Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Защитное действие формальдегида при ишемии головного мозга (экспериментальное исследование)

МЗ СССР

КОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ТРУДОВОГО КРАСНОГО

ЗНАМЕНИ

МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ им. И.М.СЕЧЕНОВА

ЩЕРБАКОВА Людмила Никаноровна

ЦИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ФОРМАЛЬДЕГИДА ПРИ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА (экспериментальное исследование) 14.00.16 патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

1,иссертат:ии на соискачие ученой степени кандидата биологических" наук

На правах рукописи УДК 616.831:616-005.4-084:547.281.1

Москва - 1990

• Работа выполнена в академической группе академика АМН СССР В.В.Кованова при Всесоюзном научном центре хирургии А?,Я СССР

/

Научные руководители: академик АМН СССР В.В.Кованов доктор биологических наук Л.В.Молчанова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук А.П.Хохлов кандидат биологических наук Н.В.Гуляева

Ведущее учреждение - Научно-исследовательский институт общей патологии и патологической физиологии АШ СССР

Защита состоится " " .............. 1990 г.

на заседании специализированного совета К.074.05.03 в I Мое -ковском ордена Ленина и Трудового Красного Знамени медицинском институте им. И.М.Сеченова (г.Москва, Б.Пироговская улица, 2-6)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института (г.Москва, пл.Шолохова, дом I).

Автореферат разослан и " ............ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета док.кед.наук

Войнов В.А.

I.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Распространенность заболеваний, связанных о постишемическими расстройствами пункций центральной нервной системы, делает проблему фармакологической защиты нервной ткани от повреждашетх) действия ишемии весьма актуальной. Отсутствие до статочно эффективных противоишемических средств с одной оторонн и чувствительность мозга к действию ишемии с другой зачастую ко -ключают возможность оперативного вмешательства на мозге, и боль -ные остаются без помощи даже в случае необходимости и техничес -кой выполнимости операции. Это обстоятельство обусловливает по -стоянный поиск аффективных щхзтивоишемических сиедств.

В группе академика АМН СССР В.В.Кованова в точение ряда лет ведутся работы по изысканию средств, обеспечивающих профилактику ишемических расстройств в различных обькутах. Работами группы покачана возможность использования альдегидов для противоипемичео -кой защиты тканей (Кованов В.В. с соавт., 1987, Тельпухов В.И.-, 1990). Преимущество формальдегида перед другими противоишемиче -скими средствами связано с тем, что он являетоя естественным метаболитом живой ткани и участвует в формировании реакции адаптя -ции в различных экстремальных.ситуациях (livorschak е., Prochas.ika Н., Вагпа К., 1У85, Huazti Z., 1985, Klrali Z., Tyihak В., Szar -та« Т., 1У85, Szarvas Т., Simon L.I1., ТгсьиХ L., Tyihak E., 1985, Cazanova M. end d'A. Heck, 1985).

Изучение процессов возникновения и развития ишемических по,-вреддений в ткани мозга за последние годы достигло значительных успехов. Однако выяснение отдельных механизмов патологического процесса не позволяет решить"вопрос о том, какие из них придают необратимый характер интегральной картине патологического рас -стройства. Изучением механизмов развития патогенетического процгсе-

г.

са при ишемии установлены факторы, способетвушие необратимости ишемического расстройотва (Молчанова Л .В., 1980, Молчанова Л.В., 1988). Косвенная оценка эффективности противоишемиче -ских средств возможна на основании изучения их влияния на эти факторы.

Цолъ и задачи исследования. Исследование ставит своей целью изучить влияние профилактического введения формальдегида на физиологические и биохимические показатели состояния мозга при ише -шш и показать некоторые возможные механизмы его действия.

В соответствии о поставленной целью были определены следу-■пцие конкретные задачи исследования:

1. Изучить изменения ферментативной активности и изоферментного спектре лактатдегидрогеназы.

2. Изучить изменения показателей количества белка при определении его по биурату и методом Лоури.

3. Изучить активность множественных форм щелочной фосфатазы в поотмитохондриальной надосадочной жидкости гомогената ткани мозга.

4. Исследовать уровень диеновой конъюгации ненасыщенных высших -жирных кислот я концентрацию липидов в ткани мозгя.

5. Исследовать изменения электрической активности мозга.

6. Изучить сохранение способности к выработке и восстановлению условного рефлекса в поствшешческом периоде.

Новизна полученных результатов. Установлено защитное профилактическое действие формальдегида при ишемии головного мозга. Впервые осуществлен новый подход в изучении механизмов защитного действия формальдегида с позиций его влияния на байховый и лшшдный обмен; Установлено действие формальдегида ва факторы, способетаушше фомнрованию необратимых измянтгий в ткани моэгя

3.

при его ишемии. Показана корреляция между изменениями исследованных биохимически* и Функциональных показателей при действии формальдегида на мозг.

При сохраненном мозговом кровотоке действие формальдегида на мозг устраняется аутолизином. Установлено потенцирупдее действие аутолизина на снижение формальдегидом активности перекис-ного окисления липидов.

Научно-практическая значимость. Проведенное исследование явля -ется обоснованием защитного действия формальдегида в ткани мозга при его ишемии и его использования.

Предложен способ устранения действия формальдегида при сохраненном мозговом кровотоке, что может иметь значение при ис -пользовании его в клинике. Внедрение в практику результатов исследования.

1. По основным положениям диссертации опубликовано 10 научных работ. *

2. Предложен способ специфической детоксикации при отравлениях альдегидами, на который получена приоритетная справка от

' ВНИИ ГПЭ № 40004£•6/14 от 26.11.85 и вынесено предварительное положительное решение.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов, указателя литературы, списка сокращений. Текст диссертации изложен на Т20 страницах машинописи, содержит 22 таблицы и II рисунков. Указатель литературы включает 163 работы отечественных и 1С2 - зарубзжннх авторов. Апробация материалов диссертационной работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены:

I. На научных конференциях группы академика А!Л СССР В.В.Когано-

ва при Всесоюзном научном центре хирургии А),И СССР, 1984-1987 г„т„

2. На объединенной научной конференции отделов патологической Лизиологии и биохимии НИИ нзврологии МЗ СССР, 1984 г.

3. На заседшши секции биохимии нервной системы Московского отделения Всесоюзного биохимического общества АН СССР, 1985 г.

4. На II Всесоюзной конференции "Биоантиоксидант" Москва, 1986 г.

5. На международном симпозиуме "Рогуляция свободно-радикальных процессов", Варна, I98S.

II.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 648 беспородных крысах обоего пола массой от 150 до 250 г .под гексеналовым наркозом. Объектом исследования является головной мозг.

Экспериментальная модель ишемии мозга у крыс. Ишемию мозга со -идавали следующим образом: из внеплеврального чрезгрудинного оперативного доступа в средостении пережимали левую и правую общие сонные артерии и подключичные.артерии дистальнее отхождения внутригрудинной я проксимальнее отхождения позвоночной артерий. Реперфузию осуществляли снятием лигатур с перевязанных сосудов,

(Розвадовский В.Д., Тре.нин С.О., Тельпухов В.И.,1983). Обработка ткани мозга. Б биохимических исследованиях использовали большие полушария головного мозга. Животных декапитировали, Еокрыпали черепную коробку, ткани больших полушарий помещали в 0,9^-ный раствор хлорида натрия, охлажденный до 0°С. Затем помещали ткань между двумя слоями фильтровальной бумаги для удаления Физиологического раствора.

Постмитохондриальную надосадочную жидкость получали путем гомогенизации ткани больших полушарий головного мозга с раствором сахарозы, взятым по отношению к массе тканей мозга из расчета 2:1. Гомогенат центрифугировали в течение 10 мин при 16 ООО g.

Получаемый материал содержит примесь некоторого количества гладкой эндоплазматической сети, свободных рибосом,микросом и ли-зосом (Мэдди Э., 1979).

Для получения экстракта лшгадов к пробе тканей мозга добавляли смесь нормального гептана л изопропилового спирта (1:1) из расчета 9 частей экстрагирупцей смеси на I часть массы ткв -ней мозга, затем гомогенизировали в течение 15 мин, после чего центрифугировали 10 мин при 4 ООО g. Получаемый экстракт пред -ставляет собой сумму липидов, включая жирные кислоты (Стальная Д.И., 1977).

Группы экспериментов и сроки исследования. Формальдегид вводили внутриартериалыю в виде 0,2^-ного раствора в 0,9^-ном растворе хлорида натрия из расчета 1,5 лсшоль/г массн тела жи -вотного со скоростью, не превышавшей I мл/мин. Аутолизин х^вво-;135ли струйно непосредственно после введения формальдегида в виде 8,4^-ного раствора в количестве 5 мл/кг массы.тела животно -го. В качестве плацебо вводили 0,9^-ннй раствор хлорида натрия в количестве, сс гветствующем расчетному количеству раствора ' формальдегида.

Мозг брали в следующие сроки :1 - икгактный мозг, 2 - oicot. чание введения растворов, 3 - при сохраненном мозговом кровото -ке через D, 20 и 60 мин после ложной операции, 4 - при ишемии через 5, 10, 20, 25, 35 и 60 мин от ее начала. В одном варлактз экспериментов реперфузию осуществляли через 10 мин, а в другом. -через 35 глин от начала ишемии; забор проб осуществляли через 90 мин от начала реперфузии.

- ампнолизат отечественного производства (Гордиенко C.B. с соавт.,1977).

Биохимические методы исследования.

Определение ферментативной активности и.сорбционных свойств лактатдегидрогеназн (ЛДГ) проводили по реакции превращения пиру-вата в лактат. Определение активности изоферментов ЛДГ проводи -'ли с использованием сорбции на ДЭАЭ-сефадексе А-50 (Bergmeyor н.и, Bernt Е., 1974). Метод позволяет определить, активность ЛДГ-^^g (М-тип) в надосадочной жидкости и активность iHTj g (Н-тип) по разности мевду общей активностью ДДГ и акишностью не сорбирую -щейся на ДЭАЭ-сефадексе А-50 фракции

Определение количества белка проводили методами Лоури и по • биурету (Lowry Q.et.al., 1951, Бэйли Дж.,1965).

Активность щелочной фосфатазы определяли в постмитохондри-альной надосадочной жидкости гомогената ткани мозга по отноше -ни» к паранлтрофенилфосфату На (szekiiic Е.,1%6). Активность термостабильной формы щелочной фосфатазн (Щ5) определяли после ин -кубации испытуемых проб при 56°С В течение 10 ГЛИН (Simon Рг., Sutherland в. , 1977). Активность термолабильной формы И® определяли по разности между общей активностью Щф и активностью термостабилыюй формы.

Определение уровня диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот проводили по методу Д.И.Стальной (1977). Метод использует появление нового максимума в спектре поглощения при длине волны 233 нм при образовании диеновых коньюгатов. Концентра -шно липидов определяла весовым методом.

Физиологические методы исследования.

Исследование электрической активности мозга проводили с помощью полиграфа П6Ч-04. Для регистрации ЭЭГ позолоченные и час -тично покрытые изолирующим лаком электроды имплантировали в со -матосенсорную зону коры по атласу стереотаксических координат '

мозга крысы. Индифферентный электрод размещали в носовых кос -тях черепа.

Для исследования способности к выработке и восстановлении условного рефлекса был использован рефлекс активного избегания в У-образном лабиринте. 3 качестве условного стимула использовали световой сигнал. В качестве безусловного стимула применялось болевое раздражение, создаваемое пропусканием электрического тока силой 0,5 мА и напряжением 140 Вт через токопроводящий пол лабиринта, в котором размещались животные.

Статистическая обработка материала.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по методу Стьвдента (Плохинский H.A.,i960). Оценку достоверности различий параметров проводили с помощью критерия Стьюдента по уровню значимости Р = 0,05. III.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При ишемии головного мозга у крыс сроком 10 мин, выполненной без применения протекторных средств, выживаемость животных была практически полной. Удлинение ишемии до 15 мин приводило к гибели более 1/3 животных. У выживших животных наблюдались зна -чительные нарушения неврологического статуса. Ишемия сроком 35 мин приводила к гибели всех животных, использованных в эксперименте.

Профилактическое введение 0,2^-ного раствора формальдегида в 0,9£-ном растворе хлорида натрия в количестве 1,5 мкмоль/г ' массы тела животного обеспечивало полную выживаемость после 25 ■ мин ишемии головного мозга. После 35 мин ишемии в присутствии экзогенного формальдегида выживаемость составляла 91%.

Защитное действие формальдегида рассматривалось как результат сохранения им энергетического баланса в ишемизированной тка-

ни (Лапкина Т.И., 1982). В нашей работе осуществлен подход к изучению механизмов защитного действия формальдегида с позиций влияния его на белковый и жировой обмен, чем и был обусловлен выбор и исследования следующих показателей.

§1. Влияние формальдегида и его комплекса с аутолизином на некоторые биохимические показатели в ткани мозга. I. Было показано, что введение формальдегида при сохраненном мозговом кровотоке существенно не изменяет общую активность ДДГ во фракции постмитохондриального супернотанта мозга у крыс, но изменяет изоферментный спектр в сторону увеличения активности : М-типа. Через час после введения формальдегида активность М-ти-па ДДГ увеличивалась вдвое.

Ишемия мозга животных также не изменяла существенно общую активность ферлзнта, но качественно изменяла изоферментный пул ДДГ, что проявлялось в троекратном увеличении активности М-типа ЛДГ через час ишемии (рис.1).

Однако в условиях ишемии присутствие экзогенного формаль -дегида делает менее продолжительным и менее интенсивным рост активности М-типа ЛДГ г. исследуемой фракции (рисЛ).

Рост активности М-типа ЛДГ расценивают как показатель тя -жести гипоксического состояния, коррелирупций со степенью риска, я лактат-ацидоз -одним из пусковых моментов патологического процесса при ишемии мозга (Юрков Ю.А.,1975, Бенедиктова А.Б., Аксенова Т.А.,1983, Ивлева В.В., Закс И.О.,1983). С дяннн«ч ваших исследований сб изменении изоспектра ДОГ вод действием формальдегида в ткани мозга при сохраненном мозговом кровотоке хорошо сочетаются сведения о том, что в ситуациях, характеризую -щихся повышенным содержанием альдегидов в ткани - лучевое и УФ-пореженме, алкогольная интоксикация, эпилептические припадки в

ивтактннй мозг

окончание введения 0,9$ -

НвЛ1

окончание введения формальдегида

ишемия ишемия о вве- ишемия о введе-

дением плацебо дением формальдегида

Рис.1. Изменение иэофорк ЛДГ в ткани мозга цри ишеш&'и при профилактическом введении формальдэгида. I - Н-гип ЛДГ, 2 - М-тип ЛДГ.

10.

т.д. - обнаруживаются изменения изоспектра ДЦГ (bal A., Garg Н.А 1981, Моисеев H.H. с соавт.,1983, Бельченко Д.И. с соавт.,1983).

Проведенное параллельно изучение сорбции ДДГ на ДЭАЭ-сефадексе А-25 показало, что введение формальдегида достоверно по -вышает сорбцию ЛДГ на ДЭАЭ-сефадексе А-25. Увеличение сорбции ЛДГ на ДЭАЭ-сефадексе А-25, вероятно, можно объяснить появлением межмолвкулярных сшивок в молекулах ЛДГ и приближением размеров сорбируемых частиц к величине пор сорбента. Обнаруживаемое наш повышение сорбции ЛДГ на ДЭАЭ-сефадексе А-25 под действием формальдегида при сохраненном мозговом кровотоке хорошо согласу-: ется с данными литературы о взаимодействии формальдегида с бел -К&МИ m vivo < Casanova VI.,Hack d'A., 1985). ХОТЯ принимая ВО внимание снижение концентрации формальдегида за счет связыва -ния его с белками крови и мембранными белками, а также за счет действия альдегиддегидрогеназ, особенно активных в барьерных структурах мозга, нельзя ожидать, что применяемая доза формальдегида может вызвать появление в белках цитозоля большого числа точек связывания (Зиматкин С.М., Островский D.M.,1989).

Снижение роста активности М-типа ЛДГ при ишемии профилак- ■ тическим введением формальдегида может быть следствием связывания формальдегида с катехолаликами и препятствия их влияния на циклазнуг систему ( Sciieuenatein к.et al.,1977). 2. Проведенными исследованиями обнаружены достоверные различия о количестве белка при определении его разными методами. Введение формальдегида увеличивает различия между результатами измерения количества белка методами Лоури и по биурету в субклеточной фракции мозга при сохраненном мозговом кровотоке. При вша -мии также усиливается различия данных о количестве белка за счет снижения результатов метода Лоури (рис.2). Предшествующее теши

Сроки исследования (глин)

Рис.2 . Изменения показателей количества белка по данным метода Лоурн при сохраненном мозговом кровотока (а) н при ишемии (б)

1 -в присутствии экзогенного формальдегида,

2 -в присутствии плацебо,

3 -в отсутствие протекторного и замещающего

растворов

введение формальдегида делает менее выраженным снижение данных о количестве белка метода Лоурл при ппемии (рис.2).

Интенсивность цветной реакции метода Лоури зсэисит от коли -чества в белке циклических аминокислот, от наличия опре^., „сч^их аминокислотных .последовательностей, от количества свобохошх

за- и 1Ш2 -групп, присутствия глицина и т.д. Модификация белка Формальдегидом снижает результаты определения количества белка методом Лоури до 65% от истинных значений. Метод же определения количества белка по биурету практически-не чувствителен к наличию модификаций белка формальдегидом (Кондакова Н.В. с соавт., 1983). Модификация формальдегидом изменяет хромогенность тирозина, гистадина и триптофана в цветной реакции Лоури.

При различных терминальных состояниях происходит увеличение количества ыиффовых оснований в ткани, кроме того повышается активность протеолитических ферментов при снижении концентра-•ции ингибиторов протеаз. Это в конечном счете может приводить к изменению количества свободных зн- и нн2 -групп и изменению результатов определения количества белка методом Лоури.

Изменения экзогенным формальдегидом хрокогенности белка в реакции Лоури, вызываемые им к моменту окончания введения в условиях сохраненного мозгового кровотока, очевидно, являются след -ствием модификации белка формальдегидом. Возможно, модифицирую -щее действие формальдегида на церебральные белки в доишемическои периоде является конкурентным и оказывает защитное действие в • условиях ишемии.

Сопоставление данных определения количества белка по биурету и методом Лоури позволяет судить о наличии изменений цереб -ральных белков при ишемии. Обнаруживается корреляция между изменениями сорбционных свойств ЛДГ по отношению к ДЭАЭ-сефадексу А-25 и процентного отношения данных о количестве белка методов Лоуряи биуретова (рис.3). В присутствии экзогенного формальдегида физико-химические изменения церебральных белков под действием ишемии значительно менее выражены, чем в его отсутствие (рис.3).

ох ^

10

40

19

а ■

л

о м СИМ

о го И а>

а К

щ

Е °

Р ы М ы о л

а И л

в>8

20 X _

Срокя Елеили

Сроки ишемии (юга)

Рис.3. Активность не сорбирующейся на ДЭАЭ-сефадексе А-25 фракции ДДГ - I, процентное отношение количества белка, определяемого методом Лоури, к количеству белка,измеряемому по баурсту -2.

3. На фоке ложной операции,так же как в присутствии экзогенного формальдегида, не происходило существенного изменения активно -сти множественных форм щелочных фосфатаз. Ишемия вызывает роз -кое повышение общей активности Пй> за счет роста активности ее термолабильной ыембраносвязанной формы з постмитохондраальной надосадочяой жидкости гомогената ткани мозга. В поствшемическоы периоде по окончании реперфузии активность термолабильной формы Щ® остается в 1,5-1,9 раза выше, чем в интактном мозге. Присутствие экзогенного формальдегида при ишемии тормозит рост активности ыембраносвязанной термолабильной формы ШО в исследуемой фракции. В постишемическом периоде после полуторачасовой репер-фузии в защищенном формальдегидом мозге активность ыембраносвязанной формы ЩФ в постмлтохондриальной надосадочной жидкости гомогената ткани мозга определяется лишь в 1,3 раза выше нормы (рис. 4). Сопоставление динамики изменений активности сорбирующейся на ДЭАЭ-сефадексе А-25 фракции ЛДГ, хромогенности белка в реакции Лоури и активности термолабильно3 щелочной фосфа -тазы при иаемия обнаруживает их корреляцию, что согласуется с данными литературы о тесном взаимодействии между конвертацией • белковых молекул и их взаимодействием с лшпадшм окружением в мембранах (рис. 5а, б, в), (De I*c«y JS.H.B.et al.,1982. Образ -uoö В.В., Селищева З.А.,1989). Стабильность мембран обеспечивается белок-липидным я белок-белкоьым соответствием в мембранах, а также количеством ¿¿-структур в мембранных белках (Газотти П., 1982, Болдырев A.A. с соавт.,1985). По мнению многих исследователей, спектр активности множественных форм ЩЭ может служить интегральны.! показателем степени дестабилизации мембранных струх -тур в терминальных состояниях (Молчанова Л.В.,1980, Молчанова Л.В. с соавт.,1983).

окончание

введения

0.%иГаС1

окончание введения фортль-дегида

лаемил• ишемшГо иве- ишемия с введе-

дением плацебо ннем форгтльдегяда

08 П>

т

Ы И бвЕ

Эй

т

II

КФГ

12

Рис. 4. Активность термостабильной (а) и термолабильной (б) форм щелочной фосфатаэы при ишемии и реперфузии.

Рис. 5 а

Сроки исследования (мин)

чь/ л/ пи

ороки исследования (мин) Рис. 5 в.

10 го 30 40 50 60

Сроки исследования (мин), Рис. 5,6

|Рис. 5 а, б, Изменения активности сорбирующейся на ДЭАЭ-сефадексе А-25 фракции ЛДГ в % ■от общей активности (I), активности термолабильной щелочной фосфатазы в % от общей активности (2) и

ЮО — но Лоури хЮО

кол.белка по биурету в % (3) при ишемии

а - отсутствие протекторного и замещающего раствора, б -введение плацебо, в - введение формальдегида.

4. Введение формальдегида вызывает повышение концентрации липи-дов в ткани мозга и предотвращает рост концентрации диеновых коньюгатов в ткани как при сохраненном мозговом кровотоке, так и в условиях ишемии мозга (рис. 6). Повышение концентрации ли -пндов в ткани мозга под действием формальдегида хорошо согласуется со сведениями о стимулировании формальдегидом синтеза ли -пндов и о снижении им уровня катехоламинов в изолиро -

ванных органах и тканях (Сило!:- л Н.В. с соавт.,1962, Гулий М.Д. с соавт.,1982, Лапкина Т.И.,1982). Роль формальдегида в холино-глициновом цикле, участке в обмене метионина и 3-аденозилмети-онина, в процессах метилирования, в том числе неэнзиматического, позволяет думать о возможности обогащения спектра липидов фосфо-липидами и повышения общего количества липидов в ткани за счет влияния экзогенного формальдегида (Дэгли С., Николсон Д.,1973, Tuc«k з., 1981, Szeado в. et al. ,1985). -Этому же может способ -ствовать ингисирование формальдегидом транспорта Са^" и предот -вращение этим активации фосфолипаз (з опав г T.R., Haaeeii>ach V.T., 1967, Савов Б.М. с соавт., 1986).

Существует тесная взаимосвязь между концентрацией фосфоли-пидов, плотностью липидного бислоя и активностью процессов ПОЛ (Сороковой В.И. с соавт., 1978, Иванов И.К.,1984). Антиоксидант-ное действие формальдегида может быть результатом уплотнения в его присутствии липидного слоя мембран вследствие повышения концентрации липидов в ткани. Кроме того, антиоксидантные свойства альдегидов связывают с их способностью образовывать в водной среде свободно-радикальные частицы, приводящие к разобщению цепей свободно-радикальных реакций,а также способностью выступать в роли не только восстановителей, но и окислителей (Кривченкова P.C., 1976, ß»or«chaJ£ В. et ах., 1985, Джафаров А.И. с соавт.,

Сроки исследования (мил)

ЮГ&1ЩЯ ненаоыщенных высших жирных кислот в ткани мозга при ишемии (А) и при сохраненном мозговом кровотоке (Б)

I - отсутствие протекторного и »амещащего растворов, 2 - введений плацебо, 3 - введение формальдегида, 4 - введение формальдегида и аутолизина.

Ограничение активации процессов ПО! экзогенным формальдегидом является одним из механизмов его защитного действия при ишемии мозга, так как роль активации ПОЛ в патогенез« ишемии мозга несомненна (Гуляева Н.В., 1989).

При сохраненном мозговом кровотоке обнаруживается влияние фор -мальдегида на тканевые белки, однотипное о действием ишемии (рис. 2, 7). Последующее введению формальдегида введение ауто -лизина приводит к восстановлению этих изменений (рис. 7). Действие аутолизина объясняется, вероятно, снижением количества кова-

Окс.ччзнг» 5 .sh. 20 ая. 60 пм.

"сг5:?м Сроки исследования (мин)

Рис. 7. Изменение активности ЛДГ, ее не сорбирущейся на ДЭАЭ-сефадексе а-25 фракции и активности М-типа ЛДГ прш сохраненном мозговом кровотоке (I - отсут- . ствие формальдегида и плацебо, 2 - введение фор -мальдегида, 3 - введение формальдегида и аутолизина)

лентно связанного с ткан евши белками фдрмвльдепда за счет реакции его с аминокислотам! аутолизина(Глжнка A.B., Воронина A.C., I977,Goi«cbccK р. *t ,1977).

§2. Влияние формальдегида на некоторые физиологические показатели.■

I. При выполнении сосудисто! изоляции головного мозга после профилактического введения формальдегида характер угнетения ЭЭГ существенно отличался от изменений ЭЭГ при ишемии в отсутствие протектора. В присутствии экзогенного формальдегида наиболее типичным является монотонное угнетение с сохранением исходного частотного состава практически в течение всего периода угнетения. До полного прекращения электрической активности сохраняется не -прерывная ЭЭГ. В отсутствие протектора при ишемии происходит распад ЭЭГ на периоды ритмической активности, разделенные периодами ритмического молчания, на стадии угнетения.

Менее продолжительному времени угнетения ЭЭГ при ишемии после предварительного введения формальдегида со-

ответствует отсутствие дестабилизации мембранных структур ткаш} мозга по данным состояния активности множественных форм ЩФ и повышенный уровень концентрации липидов в ткани мозга.В отсутствие протектора более продолжительное угнетение ЭЭГ, проходящее через стадию десинхрпнизации и распад на периоды ритмической активности и рвдиического молчания при окончательном угнетении, сочетается с дестабилизацией мембранных структур и активацией ПОЛ. На фоне сохраненного мозгового кровотока повышение уровня концентрации липидов в ткани мозга под действием экзогенного формальдегида также коррелировало со снижением интегративного индекса мощ -ности ЭЭГ, сохраняющей исходный частотный состав. С нашими дан -ны;.л хорошо согласуются сведения о взаимозависимости между физическим состоянием липидов мембранного комплекса и активностью ионных насосов (Са2*, Ка К^- АТФаз),"обеспечивающих проведе -ние нервного импульса, а также о блокировании формальдегидом про-

ведения нервного импульса изолированным нервом и ингибировании им ионного транспорта (Ту1«г D.D. ,1968, »Urgiaeamu D.O. «t ai., 1981, Тимофеев A.A., Глебов Р.Н., 1989).

% правильных ц

% правильных

>■ ОТЯЙТОВ

SB SO 100 СО КО

«К ЧИСЛО сочетаний )

во во «о «о ко

ЧИСЛО

сочетаний)

Рис. 8. Выработка (I) и восста- Рис. 9. Выработка (I) и восста -

новление (II) рефлекса избегания у крыс после 10 мин ишемии в присутствии экзо -генного формальдегида (А) и у интактных животных (Б).

новление (II) рефлекса избегания у крыс после 35 мин ишемии в присутствии экзо -генного формальдегида (А) и 10 мин ишемии в его отсут -ствие (Б)

2. После ишемии головного мозга, выполненной в условиях защиты формальдегидом, первоначальная выработка условного рефлекса и его восстановление мало отличатся от таковых в норме и протекают суде с твенно лучше, чем в случае ишемии без защиты (рис. 8). В ходе выработки и восстановления условных рефлексов после ишемии сроком 35 мин уровень правильных ответов тоже был выше, чем при первона-

начальной выработке (рис. 9). Пролонгирование сроков сохранения способности к новообразованию временных связей и сохранении ре -нее образованных под протекцией формальдегида свидетельствует о защите экзогенным формальдегидом мембранного аппарата ткани мозга при ишемии и, в частности, более полноценном сохранении функциональных свойств нейрональных мембран (Кругликов К.И.,1981).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Результаты проведенных исследований позволяют сделать за -

ч

. ключение о защитном действии формальдегида при ишемии головно -го мозга крыо. Показано, что ряд биохимических показателей в ци-топлазматической фракции гомогената головного мозга как при его ишемии, так и при действии формальдегида в условиях сохраненного мозгового кровотока изменяются однотипно. Так в присутствии экзогенного формальдегида при сохраненном мозговом кровотоке наблюдается рост активности М-типа ЛДГ, снижение'активности не сорбирующейся на ДЭАЭ-сефадексе А-25 фракции ЛДГ и снижение хро-могенности белков исследуемой фракции в реакции Лоури. Однотип -ные изменения показаны нами при ишемии головного мозга в отсут -ствие протектора. Это может свидетельствовать о конкурентном обратимом связывании функциональных групп белковых молекул формальдегидом как на уровне белков цитозоля, так и на уровне плазматических мембран.

Результаты проведенных эксперимента показывают, что в условиях ишемии в присутствии экзогенного формальдегида включаются механизмы, препятствуйте изменениям церебральных белков под действием ишемии. Анализ собственных и литературных данных позволяет считать, что в основе этих механизмов может лежать экранирующее действие свободных аминокислот, пул которых в присутствии экзогенного формальдегида при ишемии повышается более значительно,

чем при сохраненном мозговом кровотоке и при ишемии в отсутствие формальдегида.

Результаты наших экспериментов позволяют предполагать,что защитное действие формальдегида в определенной степени осуществляется за счет предотвращения им дестабилизации липопротеидно-го комплекса мембран при ишемии. Изучение электрической актив -кости мозга и биохимических показателей, характеризующих степень дестабилизации мембран, позволяет сделать заключение, что по ряду механизмов формальдегид следует отнести к препаратам мембра -нотропного типа действия. Данные о функциональном состоянии це -нтральной нервной системы после ишемии мозга, перенесенной в присутствии экзогенного формальдегида показывают, что формальдегид способствует сохранению образованных межцентральных функциональных связей и облегчает процесс их восстановления после перенесенной ишемии мозга. Изучение способности к выработке и восстановлению ранее сформированного условного рефлекса у крыс, перенесших ишемию, подтверждает наличие защитного действия формальдегида, направленного на мембранный аппарат ткани мозга.

ВЫВОДЫ

1. При ишемии головного мозга крыс, создаваемой лигированием четырех сосудов, профилактическое введение формальдегида в дозе 1,5 мкмоль/г массы тела животного оказывает защитное действие,

о чем свидетельствует выживаемость 91% животных после 35 мин ишемии.

2. При ишемии головного мозга во фракции постмитохондриального супернотанта обнаруживается:

а) рост активности М-типа ЛДГ;

б) снижение количества белка по данным метода Лоури;

в) рост активности мембраносвязанной формы щелочной фосфа -тазы;

тазы.

г) в экстракте липидов обнаруживается рост концентрации диеновых конъюгатов ненасыщенных высших жирных кислот.

3. Действие формальдегида при сохраненном мозговом кровотоке проявляется в изменении следующих биохимических показателей:

а) повышается активность М-типа ЛДГ;

б) снижается количество белка по данным метода Лоури;

в) повышается концентрация липидов в ткани мозга, что кор -

ч

реллрует со снижением интегративного индекса мощности ЭЭ1>

г) ограничивается рост концентрации диеновых конъюгатов Ее -насыщенных высших жирных кислот, имеющий место при сохраненном мозговом кровотоке в отсутствие формальдегида,

4. Введение формальдегида при сохраненном мозговом кровотоке и ишемия головного мозга вызывают во фракции постмитохондриального супернотанта однонаправленные изменения физико-химических свойств белка, однако разной степени выраженности.

5. Механизм защитного действия формальдегида при ишемии головного мозга проявляется в предупреждении изменений физико-химических свойств белка и мембранопротекторном действии, существенным мо -ментом которого является повышение уровня концентрации липидов в ткани мозга и ограничении роста концентрации диеновых конъюгатов ненасыщенных высших жирных кислот.

6. В постишемическом периоде действие формальдегида обеспечивает полноценное восстановление ЭЭГ и сохранение способности к условно-рефлекторной деятельности после 10 и 35 минут ишемии головного мозга.

?. Изучение профилактического' действия формальдегида при ишемии головного мозга обнаруживает его мембранопротекторное действие и комплексное влияние на некоторые реакции белкового обмена.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Щербакова Л.Н. Влияние экзогенного формальдегида на множест -венные формы щелочной фосфатазы в мозге при острой ишемии//Сор-малинизированный алло- и ксеногенный материал в тронсплантоло -гии.— Кишинев, 1986.- С. 57-60.

2.Тренин С.О., Щербакова Л.Н. Пиемия защищенного формальдегидом головного мозга в экспер11менте//СормалинизированниЯ алло- и ксеногенный материал в трансплантологии.- Кишинев, 1986.- С.54-56.

3.Щербакова Л.Н. Изменение уровня диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот п моз ^ крыс в присутствии формальдеги-да//11 Всес.симп. "Еиоантиоксидант",- Черноголовка, 1986.-С. 244.

4.Щербакова Л.Н. Модификация белков ткани мозга при ишемии и на фоне предварительного введения формальдегида//Депонировано в ВИНИМ.- 2/У1-1986,- Я 3869 - 1386.

5.Щербакова Л.Н., Тельпухов В.И., Тренин С.О., Баталов И.А., Лап-кина Т.И. О проницаемости гематоэнцефалического барьера для фор -мальдегида при его внутрисосудистом введении//Бяллетень эксперим. медиц. и биол.- 1986.- № II.- С. 573-575.

6.Щербакова Л.Н. Изменение сорбционних свойств белка ЛДГ после однократного введения формальдегида//Еюллетёнь эксперим.биол. и медиц,- 1986.- И 12.- С. 702-704.

7.Лапкина Т.И., Тельпухов В.И., Тренин С.О., Бапгалов И.А., Щер -бакова Л.Н. Влияние формальдегида на углеводный обмен головного мозга//Бюллетень эксперим. биол. и медиц,- 1987,- JS I,- С. 50-52. В.Щербакова Л.Н. Действие формальдегида при острой ишемии на уровне мембранных структур//Бгаллетень эксперим. биол и медиц.-1988.- » 4.- С. 432-433.

9.Scherbakova L.N.. Saraoilova T.I., Filatov V.U..Ryiltaev V.V. The exogenous Formaldehyde inrluence on the dlenconjugatloa on the un3atured fattl acida in brain tiaaue.-International conference on Regulation of free radical reaction (biochen.aapocts).-Bulg., Varna.-1969.- P. 155.

rO.Scnerbacova L.II. et al. On tile Permeability of the blood-brain Barier for intravascular Fofnaldenyde.- J.Biochen.Abstracts.-19B8.- !U 1,- V. 15.68.И.