Автореферат и диссертация по медицине (14.00.27) на тему:Закономерности развития бактериальной транслокации при ранних ишемических и реперфузионных повреждениях тонкой кишки, вызванных острым нарушением магистрального кровотока

На правах рукописи

КУВШИНОВ Артем Геннадьевич

ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАЗВИТИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ТРАНСЛОКАЦИИ ПРИ РАННИХ ИШЕМИЧЕСКИХ И РЕПЕРФУЗИОННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ТОНКОЙ КИШКИ, ВЫЗВАННЫХ ОСТРЫМ НАРУШЕНИЕМ МАГИСТРАЛЬНОГО КРОВОТОКА (экспериментальное исследование)

14.00.27 - хирургия 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иркутск—2004

Работа выполнена в ГУ «Научный центр реконструктивной и восстановительной хирургии ВСНЦ СО РАМН»

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук

Ильичева Елена Алексеевна

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Чикотеев Сергей Павлович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук, доцент

Скворцов Моисей Борисович Чернявский Владимир Викторович

Ведущее учреждение: Новосибирская Государственная медицинская академия МЗ РФ

Защита состоится ;

2004 г. в « Л?»

часов на засе-

дании Диссертационного совета Д.208.032.01 при Иркутском государственном медицинском университете (664033, Иркутск, ул. Красного восстания, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Иркутского государственного медицинского университета МЗ РФ

Автореферат разослан

2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Желтовский Ю.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Необходимость острого прекращения магистрального кровотока в бассейне верхних брыжеечных сосудов возникает при выполнении расширенных хирургических вмешательств по поводу заболеваний билиопанкреатоду-оденальной зоны, при операциях на супраренальном сегменте брюшной аорты, в условиях тяжелой абдоминальной травмы. Ишемия кишечной стенки при кратковременной (до 60 минут) окклюзии сосудов считается обратимой и, по мнению ряда авторов, не представляет угрозы для жизни больного (Кирпатовский И.Д., 1964; Кулик В.П., 1975). Имеющиеся в литературе разноречивые данные о повреждающем системном воздействии кратковременной ишемии не позволяют хирургу определить временной интервал, в течение которого выключение из кровообращения тонкой кишки не повышает риска развития системных осложнений. Дискутабельным остается вопрос о закономерностях развития бактериальной транслокации в условиях острого прекращения магистрального кровообращения тонкой кишки и ее роли в развитии синдрома системного воспалительного ответа (Gianotti L. et al., 1992; Feltis A. et al, 2000; Suzuki Y. et al., 2000).

Хирургические маневры при выполнении сосудистого этапа расширенной операции на органах билиопанкреатодуоденальной зоны включают различные формы нарушения магистрального кровотока по верхним брыжеечным сосудам: временное прекращение венозного оттока, временное прекращение артериального и венозного кровотока, временное и окончательное интраоперационное шунтирование, интраоперационная артерио-венозная перфузия тонкой кишки (Иванова Е.В., 1994; Nakao A., 1990; Tashiro S., 1991; Machado M.C., 2001; Расулов Р.И., 2002). Имеются сообщения о возможности перевязки верхней брыжеечной вены при сформированном окольном кровотоке (Child C.G. 1954., Ильичева Е.А., 1999). В литературе нет убедительных данных, касающихся безопасного временного интервала прекращения магистрального портального оттока. Опасность развития реперфузионных повреждений, исходя из экспериментальных работ, возникает с момента повреждения слизистой тонкой кишки. В механизме ишемических и реперфузионных повреждений кишки в последнее время большое значение придается роли бактериальной транслокации и системного воспалительного ответа, активируемого цитокинами (TNF-alpha, IL-6 и др.), индуцирующего развитие полиорганной недостаточности (Grotz M.R., 1999; Suzuki Y., 2000). В настоящее время сроком максимальной допустимой переносимой тотальной ишемии кишечника считается один час, однако ранние морфологические изменения регистрируются уже при 5—10-минутной ишемии (Банин В.В., 1979). В литературе отсутствуют данные о сроках переносимой ишемии, не сопровождающейся развитием системного воздействия факторов, запускающих синдром системного воспалительного ответа. Именно этот временной интервал можно определить как безопасный с точки зрения профилактики генерализованной системной воспалительной реакции и полиорганной недостаточности в послеоперационном периоде.

рос.,наш:он библиот

"ЙШП

3

Достижения радионуклидной диагностики, позволяющие изучать прижизненную динамику патологического процесса на ранних стадиях его развития, существенно расширили возможности оценки системного воздействия ишемических и реперфузионных повреждений (Flessner M.F., 1991; Perm F., 1996, Шелехов А.В., 1996; Галеев Ю.М., 2001). Многие авторы сообщают о недостаточной специфичности методов исследования бактериальной транслокации, что связано с отсутствием способов получения бактериального радиопрепарата, не содержащего свободного 99mTc (Hung J.C. et al., 1996; Nibbering P.H. et al., 1998; Peters A.M., 1998; Corstens F.H. et al., 1999). Открытие особенностей метаболизма клетки в анаэробных условиях (Lloyd J.R. et al., 1997) указывает на новые возможности для нуклидных методов исследования бактериальной транслокации, однако этот факт не получил развития в экспериментальных работах.

Закономерности развития предимунного и иммунного ответов при различных видах повреждения тканей, известные факты о бактериемии и бактериальной транслокации, как одного из триггеров патологического процесса, сообщения о сопряженности бактериальной транслокации с повреждением слизистой оболочки тонкой кишки позволяют считать рассматриваемые патологические процессы взаимосвязанными. Уточнение закономерностей развития ранних реперфузионных повреждений при кратковременной тотальной ишемии (до 1 часа) тонкой кишки, вызванной нарушением магистрального кровотока, определили направленность настоящего исследования.

Цель работы

Изучить в эксперименте проницаемость кишечной стенки для резидентных бактерий при острой кратковременной тотальной ишемии тонкой кишки и на этом основании установить временной интервал прекращения магистрального мезентериального кровотока, определяющий развитие системной воспалительной реакции.

Задачи исследования

1. Разработать экспериментальную модель изучения проницаемости кишечной стенки для Е. coli при ранних ишемических и реперфузионных повреждениях тонкой кишки в условиях острого нарушения магистрального кровотока.

2. Определить морфологические изменения стенки тонкой кишки при окклюзии краниальных брыжеечных сосудов длительностью до 60 минут.

3. Изучить проницаемость кишечной стенки для Е. coli в условиях сохранения магистрального кровотока и при острой обратимой тотальной ишемии тонкой кишки.

4. Установить морфофункциональные корреляции бактериальной транслокации при остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов.

5. Оценить роль бактериальной транслокации в развитии системной воспалительной реакции в ответ на ишемическое повреждение тонкой кишки.

Научная новизна

Доказана возможность получения в анаэробных условиях бактериального радиопрепарата с высокой концентрацией 99тТс в жизнеспособной клетке.

Установлены точные временные характеристики ранних морфофункци-ональных изменений, отражающих воздействие острого нарушения магистрального мезентериального кровотока на слизистую оболочку тонкой кишки.

Доказано системное повреждающее действие восстановления магистрального кровотока после 30-минутной тотальной ишемии тонкой кишки, триггером которого является бактериальная транслокация.

Практическая значимость.

Модификация способа приготовления бактериального радиопрепарата позволила получить жизнеспособную культуру Е. coli, пригодную для проведения разноплановых научных исследований in vivo.

Установлен временной интервал прекращения магистрального кровотока в бассейне магистральных брыжеечных сосудов, определяющий необходимость интраоперационной профилактики реперфузионных повреждений.

Доказана инициирующая роль бактериальной транслокации в развитии системного воспалительного ответа, что определяет необходимость интраоперационного системного медикаментозного воздействия на резидентную и патогенную микрофлору тонкой кишки.

Внедрение в практику

Материалы диссертационного исследования внедрены в практическую деятельность в госпитальной хирургической клинике Иркутского государственного медицинского университета на базе отделения хирургии портальной ги-пертензии Иркутской государственной областной клинической больницы, Республиканского онкологического диспансера г. Абакан (Республика Хакасия), Республиканская больница г. Улан-Удэ (Республика Бурятия), лаборатории радионуклидной диагностики ГУ НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН.

Результаты проведенного исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургической клиники ИГМУ, Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН и Медицинского факультета БГУ.

Получена патентная справка (Заявка №2003115590/20 (016533). «Способ приготовления бактериального радиофармпрепарата», приоритет от 30 мая 2003 г).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Острая тотальная ишемия тонкой кишки в течение 20 минут не приводит к нарушению целостности эпителиальной выстилки кишечных ворсин и барьерной функции кишечной стенки в отношении резидентной микрофлоры.

2. Системное повреждающее действие 30-минутной ишемии тонкой кишки проявляется с первой минуты реперфузии массивным поступлением резидентной микрофлоры в системный кровоток, что определяет развитие синдрома системного воспалительного ответа.

Апробация работы

Материалы исследования представлены на Всероссийской конференции хирургов посвященной памяти В.Ф. Войно-Ясенецкого (Красноярск, 23—25 апреля 2003 г.), II регионарной научно-практической конференции молодых ученых (Иркутск, 2003).

Опубликовано 11 печатных работ, в которых изложены основные положения диссертации.

Структура и объем работы

Диссертация содержит введение, обзор литературы, главу о материалах, методах исследования и общей характеристики наблюдений, главу о собственных результатах исследования, заключение, выводы, практические рекомендации, указатель литературы.

Текст диссертации изложен на 109 страницах машинописного текста; иллюстрирован 10 таблицами и 22 рисунками. Библиография включает 160 источников, из них 78 — отечественных и 82 - зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Общая характеристика экспериментального материала

Исследование состоит из двух разделов. В первом разделе проведена серия стендовых опытов по получению бактериального радиопрепарата (п — 16).

Во втором разделе проведены три серии острых опытов на 72 кроликах породы Шиншилла, обоего пола с массой тела 2—4 кг,, длинной тела 40— 50 см. Возраст животных до года. Животные содержались в условиях вивария при свободном доступе к пище и воде на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа от 6 апреля 1973 г. № 10045-73.

Исследования проводились в условиях лабораторий экспериментальной хирургии (зав. — к.б.н. С.А. Лепехова), бактериологической лаборатории (зав. — к.б.н. T.B. Фадеева), лаборатории патоморфологии (зав. — к.м.н. ОА Гольд-берг), лаборатории радионуклидной диагностики (зав. — к.м.н. Ю.М. Галеев), лаборатории биохимии и гемокоагуляции (зав. — к.б.н. С.Л. Богородская) НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (директор — чл.-корр. РАМН, д.м.н., профессор Е.Г. Григорьев); Изучение неспецифической резистентности организма проводилось на базе иммунологической лаборатории (зав. — к.м.н. А.В. Кочкин) Иркутского государственного института усовершенствования врачей.

Все манипуляции, связанные с использованием радиоактивных веществ выполняли с учетом норм радиационной безопасности НРБ-99 и ОСПОРБ-99.

Материалы исследования in vitro

В качестве объекта для маркировки использована Е. coli О111 — энтеропа-тогенный штамм кишечной палочки. В серии опытов in vitro отработаны условия получения бактериального радиопрепарата. За основу способа получения меченных радионуклидом бактерий был взят способ, описанный А.В. Шеле-

ховым (1998) и модифицированный Ю.М.Танеевым (2001). Методика выполнена в 8 опытах (группа контроля). В последующем эксперименте условия получения бактериального радиопрепарата были изменены путем изменения аэробной среды на анаэробную, применения простого агара в качестве питательной среды, пятикратного посева культуры Е. coli на питательную среду. Модифицированным способом бактериальный радиопрепарат получен в 8 наблюдениях (основная группа).

Методы исследования in vitro

Радиометрическое исследование бактериальногорадиопрепарата. Выполняли радиометрию 20 мл бактериального радиопрепарата с целью определения дозы вводимого в кишечник животного. Образец помещали в стерильную пробирку с последующим измерением уровня радиоактивности дозкалибратором колодезного типа CRS —5 (Capintec inc., США) по стандартной методике.

Оценка жизнеспособностирадиопрепарата.Жизнеспосо6нсоть приготовленной Е. coli с устойчивой фиксацией в клетке радиоактивной метки подтверждалась бактериологическим исследованием путем культивации на твердом питательном агаре (мясопептонный агар с 5% добавлением крови и среду Эндо) в аэробных условиях, с последующим подсчетом числа колоний (КОЕ).

Материалы исследования in vivo

Все животные распределены на 8 групп в трех сериях опытов, в соответствии с последовательным решением задач экспериментального раздела.

1-я серия опытов.

Таблица 1

Распределение животных на группы (1-я серия опытов)

Метод исследования № группы Характеристика фрагмента исследования > Общее - ЧИСЛО ä опытов

Визуальная оценка, бактериологический метод 1 Изучение вариантной анатомии каудальных и краниальных брыжеечных сосудов, изучение микробного пейзажа желудочно-кишечного тракта кролика 6

Морфологическая оценка реперфузионных повреждений стенки тонкой кишки, световая микроскопия с масляной инверсией 2 после прекращения магистрального кровотока в течение 60 мин 3

после прекращения магистрального кровотока в течение 30 мин 8

после прекращения магистрального кровотока в течение 25 мин 5

после прекращения магистрального кровотока в течение 20 мин 4

после прекращения магистрального кровотока в течение 15 мин 5

Исследования на животных 1 группы (п = 6) предусматривали изучение вариантной анатомии каудальных и краниальных брыжеечных сосудов, изучение микробного пейзажа желудочно-кишечного тракта кролика.

Морфологическая оценка реперфузионных повреждений стенки тонкой кишки после прекращения магистрального кровотока в сроки от 15 до 60 минут выполнена на животных 2 группы (и = 25).

Результаты 1-й серии опытов положены в основу экспериментальной модели ранних ишемических и реперфузионных повреждений стенки тонкой кишки.

Изучение закономерностей развития ишемических и реперфузионных повреждений стенки тонкой кишки при нарушении магистрального кровотока выполнено в двух последующих сериях опытов.

2-я серия опытов.

Определение возможных сроков появления бактериальной транслокации при ишемических и реперфузионных повреждениях стенки тонкой кишки в условиях прекращения магистрального кровотока производилось на разработанной модели с введением бактериального радиопрепарата в просвет кишечника. Оценка результатов проводилась по данным динамической прижизненной и статической сцинтиграфии после эвтаназии животного, морфологического и бактериологического исследований.

Таблица 2

Распределение животных на группы (2-я серия опытов)

Метод исследования № группы Характеристика -фрагмента исследования Общее число опытов Число принятых к анализу сцинтиграмм

Сцинтиграфия кролика. Морфологическая оценка реперфузионных повреждений стенки тонкой кишки (световая микроскопия с масляной иммерсией) 3 Изучение распределения свободного изотопа Тс-реЛесИг^а!" из просвета тонкой кишки 3 2

4 Изучение распределения бактериального радиопрепарата из просвета тонкой кишки в отсутствие ишемических и реперфузионных повреждений- 7 2

5 Изучение распределения бактериального радиопрепарата из просвета тонкой кишки при ' прекращении магистрального кровотока в течение 60 мин 6 2

Изучение распределения бактериального радиопрепарата из просвета тонкой кишки при прекращении магистрального кровотока в течение 30 мин. 3 2

Изучение распределения бактериального радиопрепарата из просвета тонкой кишки при прекращении магистрального кровотока в течение 25 мин. 1 1

Изучение распределения бактериального радиопрепарата из просвета тонкой кишки при прекращении магистрального кровотока в течение 20 мин 2 2

Изучение распределения бактериального радиопрепарата из просвета тонкой кишки при прекращении магистрального кровотока в течение 15 мин 1 1

В этой серии переменной величиной была длительность ишемии (60,. 30, 15, 20, 25 минут) (группа 5, п = 13). Сравнение результатов исследования в этой группе проводили с данными о распределении свободного 991ПТс (группа 3, п — 3) и меченых 99mTc E. coli, введенных в тонкий кит шечник кролика в отсутствие ишемических и реперфузионных повреждений (группа 4, п = 7).

Результаты 2-й серии опытов оценивались совместно со специалистами морфологической лаборатории и лаборатории радионуклидной диагностики. К заключительному анализу этой серии опытов после тщательной экспертизы качества проведенных исследований оставлены результаты двенадцати опытов (группа 5, п — 8; группа 3, п — 2; группа 4, п = 2). Полученные в первой и во второй серии опытов данные позволили выделить четкие временные промежутки ишемического периода, имеющие принципиальные различия по характеру гистологического поражения стенки кишки и по особенностям распределения бактериального радиопрепарата в организме кролика. Условия проведения 3-й серии опытов были выбраны с учетом результатов первых двух серий.

3-я серия опытов.

Оценка состоятельности кишечного барьера для Е. coli при репер-фузионных повреждениях стенки тонкой кишки, вызванных нарушением магистрального кровотока в течение 20 (группа 6, n = 6) и 30 (группа 7, n = 6) минут проводилось на разработанной модели с использованием бактериологического метода исследования. В этой же серии животных изучались системные биохимические и иммунологические показатели.

Таблица 3

Распределение животных на группы (3-я серия опытов)

Метод исследования № группы Характеристика фрагмента исследования Общее число опытов

Бактериологический метод. Биохимический метод. Иммунологический метод. Оценка системной концентрации маркеров гипокси-ческого повреждения тканей, активации системы комплемента и протеолиза 6 Оценка состоятельности кишечного барьера для £. coli при реперфузионных повреждениях слизистой тонкой кишки, вызванных нарушением магистрального кровотока в течение 30 минут 6

7 Оценка состоятельности кишечного барьера для Е. coli при реперфузионных повреждениях слизистой тонкой кишки, вызванных нарушением магистрального кровотока в течение 20 минут 6

Бактериологический метод. 8 Оценка состоятельности кишечного барьера для Е. coli при отсутствии реперфузионных повреждений слизистой тонкой кишки 6

Оперативные вмешательства у животных. Все оперативные вмешательства проводили в условиях операционной, исключающих внедрение посторонней инфекции. Выполняли премедикацию аминазин, кетамин, дро-перидол, атропин внутримышечно в дозе 0,5 мг/кг. Затем после удаления

шерстяного покрова проводилась обработка операционного поля раствором первомура. Непосредственно перед операцией внутриплеврально вводили тиопентал натрия в дозе 20 мг/кг. Проводили обработку брюшной стенки. Выполняли срединную лапаротомию. Далее оперативное вмешательство продолжали в соответствии с характеристикой группы эксперимента. Эвтаназию животного выполняли путем передозировки наркотических препаратов.

Оперативные вмешательства у животных группы 1. Тотчас после лапа-ротомии переходили к выделению брыжеечных сосудов. Кишечник вместе с единой брыжейкой отводили вправо и краниально. Листок брюшины покрывающей аорту рассекали от бифуркации до устья брыжеечной артерии с сохранением левой почечной вены. Турникеты подводили раздельно: под брыжеечную артерию в области ее устья; под лимфатические коллекторы вокруг брыжеечной артерии, отчетливо выявляемые у кролика; под брыжеечную вену, которую выделяли тотчас над артерией. Следующим этапом осуществляли забор кишечного содержимого. После наложения серо-серозных швов на проксимальный, средний и дистальный отдел тонкой кишки пунктировали зону наложенных швов с последующей аспирацией из просвета 1 мл кишечного содержимого. Каждую пункцию выполняли стерильным набором (игла диаметром 0,8 мм, шприц 2 мл). Сразу после аспирации материал помещали пробирки с питательной средой с соблюдением правил асептики. Операционную рану ушивали непрерывным брюшинно-апо-невротическим швом шелком № 5 и отдельными кожными швами.

Оперативные вмешательства у животных группы 2. Выделение сосудов брыжейки тонкой кишки проводили так же, как в группе 1. Моделировали нарушение магистрального кровотока 60 мин, 30 мин, 25 мин, 20 мин, 15 мин путем наложения сосудистых клипс вместо турникетов на брыжеечную артерию, вену, лимфатический коллектор. По окончанию периода ишемии восстанавливали кровоток снятием сосудистых клипс. Герметичность брюшной полости восстанавливали отдельными мышечно-апоневротическими швами. Эвтаназию животного производили через 60 минут после восстановления магистрального кровотока. После эвтаназии выполняли релапарото-мию, в одном блоке удаляли желудок, двенадцатиперстную, тонкую и толстую кишки. Для морфологического исследования иссекали циркулярно участки по 0,5 см из проксимальнного, среднего и дистального отделов тонкой кишки. Образцы фиксировали в 10% растворе формалина.

Оперативные вмешательствау животных группы 3. Терминальный отдел тонкой кишки в 15 см от тонкотолстокишечного перехода выводили в рану. После наложения кисетного серо — серозного шва просвет кишки вскрывали на протяжении 1,5 мм. В просвет кишки вводили тонкий полихлорвиниловый катетер диаметром 1,5 мм на глубину 10 см в дистальном направлении. Кисетный шов затягивали вокруг катетера. Герметичность наложенной фистулы контролировали компрессионной пробой с физиологическим раствором. Наружный конец катетера герметизировали пластмассовой заглушкой и выводили на переднюю брюшную стенку через дополнительный разрез, фиксировали его к коже. Операционную рану ушивали непрерыв-

ным брюшинно-апоневротическим швом шелком № 5 и отдельными кожными швами. Животное транспортировали в лабораторию радионуклидной диагностики. Наркотизированного и фиксированного на спине кролика укладывали так, чтобы экспериментальное животное полностью попадало в

В«-» 9 9m т

установленный катетер животным вводили раствор Тс-pertechnetat 1,8 МБк (48,6 ^Ci) в 2 мл физиологического раствора в течение 5 секунд. Запись изображения начинали одновременно с введением препарата. Эвтаназия животного проводилась через 60 минут. После эвтаназии из брюшной полости удаляли желудок и кишечник с брыжейкой. Для сохранения герметичности просвета перед отсечением органов на удаляемые части и их культи накладывали зажимы. Сцинтиграфия после эвтаназии животного с удаленным кишечником проводилась в течение 60 мин.

Оперативные вмешательства у животных группы 4. Технология эксперимента полностью повторяла таковую у животных группы 3. В отличие от животных 3 группы, в тонкую кишку вводили 2 мл бактериального радиопрепарата с активностью 2,22 МБк, приготовленный по модифицированному способу.

Оперативные вмешательства у животных группы 5. Выделение сосудов брыжейки тонкой кишки проводилось так же, как в группе 1, моделирование ишемии — как в группе 2, установка катетера в тонкую кишку и введение бактериального радиопрепарата и сцинтиграфия — как в группе 4. Сосудистые клипсы накладывали сразу после введения в просвет кишки бактериального радиопрепарата на 15—60 минут в зависимости от условий опыта. Забор материала для морфологического исследования производился тотчас после эвтаназии. Иссекали циркулярно участки по 0,5 см из проксимального, среднего и дистального отделов тонкой кишки, удаленной из брюшной полости с сохранением герметичности просветов. Образцы фиксировали в 10% растворе формалина.

Оперативные вмешательства у животных группы 6. Технология эксперимента полностью повторяла таковую у животных группы 5. В отличие от условий проведения эксперимента 5 группы животных, в установленный в тонкую кишку катетер вводили не бактериальный радиопрепарат, а взвесь (107) E.coti 0|ц — энтеропатогенный штамм кишечной палочки после 48 часов культивации на питательных средах. На протяжении всего эксперимента животные находились в операционной экспериментальной лаборатории, герметичность просвета желудочно-кишечного тракта не нарушалась. Длительность ишемии составляла 30 минут. Забор крови для бактериологического исследования проводился однократно до наложения сосудистых клипс, пятикратно с момента восстановления магистрального кровотока с интервалом в 15 минут. Каждый забор крови выполнялся с соблюдением правил асептики, в объеме 1 мл методом пункции ушных вен. Образцы помещали в пробирки с питательной средой. Забор крови для выполнения биохимических и иммунологических исследований проводился двукратно: до наложения сосудистых клипс и в первые минуты восстановления кровотока. Условия эксперимента кодировались для исключения субъективного фактора при оценке результатов.

Оперативные вмешательства у животных группы 7. Технология эксперимента полностью повторяла таковую у животных группы 6. В отличие от условий проведения эксперимента 6 группы животных длительность ишемии составляла 20 минут.

Оперативные вмешательства у животных группы 8. Технология эксперимента полностью повторяла таковую у животных групп 6 и 7. В отличие от условий проведения эксперимента 6 и 7 групп животных сосудистые клипсы не накладывали, эта группа составила группу сравнения. Забор крови для бактериологического исследования проводился шестикратно с момента введения в просвет кишки взвеси (107) культивированной Е. coli О111 с интервалом в 15 минут.

Методы исследования in vivo

Сцинтиграфия. Сцинтиграфию проводили на гамма-камере MULTISPECT-II и DIACAM (Siemens, Германия) с компьютерной системой обработки данных ICON. Регистрацию сцинтиграмм проводили в динамическом режиме при следующих параметрах сбора информации: 360 кадров, 1 кадр - 60 с, матрикс 64 х 64. Использовали коллиматор для низких энергий высокого разрешения. Режим дифференциального дискриминатора составлял 15%. Исследование проводили в прямой проекции, устанавливая детектор гамма-камеры так, чтобы экспериментальное животное полностью попадало в поле детекции. После эвтаназии животного сцин-тиграфию выполняли в статическом режиме. Обработка полученных данных включала визуальную оценку сцинтиграмм, выделение зон интереса (проекции кишечника, печени, сердца, легких), построение кривых «активность-время» и проводилась совместно со специалистами лаборатории радионуклидной диагностики.

Бактериологические исследования. Жизнеспособность и концентрацию Е. coli во взвеси перед введением в организм животного контролировали бактериологическим исследованием 1 мл подготовленного бактериального радиопрепарата. Биологический материал помещали в пробирки с ви-ноградно-сахарным бульоном, затем переносили на твердые среды (среда Эндо, 5% кровяной агар, желточно-солевой агар) методом секторных посевов по Gould в модификации Рябинского-Родомана не позже 6 часов с момента забора материала. Чашки инкубировали при температуре 37 °С в течение 18—24 часов, после чего подсчитывали количество колоний. Число КОЕ в 1 мл определяли по таблице. Забор кишечного содержимого на бактериальный посев осуществлялся из трех отделов тонкой кишки лабораторного животного. Проксимальный, средний, дистальный. Забор осуществлялся в стерильные пробирки с виноградно-сахарным бульоном с последующим бактериальным посевом на твердый питательный агар (мясо-пептонный агар с 5% добавлением крови и среду Эндо) и с последующим подсчетом числа колоний.

Морфологические исследования. Образцы стенки тонкой кишки фиксировали в 10% нейтральном формалине сразу после забора. Фиксированный препарат заливали парафином. Срезы окрашивали гематоксилином и

эозином, гематоксилином и пикрофуксином. Срезы исследовались в микроскопе Olympus CN 20. Метод исследования — световая микроскопия с масляной иммерсией.

Биохимические исследования. Для определения метгемоглобина в крови применяли спектрофотометрическое исследование. Исследование выполнены на спектрофотометре Ультроспек 4050 Швеция (по методике Г.В.Дервиз, 1966).

Принцип метода: метгемоглобин в кислом растворе дает характерную полосу поглощения света при 630 нм. Цианметгемоглобин (CN-метЮ), в который метгемоглобин легко превращается, совсем не имеет поглощения в этом диапазоне. Поэтому уменьшение оптической плотности после обработки гемолизата крови цианидами пропорционально количеству метгемогло-бина в растворе. Для вычисления процента метгемоглобина, который составляет от общего количества гемоглобина, необходим контрольный раствор исследуемой крови со 100% содержанием метгемоглобина.

Плазменную концентрацию конечного продукта перекисного окисления липвдов — малонового диальдегида определяли по реакции с тиобарбитуро-вой кислотой по методике, описанной А.С. Сосновским, А.В. Козловым (1992).

Агрегацию липопротеинов, по которой судили об изменении активности протеолиза, выполняли по методу АЛ. Тарабрина (1994).

Иммунологическиеметоды исследований. Подсчитывали количество эритроцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу крови по общепринятым методикам. Оценивали фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность или фагоцитарный индекс) — процент фагоцитов из числа сосчитанных нейт-рофилов, и фагоцитарное число — среднее число дрожжей, поглощенных одним активным нейтрофилом.

Для оценки степени антигенной раздраженности неактивированных in vitro фанулоцитов крови исследовали спонтанный тест восстановления нит-росинего тетразолия (НСТ-тест), выражая результаты в процентах. Активированный НСТ-тест (%) определяли для оценки функционального резерва кислородзависимого механизма бактерицидности фагоцитов.

Методы статистической обработки результатов

Использовались методы вариационной статистики, методы анализа непараметрических данных. Относительные величины, выраженные в процентах, приводили в тексте диссертации с ошибкой процента. Величины анализируемых признаков в группах представляли в виде медианы с нижним и верхним квартилями (25-й и 75-й процентили). Значимость различий количественных показателей сравниваемых групп определяли по критерию Ман-на-Уитни (U), для связанных выборок по критерию Вилкоксона (W). Сравнение качественных признаков проводили с использованием точного теста Фишера для четырехпольной таблицы. Корреляционный анализ данных в выборках с ненормальным распределением проводили с применением непараметрического коэффициента корреляции Спирмена (Rs). Статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета программ Statistica for Windows 6.0

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальная модель

В первой серии опытов определяли возможность использования кролика в модели ранних ишемических и реперфузионных повреждений при острой тотальной ишемии тонкой кишки.

Вариантная анатомия каудальныхи краниальныхбрыжеечныхсосудов кролика. Дистальнее чревной артерии от передней стенки аорты отходит краниальная брыжеечная артерия, которая отдает ветви к поджелудочной железе и снабжает кровью весь кишечник кролика (п = 6). Артерию сопровождает одноименная вена. В процессе изучения анатомии кролика нам удалось выяснить наличие дополнительной каудальной брыжеечной артерии (п = 1), кровоснаб-жающей тонкую кишку. Артерию сопровождает одноименная вена. Для моделирования тотальной ишемии тонкой кишки ее необходимо перевязывать.

Морфологические изменения кишечной стенки в условиях кратковременного острого прекращения магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов. При остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов в течение 60 минут с последующим восстановлением кровотока на 60 минут, определяются структуры всех слоев кишечной стенки проксимального, среднего и дис-тального отделов тонкой кишки. Сосуды всех слоев кишечной стенки полнокровные, отмечается отек стромы слизистого и подслизистого слоев с инфильтрацией лимфоидными и плазматическими клетками. Наибольшие изменения выявлены в средней и верхней части ворсин: слущивание клеток эпителия, массивные кровоизлияния в строму с разрушением строения ворсин и эритроцитами в просвете кишечника. Так же отмечали некроз поверхности ткани ворсин (п = 9). Острое прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов кролика в течение 60 минут сопровождается развитием острой тотальной ишемии с поражением слизистого, подслизистого и мышечных слоев всех отделов тонкой кишки.

Острое прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов в течение 30минут с последующим восстановлением кровотока на 60 минут сопровождается изменениями слизистого и под-слизистого слоев кишечной стенки проксимального, среднего и дистального отделов тонкой кишки. Эти изменения проявляются интерстициальным отеком на уровне ворсин и интерстициальных пространств, а также и в подсли-зистом слое. На поверхности ворсин дистрофические изменения клеток эпителия, слущивание эпителия с поверхности ворсин. В хорионе кишечных ворсинок отмечается набухание соединительнотканных клеточных элементов. Констатируется наличие выраженного полнокровия сосудов во всех слоях тонкого кишечника с кровоизлияниями в строму ворсин. В мышечном слое отек менее выражен, и на этом уровне преобладает только полнокровие сосудов (п = 10). Острое прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов кролика в течение 30 минут сопровождается развитием острой тотальной ишемии кишечной стенки с преимущественным поражением слизистого и подслизистого слоев всех отделов тонкой кишки.

Острое прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов в течение 25 минут с последующим восстановлением кровотока на 60 минут сопровождается изменениями различной степени выраженности. Отмечается сохранность структур слизистой с элементами отека подслизистой основы, кровоизлияния в строму ворсин и слущивание эпителия с поверхности ворсин (п — 2). В других случаях сохранялась структура ворсин на фоне отека подслизистого слоя с дискомплек-сацией призматического эпителия и полнокровием сосудов в верхних отделах ворсин (л = 6). Острое прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов кролика в течение 25 минут сопровождается развитием острой тотальной ишемии кишечной стенки с преимущественным поражением слизистого и подслизистого слоев всех отделов тонкой кишки. В морфологической картине не отмечается одно-типныхпроявлений тяжести повреждения.

Острое прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов в течение 20минут с последующим восстановлением кровотока на 60 минут сопровождается однотипными изменениями. Сохраняется структура слизистой оболочки, отмечаются элементы отека подслизистого слоя. Постоянным признаком является дискомплексация призматического эпителия ворсин. При сохраненной структуре ворсин наблюдается полнокровие сосудов в верхних отделах отдельных ворсин, свидетельствующее о расстройстве микроциркуляции (п = 6). Указанные изменения свидетельствуют о наличии ишемического и реперфузионного повреждения кишечного эпителия при остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов в течение 20 минут с последующим восстановлением кровотока на 60 минут.

Острое прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов в течение 15минут с последующим восстановлением кровотока на 60 минут сопровождается однотипными изменениями. Отмечается сохранность структур слизистой оболочки с элементами отека подслизистого слоя. Сохранена структура ворсин и клеток призматического эпителия. Наблюдается полнокровие сосудов в верхних отделах отдельных ворсин, свидетельствующая о расстройстве микроциркуляции. Указанные изменения свидетельствуют о минимальных повреждения кишечного эпителия при остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов в течение 15 минут с последующим восстановлением кровотока на 60 минут.

Результаты морфологического исследования позволяют заключить, что острое прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов кролика вызывает развитие острой тотальной ишемии тонкой кишки. Основные морфологические проявления повреждения кишечной стенки соответствуют длительности ишемического периода и в сроки от 15 до 60 минут определяются преимущественным поражением слизистой оболочки: 15-минутная ишемия — структура клеток сохранена; 20-минутная ишемия — дискомплексация призматического эпителия ворсин; 25-минутная ишемия — повреждением клеточных структур кишечного эпителия, в некоторых наблюдениях нарушается целостность

его покрова — повреждение не носит однотипного характера; 30-минутная ишемия - дистрофические изменения клеток эпителия, слущивание эпителия с поверхности ворсин с нарушением его целостности; 60-минутная ишемия — отчетливо выявляется некроз поверхности ткани ворсин.

Микробный пейзаж желудочно-кишечного тракта кролика. Проверка гипотезы о пригодности кролика для изучения бактериальной транслокации из просвета тонкой кишки на примере Е. coli основана на изучении нормального микробного пейзажа желудочно-кишечного тракта.

По результатам изучения микробного пейзажа просвета тонкой кишки здорового кролика установлено, что кишечная палочка является резидентной микрофлорой изучаемого биотопа. В связи с тем, что наибольшая концентрация E. coll (104 КОЕ) в норме находится в дистальном отделе тонкой кишки, этот отдел выбран для изучения бактериальной транслокации кишечной палочки в условиях ишемического повреждения слизистой оболочки.

В результате первой серии опытов была подтверждена гипотеза о возможности изучения закономерностей развития бактериальной транкслока-ции при ранних ишемических и реперфузионных повреждениях тонкой кишки вследствие острого прекращения кровотока по краниальным брыжеечным со-судаму кролика с использованием Е. coll.

Получение бактериальногорадиопрепарата сустойчивой фиксациейра-диоактивнойметки. Одним из методов визуальной оценки динамики перемещения кишечной палочки в живом организме является сцинтиграфия. Необходимым условием достоверности исследования является создание бактериального комплекса, в котором радионуклидная метка прочно фиксирована в жизнеспособной клетке.

За основу способа получения меченных радионуклидом бактерий был взят способ, описанный А.В. Шелеховым (1998) и модифицированный Ю.М. Галеевым (2001). В основе способа заложена элюция свободного 991ПТс из бактериального изотопного комплекса за счет разницы концентрации в растворах ионов, разделенных полупроницаемой мембраной.

На первом этапе исследования оказалось, что бактериальный радиопрепарат не обладает достаточно низким содержанием свободного 991ПТс, поскольку при диализе определялся высокий уровень активности внешнего контура как после третьего, так и после пятого диализа. Высокое содержание свободного 991ПТс сохранялось как при соблюдении всех параметров описанной методики, так и при изменении среды культивации с простого (А.В. Шелехов) на кровяной (Ю.М. Галеев) агар, так и при изменении времени культивации от 0 до 24 часов.

Максимальное содержание свободного 991ПТс в бактериальном радиопрепарате отмечалось при использовании кровяного агара без культвации кишечной палочки и составило 53 (32-69) % после диализа № 3, 42 (26— 59) % после диализа № 5.

При указанных условиях приготовления бактериального радиопрепарата минимальное содержание радиоактивных примесей после диализов № 3 и № 5 значимо не изменялось (33 (29-37) % и 32 (22-34) %

соответственно). Это позволяет заключить, что дальнейший диализ бактериального радиопрепарата не позволит добиться значимого увеличения чистоты готового препарата, что соответствует данным Ю.М. Га-леева о нецелесообразности проведения 4-5 диализов. Полученные данные позволили выдвинуть гипотезу, что условия приготовления бактериального радиопрепарата по стандартным методикам не позволяют получить препарат, годный для изучения бактериальной транслокации. Прочную фиксацию 99mTc-pertechnetat к клетке можно осуществить в анаэробных условиях на простом агаре. Теоретическим обоснованием гипотезы послужили данные литературы об изменении метаболизма Е. coli в анаэробных условиях.

В соответствии с выдвинутой гипотезой были изменены условия приготовления «меченной бактерии».

Таблица 4

Сравнительные характеристики бактериального радиопрепарата, приготовленного по известной и модифицированной методике

Условия приготовления бактериального изотопного комплекса Активность после ; 5 диализа; Содержание радиоактивных примесей в Анализирующем > растворе (%)после 5 диализа> Концентрация радиопрепарата (внутренний контур после 5 диализа) Потери < радиоактивного технеция в -среду при « инкубации, МБк:

внутреннего контура, МБк внешнего • (диализи-рующий раствор) контура, МБк»

Модифицированная методика (" = 8) 14,2* (15,6-14,8) 0,37* (0,33-0,55) 2,7* (2,4-3,3) 0,71* (0,62-0,74) 40,1* (37,5-48,1)

Стандартная методика (п = 8) 4,1 (3,7-5,5) 2,2 (1.8-2,5) 34 (29-39) 0,21 (0,18-0,28) 67,0 (53,6-75,8)

'-различия значимы (р < 0,01).

Из представленных данных (табл. 4) видно, что по всем рассматриваемым критериям модификация методики сопровождалась значимым улучшением результата. Инкубация в анаэробных условия позволяет сократить потери 99mTc-pertechnetat на этапе подготовке бактериального радиопрепарата к диализу, что подтверждается значимым снижением потерь 99mTc-pertechnetat в среду. Полученный после диализа № 5 бактериальный изотопный комплекс имел высокую концентрацию бактериального радиопрепарата в одном мл — 0,71 МБк (19,1 р.(л) (0,62 МБк (16,7"цС0—0,74 МБк (20 цСЛ)), с низким содержанием свободного 991ПТс — 2,7 (2,4—3,3) %. В группе сравнения эти показатели составили соответственно 0,21 МБк (5,7 цСО (0,18 МБк (4,9 цС0-0,28 МБк (7,6 цСЛ» и 34(29-39)% ^ < 0,05).

Таким образом, разработанный способ позволил получить бактериальный радиопрепарат с прочной фиксацией к клетке радиоактивной метки, при содержании свободного технеция во внеклеточной среде менее 5% (р<0,05).

Жизнеспособность приготовленной Е. coli с устойчивой фиксацией в клетке радиоактивной метки подтверждалась бактериологическим исследованием путем культивации на твердом питательном агаре (мясопептонный агар с 5% добавлением крови и среду Эндо) в аэробных условиях, с последующим подсчетом числа колоний: 106 (10б—107) КОЕ (n = 8), что подтверждает высокую жизнеспособность полученной клеточной взвеси.

Полученный препарат позволяет визуально оценить перемещение живых бактериальных клеток in vivo, в том числе при введении его в просвет желудочно-кишечного тракта.

Проницаемость нормальной стенки тонкой кишки кролика для свободно-ao^Tc-pertechnetatüЕ. coliсустойчивойфиксацией изотопа99"1 Tc-pertechnetat в клетке. Для оценки закономерностей развития бактериальной транслокации при остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов предстояло выяснить, происходит ли перемещение Е. coli из просвета кишечника на выбранной модели в отсутствие ишемических повреждений (3 и 4 группы животных).

Оценка бактериальной транслокации в условиях патологии методом сцин-тиграфии с использованием Е. coli с устойчивой фиксацией изотопа 99 "Т с -pertechnetat в клетке предполагает исходное понимание законов всасывания свободного 99mTc-pertechnetat при таком же способе введения. Необходимость этого опыта связанна, прежде всего, с изучением проницаемости нормальной слизистой и выявлением зон накопления свободного 99mTc-pertechnetat и бактериального радиопрепарата, введенных в просвет кишки. Введенный в просвет кишки раствор 99mTc-pertechnetat в условиях сохраненного пассажа и нормального кровоснабжения кишечной стенки начинает легко проникать в системный кровоток, что подтверждается наличием экстраинтестинальных очагов в щитовидной железе, слюнной железе, сердце, а также четким контрастированием контуров животного (п = 2) (рис. 1).

Бактериальный радиопрепарат, введенный в просвет кишки, не распространяется в организме животного за пределы кишечной стенки, что подтверждается отсутствием экстраинтестинальных очагов активности и контуров животного (п = 2) (рис. 2).

т

Рис. 1. Сцинтиграммы кролика. А-суммационный кадр динамической сцин-тиграфии за 90 мин. В кишечник введено 1,8 МБк (48,6 рСО Тс-реПесГиШа!. В -статическая сцинтиграфия в течение 1 ч после эфтаназии иудаления кишечника.

Рис. 2. Сцинтиграммы кролика. А- исследование бактериальной транслокации меченой кишечной палочки, введенной в тонкую кишку, методом динамической сцинтиграфии. Суммацион-ный кадр. 2,22 МБк (60 В - статическая сцинтиграфия в течение 1 ч после эвтаназии и удаления кишечника.

На представленной сцинтиграмме определяется только один очаг радиоактивности в области введения бактериального радиопрепарата, т.е. кишечник. Экстраинтестинальных очагов не выявляется, что говорит об отсутствии транслокации меченых бактерий в условиях сохраненного пассажа и нормального кровоснабжения кишечной стенки. Для Е. coli нормальная слизистая является непроницаемым барьером.

Закономерностиразвития бактериальной транслокации при остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов. При остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов в течение 60 минут с последующим восстановлением кровотока на 60 минут (я = 2) на всем протяжении сканирования в процессе ишемического повреждения не отмечалось поступления бактериального радиопрепарата за пределы просвета кишки. С момента снятия зажимов отмечался резкий подъем кривой «активность—время» в проекции средостения с последующим постепенным увеличением количества импульсов в минуту. Сцинтиграфия после эвтаназии и удаления кишечника показала наличие контуров тела с максимальной концентрацией бактериального радиопрепарата в мочевом пузыре и несколько меньше в зоне печени, сердца (рис. 3, 4).

Полученные данные свидетельствуют о том, что ишемия в течение 1 часа сопровождается выраженными реперфузионными повреждениями, которые с первых минут реперфузии проявляются бактериальной транслокацией.

При остром прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов в течение 30 минут с последующим восстановлением кровотока на 60 минут (п = 2) на всем протяжении сканирования в процессе ишемического повреждения не отмечалось поступления бактериального радиопрепарата за пределы просвета кишки. С момента снятия зажимов отмечался слабо выраженный подъем кривой «активности время в проекции средостения. Сцинтиграфия после эвтаназии и удаления кишечника показала наличие контуров тела с максимальной концентрацией бактериального радиопрепарата в мочевом пузыре и несколько меньше в зоне печени и почек (рис. 4).

Рис. 3. Сцинтиграммы кролика - 60-минутная ишемия тонкой кишки. А-суммационный кадр ишемических повреждений. В-суммационный кадр реперфу-зионныхповреждений. С-ста-тическая сцинтиграфия после эвтаназии и удаления кишечника. D - кривая «активность-время». 1 -бактериальный радиопрепарат в просвете кишки. 2 - зона интереса в проекции головы («golova»). 3 - зона интереса в проекции средостения («cor»). 4 - зона печени. 5 -зона мочевого пузыря с накопленным бактериальным радиопрепаратом. 6 - подъем кривой «активность-время» после начала реперфузии.

Рис. 4. Сцинтиграммы кролика -30-минутная ишемия ишемия тонкой кишки. А - суммацион-ный кадр ишемических повреждений. В - суммационный кадр реперфузионных повреждений. С - статическая сцинтиг-рафия после эвтаназии и удаления кишечника. О - кривая «активность-время». 1 -бактериальный радиопрепарат в просвете кишки. 2 - зона интереса в проекции средостения. 3 - зона мочевого пузыря с накопленным бактериальным радиопрепаратом. 4 - подъем кривой «активность-время» после начала реперфузии.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ишемия в течение 30 мин сопровождаетсяреперфузионными повреждениями, которые с первыхми-нутреперфузии проявляются бактериальной транслокацией.

При остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов в течение 15—25 (п = 5) минут с последующим -восстановлением кровотока на 60минут в процессе ишемического иреперфузи-онного повреждения не отмечалось поступления бактериальногорадиопрепара-та за пределы просвета кишки. Сцинтиграфия после эвтаназии и удаления кишечника показала отсутствие контуров тела и экстраинтестинальных очагов активности бактериального радиопрепарата (рис. 5).

Полученные данные позволяют предполагать отсутствие бактериальной транслокации при реперфузионных повреждениях слизистой тонкой кишки на фоне ее 15—25-минутной ишемии.

Результаты проведенных морфологических (группа 2) и радионук-лидных исследований (группа 5) позволили выдвинуть гипотезу, что длительность ишемии при остром прекращении магистрального кровотока по краниальным брыжеечным сосудам определяет последовательное развитие местных и системных реперфузионных повреждений. При реперфузи-онных повреждениях, не сопровождающихся нарушением целостности кишечного эпителия (ишемия 15—20 минут) сохраняется барьерная функция слизистой в отношении Е. coli. Разрушение эпителиального покрова тонкой кишки (ишемия 30 и более минут) сопровождается развитием бактериальной транслокации.

Для подтверждения гипотезы о состоянии барьерной функции тонкой кишки при 20- и 30-минутной ишемии произведена заключительная серия опытов (группы 6, 7, 8). Результаты этой серии опытов представлены в таблице 5.

Полученные данные позволяют утверждать, что реперфузия ишемизи-рованной в течение 20 минут слизистой тонкой кишки не сопровождается развитием бактериальной транслокации. Реперфузионные повреждения слизистой тонкой кишки при 30-минутной тотальной ишемии сопровождаются нарушением барьерной функции тонкой кишки и проявляются массивным no-

ступлением в системный кровоток жизнеспособной кишечной палочки. Бактериологическое исследование внутреннихорганов подтверждает наличие основного лимфатического и дополнительного портального путей бактериальной транслокации.

Таблица 5

Содержание Е. coli (lg КОЕ) в крови и внутренних органах при -реперфузионных повреждениях слизистой тонкой кишки, вызванных ишемией в течение 20 и 30 минут

Кровь (время забора крови) ■ о

а: . С ' га х - х. I v I. х . х л J С ей га >. л X - я ф : о ф Я: га sc X : ф

0.. 1. z О - о S; г 2: «О » 2 О : «О 2 ■о 2 о <0 о f га 2 га s о. с; га С 7 Ф С о с i_ -ф о. ф о ф С -ф О "

№8 (контроль) 1-6 Роста бактерий нет

№7 (ишемия 20 мин) 1-6 Роста бактерий нет

1 - 5 5 5 5 5 5 5 - - - -

2 - 4 4 5 5 6 6 6 - - - -

3 - 4 5 5 6 5 4 - - - - 4

№6 4 - 5 5 5 5 5 5 5 - - - -

(ишемия 30 5 - 4 4 5 5 6 5 5 - - - -

мин) 6 - 4 5 5 5 5 4 - - - - 4

Сравнительный анализ системного воздействияраннихишемическихире-перфузионныхповреждений слизистойтонкой кишки при прекращениимагист-рального кровотока в течение 20и 30 минут проведен на животных группы № 6 и № 7. Различия в лабораторных показателях до наложения сосудистых клипс и в первые минуты восстановления кровотока представлены на рис. 6.

Как представлено на графиках, после восстановления кровотока по краниальным брыжеечным сосудам при более легкой степени ишемии определяется значимо более высокая концентрация маркеров клеточного повреждения в системном кровотоке. Концентрация малонового диальдегида и повышение уровня метгемоглобина в эритроцитах выше у животных 7 группы (ишемия в течение 20 минут) (р < 0,05). Установленный факт объясняется тем, что при 20-минутной ишемии эпителий кишечных ворсин, несмотря на состоявшееся гипоксическое повреждение, остается жизнеспособным и в системный кровоток поступает значительное количество метаболитов, в том числе продуктов свободно-радикального повреждения (маркером которого является метгемоглобин) и перекисного окисления липидов (малоновый диальдегид). При 30-минутной ишемии слущивание погибшего эпителия кишечных ворсин в просвет кишки сопровождается меньшим поступлением в кровь продуктов клеточного метаболизма (рис. 6а, г), однако в сравнении с исходными показателями, концентрация малонового диальде-гида также значимо увеличивается.

0.45 0.4 0.35 0.3

0,25

о л

0.15 0.1 0.05 0

0,2 0,18 0.16 0.14 0,12 0.1 0.08 О.Ов 0.04 0,02 О

Динамика концентрации метге могло бина » _в системном кровотоке (%) _

3,5 3 2,5 2 1.5 1

-о-* (р=0,028) При 20 минутной ишемии -о-При зо минутой ишемии'

/

Концентрация метгемоглобина до моделирования патологии

Концентрация -мет гемоглобина при реперфуэии

Динамика НСТ тест (спонтанный) (%)

НСТ спонтанный до моделирования патологии

НСТ спонтанный при реперфуэии,

Динамика НСТ тест (индуцированный) (%) ■

-*(Р=0.028) при 30 мин ишемии -

НСГГ индуцированный до моделирования патологии

НСТ индуцированный при реперфуэии -

Агрегация липопротеидов * (А340/1 мин)

-При 20 минутой ишемии " -*(р«0,028) При 30 минутой -ишемии

Агрегат я липопротеидов до Агрегация липопротеидов при моделирования патологии реперфуэии -

Динамика концентрации V малонового диальдегида в системном кровотоке -(мкмопь/л)

—^При 20

минутой ■

ишемии ~

-О—*(р=0,028)При

30 минутой •

ишемии ■>

Концентрация малонового Концентрация малоноеого -диальдегида до модалиров анмя диапьдвгида при реперфуэии . патологии

Динамика концентрации циркулирующих иммунных комплексов < _(у ело а. ад.)_

—О—При 20 минутой ишемии ^•(р=0,028) при 30 минутой

Концеиградо фркулируюиде-ч Концентрация циркулирую«« иммунных комплексов ДО . иммунных аомллексоа 14м модвтрования патологии > реперфуэии "

ж

Рис. 6.' Сравнительный анализ лабораторных : показателей при 20 и 30-минутной окклюзии • магистрального кровотока по краниальным ч брыжеечным сосудам:

Значимые изменения показателей, отражающих инициацию системного воспалительного ответа, удалось зарегистрировать только в 6-й группе животных (ишемия 30 минут). Снижение содержания в крови циркулирующих иммунных комплексов (рис. 6е) объясняется их осаждением, что подтверждает активацию системы комплемента. Активация протеолиза, проявляющаяся снижением показателя агрегации липопротеидов (рис. 6ж), реализуется как через «каскад комплемента», так и вследствие «нейтрофильно-го взрыва». Повышение фагоцитарного числа (рис. 6б) с одновременным снижением резерва фагоцитарной и метаболической активности нейтрофи-лов (рис. 6в, д) подтверждает массивное взаимодействие попавших в кровоток бактерий с иммунокомпетентными клетками.

Рис. 7. Инициирующая роль бактериальной транслокации в развитии синдрома системной воспалительной реакции.

Динамика лабораторных показателей при 30-минутной ишемии свидетельствует о развитии ответа острой фазы (предиммунного ответа), а соотношение показателей в 6 и 7группе позволяет вычленить бактериальную транслокацию как фактор, инициирующий системную реакцию организма, что дополняет принятую Согласительной конференцией American College of Chest Phisicians и Society of Critical Care Medicine, 1992 г. схему патогенеза синдрома системного воспалительного ответа (рис. 7).

выводы

1 Разработанная модель острого нарушения магистрального кровотока в бассейне брыжеечных сосудов кролика пригодна для изучения проницаемости кишечной стенки для резидентной микрофлоры в условиях ишемических и реперфузионных повреждений тонкой кишки.

2. Изменение условий инкубации Е. coli с 99mTc-pertechnetat с аэробных на анаэробные позволяет получить бактериальный радиопрепарат с высокой удельной радиоактивностью и низким содержанием свободного 99тТс, что позволяет проводить биомедицинские исследования «in vivo» в пределах 95% доверительного интервала.

3. Острое прекращение магистрального кровотока в сроки от 15 до 60 минут вызывает тотальную ишемию стенки тонкой кишки с преимущественным поражением слизистой оболочки. При ишемии длительностью 20 минут и менее изменения слизистой характеризуются дискомплексацией эпителия; с сохранением целостности его покрова. Ишемия длительностью 30 минут и более сопровождается нарушением целостности эпителиального покрова.

4; Сохранение целостности эпителиального покрова слизистой оболочки тонкой кишки обеспечивает ее защитную функцию в отношении резидентной микрофлоры.

5. Острая ишемия тонкой кишки в течение 30 минут и более сопровождается развитием бактериальной транслокации, которая развивается с первой минуты восстановления магистрального кровотока.

6. Бактериемия инициирует развитие предиммунного ответа, что проявляется активацией системы комплемента и протеолиза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных (верхних брыжеечных сосудов) в сроки до 20 мин не требует специфической профилактики системного повреждающего воздействия реперфузион-ных повреждений.

2. Ишемические повреждения тонкой кишки свыше 20 минут предполагает применение профилактических мероприятий направленных на устранение повреждающего воздействия бактериальной транслокации. Эти мероприятия должны включать системную антибактериальную терапию, нормализацию системы комплемента и гемостаза.

3. Приготовление бактериального радиопрепарата, для изучения закономерностей течения патологического процесса in vivo с помощью Е. coli следует проводить в анаэробных условиях.

Список опубликованных работ

1. Ильичева Е.А Отдаленные результаты лечения рака поджелудочной железы (обзор литературы) / Е.А. Ильичева, А.Г. Кувшинов, Д.И. Максиков // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2002. - № 2. - С. 89~94.

2. Кувшинов А.Г. Интраоперационные нарушения портального оттока и способы их коррекции (обзор литературы) / А.Г. Кувшинов, Е.А. Ильичева // Там же. - С. 94-96.

3. Кувшинов А.Г. Результаты лечения гнойно-септических осложнений после панкреатодуоденальных резекций / А.Г. Кувшинов, Е.А. Ильичева, Д.И. Максиков // Актуальные вопросы гнойно-септической хирургии: Сборник тезисов Всероссийской конференция хирургов посвященной памяти В.Ф. Войно-Ясенецкого. — Красноярск, 2003. — С. 45-46.

4. Чикотеев СП. Гемодинамические аспекты ангиоонкохирургии би-лиопанкреатодуоденальной зоны /СП. Чикотеев, Е.А. Ильичева, А.Г. Кувшинов, Д.И. Максиков // Актуальные проблемы ангиологии и сосудистой хирургии. - Иркутск, 2003. - С. 140-145.

5. Кувшинов А.Г. Модель для оценки бактериальной транслокации из тонкой кишки при ее ишемических и реперфузионных повреждениях / А.Г. Кувшинов // Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: Материалы межрегиональной науч.-практ. конф. молодых ученых Сибири. - Иркутск, 2003. - С. 216.

6. Ильичева Е.А. Определение индекса шунтирования как признак резек-табельности рака головки поджелудочной железы при панкреатодуоденальной резекции / ЕА Ильичева, Л.Н. Грядасова, АХ. Кувшинов // Вестн. Ассоциации хирургов Иркутской области. - Новосибирск: Наука, 2003. — С 101-102.

7. Кувшинов А.Г. Изучение микробного пейзажа тонкой кишки лабораторного животного кролика / А.Г. Кувшинов, Е.А. Ильичева, С.А Ле-пехова и др. // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2003. - № 4. - С. 133-134.

8. Кувшинов А.Г. Изучение вариантной анатомии магистральных сосудов тонкой кишки лабораторного животного кролика / А.Г. Кувшинов, Е.А. Ильичева, С.А. Лепехова и др. // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2003. - № 4. - С. 134-135.

9. Кувшинов А.Г. Морфологические изменения кишечной стенки при ранних реперфузионных повреждениях в условиях острого кратковременного прекращения магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов лабораторного животного кролика / А. Г. Кувшинов, О А. Гольдберг, Е.А. Ильичева и др. // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. - 2003. - № 4. - С. 136-141.

10. Кувшинов А.Г. Получение бактериального радиопрепарата с устойчивой фиксацией к бактериальной клетке радиоактивной метки / А.Г. Кувшинов, Е.А. Ильичева, С.А. Лепехова и др. // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. -2003. - № 5. - С. 111-114.

11. Кувшинов А.Г. Закономерности развития бактериальной транслокации при остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов / А.Г. Кувшинов, Е.А. Ильичева, Т. Рой и др. // Бюлл. СО РАМН. - 2003. - № 5. - С. 114-118.

Подписано в печать 10.01.2004. Бумага офсетная. Формат 60x847^

Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. 1,2 _Тираж 100 экз. Заказ № 013-04._

РИО НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 20-87-73)

i - 2706

Хирургические маневры при выполнении сосудистого этапа расширенной операции на органах билиопанкреатодуоденальной зоны включают различные формы нарушения магистрального кровотока по верхним брыжеечным сосудам: временное прекращение венозного оттока, временное прекращение артериального и венозного кровотока, временное и окончательное интраоперационное шунтирование, интраоперационная артериовенозная перфузия тонкой кишки (Иванова Е.В., 1994; Nakao А., 1990; Tashiro S., 1991; Machado М.С., 2001; Расулов Р.И., 2002). Имеются сообщения о возможности перевязки верхней брыжеечной вены при сформированном окольном кровотоке

Child C.G. 1954., Ильичева E.A., 1999). В литературе нет убедительных данных, касающихся безопасного временного интервала прекращения магистрального портального оттока. Опасность развития реперфузионных повреждений, исходя из экспериментальных работ, возникает с момента повреждения слизистой оболочки тонкой кишки. В механизме ишемических и реперфузионных повреждений кишки в последнее время большое значение придается роли бактериальной транслокации и системного воспалительного ответа, активируемого цитокинами (TNF - alpha, IL - 6 и др), индуцирующего развитие полиорганной недостаточности (Grotz M.R., 1999; Suzuki Y., 2000). В настоящее время сроком максимальной допустимой переносимой тотальной ишемии кишечника считается один час, однако ранние морфологические изменения регистрируются уже при 5-10 минутной ишемии (Банин В.В., 1979). В литературе отсутствуют данные о сроках переносимой ишемии, не сопровождающейся развитием системного воздействия факторов, запускающих синдром системного воспалительного ответа. Именно этот временной интервал можно определить как безопасный с точки зрения профилактики генерализованной системной воспалительной реакции и полиорганной недостаточности в послеоперационном периоде.

Достижения радионуклидной диагностики, позволяющие изучать прижизненную динамику патологического процесса на ранних стадиях его развития, существенно расширили возможности оценки системного воздействия ишемических и реперфузионных повреждений (Flessner M.F., 1991; Perm F., 1996; Шелехов А.В., 1996; Галеев Ю.М., 2001). Многие авторы сообщают о недостаточной специфичности методов исследования бактериальной транслокации, что связано с отсутствием способов получения бактериального радиопрепарата, свободного от несвязанного 99mTc (Hung J.C et al., 1996; Nibbering P.H. et al., 1998; Peters A.M., 1998; Corstens F.H. et al., 1999). Открытие особенностей метаболизма клетки в анаэробных условиях (Lloyd J.R. et al., 1997) указывает на новые возможности для нуклидных методов исследования бактериальной транслокации, однако этот факт не получил развития в экспериментальных работах.

Закономерности развития предиммунного и иммунного ответов при различных видах повреждения тканей, известные факты о бактериемии и бактериальной транслокации, как одного из триггеров патологического процесса, сообщения о сопряженности бактериальной транслокации с повреждением слизистой оболочки тонкой кишки позволяют считать рассматриваемые патологические процессы взаимосвязанными. Уточнение закономерностей развития ранних реперфузионных повреждений при кратковременной тотальной ишемии (до 1 часа) тонкой кишки, вызванной нарушением магистрального кровотока, определили направленность настоящего исследования.

Цель работы

Изучить в эксперименте проницаемость кишечной стенки для резидентных бактерий при острой кратковременной тотальной ишемии тонкой кишки и на этом основании установить временной интервал прекращения магистрального мезентериального кровотока, определяющий развитие системной воспалительной реакции.

Задачи исследования

1. Разработать экспериментальную модель изучения проницаемости кишечной стенки для Е. coli при ранних ишемических и реперфузионных повреждениях тонкой кишки в условиях острого нарушения магистрального кровотока.

2. Определить морфологические изменения стенки тонкой кишки при окклюзии краниальных брыжеечных сосудов длительностью до 60 минут.

3. Изучить проницаемость кишечной стенки для Е. coli в условиях сохранения магистрального кровотока и при острой обратимой тотальной ишемии тонкой кишки.

4. Установить морфофункциональные корреляции бактериальной транслокации при остром прекращении магистрального кровотока в бассейне краниальных брыжеечных сосудов.

5. Оценить роль бактериальной транслокации в развитии системной воспалительной реакции в ответ на ишемическое повреждение тонкой кишки.

Научная новизна

Доказана возможность получения в анаэробных условиях бактериального радиопрепарата с высокой концентрацией 99тТс в жизнеспособной клетке.

Установлены точные временные характеристики ранних морфофункциональных изменений, отражающих воздействие острого нарушения магистрального мезентериального кровотока на слизистую оболочку тонкой кишки.

Доказано системное повреждающее действие восстановления магистрального кровотока после 30-минутной тотальной ишемии тонкой кишки, триггером которого является бактериальная транслокация.

Практическая значимость

Модификация способа приготовления бактериального радиопрепарата позволила получить жизнеспособную культуру E.coli, пригодную для проведения разноплановых научных исследований in vivo.

Установлен временной интервал прекращения магистрального кровотока в бассейне магистральных брыжеечных сосудов, определяющий необходимость интраоперационной профилактики реперфузионных повреждений.

Доказана инициирующая роль бактериальной транслокации в развитии системного воспалительного ответа, что определяет необходимость интраоперационного системного медикаментозного воздействия на резидентную и патогенную микрофлору тонкой кишки.

Внедрение в практику

Материалы диссертационного исследования внедрены в практическую деятельность в госпитальной хирургической клинике Иркутского государственного медицинского университета на базе отделения хирургии портальной гипертензии Иркутской государственной областной клинической больницы, Республиканском онкологическом диспансере г. Абакан (Республика Хакасия), Республиканской больнице г. Улан-Удэ (Республика Бурятия), лаборатории радионуклидной диагностики ГУ НЦ РВХ ВСНЦ СО РАМН.

Результаты проведенного исследования используются в учебном процессе кафедры госпитальной хирургии ИГМУ, Научного центра реконструктивной и восстановительной хирургии Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН и Медицинского факультета БГУ.

Получена патентная справка (Заявка № 2003115590X20 (016533). «Способ приготовления бактериального радиофармпрепарата», Приоритет от 30 мая 2003 г).

Основные положения, выносимые на защиту

Острая тотальная ишемия тонкой кишки в течение 20 минут не приводит к нарушению целостности эпителиальной выстилки кишечных ворсин и барьерной функции кишечной стенки в отношении резидентной микрофлоры.

Системное повреждающее действие 30-минутной ишемии тонкой кишки проявляется с первой минуты реперфузии массивным поступлением резидентной микрофлоры в системный кровоток, что определяет развитие синдрома системного воспалительного ответа.

Апробация работы

Материалы исследования представлены на Всероссийской конференции хирургов посвященной памяти В.Ф. Войно-Ясенецкого 23-25 апреля 2003 г. (Красноярск 2003), II регионарной научно-практической конференции молодых ученых (Иркутск, 2003).

Опубликовано 11 печатных работ, в которых изложены основные положения диссертации.

Структура и объем работы

ВЫВОДЫ:

1. Разработанная модель острого нарушения магистрального кровотока в бассейне брыжеечных сосудов кролика пригодна для изучения проницаемости кишечной стенки для резидентной микрофлоры в условиях ишемических и реперфузионных повреждений тонкой кишки.

2. Изменение условий инкубации E.coli с 99mTc-pertechnetat с аэробных на анаэробные позволяет получить бактериальный радиопрепарат с высокой удельной радиоактивностью и низким содержанием свободного 99тТс, что определяет возможность проведения биомедицинских исследований «in vivo» с высоким уровнем статистической значимости (в пределах 95% доверительного интервала).

3. Острое прекращение магистрального кровотока в сроки от 15 до 60 минут вызывает тотальную ишемию стенки тонкой кишки с преимущественным поражением слизистой оболочки. При ишемии длительностью 20 минут и менее изменения слизистой оболочки тонкой кишки характеризуются дискомплексацией эпителия. Ишемия длительностью 30 минут и более сопровождается нарушением целостности эпителиального покрова.

4. Сохранение эпителиального покрова слизистой оболочки тонкой кишки обеспечивает ее защитную функцию в отношении резидентной микрофлоры.

5. Острая ишемия тонкой кишки в течение 30 минут и более сопровождается развитием бактериальной транслокации, которая регистрируется с первой минуты восстановления магистрального кровотока.

6. Бактериемия инициирует развитие предиммунного ответа, что проявляется активацией системы комплемента и протеолиза.

Практические рекомендации:

Прекращение магистрального кровотока в бассейне краниальных (верхних) брыжеечных сосудов в сроки до 20 мин не требует специфической профилактики системного воздействия реперфузионных повреждений.

Ишемическое повреждение тонкой кишки свыше 20 минут предполагает применение профилактических и лечебных мероприятий. Эти мероприятия должны включать системную антибактериальную терапию, нормализацию системы комплемента и гемостаза.

Приготовление бактериального радиопрепарата для изучения закономерностей течения патологического процесса in vivo с помощью E.coli следует проводить в анаэробных условиях.