восстановительном периоде;

-показано, что изменение полиплоидизации печени носит стереотипный неспецифический характер при действии химических, физических и биологических факторов и их сочетаниях, что позволяет использовать этот показатель при оценке вредного действия факторов окружающей среды;

-установлена новая характеристика степени полиплоидизации гепатоцитов-независимость от сезона года и распределения животных по двигательной и эмоциональной активности;

-предложено проверять интактность контрольных животных по оценке степени полиплоидизации печени; -выявлено, что степень полиплоидизации гепатоцитов. наряду с морфофункциональными и биохимическими показателями, является определяющей для доказательства эмбриоток-сического действия формальдегида.

-найдено, '¿то. ориентируясь на время развития и выраженность степени полиплоидизации печени, можно распределить химические вещества по степени токсичности,- убывающей в соответствии со снижением класса опасности.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ В целом, результаты проведенных исследований позволили обосновать биологическую значимость показателя ВР-плоидности гепатоцитов как ведущего неспецифического морфологического критерия вредности.что представляет собой новое направление в гигиенической оценке факторов окружающей среды.Применение этого критерия важно для установления порогов вредного действия факторов при их гигие-

ническом нормировании,при определении выраженности эффекта (от N0AEL-L0AEL-FEL), для характеристики статуса организма и его адаптации, оценки стадий патологического процесса, степени токсичности факторов.а также при оценке экологической обстановки для выявления зон чрезвычайной экологической ситуации и экологического бедствия.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Практическая значимость работы заключается в применении биомаркера BP в гигиенической оценке факторов окружающей среды.

Полученные результаты исследований были использованы для установления порогов вредного действия при нормировании ряда веществ; для 8 из них (гексаметиленимин, бензол.никель, формальдегид, 1,2-дихлорпропан, 1,2.3-три-хлорпропан, перхлорэтилен, четыреххлористый углерод) утверждены ПДК.

Результаты по изучению острого воздействия на организм фенола, диоксида азота, формальдегида, свинца, хлороформа были приняты в Информационно-консультативном токсикологическом центре МЗМП РФ при создании Программного комплекса компьютерной информационно-поисковой токсикологической системы "POISON" (сертификат программного продукта 180 от 27.12.1995г.).

Материал был использован при подготовке ""Временных методических указаний по обоснованию предельно -допустимых концентрации (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест", И.,1989 (утвержденных Минздравом СССР.М 4681-88 от 15.0.7.1988г.). -"Методических рекомендаций по использованию информативных методов и показателей для морфологической оценки ряда биосистем в гигиенических исследованиях". НИИ ОКГ им.А.Н.Сысина АМН СССР, Москва; НИИ ГиМ Минздрава ГДР, Бад-Эльстер. (Утверждены председателем Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды" академиком РАМН Г.И.Сидоренко 13.12.1989. М.,1990г.). -9 выпусков методических рекомендаций, посвященных морфологическим методам и показателям, включающим показатели BP, при оценке факторов окружающей среды ( утверждены председа-

телем Проблемной комиссии " Научные основы гигиены окружающей среды" академиком РАМН Г.И.Сидоренко в г.г.: 1980 /2/. 1982 /1/, 1984/2/. 1986 /1/. 1987 /2/. 1988 /1/).

По методическим приемам, используемым в диссертации, получено 1 изобретение ( авторское свидетельство N 1467567, 1988Г.).

Результаты внедрены -на кафедре коммунальной гигиены факультета усовершенствования врачей и морфологической лаборатории кафедры анатомии человека Донецкого Государственного медицинского института им.М.Горького (1989г. ); -в лаборатории патоморфологии Киевского НИИ гигиены питания (1987г.); -на кафедре патанатомии Среднеазиатского медицинского педиатрического института; -в проблемной биофизической лаборатории и на кафедре гистологии Ташкентского Государственного медицинского инсти-тута(1987г.); -на кафедре анатомии человека Днепропетровского медицинского института (1987г.); -в Новосибирском медицинском институте (1987г.); -на кафедре патанатомии Воронежского Государственного медицинского института (1987г.).Внедрения подтверждены актами и справками.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы диссертаций доложены на 28 институтских. Региональных, Республиканских. Всероссийских и Всесоюзных пленумах.конференциях и съездах.на секции цитологии МОИП и заседаниях общества анатомов, гистологов и эмбриологов (-на Всесоюзной учредительной конференции по токсикологии. -М. -1980; -на 1 съезде эпидемиологов и гигиенистов Таджикистана.-Душанбе-1985; -на 1 Всесоюзном съезде токсикологов.-Ростов-на-Дону-1986. -на конференции "Проблемы санитарной охраны водоемов".-Пермь-1988; -на Всесоюзной научно-практической конференции" Проблемы исследования и преодоления экологической опасности в промышленном регионе".-Кемерово-1990; -на 5 Всесоюзной конференции по экологической физиологии, биохимии и морфологии.- Фрунзе-1977; -на Всесоюзном симпозиуме" Биологический эффект канцерогенных М-нитрозосоедине-ний".-Л.-1980; -на 9 и 10 Всесоюзных съездах анатомов, гистологов и эмбриологов.-Минск-1981 и Полтава-1986. -на

2 Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов.- Л.-1988; -на 1 Дальневосточной конференции морфологов-пульмонологов "Морфологические критерии дизадапта-ции дыхательной системы к факторам внешней среды". -Благовещенск- 1985; -на научной конференции "Гистогенез и регенерация".-Л.-1986; -на 3 Всесоюзной конференции "Эндокринные системы организма и вредные факторы окружающей среды".-Самарканд-1987; -на 4 конференции морфологов республик Средней Азии и Казахстана " Проблемы реактивности и адаптации клеток, тканей и органов".-Караган-да-1988: -на Региональной конференции морфологов-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока" Медико-экологические аспекты морфологии легких".-Благовещенск-1989;-на Пленуме Научного общества патофизиологов Российской федерации " Патофизиологические аспекты экологии". -Уфа, 1992; -на Ученом Совете (1996) и межотдельческой комиссии по апробации докторских диссертаций НИИЭЧ и ГОС им. А.Н.Сы-сина РАМН (1997)).

Материалы диссертации нашли своё отражение в 66 публикациях, из них 1-монография, 25-в центральной печати.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалу и методам исследований, 5 глав собственных исследований с их обсуждением и резюме, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Текст изложен на 266 страницах машинописи, иллюстрирован 57 таблицами. 58 рисунками, 45 микрофотографиями. Указатель литературы содержит 557 источников (164-зарубежных).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ -Закономерности развития ВР в различных клеточных популяциях эпителиальной и соединительной ткани печени,легком, почке, желудке, кишечнике, надпочечной, поджелудочной и щитовидной железах при действии факторов окружающей среды и выбор наиболее значимых показателей ВР для решения гигиенических задач. -Доказательства об изменении полиплоидизации печени как показателе ВР, который адекватно отражает вредное дейст-

- 10 -

вие факторов среды и является его биомаркером.

-Биологическая значимость показателя изменения полипло-идизации печени при различных вариантах воздействия факторов окружающей среды химической, биологической и физической природы.

-Система качественных и количественных характеристик показателей BP как биомаркеров вредного действия на организм факторов окружающей среды и использование наиболее критериально значимого показателя- изменение степени полиплоидизации гепатоцитов в гигиенических исследованиях (определение: выраженности эффекта, степени токсичности факторов, резистентности и индивидуального статуса организма; нормирование веществ ).

МАТЕРИАЛ, МЕТОДЫ и ОБЪЕМ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа выполнялась в рамках медико-биологического отдела НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им.А.Н. Сысина РАМН {с личным вкладом не менее 80%) и обобщает результаты многолетних (1973-1996гг.) исследований, проведенных в рамках 28 научно-исследовательских тем (NN государственной регистрации: 598294; 73043431; 72039101; 73043440; 76055276; 76066065; 77048989; 78045359:81049171; 81049177; 81049182; 81049192; 81049195; 81051680; 81105495; 910013582; 01.821065823; 01.850000489; 01.824065820; 01.850000489; 01.860014395; 01.860014397; 01.890040722; 01.890040732; 01.910013580; 01.910013586;.01.910013592; 01.940001791).

Постановка модельных опытов осуществлялась сотрудниками НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды. В работе использовались отдельные фрагменты совместных исследований с рядом лабораторий института (рук.: д. м. н. С. Л. Авалиани, проф. Ю. Д. Губернский, проф. В. С. Журков, проф. Г. Н. Красовский, д. м. н. Е. Н. Кутепов. к. м. н. Л. X. Мухам-бетова,1 проф. М.А.Пинигин), а также с д.м.н.Г.Ф.Семеновой (НИИ педиатрии РАМН).

Эксперименты выполнены на 2109 самцах и самках нелинейных мышей, крыс и морских свинок, самцах мышей (CBAxC57Bl/6)Fl. Изучались различные клеточные популяции в печени, легком, почке, кишечнике, желудке, поджелудоч-

- и -

ной, надпочечной и щитовидной железах.

Исследовались различные факторы окружающей среды: химические при пероральном, парентеральном и ингаляционном воздействии различных доз и концентраций 22 химических веществ, принадлежащих к разным классам опасности /бериллий, никель, свинец, железо , двуокись азота, формальдегид. фенол, анилин, бензол, хлороформ, 1,2-дих-лорпропан (ДХП), 1,2,3-трихлорпропан (ТХП). перхлорэти-лен (ГШ), четыреххлористый углерод (СС14), кротоновый альдегид, гексаметилендиамин (ГМДА). гексаметиленимин (ГМИ). этиленгликоль, изопропиловый спирт, фенобарбитал, циклофосфамид, нитрозодиметиламин(НДМА)/ в условиях острых, подострых и хронических экспериментов в различных режимах воздействия; биологические, представленные ин-траназальным воздействием вируса гриппа (штамм Р1?-8) и ингаляцией разных видов белково-витаминных концентратов (БВК); физические-шум и УФ-радиация. Восстановительный- период изучался после хронической ингаляции БВК и СС14, однократного перорального воздействия бензола.

Анализировалось воздействие 19 комбинаций химических веществ, представленых смесями газов, одна из которых- из 33 химических соединений, являющихся наиболее распространенными загрязнителями атмосферного воздуха. Исследовались различные комплексные воздействия, в том числе и моделирующее загрязнение атмосферного воздуха, воды и пищевых продуктов.

Методы морфофункционального анализа: гистологический. гистохимический /содержание нейтральных жиров, полисахаридов, суммарных нуклеиновых кислот. РНК, ДНК.гликогена, гемосидерина/. гистоферментативный /активность ЛДГ, СДГ, Г-6-ФДГ. НАД-ДГ и НАДФ-ДГ,кислой и щелочной фосфатаз.неспецифической эстеразы, АТФ-азы/. морфо-ка-рио-и стереометрический на МБИ-15 с окулярной измерительной сеткой и на "Телевизионном анализаторе изображений 2-МТ" /индекс альтерации гепатоцитов (ИА) и их мито-тический индекс (МИ), число клеток РЭС, макрофагов, лимфоцитов, нейтрофилов, распределение ядер гепатоцитов по классам плоидности на мазках гепатоцитов и число высо-коплоидных гепатоцитов на срезах печени,соотношение од-

- 12 -

но-и двуядерных гепатоцитов, площадь ядра, площадь клетки. периметр ядра и клетки, объемная доля паренхимы, стромы. клеточно-лимфоидных инфильтратов.сосудов.некрозов/. авторадиографический /одно-и двукратное введение тимидина. меченного тритием, с последующей авторадиографической обработкой-определение индекса меченых ядер (ИМЯ) и меченых митозов/, цитофотометрический на МУФ-5 и однолучевом зондовом цитофотометре /концентрация РНК,содержание ДНК/, интерферометрический на БИНАМЕ Л-211 /сухой вес клетки/.

Всего было использовано 49 показателей, проведено 32205 анализов.

Для обработки полученных результатов использовали параметрические и непарамётрические методы статистики с помощью статистической диалоговой систему "Stadia"(версия 4.5) на ЭВМ "286". Высчитывали достоверность полученных изменений, коэффициент плоидности (П к), корреляционные зависимости. Методом пошаговой регрессии на компьютере "РС-АТ" проводили регрессионный анализ информативности показателей для оценки состояния организма.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ (ВР) ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ОРГАНИЗМ ХИМИЧЕСКИХ, ФИЗИЧЕСКИХ И БИОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Исследование воздействия химических (бензол,никель, фенол,диоксид азота. ГМИ.СС14.НДМА.смесь газов при их пе-роральном, ингаляционном и комплексном воздействии)-, биологических (вирус гриппа) и физических (УФ) факторов и их сочетаний в условиях подострых и хронических экспериментов установило, что на фоне выраженных структурно-гистохимических повреждений в печени, легком, почке, кишечнике, желудке, поджелудочной.надпочечной и щитовидной железах развивается ВР, визуально определяемая по увеличению клеточного состава и авторадиографически-по достове-верному повышению числа ДНК-синтезирующих клеток. (ИМЯ).

ИМЯ во всех изученных органах, за исключением эпи-телиоцитов надпочечника, при действии изученных ксеноби-

- 13 -

отиков менялся однонаправленно (рис.1,а). В этом случае развитие ВР определялось по статистически значимому увеличению ИМЯ. Однако, ВР отличалась от клеточной физиологической регенерации (ФР) не только количественным увеличением числа редуплицирующих эпителиоцитов, но и тем, что в процесс синтеза ДНК вовлекались клеточные популяции, в норме редко или вообще не делящиеся. Показано, что в контроле большая часть ИМЯ эпителиоцитов щитовидной железы приходилась на долю интерфолликулярных клеток,а при воздействиях-увеличивалась доля ДНК-синте-зирующих клеток фолликулярного эпителия. Усиливалась гетерогенность распределения редуплицирующих клеток даже в пределах одной и той же клеточной популяции. Так, в легком при ингаляции диоксида азота наблюдалось очаговое повреждение части бронхиолярных клеток; в этих участках отсутствовали меченые клетки,тогда как в других, компенсаторно гиперплазированных, отмечались ДНК-синтезирующие эпителиоциты. Хотя изолированное и сочетанное 4-х месячное воздействие УФ- радиации и НДМА в конце эксперимента не вызвало изменения ИМЯ, среди меченых клеток (для НДМА и НДМА + УФ), в отличие от контроля, определялось больше низкоплоидных гепатоцитов.

ВР запускалась в ответ на структурно-функциональные изменения, развивающиеся волнообразно (рис. 1,6), однако эта связь была неодназначной, как и неоднозначным был характер выявленных реакций повреждений. Чаще всего реакции повреждения и компенсации, в том числе и ВР,возникали одновременно,реже-реакции альтерации опережали развитие ВР, а в некоторых случаях -при развитии ВР не удалось обнаружить реакции повреждений, что свидетельствовало не об их отсутствии, а о неприменении адекватного метода их регистрации.

Когда ИМЯ достоверно увеличивался, можно было предполагать, что вслед за этим запускалась клеточная пролиферация, характеризовавшая ВР. Однако, в некоторых экспериментах увеличение ИМЯ в исследуемой временной точке не происходило, хотя морфологически отмечалась клеточная гиперплазия, например, сосочковая гиперплазия бронхиального эпителия. Это объяснялось асинхронностью процес-

I

' е н я возлействня, к е с яцы

Время воздействия, месяцы

Рисунок 1- Индекс печеных ядер (ИМЯ)* (а) и активность ДОГ, <-6) в легких мышей ЗНК после 3-х месячного воздействия свинца- Кривые ИМЯ <а> и активности ЛЛГ <£> в: а/ыгеолоцитах при действии свинца в дозе 0,3 иг/л<1>, в дозе Змг/л (2), в еронхиолярном эпителии, 0,3 мг/л ( 3) ,Змг/л (4), в бронхиаль'ном эпителии,О,Змг/и (5), Змг/л (в), в ме.жалызеолярных перегородках, О,Змг/л (7), Змг/л (8)- 0-до-

- 15 -

са вступления клеток в S-фазу. Кроме того, временные интервалы, выбранные для изучения развития BP после однократного или в динамике хронического воздействия исследуемых факторов. значительно превышали среднее время синтеза ДНК (равное около 8 часов). Все это не позволило рекомендовать сроки взятия материала для идентификации BP при гигиенической оценке ксенобиотиков. Этими же причинами могла не только не улавливаться тропность воздействия агента к определенной клеточной популяции, но и не определяться сам факт развития BP. Поэтому увеличение ИМЯ для той или иной клеточной популяции, на которую указывали многие исследователи при анализе воздействия различных химических веществ (Evans M.J.et al., 1971,1976,.1993; Shaml S.G.et al.,1984; Stephens K.J.et al.,1978;Witschl H.P.,1990), не всегда свидетельствует о тропности фактора к данному типу клеток.

Вместе с тем,правильность оценки клеточной пролиферации, как считает D.R.Apple ton (1984),зависит от точности использованной стратегии. По представлению R.W.Morris (1993) очень сложно определить незначительное,достоверно не определяемое, увеличение ИМЯ, особенно в таких клеточных популяциях, как гепатоциты. у которых фракция роста и ИМЯ низкие. Исследование показало, что недостатком этого показателя являлось и то,что увеличение ИМЯ чаще всего определялось в подострых экспериментах и в ранние сроки хронических, а дозовая и временная зависимость достоверно установлена (в легком) только при динамическом воздействии свинца и при его сочетании с вирусом гриппа.

Чтобы избежать методических ошибок, ИМЯ подсчи-тывался для различных типов тканей- эпителиальной и соединительнотканной. Так. при ингаляции смесями различных газов, было показано одновременное развитие BP в паренхиме и строме печени; дифференцированный подсчет ИМЯ в различных стромальных клетках определил увеличение пролиферации клеток РЭС при отсутствии аналогичной реакции со стороны лимфоидно-гистиоцитарных клеток.

Морфогенез развития BP при действии факторов окружающей среды наиболее полно может быть раскрыт на основе анализа особенностей пролиферативных реакций как харак-

- 16 -

терного признака регенерации для всех клеток кооперации. Необходимо подчеркнуть, что такой подход продиктован накоплением многочисленных данных, свидетельствующих о наличии в органах тесной кооперативной связи (Серов В. В.. Лапиш К.. 1989).

Анализ полученных данных позволил представить систему оценки ВР авторадиографическим методом в различных органах при воздействии факторов окружающей среды, с выбором наиболее информативных (приоритетных) клеточных популяций для решения различных гигиенических задач (табл. 1).

Таким образом, оценка развития ВР в органах, отличающихся темпом обновления клеток, показала, что установление ВР по определению числа ДНК-синтезируювдх клеток является интегральным показателем, отражающим повреждающее воздействие факторов. Однако, нестабильность выявления изменения ИМЯ в ходе воздействия сужает возможности использования этого маркера ВР в гигиенических исследованиях.делая его менее надежным критерием вредного действия.

ОЦЕНКА НАИБОЛЕЕ ИНФОРМАТИВНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ВР

Нестабильность выявления показателя ИМЯ привела к поиску иного методического приема оценки ВР. пригодного для эффективного решения гигиенических задач, заставила отойти от традиционного показателя клеточной пролиферации (число ДНК- синтезирующих клеток) и обратиться к использованию других методов и показателей ВР.

Применение цитофото-и кариометрии на тех же моделях воздействия выявило .ВР в печени даже в тех группах.в которых авторадиографически не отмечалось повышение ИМЯ: (1-месячная ингаляция и комплексное воздействие никеля в максимальной дозе и концентрации),50-суточная,3-месячная ингаляция бензола и эта же ингаляция со специфической нагрузкой, 14-суточная ингаляция фенола (рис.2).

При этом происходило изменение различных' исследуемых параметров развития ВР:нарушение дискретности гистограмм, уменьшение процента всех двуядерных или двуядер-ных с диплоидными ядрами, увеличение одноядерных тетра-

Таблица 1

Оценка ВР авторадиографическим методом* в органах при воздействии факторов окружающей среды.

орган клеточные популяции (**) приоритетные клеточные популяции (***)

легкие эпителий:бронхиальный, бронхиолярный, альвеолярный; соединительнотканные клетки. эпителий:бронхов и альвеол; соединительнотканные клетки.

почка эпителий извитых канальцев коркового вещества почки -

тонкая кишка эпителий:основания ворсин, центра ворсин, верхушки ворсин; соединительнотканные клетки. эпителиоциты центра ворсин.

желудок эпителий желез дна желудка: добавочный, шеечный, обкладочный,железистый; эпителий шшрической части. добавочный и шеечный эпителий желез дна желудка.

поджелудочная железа эпителий экзокринного отдела ацинусов и протоков(центроаци-нозный, вставочный, внутри- и междольковый) и панкреатичес -кие клетки эндокринного отдела эпителий ацину-сов и центроаци-нозные клетки протоков.

надпочечная железа эпителий -коркового вещества: клубочковой зоны, пучковой зоны, сетчатой зоны и -мозгового вещества; соединительнотканные клетки капсулы. эпителий на границах: клубоч-ково-пучковой зоны и сетчатой зоны коркового вещества-мозго-вого вещества.

щитовидная железа эпителий: интерфолликулярный, фолликулярный (малых, средних и больших фолликул); соединительнотканные клетки. интерфолликулярный эпителий.

*- авторадиографическое (с тимидином, меченным тритием. 0.5-1мкки/г. массы животного) определение ДНК-синтезирую-щих клеток(ИМЯ,%); ** - для изучении механизма действия исследуемого фактора; *** - для гигиенической оценки воздействия на организм факторов окружающей среды. Определение ВР- по достоверному увеличению ИМЯ клеток

4п (55)

а)

ИМЯ (%)

б)

908070-

4г

1.0- рЧ-

0.8- /V

0.6- ///

0,4- ///

==///==///=

0.2- р£-| ///

•»-группы

1—К—' <-1^ Ч?-1

'—К—' |-1-1 |-2-1

Рисунок 2.Число тетраплоидных (а) и ДНК-синтезирующих(б) гепатоцитов при ингаляции фенола в концентрации 14мг/л. Группы животных: контрольная (К) и подопытные.подвергавшиеся непрерывной ингаляции фенола в течение 4-х(1) и 14 (2) суток;тетраплоидные(4п) и ДНК-синтезирующие(ИМЯ) ге-патоциты; заштрихованы достоверные изменения

плоидных или высокоплоидных гепатоцитов.

На модели воздействия на организм употребления воды различной степени минерализации было показано, что при водопотреблении крысами дистиллированной и морской воды возникали реакции повреждения (увеличивался ИА гепатоцитов, снижалось число клеток РЭС), вызывая через 1 месяц ВР, определяемую по достоверному увеличению процента одноядерных гепатоцитов. Однако, отмеченное изменение к концу 6-месячного хронического эксперимента нивелировалось из-за качественного перераспределения соотношения одно-и двуядерных гепатоцитов по классам плоидности.

И, наконец, оценка ВР по маркерному показателю клеточной пролиферации (митозу) на моделях изолированного и комбинированного воздействия циклофосфамида и фенобарбитала показала достоверное развитие ВР только при изолированном воздействии фенобарбитала, хотя отмечалось изменение нормальной паренхимы и появление микронекрозов в других подопытных группах.

Таким образом,исследования показали, что такие маркеры ВР1в печени, как изменение ДНК-синтезирующей активности клеток, соотношение одно-и двуядерных гепатоцитов и митозы, не всегда регистрировались, что снижало эффективность их использования в гигиене (табл.2). В отличие от этих биомаркеров ВР, определение степени полиплоидиза-

- 19 -

ции ткани по уровню плоидности субпопуляций гепатоцитов и отражающее регенерацию ткани через модифицирующий митоз, являлось стабильным показателем. Оценка степени по-липлоидизации не информативна по коэффициенту плоидности. не изменяющемуся в условиях малых воздействий, менее информативна по соотношению одно-и двуядерных гепатоцитов и одному цитофотометрическому определению содержания ДНК и наиболее информативна -при сочетании с определением распределения субпопуляций гепатоцитов по классам плоидности (табл.2).

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИЗМЕНЕНИЯ СТЕПЕНИ ПОЛИПЛОИДИЗА-ЦИИ ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Степень полиплоидизации гепатоцитов как наиболее определяемый биомаркер ВР был исследован при действии различных факторов окружающей среды и показана универсальность его изменения при воздействии на организм 18-х химических веществ, физических (шум уровнем 80 и 100 дБА) и биологических факторов (вирус гриппа, разные виды БВК). Это свидетельствовало о том. что изменение степени полиплоидизации является неспецифическим показателем вредного действия.

Изменение степени полиплоидизации у молодых животных при воздействии факторов было аналогично такому же у старых контрольных крыс, что позволило рассматривать его как показатель старения организма и предложить оценивать интактность контрольных животных по определению у них степени полиплоидизации печени.

При воздействии СС14 в концентрации 25мг/мЗ со специфической нагрузкой тем же веществом (2000мг/мЗ) степень полиплоидизации в динамике патологического процесса (цирроз ) увеличивалась на ранней стадии. Изменение этого показателя отмечалось и после прекращения воздействия, сопровождаясь разрастанием соединительнотканных структур, которые сужали функциональную активность печени. Это являлось еще одним доказательством того, что изменение степени полиплоидизации нужно рассматривать как критерий вредного действия.

Исследование восстановительного 3,5-месячного пери-

Таблица 2

Сравнительный анализ значимости количественно определяемых морфофункциональных показателей изменения печени при оценке вредного действия факторов окружающей среды

показатели характеристика изменений показателей:

значи- необра- независимость от просто-

мость тимость специфики воздей- та оп-

ствия ределе-

ния

балочная

дискомпле-

ксация; ++ - + +

соотноше-

ние долей

паренхимы/

стромы; ++ 4-- - +

лимфоидная

инфильтра-

ция; + - - +

число кле-

ток РЭС; + - + +

концентра-

ция РНК; + - - -

содержание

белка; + - - -

активность

ЛДГ, СДГ.

Г-6-ФДГ,

НАД-ДГи др + - - -

некрозы +++ - - +

индекс

альтерации: +++ - - +

ПП.

11 и а а о а 1 с л н и 1 .

число ДНК-

синтезиру-

ющих клеток;. +++ - + -

отношение

одно/двуя-

дерных кл. + - + +

митотичес-

кий индекс; +++ - + -

изменение

плоидности: цитофотометоия: дискретность гистограмм

+ - +

распределение гепатоцитов по классам плои-

дности

1 +++ + + +

альтернативная оценка изменений показателей:да (+), нет (-), не всегда доказана (±)

- 21 -

ода в печени после 1-недельной ингаляции ТХП и 27-суточ-ног'о однократного перорального воздействия безола показало, что морфологически печень подопытных животных отличалась от контрольных только изменененным распределением гепатоцитов по классам плоидности. Это свидетельствует о значимости и стабильности выявления этого показателя даже после экспериментов.

Определено, что полиплоидизация гепатоцитов зависима от дозы и времени воздействия и характеризуется положительной корреляционной связью для высокоплоидных гепатоцитов (г=+0.99) и отрицательной (г=-0,99) -для двуядерных с диплоидными ядрами (рис. 3).

На моделях ингаляции ДХП, ТХП, СС14. ПХЭ (в острых, подострых и хронических экспериментах) сопоставление разной степени изменения полиплоидизации гепатоцитов с выраженностью повреждений печени позволило дифференцировать стадии обнаруженного вредного эффекта как ЬОАЕЬ,минимальный уровень и ЕЕЬ,явно выраженный эффект (табл.3). Так,минимально вредный эффект уровня ЬОАЕЬ возникал при 3-х суточной ингаляции СС14 (ЗООмг/мз, группа 3) и выражался в изменении соотношения одно-и двуядерных гепатоцитов: достоверным увеличением тетраплоидного класса(4п) и (или) уменьшением доли двуядерных с диплоидными ядрами (2п+2п); пролонгирование ингаляции до 33-х суток (группа 7) переводило эффект из ЬОАЕЬ в ГЕЬ, определяющей характеристикой которого являлось достоверное увеличение доли высокоплоидных классов (8п. 8п+8п, 16п). На этом уровне эффекта появлялись такие высокоплоидные гепатоциты (16п, 32п), которые у крыс 2-5 месячного возраста в норме или не встречались или встречались крайне редко. Переход от ЬОАЕЬ к ГЕЬ (прерывистая ингаляция ССЬ4,100 мг/мЗ, группа 13) выражался в том. что при изменении соотношения одно-двуядерных тетраплоидных гепатоцитов происходило нарушение дискретности гистограмм 4п-8п классов.

Таким образом показано, что показатель степени полиплоидизации гепатоцитов отражает вредное воздействие и характеризуется зависимостыо"доза-время-эффект". Установленные градации изменения степени полиплоидизации предлагают определять уровни эффекта по международной

Рисунок 3. Зависимость развития эффекта полиплоидизации. определяемой (а) по уиенЬиенип процента двуядерных гепа-тоцитов с диплоидными, 2п+2п, ядрами (г--0,99) и (б) по увеличении процента двуядерных с октаплоидными. 8п+8п, ядрами С г=+0,Э9), от времени ингаляции СС14 в концентрации 100 мг/мз (а) и 300 мг/мз (б). По оси абсцисс-вре-мя воздействия ( сутки ): по оси ординат- процент двуядерных гепатоцитов с диплоидными (а) и октаплоидными (6) ядрами

Таблица 3

Соотношение гепатоцитов по классам плоидности (в %) у контрольных и подопытных крыс при ингаляции СС14

1 1 N классы плоидности гепатоцитов. в 1 % (М+т): |

1 груп-

1 1 1 1 1 1

1 пы 2П I I 2п+2п I 4П |4п+4п I 1 1 1 8п |8п+8п, 16п| 1 [

1 1 6.4+0,9 16,4+1,7 66,9+1,9 9+0,6 1,2+0,3 0,1+0,01, |

единичные 1

1 з 1,4+0,3* 9. 1+2. 5*77, 3+1, 5*10+2. 1 1,6+0,5 0,6+0.11, |

единичные 1

I 13 3+0,6* 8.4+2,2*75,8+2,3* 9.5+1,5 3+0,9 0,2+0.1, |

0,1+0,01 |

1 7 4,9+0.8 3,6+0,8*75.5+2.6* 7+1.7 7.6+2.5*0.9+0. 1*. |

1 единичные 1 I

Группы крыс: контрольные (1) и подвергавшиеся непрерывной ингаляции СС14 в концентрации 300 мг/мЗ в течение 3-х (3) и 33-х (7) суток, а при прерывистой ингаляции в концентрации 100мг/мЗ в режиме:4 часа ингаляции, перерыв 8 часов -в течение 9 суток (чистое время-72 часа), (13). Выраженность эффекта в группах:ИОАЕЬ (1), ЬОАЕЬ (3). переход от ЬОАЕЬ к ГЕЬ (13) и РЕЬ (7):* -достоверные изменения

классификации: Ж)АЕЬ, ЬОАЕЬ и ГЕЬ ( ИОАЕЬ как отсутствие изменения показателя. ЬОАЕЬ- изменение соотношения од-но-и двуядерных тетраплоидных гепатоцитов и ГЕЬ-увеличе-ние их высокоплоидных форм ).

СРАВНЕНИЕ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ

Для оценки значимости используемых морфофункцио-нальных показателей было проведено их сравнительное изучение на различных моделях воздействия на печень, легкое, почку, кишечник, желудок, поджелудочную, надпочечную и щитовидную железы. Показано, что среди всех изученных морфофункциональных показателей неспецифических и специфических реакций при воздействии изученных ксенобиотиков раньше всего возникали гемоциркуляторные наруше-

- 24 -

ния и гистоферментативные изменения активности окислительно-восстановительных . ферментов, в первую очередь ЛДГ и СДГ. В отличие от биомаркеров ВР.до развития патологии органов большинство используемых показателей обладают фазностью изменений и, в зависимости от доз, а также в различные временные интервалы меняются разнонаправ-ленно(рис.1,б).Аналогичное перемежающееся изменение активности окислительно-восстановительных ферментов.сменяющееся в конце эксперимента их снижением, наблюдал К.Г.Кавтнашвшш (1977), связывая этот процесс с развитием и итогом ВР.

Для количественно определяемых изученных показателей была оценена их значимость (табл.2). Наиболее значимыми биомаркерами вредного действия (помимо показателей ВР) являлись: увеличение балочной дискомплексации и соединительнотканных элементов, альтерация и некрозы гепа-тоцитов,однако все они обратимы, за исключением увеличения доли стромы органа, которое, в определенных условиях (Логинов А.С.,Аруин Л. П.,1985),- необратимо.

Обратимость показателей также связана с развитием резистентности органй вследствие компенсаторно-приспособительных реакций, к которым относится и ВР. Большинство из изученных количественных показателей возникает у подопытных животных асинхронно, изменяется волнообразно и количественно не зависит от изучаемого фактора.

Таким образом, установлено, что, в отличие от всех исследованных биомаркеров вредного действия, наиболее критериально значимым является изменение степени полип-лоидизации (гепатоцитов) как стабильно выявляемый и не зависимый от специфики воздействия; кроме того, оценка этого показателя отличается экономичностью и легкостью обучения его определения.

СИСТЕМА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ВР И МЕТОДОВ ИХ ОЦЕНКИ Помимо схемы (табл.1) выбора наиболее информативных клеточных популяций легкого, почки, кишечника, желудка, поджелудочной, надпочечной и щитовидной желез при изучении одного из показателя ВР (ИМЯ) для решения различных гигиенических задач определена система

- 25 -

рекомендуемых показателей с характеристикой их изменения для оценки уровней эффектов ( ШАЕЬ, ЬОАЕЬ, переход от ЬОАЕЬ к ГЕЬ и ГЕЬ), вызываемых в печени при действии химических, биологических (БВК) и физических (шум) факторов окружающей среды.

Полученные результаты позволили охарактеризовать эффект уровня ШАЕЬ отсутствием: увеличения ИМЯ гепатоцитов и соединительнотканных клеток, нарушения дискретности гистограмм содержания в ядрах ДНК и изменения гепатоцитов по классам плоидности. При регистрации ЬОАЕЬ необходимым условием являлось определение изменения любого из вышеперечисленных показателей, которые могли сопровождаться увеличением доли одноядерных тетраплоид-ных и (или) уменьшением доли двуядерных гепатоцитов с диплоидными ядрами. Переход эффекта от ЬОАЕЬ к ГЕЬ выражался ( при увеличении доли одноядерных тетраплоидных и (или) уменьшении доли двуядерных гепатоцитов с диплоидными ядрами) увеличением ИМЯ и (или) нарушением дискретности гистограмм ДНК-ядер гепатоцитов с незначимым увеличением доли высокоплоидных гепатоцитов без появления (или с появлением) высокоплоидного класса, отсутствующего в печени контрольных крыс. Для суждения о наступления эффекта уровня ЕЕЬ приоритетным показателем являлось значимое увеличение доли бысокоплоидных гепатоцитов.

В зависимости от поставленной цели предложен набор методов и показателей оценки ВР в печени:от наиболее широкого их использования для выяснения механизма действия факторов окружающей среды до минимального при оценке степени токсичности веществ и определения уровней эффектов : ШАЕЬ-ЬОАЕЬ-ГЕЬ ( табл.4).

Таким образом,выполненные исследования позволили представить наиболее полную систему показателей ВР в печени и, в меньшей степени, в легком, почке, кишечнике, желудке. поджелудочной, надпочечной, щитовидной железах, а также методов их оценки для гигиенических исследований. Кроме того, по степени выраженности ВР в печени удалось оценить эффект вредного действия различных уровней (ШАЕЬ- ЬОАЕЬ-ГЕЬ).

Таблица 4

Методы и показатели оценки ВР в печени при действии факторов окружающей среды

1 (исследования .... ... . ,. .... рекомендуемые методы и 1 клеточные |

Iпри оценке: показатели популяции 1

1 механизма 1) авторадиография, опреде- гепатоциты, |

(действия фа- ление ИМЯ*; соедините- |

1кторов окру- льнотканные |

жающей среды клетки |

2)*кариометрия. подсчет на гепатоциты 1

мазках гепатоцитов их рас-

пределения по плоидности*;

3)цитофотометрия ДНК ядер*; -м- |

4)определение МИ; —1

5)соотношение одно-и двуядер- —" — 1

кых гепатоцитов;

6)определение П к.

1 уровней эф- 1)автЬрадиография, определение гепатоциты 1

фекта (N0AEL ИМЯ;

I-FEL), сте- 2)цитофото-и кариометрия. — " — 1

пени вред- анализ распределения гепато-

ности факто- цитов по классам плоидности*;

1ров | 1

*- приоритетные методы и показатели

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОКАЗАТЕЛЯ П0ЛИПЛ0ИДИЗАЦИЯ ПЕЧЕНИ КАК БИОМАРКЕРА ВРЕДНОГО ДЕЙСТВИЯ В ГИГИЕНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

I.1 Оценка эмбриотоксического действия веществ Было установлено, что пренатальное воздействие формальдегида ( вводимого самкам внутрижелудочно в дозе 0,5мг/кг в течение всей беременности) вызывает у новорожденных крысят изменение степени полиплоидизации гепато-

- 27 -

цитов, не нормализовавшееся в более поздний период онтогенеза (2-х недельные,2 и 4- месячные крысы).Этот процесс сопровождался нарушением дифференцировки органа, которое приводило в половозрелом возрасте к структурно-метаболическим нарушениям.

Из анализа постнатального онтогенеза роста и дифференцировки печени вытекало, что воздействие в пренаталь-ном периоде оказывало влияние на эмбриогенез и в поста-натальном периоде не происходило полного восстановления органа. Более того, дополнительная "нагрузка" на этом фоне (болезнь) еще более снижала структурно-функциональные резервы органа, приводя к усугублению эффекта воздействия и переводя уровень гепатотоксического эффекта (оцененного по изменению степени полиплоидии) от ЬОАЕЬ у здорового 4-х месячного потомства к РЕЬ -у больного.

Полученные новые данные подтверждают клинические и экспериментальные работы, свидетельствовавшие об изменениях, возникающих в эмбриогенезе и постнатальном периоде у потомства после воздействия на мать различных факторов окружающей среды (Бектемирова Р.М.и др.1990; ВОЗ.1988; Ещенко 0.И..1989; Уткина Л.И. и др.,1989). Вместе с тем, рекомендуемые для оценки эмбриотоксического действия общепринятые тесты в условиях данного опыта не изменялись.

Таким образом,только морфофункциональные исследования, включающие определение степени полиплоидизации печени, а также биохимический анализ (Астахова Л.Ф.и др.1996), в отличи^ от 10 исследованных общепринятых покаказателей эмбриотоксического действия, доказали последствия прена-тального воздействия формальдегида на печень потомства.

2. Оценка резистентности (адаптации) Подтверждением важной роли печени в адаптации организма к действию факторов окружающей среды служило проведенное сравнение интегральных показателей с показателями ВР. Сопоставление показателей ВР в печени,отражающих токсический эффект бензола в различных вариантах его воздействия. с другими токикологическими показателями (Косяков В.В..1977), определило,что в подострых экспериментах (50 суточная ингаляция в концентрации 20мг/мЗ) время

- 28 -

развития эффекта в печени и организме совпадало, а в условиях хронической 4-месячной ингаляции (3,5мг/мЗ)развитие эффекта в печени опережало его развитие в организме.

По степени ответа на специфическую (тем же химическим веществом в больших дозах -бензол. СС14, смесь из 33-х химических веществ) и функциональную (вирус гриппа) нагрузки по развитию ВР в печени судили о степени резистентности ( адаптированное™) органа (рис.4).

Определены 3 варианта ответа: 1-вариант (рис.4,а), когда ответ на нагрузку свидетельствовал о резистентности (адаптированности) органа, так как степень полиплои-дизации и ИА гепатоцитов, развившиеся после 3-х месячной ингаляции бензола в концентрации 3,5мг/м3 со специфической нагрузкой бензолом в дозе ЗОООмг/кг по отношению к опыту не менялись (при более высоком значении ИА гепатоцитов при одной нагрузке); 2- вариант(рис.4,б), наблюдавшийся при месячной ингаляции смесью из 33-х химических веществ, моделирующих уровень реальной нагрузки в 8 Р со специфической нагрузкой той же смесью уровнем в 800 Р.-когда печень частично резистентна (адаптирована) и хотя ИА не менялся. ' степень полиплоидизации увеличивалась в меньшей степени,чем при одной нагрузке; 3-вари-ант, когда нагрузка усиливала эффект воздействия опыта и характеризовалась снижением резистентности (адаптированности) печени. Такой вариант ответа регистрировался при 0,5 месячном воздействии свинца или бериллия в дозах, кратных 100 ПДК, и функциональной нагрузке вирусом гриппа (рис.4,в);'при месячном воздействии свинца или бериллия в тех же дозах и с той же нагрузкой, а также при 3,5-месячной ингаляции СС14, 25мг/мЗ, со специфической нагрузкой СС14, 2000мг/мЗ, и при 4-х месячной ингаляции бензола,3,5мг/м3. со специфической нагрузкой, 3000 мг/кг (рис.4.г); при месячной ингаляции смесью из 33-х химических веществ уровнем 30 Р с нагрузкой в 800 Р, а также при 50-суточной ингаляции бензола, 20мг/мЗ, со специфической нагрузкой, ЗОООмг/кг (рис.4.д).

Снижение резистентности (адаптированности) наблюдалось либо с увеличением воздействующего уровня ( при ингаляции смесью уровнем от 8 до 30 Р). либо пролонгирова-

а)

ИА+

//// //// О

- 29 -б)

ИА+ ИА+

//// //// Н

//// //// о+н

+

ИА+

ИА+

//// //// Н

ИА+

//// О+Н

К

К

О

в)

ИА+

ИА+

//// Н

//// //// 0+Н

Г)

ИА+ ИА+

//// О

//// Н

ИА+

//// //// О+Н

К

о

к

д)

+

ИА +

//// //// //// О

ИА+

/// /// Н

ИА+

//// //// //// //// О+Н

к

Рисунок.4. Изменение степени полиплоидизации печени при воздействии химических веществ со специфической и функциональной нагрузкой. Столбиками представлено изменение степени плоидности; над столбиками- степень выраженности (+) индекса альтерации (ИА); группы животных:К-конт-роль, 0-опыт, Н-нагрузка, О+Н- опыт с нагрузкой; ////-достоверный эффект

нием времени воздействия (с 3-х до 4-х месяцев при ингаляции бензола в концентрации 3,5 мг/мЗ).

Таким образом, определение степени полиплоидизации позволяет оценивать адаптацию к воздействию факторов окружающей среды.

3. Оценка статуса организма Другим примером оценки выраженности эффекта с учетом стадий адаптации при использовании системы критери-

- 30 -

ев,которые выстраивались по логико-диагностическому признаку и базировались на оценке суммарной сопряженности всех ее компонентов, являлось установление зависимости "интенивность воздействия-статус организма", с применением, в том числе, морфофункциональных показателей.

При такой оценке удовлетворительная адаптация организма характеризовалась целым комплексом обратимых процессов. лежащих в пределах восстановительной нормы при отсутствии изменения степени полиплоидизации печени и соответствовала уровню 1ЮАЕЬ (табл. 5). Напряжение механизмов адаптации оценивалось развитием различных реакций, изменения которых выходили за пределы физиологической нормы,в том числе увеличение ИА гепатоцитов и умеренная полиплоидия, характеризовавшаяся увеличением одноядерных тетраплоидных гепатоцитов при снижении двуядер-ных с диплоидными ядрами. Этот уровень адаптации соответствовал уровню ЮАЕЬ. Перенапряжение механизмов адаптации или недостаточная, неудовлетворительная адаптация отличались значительным изменением большинства из изученных показателей, ( хотя некоторые из них у отдельных животных могли быть выражены слабее или сильнее, чем у остальных. Однако, степень полиплоидизации определялась стабильным увеличением высокоплоидных гепатоцитов,соответствовавших уровню ГЕЬ. Для оценки этих 3-х стадий по морфологическим критериям определение изменения степени полиплоидизации гепатоцитов имело лимитирующее значение.

Выполненный в рамках работы по определению статуса организма регрессионный анализ морфофункциональных показателей. наиболее информативных для оценки состояния здоровья организма, .показал, что наибольший коэффициент корреляции (г=0,85) существует между изменением состояния организма с показателями ИА и степенью их полиплиди-зации .

Крмплексная морфофункциональная оценка, включающая определение степени полиплоидизации печени, вкупе с различными показателями состояния организма оказалась полезной для получения С.Л.Авалиани (1995) количественных зависимостей " доза-ответ", ориентированных на оценку целостного организма и определение структуры (распреде-

Таблица 5

Степень полиплоидизации гепатоцитов и другие морфофункци-ональные показатели печени, используемые как критерии для ранжирования состояния организма по степени выраженности эффекта

Критерии для установления дифференцированного статуса статус организма

диагностические статистические

балочная дискомплексация-0 бал. ИА-в пределах стреднестатисти-ческих контрольных величин;микронекрозы отсутствуют;ПЛ-в пределах возрастной нормы. изменения лежат в пределах физиологической нормы,значимо не отличаясь от контроля удовлетворительная адаптация

очаговая балочная дискомплек-сация-1-3 балла; жировая дистрофия 1-3 балла; нарушения микроциркуляции; ИА до 25%; микронекрозы отсутствуют; изменение соотношения одно-и двуядерных тетраплоидных гепатоцитов (ЬОАЕЬ). изменения достоверно отличаются от контроля и выходят за пределы физиологических колебаний показателя (а) напряжение механизмов адаптации

балочная дискомплексация-4 бал жировая дистрофия-4 бал, и выше ИА-25-40%; изменение(чаще снижение активности ЛДГ, СДГ, НАД-ДГ ); иногда- увеличение фиброзириьания н лимфоидно-клеточной инфильтрации; увеличение доли высокоплоидных гепатоцитов ( РЕЬ). "-" (а) по отдельным показателям может быть выявлена зависимость "поза-эффект"? перенапряжение механизмов адаптации или неудовлетворительная адаптация

отсутствие балочного строения, выраженное фиброзирование (в отдельных случаях-холангиофиб-роз); лимфоидные инфильтраты (иногда гранулемы);поля некрозов; ИА-свыше 40%; резкое снижение числа клеток РЭС и активности ЛДГ. СДГ.НАД-ДГ; увеличение активности кислой фосфатазы; нарушение нормального распределения гепатоцитов по классам плоидности "-" (а) зависимость "доза-эффект" по большинству показателей. истощение механизмов адаптации или ее срыв

- 32 -

ления) животных с различным статусом в зависимости от химической нагрузки.

4. Оценка степени токсичности веществ Был проведен сравнительный анализ 8 химических веществ, представленных растворителями и металлами ( в дозах кратных 10 и 100 ПДК, при их раздельном и сочетанном воздействии с вирусом гриппа в динамике 3-х месячного эксперимента). Показано, что в зависимости от времени и дозы веществ изменение высокоплоидных гепатоцитов характеризовало степень токсичности веществ в соответствии с классом опасности, так как выстраивало их в порядке убывания токсичности от бериллия и свинца к анилину и формальдегиду, железу,этиленгликолю, фенолу (для изопропи-лового спирта зависимость не определена).

Между тем. по оценке гистоферментативной активности маркерных окислительно-восстановительных ферментов и по ряду исследованных интегральных показателей (гибели животных после инфицирования, "опеченению" легочной ткани, титру вируса гриппа и реакции торможения гемагглюти-нации) класс опасности веществ не совпадал со степенью их влияния на сопротивляемость организма к вирусной инфекции. Так. по интегральным показателям наиболее депрессивное действие на сопротивляемость организма оказывал этиленгликоль и изопропиловый спирт, а наименьшее влияние- бериллий и железо. Исходя из этого бериллий, относящийся к 1 классу опасности, по степени снижения сопротивляемости инфекции отнесли бы только к 4-му классу. Когда же оценивали гистоферментативную активность, например ЛДГ, то наиболее утяжеляющее действие вирусной инфекции на процессы анаэробного гликолиза оказал этиленгликоль.

Следовательно, ориентирование на вышеприведенные токсикологические и гистоферментативные показатели привело бы к неверному заключению о токсичности веществ.

Вероятно, отмеченную неадекватность в оценке токсичности веществ можно объяснить с позиций достижения организмом определенной резистентности, вызванной, как и в печени, компенсаторными реакциями. Этим же объяснялось

- 33 -

и изменение сопротивляемости инфекции: чем более токсичны вещества и больше степень вызванных ими повреждений и компенсаций, в том числе и ВР, тем больше резистентность к последующему воздействию, сохранявшаяся до определенного уровня, в свою очередь зависисящего от степени токсичности вещества.

Таким образом, только по определению изменения степени полиплоидизации. в отличие от других изученных показателей, вещества по степени токсичности выстраивались в соответствии с их классом опасности.

5.Оценка эффекта кумуляции При оценке разных режимов ингаляции СС14,300 мг/мЗ, М. А.Пинигиным(197б) были рассчитаны коэффициенты кумуляции как отношение"чистого"времени наступления токсических эффектов при прерывистом воздействии ко времени наступления тех же эффектов при непрерывном воздействии вещества. Были построены кривые зависимости"чистого" времени наступления эффектов от величины отношения длительности перерыва к длительности повторного воздействия.

В логарифмическом масштабе эти кривые имели вид прямых и их угол наклона по изменению различных показателей позволил оценить кумулятивность ССЬ4. Угол наклона для показателя степсии плоидности гепатоцитов и их жировой дистрофии равнялся 18 градусам, тогда как для других показателей, таких как содержание гексоз и гексо-заминов крови- 48 и 52 градусам.

Ориентация на распределение гепатоцитов по классам плоидности позволила оценить кумулятивность ССЬ4, отнеся его к высоко кумулятивным веществам (2-й класс кумуляции, совпадающий с классом опасности этого вещества в списке ПДК веществ в воздухе рабочей зоны).

Оценка порогов вредного действия Разная степень градированности изменения степени полиплоидизации отражала разную степень градированности вредного действия, что чрезвычайно важно для установления порогов вредного действия факторов окружающей среды. Сравнение концентраций, при которых обнаружено из-

- 34 -

менение степени полиплоидизации и первичные изменения различных функциональных показателей при нормировании веществ показало, что отношение порогов выявления степени полиплоидизации к первичным изменениям (по кратности ': ПДК) равно от 1 (то есть время развития ВР и изменения других■ функциональных показателей совпадает-для ДХП.ТХП.ПХЭ, СС14, ГМДА) до 5" (2.9-для БВК и 5 -для кротонового альдегида) (рис. 5).Изменение степени полиплоидизации гепатоцитов определено при дозах, кратных от 5. ПДК и выше (исключение- ГМДА. для которого по многим показателям, в том числе и ВР. эффект возникал на уровне ПДК. что требует его дальнейшего уточнения). Кратность СЬ50 к ПДК была значительно выше ( для ТХП эта величина равнялась 140000. для СС14-1714) . чем кратность порога выявления изменения степени полиплоидизации к ПДК этого вещества.

Особенно большая сопоставимость развития эффекта полиплоидизации отмечалась с изменением СПП,холинэстера-зы и каталазы крови, тогда как разнообразные, используемые параллельно другие морфологические, а также биохимические и физиологические показатели, значимость которых как биомаркеров вредности не всегда определена, появлялись при меньших дозах и концентрациях нормируемых веществ и первоочередность их выявления зависела от чувствительности применяемого метода и от механизма действия исследуемых веществ. Для ДХП такими первичными изменениями были нарушения сперматогенеза, индекса альтерации гепатоцитов и активности кислой фосфатазы печени; для ТХП- активности холинэстеразы, для ПХЭ- активности ЛДГ, для СС14-содержания гексоз, связанные с белками, для кротонового альдегида- активности М-ацетил-Б-глюкозами-нидазы , индекса альтерации гепатоцитов, для ГМДА -уровня гемоглобина, числа нейтрофилов, ферментативной aктивнqcти различных органов, для БВК- структурно-функционального состояния макрофагов.

кратность ПДК

1200 200:

70 -65 -60 -55 -50 -45 -40 -35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 -1 ПДК-

Л

б

О

о

о

ОБОЗНАЧЕНИЯ:

вещества: 1- ДХП; 2- ТХП;

3- !!ХЭ: 4- СС14: Ь- кротоновый

альдегид; Ь- ГЫДА; 7- ЬВК.

а

изменение плоидности гепатоцитов;

+ - первичные изменения;

изаененйя СПП:

вещества

1 2 3 4 5 7

(ДХП ТХП ПХЗ СС14 к.а.ГМДА БВИ)

Рисунок 5.Кратность по отношению к ПДК появления первичных изменений , изменений СПП и развития ВР

- 36 -

Таким образом, в системе оценок общетоксического действия веществ при обосновании ПДК токсикометрические характеристики могут быть дополнены новым биомаркером вредного действия- степенью полиплоидизации гепатоцитов.

Однако, токсикометрия требует не столько определения порога любого действия, сколько определения порога вредного действия, то есть доз и концентраций, вызывающих начальные изменения, лежащие на грани нормы и патологии. как это рассматривали известные токсикологи Н.В. Лазарев (1976) и Н. С.Правдин (1934).Это тем более важно, что порог вредного действия является основополагающей величиной, позволяющей подходить к обоснованию подпоро-говой, не действующей на организм дозы (ПДК).

Введение порога вредного действия по оценке степени полиплоидизации гепатоцитов как самого надежного морфо-функционального биомаркера ВР, отражающего вредное действие, развивающееся на ранней стадии патологического процесса, повышает надежность научного обоснования гигиенических нормативов вредных веществ в объектах окружающей среды и выбора коэффициента запаса, позволяет построить зависимости "доза (концентрация)-эффект", прогнозировать ожидаемые обратимые и необратимые эффекты у населения. Показатель степени полиплоидизации гепатоцитов может служить одним из критериев оценки экологической обстановки для выявления зон чрезвычайной экологической ситуации и зон экологического бедствия согласно критериям, разработанным Министерством охраны окружающей среды и природных ресуров Российской Федерации (1992).

. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В нашей работе определено, что показатель ВР-уве-личение степени полиплоидизации гепатоцитов как биомаркер вредного действия факторов окружающей среды определяется следующим: а) вызывается механизмами, включающимися при структурно-метаболических повреждениях, требующих образование новых клеток; б)необратимостью и стабильностью выявления в динамике хронического воздействия; в) является показателем старения организма;

г)возникновением в динамике патологического процесса на ранней стадии; д) разрастанием соединительнотканных структур, сопровождающим развитие ВР и сужающим функциональную активность органа; е) наибольшей чувствительностью делящихся клеток к факторам окружающей среды.

Приоритетность использования степени полиплоидизации ( среди других морфофункциональных показателей печени) в гигиенических исследованиях, помимо необратимости его выявления в динамике хронического воздействия, доказывается еще и тем, что увеличение клеточной пролиферации является генетически запрограммированной неспецифической реакцией, возникающей при снижении функции печени, которая вызывается различными структурно-метаболическими нарушениями. Тем самым нивелируется специфика воздействия, что является перспективным при сравнении токсичности веществ разных классов, оценке комплексного, комбинированного и сочетанного воздействия.

'Полиплоидизация печени широко изучалась при остром и, реже, хроническом действии, в основном, гепатоксичес-ких веществ (Солопаев Б.В.,1980; Gerhard Н. et al.,1973; Uryvaeva I. V. et al.,1995). Между тем, морфофункциональ-ные изменения в печени отмечались при воздействии физических (Наджимудинов Т.К.и др..1993;Утемисов Б.К.,1991; Юрченко И.В. и др.,1986; ) и биологических факторов: БВК (Немыря В.И..1989; Новодержкина Ю. Г.и др..1975) и вируса гриппа (Бонашевская Т.И..1987). Однако, в этих исследованиях ВР не анализировалась.

Патогенез развития ВР в печени при действии изученных факторов, вероятно, различен и еще достаточно не изучен, хотя имеются некоторые гипотезы. Без сомнения, в детоксикации химических веществ печени принадлежит ведущая роль. Но и при воздействии других факторов печень играет большое значение для состояния организма ввиду её значительной роли в межорганных взаимодействиях. Так, БВК как сильный аллерген связан с феноменом опсонизации, а факторы, ответственные за неё или за её регуляцию, синтезируются либо контролируются печенью (Larcher V.,1981). Вирус гриппа приводит к интоксикации организма. оказывающей влияния и на печень (Жернакова Т.В.и

- 38 -

др.,1984;Фролов Е.А.и др.,1983). Шум. помимо хорошо известного поражения органа слуха, вызывает функциональные расстройства сердечно-сосудистой, центральной нервной и иммунологической систем (Алексеев C.B. и др.,1991; Суворов Г.А..1986). В свою очередь, сосудистые реакции в печени обусловлены сдвигами в ЦНС и включением в патологический процесс вегетативного отдела нервной системы; при воздействии шума развивалось застойное полнокровие органов с нарушением проницаемости сосудов и трофики, приводящей в печени к балочной дискомплексации и жировой дистрофии (Осинцева В.П. и др.,1967; Дусаева А.Д. и др..1986).

В многочисленных исследованиях показано, что поли-плоидизация зависит от клеточного типа, органа, вида, возраста и даже линии животного, является в норме стабильным, генетически запрограммированным показателем (Бродский В.Я.,Урываева И.В..1981;Кудрявцев Б.Н., 1993).

Подтверждением тому служила проведенная оценка распределения гепатоцитов по классам плоидности у 58 контрольных самцов белых беспородных крыс, сгруппированных по сезонам года и массе животных,отражающей их возраст,а для 19 крыс еще по функциональным особенностям. Установлены новые характеристики распределения гепатоцитов по классам плоидности-независимость от сезона года и двигательной и эмоциональной активности крыс. Среди изученных видов животных наибольшая степень полиплоидизации была у мышей, в меньшей степени-у крыс и незначитель-ной-у морские свинок. При этом с возрастом степень полиплоидизации усиливалась.

В печени при достаточной дозе и времени воздействия в ответ на различные по своей природе структурно-функциональные изменения, зависимые от изучаемого фактора, стереотипно менялась степень полиплоидизации. Сопоставление полученных результатов с данными других исследователей (Maurer W., et al.,1973; Styles J.,1993; Uryvaeva I.V.et al.,1995) позволили заключить.что увеличение степени полиплоидизации является универсальным биологическим показателем вредности, возникающим при необходимости коррегирования повреждений.

- 39 -

В последнее десятилетие для оценки воздействия окружающей среды остро встала необходимость разработки надежных биомаркеров вредного действия (S. М. Rappaport et al.,1995; Sexton К.et al,1995) для оценки воздействия на организм факторов среды, в том числе и для классификации уровней эффекта. Однако, предлагаемая за рубежом характеристика различных уровней эффекта (N0EL-FEL) не дает исследователю конкретных рекомендаций для их оценки. Между тем, научное обоснование особенно информативного показателя BP, степени полиплоидизации гепатоцитов как морфофункционального биомаркера вредного действия, имеющего градированную степень выраженности и отражающего различную степень пролиферации, позволило разграничить уровни возникающих эффектов N0AEL - L0AEL и FEL и использовать этот показатель при обосновании пороговых и подпороговых величин.

Следует подчеркнуть, что пролиферации клеток, которая является характерной чертой BP, отводят значительное место в ключевых событиях канцерогенеза. Так как для ряда химических веществ доказана взаимосвязь между канцерогенезом, пролиферацией и регенерацией, то перспективой дальнейших исследований может являться изучение зависимостей между канцерогенезом и BP. Другим направлением дальнейшей работы может быть определение критериев BP в тех органах экспериментальных животных, где отмечается полиплоидизация, а также у людей в объектах, доступных морфологическому анализу, например, в мазках-отпечатках слизистых оболочек носоглотки, с их апробацией при изучении состояния здоровья населения.

ВЫВОДЫ.

^Сравнительный анализ всех исследованных морфофу-нкциональных показателей печени ( включая такие показатели BP, как митотический индекс и ДНК-синтезирующую активность клеток, соотношение их одно-и двуядерных форм, содержание ДНК. коэффициент плоидности и распределение гепатоцитов по классам плоидности) установил, что наиболее критериально значимым и достоверно определяемым показателем вредного действия различных факторов окружаю-

- 40 -

щей среды является полиплоидизация гепатоцитов.

2.Оценка плоидности не информативна по коэффициенту плоидности. менее информативна по соотношению одно-и двуядерных гепатоцитов и одному цитофотометрическому определению содержания ЛНК и наиболее информативна-при сочетании с распределением гепатоцитов по классам плоидности.

3. Определено, что степень (уровень) полиплоидиза-ции меняется при действии химических, физических и биологических факторов и их сочетаниях, сохраняется после прекращения действия исследуемого фактора, носит стереотипный, количественно определяемый и необратимый характер. дифференцирующий разную степень выраженности вредного эффекта и подчиняется зависимости "доза (концентрация) -время-эффект".

4. Показано, что один из показателей ВР - число ДНКсинтезирующих клеток (ИМЯ), определяемый в печени, легком, почке, кишечнике, желудке, поджелудочной, надпочечной и щитовидной железах, зависит от дозы и длительности воздействия. Разработанная система оценки ВР по ИМЯ в различных органах позволяет выбирать приоритетные клеточные популяции для решения различных гигиенических задач. Однако, кратковременность выявления ИМЯ снижает эффективнось его применения в гигиене.

5. Степень полиплоидизации гепатоцитов как биомаркер вредного действия факторов доказывается тем, что: а) вызывается механизмами, включающимися при структурно-метаболических • повреждениях, требующих образование новых клеток: б) является необратимым и стабильно выявляется в динамике хронического воздействия; б) возникает в динамике патологического' процесса на ранней стадии; в) сопровождается разрастанием соединительнотканных структур, сужающих функциональную активность органа; г) является показателем старения печени; д) отражает клеточное деление, йвлющееся чувствительной фазой клеточного цикла к факторам среды. :

6. Доказана сопоставимость различной степени полиплоидизации гепатоцитов с уровнем вредного действия, позволяющая ранжировать эффекты: ШАБЬ. ЬОАЕЬ и РЕЬ (ЫОАЕЬ

- 41 -

как отсутствие изменения показателя, ЮАЕЬ- изменение соотношения одно-и двуядерных тетраплоидных гепатоцитов, ГЕЬ-увеличение их высокоплоидных форм ) и использовать эту градацию для обоснования пороговых и подпороговых величин при гигиеническом нормировании.

7.Для решения гигиенических задач на моделях специфических и функциональных нагрузок по величине степени полиплоидизации на нагрузку предложено оценивать адапти-рованность печени. При ранжировании животных по их статусу определено, что изменение плоидности начинается у животных с напряжением адаптации и усиливается в стадиях перенапряжения и срыва.

8. Установленные характеристики и зависимости определили критериальную значимость показателя изменения степени полиплоидизации как биомаркера вредного действия и его возможность использования в гигиенических исследованиях при: установлении порогов вредного действия; изучении степени токсичности веществ; определении резистентности органа; определении эффекта кумуляции; оценке состояния экспериментальных животных по статусу организма; изучении эмбриотоксического действия.

- 42 -СПИСОК

основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Пролиферация и полиплоидизация гепатоцитов как показатели восстановительной регенерации печени при действии химических факторов окружающей среды. // Гигиена и санитария.-1989- N 3,- С.48-52.

2. Развитие морфофункциональных исследований в гигиене (от работ А.П.Доброславина до наших дней).// Гигиена и санитария.- 1992 - N 9-10.- С.31-33.

3. Авторадиографическое исследование компенсаторно-восстановительной регенерации легких при действии химических факторов окружающей среды.//Актуальные вопросы пульмонологии. Морфологические критерии дезадаптации дыхательной системы к факторам внешней среды (Мат.1-й Дальневосточной конф.). -Благовещенск- 1985-4.1,- С.91-92.

4. Репродукция клеточных популяций крыс при хроническом воздействии хлористого никеля. /Микроэлементы в биологии и их применение в медицине и сельском хозяйстве (Тез. докл.Х-й Всес.науч.конф.).-Чебоксары-1986-ч.2.- С.72-73.

5.Авторадиографическое исследование синтеза ДНК в эндокринных железах при хроническом воздействии хлористого никеля// Эндокринная система организма и вредные факторы внешней среды (3 Всес.конф.).-Л.-1987. -С.28.

6. Восстановительная регенерация различных клеточных популяций легких крыс и морских свинок при изолированном и сочетанном действии химических и физических факторов окружающей среды.//Медико-экологические аспекты морфологии легких (Тез.докл. регион.конф.).-Благовещенск-1989.-С. 77-78.

7. Взаимосвязь загрязнения окружающей среды и старения организма на примере регенерации печени при воздействии химических веществ. //Проблемы исследования и преодоления экологической опасности в промышленном регионе.-Кемерово- 1990.-С.93.

8. Восстановительная регенерация различных клеточных популяций при действии факторов окружающей среды.// Гигиена окружающей среды. -М.-1990. - С.11-14.

9. Клеточная восстановительная регенерация как фактор риска при воздействии окружающей среды.// Профилактическая медицина..Состояние и перспективы.-Л. - 1991.- С. 10.

-в соавторстве:

-в центральной печати:

10.Монография: Морфофункциональные исследования в' гигиене. - М.: Медицина- 1984. - 159 С. (с Т.И.Бонашевской, Н.Б.Кумпан, Л.В.Панасюк).

11. Влияние 1,2,3-трихлорпропана на плоидность клеток печени крыс. // Бюлл. экспер. биол. и медицины.- 1974 -М 12,- С.74-77. (с В.Р.Цулая.Т.Л.Маршак. В.Я.Бродским ).

12. Структурные и гистохимические изменения печени при воздействии ряда ароматических и галогенпроизводных уг-леводорЬдов.// Гигиена и санитария-1975- N 6,- С.111-113. (с Т.И.Бонашевской).

13. Исследование влияния ряда веществ из группы хлорп-роизводных углеводородов на состав популяции гепатоцитов крыс. //Бюлл. экспер. биол. и медицины.- 1977- N 3,- С. 345-348 ( с Т. И. Бонашевской, Т.Л.Маршак, В.Я.Бродским).

14. Структурные и гистохимические изменения печени при воздействии некоторых хлорпроизводных углеводородов. //

Общие вопросы патолог, анатомии.. реф.11.76.33 за N 31691976- N 11 (с Т.Н.Бонашевской. В.Р.Цулая, В.М.Шайпак ).

15. Токсикологическая характеристика некоторых хлорпро-изводных углеводородов.//Гигиена и санитария.-1977-N 8.-С. 50-53 (с В. Р. Цулая, Т. И. Бонашевской, В. В. Зыковой и др.).

16. Полиплоидизация как механизм компенсации при действии химических факторов окружающей среды. // Гигиена и санитария,- 1977- N 12. - С. 81-83 (с Т.И.Бонашевской, В.Я.Бродским, Т.Л.Маршак. В.Р.Цулая).

17. Влияние различных режимов прерывистого действия че-тыреххлористого углерода на развитие гепатотоксического эффекта.// Гигиена и санитария. -1979- N П.- С.68-70 (с Т.И.Бонашевской,Е. К.Булочниковой,3. П.Григоревской и др.).

18. Сравнительное биохимическое и морфологическое исследование печени экспериментальных животных в процессе гепатотропного действия атмосферных загрязнений (на модели четыреххлористого углерода). // J. of Hygiene. Epidemiology, Microbiology and Immunology.- Praga -1979-N 4-V.23. -P. 326-334. (с P.В.Меркурьевой, Т.И.Бонашевской. И.С.Шатерниковой и др.).

19. Полиплоидизация гепатоцитов при различных режимах воздействия СС14 на печень крысы. // Бюлл. экспер. би-ол. и медицины.-1980- N6.- С.86-87 ( с Т.И.Бонашевской, Г.И.Некрасовой).

20. Состояние и перспективы развития морфологических исследований в области гигиены окружающей среды.// Гигиена и санитария.-1981- N 1.-С.13-15 (с Т.И.Бонашевской).

21. Экспериментальное изучение биологического действия пыли кормового белка при ингаляционном пути поступления. // Гигиена и санитария,- 1984- N2,- С.26-30 (с Т.И.Бонашевской, В.И.Немыря ,Л.М.Чабан и др.).

22. О некоторых аспектах биологического действия дистиллята. // Гигиена и санитария.-1989- N 3.- С. 92-93 (с Ю.А.Рахманиным. Р.И. Михайловой, А.В.Филипповой и др.).

23. Гигиеническая оценка минерализующих материалов-известняков для коррекции солевого состава маломинерализованной воды.//Гигиена и санитария.- 1990- N8.- С.4-8 (с Ю. А. Рахманиным, А.В.Филипповой, Р.И.Михайловой и др.).

24.Морфофункциональная оценка изолированного и сочетай-ного действия химических и физических факторов окружающей среды.//Гигиена и санитария.- 1991-М 2,- С.54-57 (с Т.И.Бонашевской, М. А. Пинигиным, Н.Б.Кумпан и др.).

25. Структурно-функциональная оценка надпочечных желез в токсикологическом эксперименте.//Гигиена и санитария. -1991- N 3- С. 58-61 (с Т.И.Бонашевской, Н.Б.Кумпан, Н.В.Пиртахия).

26.Гепатоцеллюлярные механизмы компенсаторных процессов при воздействии химических факторов окружающей среды. //Гигиена и санитария.-1991-М 12,- С. 15-19 (с Т.И.Бонашевской, Т.Г.Ламентовой, В.Сэффнер и др.).

27. Установление зависимости интенсивности воздействия - статус организма по монофункциональным показателям. //Гигиена и санитария. -1993- N 9.-С. 39-42 ( с С.Л.Ава-лиани, М.М.Андриановой).

28. Исследование структурно-функциональных изменений в печени и иммунокомпетентных органах при воздействии диаминов.// Гигиена и санитария.- 1993- N 5.- С. 44-46 (с З.И.Когановой, Т.И.Бонашевской. Л.Х. Мухамбетовой).

29. Методические аспекты медико-биологических исследований в гигиене окружающей среды. //Гигиена и санитария. -1994- N1,- С.16-19 (с И.В.Петровой. Л. X.Мухамбетовой).

30. Влияние интоксикации свинцом на течение вирусной инфекции. //Гигиена и санитария,- 1994 -И 1- С. 32-35 (с 3.М.Гасимовой, Л.М.Климовой ).

31. Дифференциальная донозологическая характеристика состояния крыс после химического воздействия. // Гигиена и санитария.-1994-М 4.- С.8-10 (с Г.Ф.Семеновой. Т. И. Бонашевской) .

32. Влияние воздействия формальдегида в преиатальном периоде на развитие потомства крыс. //Гигиена и санитария. - 1994- N6.-0. 31-34 ( с В. С. ¡Курковым, З.М.Гасимо-вой, В. И.Казачковым).

33. Основные этапы развития мелико-биологических исследований в гигиене окружающей среды.// Экология человека. - 1996^ 3.-С.13-15 (с Л.X Мухамбетовой. И.В Петровой, В.С.Журковым ).

-в сборниках:

34. К вопросу о биологическом действии малых концентраций гексаметиленимина на организм морских свинок.//Гигиенические аспекты охраны окружающей среды.-М.- 1976-вып. 3.- С.45-47 (с Ф.М.Эрман, В.Ф.Кавериной. М. С. Гордеевой).

35. Морфологическое, гистохимическое и гистоавторадиог-рафическое исследование системы органов дыхания при различных путях введения хлористого никеля.// Гигиенические аспекты охраны окружающей среды,- М.-1976-вып. 4,- С. 39-41. ( с Т.И.Бонашевской, А.И.Ицковой).

36. Роль восстановительной регенерации в развитии адаптационных процессов к-действию химических факторов окружающей среды. //Эколого-физиологические исследования в природе и эксперименте (Тез.докл. 5-й Всесоюз. конф. по экологической физиологии, биохимии и морфологии). -Фрунзе- 1977.- С.277-279 (с Т.И.Бонашевской).

37. Применение методов количественной гистохимии и гис-тоавторадиографии для оценки компенсаторно-приспособительных реакций к химическим факторам окружающей среды. // Гигиенические аспекты охраны окружающей среды.- М. -1977- вып.5.-С.16-19 (с Т.И.Бонашевской. Е. К. Булочнико-вой, И.М.Кецлер).

38. Прогнозирование времени наступления некоторых токсических эффектов при ингаляционном воздействии хлорированных углеводородов в различных концентрациях и режимах. // Там же. - С. 33-36 ( с М.А. Пинигиным. З.П.Григо-ревской. Г.И.Некрасовой и др.).

39. Характеристика раздельного и комбинированного действия на организм некоторых хлорпроизводных углеводородов при ингаляционном поступлении.// Там же. - С.42-45 (с В.Р.Цулая, Т.И.Бонашевской. В.М.Шайпаки др.).

40. Оценка некоторых методических подходов к изучению комплексного действия металлов на примере никеля./'/Там же. -С. 45-47 (с М. Л. Пинигиным. Л. И. ицковой. II. II. Елаховс-кой и др.). :

41. Использование комплекса количественных гистохимических методов при оценке реакций печени на химическое воздействие.// Гигиенические аспекты охраны окружающей среды.- М.- 1978- вып. 6.-С. 27-31 (с Т.И. Бонашевской. И.М.Кецлер. С.В.Красноселовой и др.).

<12. Результаты и перепет ивы изучения тканевых барьере организма п гигиенических исследованиях. // Гигиенически -аспекты охраны окружающей среды.-М.-1979- вып. 7.-с. 12-1 (с Т.И. Боиашевской. Е.К.Булочниковой. Н.Б.Кумиан и др.) -13. Г'истоФупкиипиальпал характеристика печени в раине периоде действия НЛМЛ ч ультрафиолетовой радиации. / Биологическим эффект М-нитрозососдинепий ( Тез.Всесоюз симпоз. ). -Л.-1980- С. 31-32 ( с Т.И.Боиашевской. II.И.Ли твиновым. Ю.И.Прокопенко и др.).

44. Сравнительная чувствительность интегральных токси кометрических и морфологических показателей, исследован пая в процессе адаптации организма к действию токсичес ких веществ. // Всесоюз. учредит, коиф. по токсикологи (Тез. Л0К.П. ). - М. - 1980. - С.109-190. ( с Г. И. Боиашевско II. Б. Кумиан. Е. К. Булочниковой).

45. Пластичные и жесткие показатели клетки при развитп интоксикации.// Тез.9-го Всес. съезда анатомов, гистоло гов и эмбриологов.-Минск-1981.- С.59 ( с Т.И.Боиашевско Е. К. Булочниковой. II. Б.Кумиан).

46.Структурно-функциональные основы приспособительны реакции легких к действию атмосферных загрязнений.// Не дшшиские проблемы охраны окружающей среды.-М.-1981.- С 82-80 (с Т. и. Боиашевск.ой. Н.Б.Кумиан. Е. К. Булочниковой др.).

.47.. Динамический морфофушециоиальный анализ в гигиени ческих исследованиях.//Тез.попл. 1 съезда эпидемиологе и гигиенистов Таджикистана.- Душанбе:Лониш- 1985- ч.1. С. 27?.- 274 ( с II. 11. Е.лахоискои, II. И. Мамулашвили). 40. Структурные и ультрэструктурные нарушения гомеоста за и его коррекции при экспериментальном моделировани атмосферных загрязнений.//Гистогенез и регенераци (Тез.докл. научной конференции).- Л.-1986.- С.83 ( Т. И. Боиашевской. II. Б. Кумиан. 3. М. Гасимовой).

49. Характеристика компенсаторно-приспособительных про иессов к действию атмосферных загрязнений. //Тез.док. Всес. съезда анатомов, гистологов и эмбриологов. (Винну ца)-Полтава-1906.- С.52 (с Т.И.Боиашевской.И.Б.Кумиан).

50. Изучение взаимосвязи резистентности биосистем ра; иого уровня интеграции //Проблемы охраны здоровья касс ления и защиты окружающей среды от химических вредм Факторов (Тез.докл. 1 Всес.съезда токсикологов). -Рос тов-на-Дону- 1986.- С. 335-336 (с Т.И.Бонашевско( Н.Б.Кумпан. Л.Л.Радкевич и др.).

51. Морфофункциональная оценка геиатотоксического дей< твия химических факторов окружающей среды.// Структу| но-функииональные и биохимические механизмы влияния фа1 торов окружающей среды на организм человека и экспер! ментальных животных. -И. -1986. - С. 2.0-25.

52. Использование количественных морфологических мет( лов в гигиенических исследованиях.// Там же.- С. 27-31 ( с Н.Б.Кумиан).

53. Количественное морФоФункиионалыюе исследоват изолированного и сочетаниого действия факторов окружа! щей среды на организм. // Там же. -С. 68-73 (с Н.Б.Ку; пан. М. А. Жарск.ой. Г. И. Некрасовой и др.).

54. МорФоФункиионалыюе исследование надпочечников п воздействий факторов окружающей среды. //Эндокринная си тема организма и вредные Факторы внешней среды(3-я Все

. - 40 ~

конф.).-Л,- 1987- С. 28 (с Т.Н.Бонашевской, Н.Б.Кумпан).

55. Гистоферментативная активность печен» мышей, подвергавшихся раздельному и сочетанному воздействию химических веществ и вируса гриппа.// Гигиена труда и профзаболеваний в химической промышленности Казахстана. -Ал-ма-Ата-1987. - С.91-99. (с т.И.Бонашевской. О.И.Прокопенко. Н.Б.Кумпан и др.).

56. Морфофункциональная оценка печени при аллергическом альвеолите.//Гигиенические аспекты изучения биологического загрязнения объектов окружающей среды (Мат. X Всес. конф.).-М.-1988-4.2.-С.9-10 (с О.В.Заремба, М.А.Рябовой).

57. Альтерация различных клеточных популяций как стереотипная ответная реакция на воздействие химических факторов. //Проблемы реактивности и адаптации клеток, тканей и органов (4 конф. морфологов республик Средней Азии.Казахстана). -Караганда-1988. - С. 33-34 (с Т. И.Бонашевской, Н.Б.Кумпан и Т.Г.Ламентовой).

58. Информативность морфологических показателей при оценке химических и биологических загрязнений окружающей средн.//2 Всерос. съезд анатомов, гистологов и эмбриологов. ,-М.-1988.- С. 15 (с Т.И.Бонашевской, Н.Б.Кумпан. З.М.Гасимовой).

59. Методические подходы к структурно-функциональному анализу многокомпонентной химической смеси.//Тез.докл.7 Всес. конф. по экологической физиологии.-Ашхабад-1988.-С. 66 (с Т.И.Бонашевской,Н.Б.Кумпан,З.М.Гасимовой).

60.Морфологические подходы к оценке эндогенных Факторов риска при изолированном и сочетанном действии химических и физических факторов окружающей среды.//Актуальные проблемы гигиенического регламентирования химических Факторов в объектах окружающей среды. {Тез. докл. Всес. конф.). - Пермь-1989.- С. 32-34 { с Т.И. Бонашевской. Н.Б.Кумпан. З.М.Гасимовой).

61. Морфофункциональные неспецифические реакции повреждения и компенсации при действии химических факторов окружающей среды.//Методология фундаментальных исследований в гигиене окружающей среды.-М.-1989.- С. 124-129 (с Д. М.Климовой. К.К.Кузнецовой).

62. Морфофункциональная оценка защитных систем организма при действии гексаметилендиамина и парафенилендиами-на.// Охрана окружающей среды и здоровье населения.-Тар-ту-1990.-С.133-135 {с А.В.Присекйной и А.М.Осипенко).

63. Сравнительный анализ морфофункциональных компенсаторно-приспособительных изменений в печени экспериментальных животных и человека. //Актуальные проблемы лекарственной токсикологии.-М.-1990-4.1. - С. 32 (с Т.И. Бонашевской, В.С.Пашковой. П.Г.Маркиным).

64. Морфофункциональный анализ печени крыс при изолированном и комбинированном воздействии циклофосфамида и фенобарбитала.//Там же, - С. 19 (с Н.П.Бурмантовой).

65.Количественные подходы к морфологической оценке воздействия реальной нагрузки факторов окружающей средне/Профилактическая медицина. Состояние и перспективы. -Л. -1991- С. 130 (с С.Л.лвалиани. М.М.Андриановой).

66.Количественная морфологическая оценка функционального состояния надпочечных желез при действии факторов окружающей среды.//Эндокринная система организма и вредные Факторы окружающей среды. - Л.-1991- г. ru (с Т. Г. Ламентовой. И. А. крятовым).