Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Закономерности холестеринового обмена в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией

На правах рукописи

Зд)

Довжикова Инна Викторовна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ХОЛЕСТЕРИНОВОГО ОБМЕНА В ПЛАЦЕНТЕ ПРИ ОБОСТРЕНИИ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.03.03 - патологическая фшиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 /, 07.3 2311

Иркутск-2010

4854608

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Дальневосточном научном центре физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН.

Научные консультанты:

академик РАМН Л у цепко Михаил Тимофеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Власов Борис Яковлевич

доктор медицинских наук, профессор Изатулин Владимир Григорьевич

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Дубровина Валентина Ивановна

Ведущее учреждение: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии СО РАМН

Защита состоится « » _ 2011г. в 10.00 часов на заседании

диссертационного совета Д 001.038.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Шолохов Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования Самой распространенной, неконтролируемой и длительное время существующей в организме преимущественно в латентной форме среди вирусных инфекций человека считается герпетическая. Её возбудитель — вирус простого герпеса (ВПГ) выявляется у 95-98% взрослого населения. Герпетическая инфекция может приобретать крайне тяжелые формы, создавать благоприятную основу для внутриутробного инфицирования плода, если она протекает на фоне иммунодефицита, который характеризует беременность (Лавров В.Ф. и др., 2006; Маматказина P.P. и др., 2007). В период имплантации и раннего эмбриогенеза при негативном воздействии ВПГ возникает первичная плацентарная недостаточность, которая приводит к самопроизвольному прерыванию беременности, задержке внутриутробного развития плода (Нисевич Л Л. и др., 2007). Инфицирование плода в более поздние сроки не вызывает формирования грубых дефектов развития, тем не менее, в этих случаях может произойти нарушение функциональных механизмов дифференцировки клеток и тканей. Наличие активной герпес-вирусной инфекции у матери после 32 недель беременности приводит к инфицированию плода в 40-60% случаев. В это время регистрируется также развитие плацентарной недостаточности. Появляются нарушения функционального состояния плода, многочисленные органические изменения во всех отделах плаценты: развиваются патологические процессы в ее различных ферментных системах, изменения маточно-плаценгарно-плодового кровотока (Тютюнник В JI. и др., 2003; Вареница А.Н. и др., 2006; Башмакова Н.В. и др., 2007; Курманапиева З.Б., 2007; Haun L et al., 2007; Anzivino Eet al., 2009; Pinninti S.G. et al, 2010). Подобная ситуация привела к пересмотру взглядов на герпетическую инфекцию, и заставила признать ее роль в развитии различных акушерских и перинатальных патологических состояний.

Несмотря на значительное число научных исследований, полученные в них данные являются неполными, порой противоречивыми. Прежде всего, это касается этиопатогенетической роли ВПГ в развитии недостаточности фетоплаценгарной системы, практически всегда сопровождающейся нарушением гормонального баланса. На наш взгляд, недостаточно зарегистрировать изменения, происходящие в гормональном фоне, необходимо раскрыть причины найденного патологического состояния. Так как предшественником всех стероидных гормонов является холестерин, то было бы целесообразно проанализировать его содержание и обмен, включая исследование ферментов стероидогенеза, их регуляторов и коферменгов. Оценив доступную современную литературу, нами не было обнаружено исследований холестеринового метаболюма при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции, и работ, посвященных изучению факторов, приводящих к изменениям концентрации стероидов при инфекционных процессах у матери.

На основании вышеизложенного целью нашей работы являлось раскрытие основных закономерностей синтеза и превращения холестерина в плаценте при беременности, осложненной обострением герпес-вирус ной инфекции.

Задачи исследования

1. Оценить процессы синтеза холестерина в фетоплацентарной системе при нормально протекающей беременности и выявить их нарушения при гестации, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции.

2. Проанализировать влияние изменений холестеринового обмена на содержание стероидных гормонов при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекцией, в сравнении с физиологически протекающей гестацией.

3. Выявить процессы деградации холестерина и стероидогенеза в плаценте при беременности, осложненной обострением герпес-вирус ной инфекции.

4. Установить взаимосвязь изменений холестеринового обмена и ферментативного метаболизма путем определения гистохимической картины тканей плаценты.

5. Разработать модель, позволяющую рассмотреть изменения конформационной структуры стероидов в плацентарном барьере и отметить ее вариабельность в физиологических условиях и при поражении организма вирусной инфекцией.

Научная новю та и научная з начимость

Выявлена динамика изменения содержания холестерина в плаценте в зависимости от тяжести инфекционного процесса (герпес-вирусного) на различных этапах беременности, заключающаяся в том, что наибольшее уменьшение концентрации стероида было обнаружено при титре антител класса в к ВПГ 1:12800.

Установлено, что при изменении содержания холестерина снижается концентрация половых стероидных гормонов: прогестерона, дегидроэпиандростерона, эстриола, эстрадиола в периферической крови беременной и в плаценте во время обострения герпес-вирусной инфекции.

Изучены этапы биосинтеза холестерина в плаценте и получены гистохимические доказательства его нарушения при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности.

Обнаружено, что в нарушении биосинтеза холестерина в плаценте, возможно, важную роль играют изменения конформационной структуры молекул под влиянием токсических продуктов герпес-вирусной инфекции.

Новым является и нарушение адекватности регуляторных механизмов ферментативных реакций, участвующих в обмене холестерина в плаценте при обострении герпес-вирусной инфекции. На основании комплексной оценки гистохимических реакций, доказано изменение активности вторичных мессенджеров: гуанилатциклазы и аденилатциклазы, МЭ-сингазы, поставщиков коферменга НАДФ, а также источников свободных радикалов.

Разработаны новые модификации способов, позволяющих на гистохимическом уровне оценить в плаценте активность процесса биосинтеза холестерина на различных его этапах.

Практическая значимость работы

Результаты работы пополняют фундаментальные знания, позволяющие прогнозировать нарушения продукции основных стероидных гормонов, на основании изменения холестеринового метаболизма во время беременности, протекающей на фоне обострения герпес-вирусной инфекции.

Установленные закономерности изменения содержания холестерина при обострении герпес-вирусной инфекции, оказывающее влияние на синтез гормонов фетоплаценгарного комплекса (прогестерона, эстрадиола, эстриола, дегидроэпиандростерона и кортюола) могут служить основой для разработки эффективных методов прогнозирования и профилактики плацентарной недостаточности.

Полученные данные о закономерностях синтеза холестерина в плаценте позволяют спрогнозировать не только течение беременности, рост и развитие плода, но и сформировать представление о первых годах жизни ребенка.

Положения, выносимые на защиту

1. При обострении герпес-вирус ной инфекции уменьшается активность биосинтеза холестерина в плаценте в сопоставлении с физиологической беременностью, что доказывается гистохимической оценкой этапов образования холестерина.

2. В плаценте и в периферической крови на разных сроках осложненной обострением герпес-вирусной инфекции беременности происходят существенные сдвиги содержания стероидных гормонов: снижение концентрации прогестерона, дегвдроэпиандросерона, эстрогенов и повышение концентрации кортюола.

3. Нарушение биосинтеза холестерина в плаценте при активации герпес-вирусной инфекции оказывает прямое влияние на интенсивность процессов синтеза гормонов.

4. Изменение метаболизма холестерина в фетоплаценгарной системе при осложненной герпес-вирусной инфекцией беременности сопровождалось нарушением регуляторных процессов, таких как активность вторичных мессенджеров, источников свободных радикалов, поставщиков коферменга НАДФ.

5. Биосинтез холестерина в плаценте изменяется под воздействием лазерного облучения и при добавлении взвеси вируса герпеса в инкубационный раствор реакции на выявление ферменов, участвующих в данном процессе.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на областной конференции «Фетоплаценгарная система при герпесной инфекции» (Благовещенск, 2003); на П съезде врачей-пульмонологов Сибири и Дальнего Востока, сателлигном симпозиуме (Благовещенск, 2007); III Всероссийской научно-практическая конференция с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007); на VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); на Всероссийской научно-практической конференции "Здоровье девочки, девушки, женщины" (Томск, 2008); на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 55-летию образования ЧГМА «Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины» (Чита, 2008); на Научном симпозиуме «Механизмы формирования фетоплаценгарной недостаточности при вирусном повреждении организма беременных» (Благовещенск, 2008); на П Международной конференции «Ранние сроки беременности: проблемы, пути решения, перспективы» (Москва, 2009); на Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования» (Бразилия, 2009); на

Межведомственной научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы исследований в биологии» (Благовещенск, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 44 печатных работы, из них в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ - 19, монография - 1 (в соавторстве).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 273 страницах, состоит из введения, 10 глав собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 2 схемами, 41 рисунком и 15 таблицами.

Библиографический список включает 567 литературных источников: 227 отечественных и 340 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Все исследования проведены с учетом нормативных документов и одобрены Комитетом по биомедицинской этике ДНЦ ФПД СО РАМН.

Обследованы 273 беременные женщины в возрасте 17-35 лет. Все пациентки обследовались в динамике по триместрам беременности (10-12 недель, 19-24 недели, 26-34 недели). Проводилось лабораторные исследования периферической крови: липидный статус (общие липиды, ЛПВП, ЛПНП, триглицериды, общий холестерин), содержание гормонов (прогестерон, эстриол, эстрадиол, дегидроэпиандростеронсульфат, кортизол). После родоразрешения этих беременных были получены плаценты, в гомогенатах которых определяли содержание гормонов и холестерина.

Материалом для исследования послужили зрелые плаценты, взятые при родоразрешении в срок практически здоровых матерей (30 случаев -контрольная группа) и, перенесших обострение хронической герпес-вирусной инфекции I типа в третьем триместре беременности (78 случаев).

Аналогичные исследования проведены в 165 ворсинчатых хорионах, полученных при проведении медицинских абортов на сроке 5-10 недель у беременных с обострением герпеса (75 случаев) и не имевших такового (90 случаев). Исследования в I триместре проводилось в группах со сроком 5-7 недель, 6-8 недель и 9-10 недель беременности. В зависимости от срока и течения беременности, материал был разделен на группы: контрольную и с обострением хронической герпес-вирусной инфекции. Диагностическими критериями обострения хронической герпес-вирусной инфекции служили характерная клиническая картина заболевания с подтверждением методами клинико-лабораторного обследования. По значимым параметрам (возраст, акушерско-гинекологический анамнез, наличие других хронических соматических заболеваний) на момент обследования сравниваемые группы достоверно не различались.

Биохимические методы исследования В определении типоспецифических антител класса Мивк вирусу простого герпеса I иммуноферменгным методом использовали стандартные тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия) на аппарате спектрофотометр «БШ-Рах 2100» (США).

Для изучения липидного обмена выявляли следующие показатели: общие липиды (сульфофосфованильным реактивом); общий холестерин сыворотки и триглицериды с помощью коммерческих наборов «Новохол» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия); липопротевды высокой плотности посредством коммерческих наборов «ЛВП-Холестерин-Ново» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия); липопротеиды низкой плотности находили расчетным методом.

Исследование гормонов (прогестерон, эстриол, эстрадиол, дегидроэпиандростеронсульфат, кортизол) в периферической крови и плацентарном гомогенате проводили методом иммуноферменгного анализа, используя наборы ЗАО «Алкор Био» (Санкт-Петербург, Россия) на спектрофотометре «81а1-Рах 2100» (США).

Для приготовления гомогената плаценту забирали в течение 10-15 мин после родов. Плодовая часть плаценты срезалась скальпелем пластинками площадью 2-3 см и толщиной не более 1 мм. Кусочки ткани помещали в 200 мл физиологического раствора (ФР), отмывали от клеток крови, перемешивая 15 мин на магнитной мешалке. Для получения экстрактов, отмытые кусочки плаценты подсушивали, взвешивали, растирали пестиком в фарфоровой ступке и гомогенизировали до однородной кремообразной массы. К полученному гомогенату добавляли ФР в объеме, равном изначальному весу ткани. Взвесь помешали в пластиковые пробирки Falcon и замораживали при -20°С в течение суток. Затем гомогенат размораживали и центрифугировали при 4000 об/мин при температуре +4°С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°С до проведения ИФА.

Аналогичным способом готовили гомогенат и ворсинчатого хориона, который забирали в течение 10-15 мин после проведения медицинского аборта. Исследования ворсинчатых хорионов I триместра проводилось в группах со сроком 5-7 недель, 6-8 недель и 9-10 недель беременности.

Гистохимические методы исследования

Выявление ЗР-, За-, lip- и 17р-гидроксистероиддегидрогеназ производилось по методу с солями тетразолия прописи Z Lojda с соавт. (1982) в модификации лаборатории механизмов этиопатогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при H3JIДНЦ ФПД СО РАМН. Для определения локализации энзимов в качестве акцептора применялась соль тетразолия фирмы ICN Biomedicals (США) в конечной концентрации 5мМ. Как коферменг использовали НАДФ (Reanal, Венгрия) в конечной концентрации 1мМ. Инкубационный раствор готовился на основе 0,1М фосфатного буфера рН 7,4. Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывали дистиллированной водой, фиксировали в 10%-м нейтральном формалине и заключали в глицерин-желатин. Для исключения участия других факторов в восстановлении тетразолиевой соли проводили контрольные опыты.

Субстратом для выявления 17р-гидроксистероиддегидрогеназы являлся 2мМ раствор в диметилформамвде 5андростен-17р-ол-Зон (SERVA, Германия); для ЗР-гидроксистероидцегвдрогеназы - 2мМ растворы в диметилформамвде андростан-Зр-ол-17он (SERVA, Германия), Д5-прегнен-ЗР-ол-20-он (SERVA, Германия); для lip-гидроксистероиддегвдрогеназы (I типа) - 2мМ растворы в диметилформамвде 11 Р-кетоэтиохоланолона (SERVA, Германия) и 11-дегидрокортикостерона (SERVA, Германия); для 11 р-гидроксистероидцегвдрогеназы (П типа) - 2мМ растворы в диметилформамвде lip-гидроксютиохоланолона (SERVA, Германия), гидрокортизона (Хемофарм, Сербия); для

дегидроэпиандростерондегвдрогеназы - 2мМ раствор в диметилформамиде 5андростен-Зр-ол-17он (дегидроэпиандростерона) (SERVA, Германия); для За-гидроксистероиддегидрогеназы - 2мМ раствор в диметилформамиде 5Р-авдростан-3а-ол-17он (SERVA, Германия).

Выявление аденштатциклазы проводили по J.Reik et al. (1970) в модификации Б.Я. Рыжавского (1979) и лаборатории нейроэндокринной регуляции дыхательной системы ДНЦ ФПД СО РАМН. Метод выполнялся на криостатных срезах после фиксации 1% раствором глютаральдегвда на какодилатном буфере (рН 7,4). Инкубация продолжалась 30 минут при 37°С с последующей обработкой срезов 0,5% раствором сульфида натрия. Осадок сульфида свинда маркировал места локализации фермента. Заключение обычное.

Гистохимическое определение гуанилатциклазы основано на осаждении высвобождающегося пирофосфата при помощи ионов свинца по аналогии с методом Reik et al. (1970) в модификации Рыжавского (1979). Выявление фермента было адаптировано для анализа на световом микроскопе. Реакция проводилась на криостатных срезах после фиксации 1% раствором глютаральдегида на какодилатном буфере (рН 7,4). В качестве субстрата использовали литиевую соль гуанозинтрифосфатной кислоты фирмы ICN Biomedicals (США). Использовалась инкубационная

среда Вакстайна и Магоела с нитратом свинца в качестве реагента для осаждения фосфата. Инкубация продолжалась в течении 30 минут при 37°С с последующей обработкой срезов 0,5% раствором сульфида натрия. Специфичность выявления проверялась путем исключения субстрата из инкубационного раствора.

Для изучения работы НАДФ+-зависимой малатдегвдрогеназы был применен метод с солями тетразолия для определения дегвдрогеназ по прописи Z. Lojda (1965).

Для оценки работы пенгозофосфатного пути применялся метод с солями тетразолия для выявления глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы по прописи Z Lojda (1965).

Для оценки активности NO-сингазы был применен метод выявления ее маркера - НАДФН-диафоразы по G. Nacos и R. Gossrau (1994).

Для определения АТФаз клеточных мембран и митохондрий был применен метод Wachstein М„ Meisel Е (1957) в модификации Lojda Z, Gossrau R., Schiebler Т.Н. (1982).

Выявление перекисей жирных кислот происходило с помощью метода Винклера-Шульце (Р. Лилли, 1969).

Для анализа активности синтеза холестерина были разработаны гистохимические способы для определения активности превращений мевалоната, сквалена, 7а-дегидрохолестерина. Суть их базировалась на том, что окисление веществ в тканях происходит посредством включения промежуточных переносчиков водорода соответствующими ферментами при помощи кофакторов. Наш метод основан на восстановлении акцептора, в качестве которого использовался нигросиний тетразолий.

Изучалась активность преобразований 7а-дегидрохолестерина -производного холестерина, который является одним из его предшественников, на основе метода с солями тетразолия прописи, приведенной 3. Лойда, Р. Госсрау, Т. Шиблер (1982) был разработан способ гистохимического выявления 7а-дегидрохолестериндегидрогеназы. Для

определения локализации энзима в качестве акцептора применялась соль тетразолия фирмы ICN Biomedicals (США) в конечной концентрации 1 мг/мл. Субстратом реакции являлся 2 мМ раствор в диметилформамиде 7а-дегидрохолестерина фирмы SERVA, Германия. Как коферменг использовали НАДФ (Reanal, Венгрия) в концентрации 1 мг/мл. Инкубационный раствор готовился на основе 0,1 М фосфатного буфера рН 7,4. Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывали дистиллированной водой, фиксировали в 10%м нейтральном формалине и заключали в глицерин-желатин.

Оценку активности преобразований мевалоната и сквалена проводили полностью аналогичным способом. В качестве субстрата использовали 0,1 М раствор мевалоната фирмы ICN Biomedicals (США) и 2 мМ раствор сквалена фирмы Ferak (Германия), соответственно.

Для исключения участия других факторов в восстановлении тетразолиевой соли мы проводили контрольные опыты.

В своей работе мы поставили цель - разработать модель, позволяющую экспериментально проанализировать изменения конформационной структуры макромолекул в плацентарном барьере и отметить ее вариабельность при поражении вирусной инфекцией. Для определения роли конформационных изменений в активности ферментативной реакции были проведены следующие опыты. Фактором, способным изменять конформационное состояние макромолекул, является лазерное излучение. Оно инициирует колебательно-возбужденное состояние макромолекул, в результате чего меняется их конформация (Leshenyuk N.S., 2007; Weiss S., 1999). Действие стероидов тесно связано с их химической структурой. Считается, что даже незначительные вариации в структуре стеранового скелета и функциональных заместителей приводят к существенному изменению биологической активности молекул, то есть процессов транспорта, ассоциации со специфическими рецепторами, ферментативной трансформации (Сергеев П.В., 1984). Для наглядной демонстрации того, как

изменение структуры макромолекулы отражается на ее ферментативной активности, нами были выполнены эксперименты с предварительной обработкой субстрата лазерным излучением.

Мы воздействовали на инкубационный раствор, содержащий субстрат гистохимической реакции для выявления ферментов обмена холестерина -дегидрогеназ, лучами лазера. Лазерное облучение проводилось с помощью гелий-неонового лазера 1А-2, с длиной волны 633 нм. Выходная мощность на световоде 4-6 мВт. Время облучения - 30 секунд. После чего проводились гистохимические реакции на выявление дегвдрогеназы, специфичной к искомому соединению по приведенной выше прописи Лойда 3. (1982). Мы провели подобные опыты с использованием следующих субстратов: 5<х-холестан и 0-стерол (для общего изучения влияния лазерного излучения на активность стероиддегидрогеназных реакций); 7а-дегидрохолестерин, сквален, мевалонат (для оценки непосредственно процессов синтеза холестерина). Для контроля параллельно выполняли обыкновенные гистохимические реакции с теми же субстратами.

Нами было предположено, что и активация инфекционного процесса может действовать на макромолекулы, изменяя именно их конформацию. Для того чтобы проверить это предположение и показать непосредственное воздействие инфекционного начала на активность гистохимической реакции были проведены опыты, в которых в инкубационную среду добавляли содержимое герпетических везикул, взятое при обострении хронической герпес-вирусной инфекции I типа (титр антител класса к вирусу простого герпеса I- 1:12800), в количестве 0,1 мл на 1 мл раствора. После того, как между компонентами произошло взаимодействие, проводилось гистохимическое выявление искомой дегидрогеназы по описанной выше схеме. Все опыты проходили одновременно с контролем, в качестве которого служили обычные гистохимические определения тех же самых дегидрогеназ (без какого-либо дополнительного воздействия).

Все гистохимические препараты обрабатывались на персональном компьютере. Количество образующихся продуктов реакции определяли путем подсчета на постоянном размере изображения (10x6) по программе компьютерной цитофотометрии методом измерения на стандартную единицу площади 0,1 (зонд) в 100 различных точках объекта.

Статистические методы исследования Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов вариационной статистики с оценкой достоверности различий по критерию Стъюденга (1). Принимались во внимание уровни значимости (р) 0,05; 0,01; 0,001. Различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Содержание холестерина у беременных при обострении герпес-вирусной

инфекции

Количество холестерина в периферической крови женщин контрольной группы увеличивалось по мере нарастания срока беременности с 5,61±0,11 ммоль/л в первом триместре до 6,78±0,13 ммоль/л во втором и 7,79±0,12 ммоль/л в третьем, что является физиологически целесообразным, так как нуждаемость в холестерине и продуктах его метаболизма растет с течением гравидарного периода. Обострение герпес-вирусной инфекции оказывало влияние на содержание холестерина в периферической крови, достоверно снижая его концентрацию. Наиболее значительные изменения были отмечены при титре антител класса к вирусу простого герпеса 1:12800. Так в первом триместре количество данного стероида достоверно понизилось на 11% по сравнению с контрольной группой, во втором триместре на 14% и в третьем триместре на 19%

Содержание холестерина определяли непосредственно, в самом органе, в котором происходит основной процесс стероидогенеза во время беременности. При обострении герпес-вирусной инфекции наблюдалось достоверное снижение количества холестерина в гомогенате плаценты в период I триместра беременности. Обнаружена зависимость выявленных

нарушений от активности инфекционного процесса. Так при тигре антител класса IgG к вирусу простого герпеса 1:3200 количество стероида в гомогенате ворсинчатых хорионов при 9-10 недельном сроке развития уменьшилось на 38% по сравнению с контролем, в котором оно составляло 3,14±0,091 ммоль/л, при тигре антител 1:6400 - уже более чем на 50% В гомогенате зрелых плацент при тигре антител класса IgG к вирусу простого герпеса 1:3200 количество стероида уменьшилось на 25% по сравнению с контрольной группой (2,65±0,113 ммоль/л), тогда как при тигре 1:12800 концентрация холестерина снижалась уже более чем на 60%

По нашему мнению, снижение количества холестерина при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции, вызвано нарушением процесса его синтеза. Еще одной из причин патологии могло стать снижение количества эстрогенов и плацентарного лакгогенного гормона, которые контролируют данный процесс. Последнее могло привести к состоянию так называемого «порочного круга», когда пониженная продукция холестерина сопровождалась уменьшением образования стероидного гормона, малая концентрация которого была не способна регулировать синтез предшественника.

Исследования последних лет свидетельствуют о том, что пониженный уровень холестерина в период гестации оказывает негативные последствия для здоровья плода. По данным зарубежных исследователей низкая концентрация данного стероида приводит к преждевременным родам, а также к малому весу новорожденного (Muenke М., 2004; Edison RJ.et al., 2007; Mac Dougall R., 2007).

Было обнаружено, что снижение количества холестерина происходило не в связи с его переходом в ЛПВП, так как их содержание в периферической крови при осложненной герпесом беременности практически не отличалось от показателей контрольной группы.

Наиболее выраженные изменения содержания ЛПНП, которые считаются ответственными за поступление холестерина в ткани, были

отмечены при вспышке вирусной инфекции в III триместре гестации, сопровождающейся тигром антител класса IgG к вирусу простого герпеса 1:12800 - на 15% до 3,39±0,03 ммоль/л (контрольная группа - 4,01±0,06 ммоль/л). В I триместре количество липопротеидов данного вида при том же тигре антител статистически достоверно уменьшилось до 2,85±0,08 ммоль/л (контрольная группа - 3,09±0,02 ммоль/л), во П триместре - до 3,30±0,09 ммоль/л (контрольная группа — 3,85±0,07 ммоль/л). Снижение их количества, вероятно, может иметь последствия для нормального роста и развития плода, так как они не будут способны в достаточной мере обеспечивать транспорт холестерина.

Изменение содержания гормонов при герпес-вирусной инфекции во время беременности

Исследование содержания прогестерона в периферической крови беременных показало достоверное его снижение по сравнению с показателями контрольной группы (при титре антител класса IgG к вирусу простого герпеса 1:12800) в I триместре на 23% (в контрольной группе -181,3±15,71 нмоль/л), во П триместре - на 25% (в контрольной группе -212,7±9,02 нмоль/л). Опаснее всего при данном тигре антител (по нашим данным) ситуация сложилась в Ш триместре беременности - 133,1±12,75 нмоль/л (в контрольной группе -254,9±13,11 нмоль/л). Снижение количества прогестерона в крови женщины уже наблюдалось разными исследователями при острых респираторных вирусных инфекциях (Луценко М.Т. и др., 2000; Ярославский В.К., 1989) и практически всегда при хронической плацентарной недостаточности различного генеза (Пустотина O.A., 2006; Савельева Г.М. и др., 1991; Рец Ю.В. 2008; Azenabor A.A.et al., 2007). Исследований же прогестерона в плаценте (гомогенат) при обострении герпеса в доступной нам литературе практически не было обнаружено. При сроке гестации 5-6 недель содержание прогестерона при тигре антител класса IgG к вирусу простого герпеса 1:12800 в гомогенате ворсинчатого хориона достоверно сократилось до 23,4±5,71 нмоль/л (в контрольной группе -

152,2±38,92 нмоль/л), при сроке 7-8 недель - до 32,9±4,11 нмоль/л (в контрольной группе - 160,0±21,13 нмоль/л и при сроке 9-10 недель -48,3±4,33 нмоль/л, более чем в 3 раза по сопоставлению с показателями контрольной группы 171,2±22,16 нмоль/л, что создавало большую опасность для беременности. Данная тенденция сохранялась при оценке количества гормона в гомогенате зрелой плаценты, взятой при родах в срок от матерей, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности, где также было установлено достоверное снижение прогестерона при тигре антител класса IgG 1:12800 на 25% в центральной зоне и на 20% в периферической зоне этого органа (в контрольной группе - 240,5±9,05 нмоль/л и 176,6±5,66 нмоль/л, соответственно). То есть более серьезное воздействие герпес-вирусной инфекции на концентрацию данного гормона сказалось в центральной области плаценты.

Продукция прогестерона в начале гестации настолько важна, что ее недостаток часто приводит к десинхронгоации развития эндометрия и является в большинстве случаев основной причиной преждевременного прерывания беременности. Ввиду того, что уровень гормона недостаточен для поддержания функции плаценты, обеспечения гомеостаза эндометрия и миометрия, а также иммунной толерантности организма беременной, то уменьшение количества стероидного гормона во время осложненной герпесом беременности могло иметь самые серьезные последствия. Нарушение перечисленных функций вследствие снижения уровня прогестерона, особенно в ранние сроки беременности, значительно увеличивает риск ее прерывания и создает предпосылки для развития плацентарной недостаточности (Доброхотова Ю.Э., 2008; Пустотина O.A., 2006; Nygren K.G. etal., 1973; WietierM., 1971).

Рассматривая факторы, которые могли привести к столь значительным нарушениям прогестеронового содержания, было отмечено, что прогестероногенез ш холестерина идет при последовательном действии двух плацентарных ферментов P450scc и 3 ß -г ид ро кс исте роиддегидрогеназы

(Payne A.H., Hales D.B., 2004). Мы проанализировали активность Зр-гидроксистероиддегидрогеназы в плаценте от женщин, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности, и обнаружили убедительные, подтвержденные цигофотометрической оценкой, свидетельства низкой интенсивности работы данного энзима по сравнению с контрольной группой, как в ворсинчатых хорионах первого триместра развития (цигофотометрическая оценка - 1,97± 0,078 усл. ед. на сроке 9-10 недель при тигре антител класса IgG к вирусу простого герпеса (контроль -4,90 ± 0,091 усл. ед.)), так и в зрелой плаценте (2,56± 0,067 усл.ед. (контроль - 7,23±0,098 усл. ед.)). Мы полагаем, что снижение активности стеровдогенеза в плаценте становилось причиной уменьшения количества прогестерона при осложненной герпесом беременности.

Следующим моментом, который мог привести к низкому содержанию прогестерона, могло быть нарушение регуляторных процессов. Считается, что образование прогестерона в плаценте регулируется белковыми гормонами, действующими через - цАМФ. Ферментом, отвечающим за образование этого нуклеотвда, является аденилатциклаза. Гистохимическая картина позволила прийти к выводу, что присутствие вирусной инфекции уменьшало интенсивность работы АЦ в ворсинах зрелой плаценты до 3,10±0,25 усл. ед. (при тигре антител класса IgG к вирусу простого герпеса 1:12800) (цигофотометрическая оценка в контрольной группе - 6,59±0,21 усл. ед.). Это становилось причиной низкого содержания в цитоплазме цАМФ, что по нашему мнению являлось фактором, влияющим на снижение процесса стеровдогенеза. Кроме этого, данное нарушение могло иметь и другие негативные последствия, так как цАМФ выступает в качестве основного проводника взаимодействия структурно-функциональной системы живых клеток с внешней средой.

В прогестероновом метаболизме задействована и За-гцдроксистероидегвдрогеназа. При обострении герпеснвирусной инфекции цитофотометрически интенсивность работы За-

гиароксистероидцегидрогеназы гадала (например, на сроке 9-10 недель гестации при тигре антител класса к вирусу простого герпеса 1:12800 до 1,97±0,089 усл. ед. (цигофотометрическая оценка в контрольной группе -4,01±0,676 усл.ед.)). Мы связываем это со снижением концентрации субстрата при осложненной беременности. Выявленный факт наряду с полученными нами раннее данными еще раз показал, что при обострении герпес-вирусной инфекции во время гестации происходило снижение активности стероидогенеза.

Синтез эстрогенов в фетоплаце тарной системе в качестве обязательного промежуточного соединения подразумевает образование одного из андрогенов - дегидроэпиандростерона. Во время обострения герпес-вирус ной инфекции отмечалось достоверное снижение содержания данного стероидного гормона в периферической крови беременной по сравнению с показателями контрольной группы (при регистрации тигра антител класса 1:12800 в первом триместре гестации его количество снизилось на 38% (в контрольной группе - 12,2±0,82 мкмапь/л), во втором и третьем триместрах - на 40% (в контрольной группе - 13,3±0,87 мкмоль/л и 8,9±0,98 мкмоль/л, соответственно)). Низкий уровень дегидроэпиандростерона, несомненно, скажется на тех процессах, в которых этот гормон задействован. Во-первых, уменьшение концентрации дегидроэпиандростерона приводит к нарушению процесса гормонообразования. Во-вторых, дегвдроэпиандростерон участвует в регуляции различных звеньев репродуктивной системы. Кроме этого, данный гормон обладает широким спектром общеметаболических свойств. Для более точной оценки процессов гормонообразования, в данном случае -эстрогенов, мы посчитали необходимым провести изучение содержания дегидроэпиандростерона в плацентарном гомогенате. В доступной нам литературе, мы не обнаружили каких-либо подобных исследований, проводимых в гомогенате ворсинчатых хорионов и плаценты. При обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности количество

дегидроэпиандростерона в гомогенате плаценты существенно менялось. Содержание этого соединения уменьшалось (при титре антител класса ^О к вирусу простого герпеса 1:12800) в 2 раза как в том случае, если обострение вирусного процесса происходило в первом триместре беременности, так и в последующие периоды внутриутробного развития. Концентрация дегидроэпиандростерона уменьшалась до 1,01± 0,072 мкмоль/л на сроке 6-8 недель беременности (в контроле - 2,09 ± 0,091 мкмоль/л); до 1,17 ± 0,021 мкмоль/л на сроке 9-10 недель (в контроле - 2,25 ± 0,066 мкмсшь/л); до 0,70 ± 0,020 мкмоль/л в зрелой плаценте, взятой при родах в срок (в контроле -1,40 ± 0,033 мкмоль/л).

Чтобы оценить непосредственно сам процесс образования эстрогенов, мы провели гистохимические реакции на выявление фермента, участвующего в преобразовании данного гормона в плаценте и ворсинчатых хорионах. На данной стадии действует дегвдроэпиандростерондегидрогеназа - она относится к группе ЗР-гидроксистероиддегвдрогеназ. Активность гистохимической реакции на дегидроэпиандростерондегидрогеназу в синцигио- и циготрофобласте хориальных и плацентарных ворсинок в таких случаях была снижена, что было доказано при цигофотометрическом измерении (например, при сроке 9-10 недель 2,29±0,367 усл. ед. (цигофотометрический показатель в контрольной группе - 4,29±0,358 усл. ед.)). Подавление интенсивности данной реакции свидетельствовало о нарушении биосинтеза эстрогенов щ дегидроэпиандростерона.

Изменение же уровня эстрогенов считается одним из факторов развития плацентарной недостаточности. Эстрогены выполняют ведущую роль в формировании и развитии беременности. Они обеспечивают рост, созревание и овуляцию яйцеклетки, участвуют в регуляции биосинтеза прогестерона, оказывают выраженное воздействие на иммунокомпетенгные клетки, повышают уровень маточно-плаценгарного кровотока и объем циркулирующей крови, подготавливают организм беременной к родам.

Мы проанализировали содержание эстриола — основного эстрогена фетоплаценгарного комплекса. Его количество значительно уменьшалось при обострении герпес-вирусной инфекции. Следует отметить, что, как и в случае с прогестероном, наблюдалась прямая зависимость от степени активности герпес-вирусной инфекции, и при тигре антител к вирусу простого герпеса класса 1:12800 определялось наиболее резкое падение содержания гормона, особенно существенное в I триместре - на 32% (в контрольной группе - 37,6±4,31 нмоль/л). Во втором и третьем триместрах изменения были не столь серьезными: показатели снизились на 14% по сравнению с контрольной группой, в которой они составляли 48,6±1,91 нмоль/л и 53,9±3,30 нмоль/л, соответственно. При обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности содержание женских половых гормонов в гомогенате ворсинчатого хориона и зрелых плацент беременности резко изменялось. Так, например, при сроке гестации 5-6 недель (при тигре антител класса к вирусу простого герпеса 1:12800) концентрация эстриола уменьшилась - до 3,9±0,91 нмоль/л (в контрольной группе - 31,2±0,95 нмоль/л). На 7-8 и 9-10 недельной стадиях развития количество гормона снизилось до 14,6±1,19 и 20,9±2,12 нмоль/л (в контрольной группе - 52,3±1,15 и 69,1±3,48 нмоль/л, соответственно).

В гомогенате центральной зоны плаценты содержание эстриола (при тигре антител класса к вирусу простого герпеса 1:12800) уменьшилось на 30% (в контрольной группе - 251,1±9,02 нмоль/л, в периферической зоне - на 17% (в контрольной группе - 198,6±7,89 нмоль/л). Таким образом, наиболее сильное влияние герпес-вирусной инфекции на данный гормон отмечалось в центральной зоне плаценты.

Выявленный факт свидетельствовал о том, что вспышка герпес-вирусной инфекции в самом начале гестации приводила к самым серьезным последствиям и могла поставить под вопрос дальнейшее развитие беременности. Достаточное количество данного гормона необходимо для поддержания гравидарного гомеостаза. Эстриол является наиболее

деятельным протектором роста матки. Недостаток его синтеза вызывает угрозу прерывания в первой половине беременности и угрозу преждевременных родов — во второй (Nygren К.в. е1 а1., 1973; Еаз(егПг^ W.E, 1970).

Следующим эстрогеном, на котором мы остановили свое внимание, был эстрадиол. Гормон способствует развитию комплекса биохимических изменений, обеспечивающих миометрий пластическим материалом и энергетическими ресурсами. Обострение герпес-вирусной инфекции повлияло на содержание эстрадиола, точно таким же образом, что и на остальные половые гормоны. Его количество уменьшалось как в периферической крови матери, так и в гомогенате плаценты. В первом триместре при титре антител к вирусу простого герпеса класса О 1:12800 произошло его снижение в периферической крови матери приблизительно на 5%, во втором триместре - на 16%, в третьем - на 40% по сравнению с контрольной группой, в которой оно составляло 29065,1± 147,29 пмоль/л; 29789,2± 167,43 пмоль/л; 31958,5±185,13 пмоль/л, соответственно. Данному факту, на наш взгляд, можно дать следующее объяснение. Принимая во внимание то обстоятельство, что на начальных этапах беременности еще малая часть эстрогенов синтезируется плацентой, а большая - организмом матери (в яичниках), можно прийти к заключению, что вспышка герпес-вирусной инфекции затрагивала процесс стероидогенеза в основном в провизорном органе, и на содержании эстрадиола в периферической крови женщины это отразилось в меньшой степени. К этому выводу же позволяло подойти и значительное снижение количества Е2 в гомогенате ворсинчатых хорионов, полученных в первом триместре гестации. На 5-6 недельной стадии развития концентрация гормона сократилась до 11145,3±231,01 пмоль/л (в контрольной группе - 21811,0±129,54 пмоль/л), на 7-8 и 9-10 недельных стадиях - до 13415,8±148,33 пмоль/л и 15567,2± 106,67 пмоль/л, соответственно (в контрольной группе - 24181,3±134,45 пмоль/л и 26002,2±102,37пмоль/л, соответственно).

Снижение количества эстрадиола кроме всего прочего ведет и к неполноценной продукции прогестерона (Сидельникова В.В., 2002). То есть на секреции прогестерона, по все видимости, отразилось не только уменьшение количества его предшественника - холестерина, но еще и нарушение контроля со стороны женских половых гормонов. Установлено, что понижение уровня эстрадиола определяется при угрозе прерывания беременности и нарушении состояния плода.

Падение концентрации гормона могло свидетельствовать о нарушении синтетических процессов в данном органе. Для получения доказательства этого, было решено подвергнуть рассмотрению ферментативную активность биосинтеза эстрогенов. Для ее оценки мы проаналшировали работу 17Р-гцдроксистеровддегидрогеназы. В наших исследованиях было выявлено снижение интенсивности работы данного фермента при осложненной беременности, что было доказано при цигофотометрическом измерении (например, при тигре антител к вирусу простого герпеса класса О 1:12800 на сроке 9-10 недель - до 2,29±0,367 усл. ед. (цитофотометрическая оценка в контрольной группе - 4,29±0,358 усл. ед.)).

Перейдем к рассмотрению причин, которые способствовали возникновению нарушения эстрогеновой продукции. На наш взгляд, основным фактором является выявленное нами снижение количества их предшественников: первоначального - холестерина и непосредственного -дегидроэпиандростерона.

Кроме этого, к уменьшению интенсивности работы фермента, отвечающего за синтез женских половых стероидных гормонов, привели, по нашему мнению, изменения в процессе регуляции. Контролируется работа стероидцегидрогеназ в плаценте, в том числе и 17Р-гвдроксистероиддегидрогеназы, хорионическим гонадотропином и хорионическим лютеингоирующим гормоном. Действуют они через протеинкиназу А, запускаемую цАМФ. При обострении герпес-вирусной

инфекции нами было выявлено снижение активности АД, которое способствовало потере адекватного контроля процесса стероидогенеза.

Следующим аспектом, важным для биосинтеза эстрогенов является достаточная концентрация обязательного коферменга - НАДФ/НАД (Адапуа1 А.К. й а1„ 2005). Никотинамидаденицдинуклеотвдфосфат синтезируется в процессе пенгозофосфатного пути и за счет фермента НАДФ+-зависимой малатдегвдрогеназы.

Работу пенгозофосфатного шунта принято оценивать по активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Проведенное нами изучение интенсивности работы вышеназванного энзима показало, что при обострении герпес-вирус ной инфекции, активность фермента снижалась в зрелой плаценте до 2,50±0,04 усл. ед. (цигофотометрическая оценка в контрольной группе - 4,8±0,06 усл. ед.). Инактивируется активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы повышенным количеством свободных радикалов (Господарьов Д.В. 1 др., 2005). Нами было отмечено, что при обострении герпес-вирус ной инфекции, в плаценте наблюдается повышение активности ЫО-сикгазы, а также увеличение содержания перекисей жирных кислот. Мы считаем, что выявленные факты стали одной из причин угнетения работы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

Другим поставщиком необходимого коферменга является малатдегидрогеназа. В плаценте при обострении герпес-вирусной инфекции, было выявлено цитофотометрически доказанное уменьшение активности этого энзима до 1,1±0,03 усл. ед. (при тигре антител к вирусу простого герпеса класса в 1:12800) по сравнению с контрольной группой, в которой цитофотометрическая оценка составляла 2,б±0,08 усл. ед.. Полученные данные говорили о падении концентрации одного из важнейших коферменгов - НАДФ+, что, по нашему мнению, нашло отражение в биосинтезе стероидных гормонов, активность которого в наших исследованиях снижалась.

Вспышка герпес-вирусной инфекции во время гестации приводила к значительным изменениям содержания гормона фетоплаценгарного комплекса - кортгаола. Его количество возросло как в периферической крови матери, так и в гомогетте плаценты. В сыворотке женщин наибольший рост гомона был отмечен в первую половину беременности, причем выявлялась четкая зависимость нарушений от выраженности герпес-вирусного процесса, и наиболее резкое увеличение концентрации произошло при регистрации титра антител к вирусу простого герпеса 1:12800. Количество гормона в I триместре возросло до 756,8±38,67 нмоль/л, во II-до 976,4±45,56 нмоль/л, в III - до 1154,8±48,87 нмоль/л (в контрольной группе - 454,2±29,33 нмоль/л, 542,3±51,12 нмоль/л, 868,0±42,90 нмоль/л, соответственно). При изучении гомогенатов плаценты была отмечена еще более серьезная ситуация. Содержание коргизола при обострении герпес-вирусной инфекции в гомогенате ворсинчатых хорионов выросло более чем в два раза (при тигре антител класса к вирусу простого герпеса 1:12800 в 6-8 недель беременности - 439,6±19,80 нмоль/л, контрольная группа - 154,8±10,67 нмоль/л; в 9-10 недель - 468,7± 13,75 нмоль/л, контрольная группа -161,7±11,85 нмоль/л) в гомогенате зрелых плацент - более чем в полтора раза (при том же тигре антител 1:12800 - 639,2± 12,70 нмоль/л по сравнению с контрольной группой - 395,3±15,12 нмоль/л). То есть первый триместр беременности оказался самым уязвимым к действию герпеса.

Вызывает удивление отсутствие в мировой медицинской литературе рекомендаций по контролю содержания кортизола во время беременности, в отличие от прогестерона и эстрогенов. Мы полагаем, что такой контроль необходим, так как повышение концентрации кортизола будет оказывать многостороннее отрицательное воздействие на течение беременности и способствовать развитию обстановки, неблагоприятной для плода. Рассмотрим подробнее данный аспект. Во-первых, высокие значения показателей содержания гормона, предполагают увеличение его продукции, что в свою очередь подразумевает смещение расхода прекурсоров

стероидогенеза (Wirth ММ. et al., 2006). В ситуации, когда при обострении герпес-вирусной инфекции было выявлено уменьшение количества гормонообразовательной базы - холестерина, вышеупомянутое перераспределение становится опасным для беременности.

Особенно внушает опасение увеличение концентрации кортшола непосредственно в самой плаценте. В последние годы целым рядом зарубежных ученых установлено, что повышенное количество кортизола, проникающее через плаценту, способно вызвать развитие патологий, которые могут проявиться в детском и подростковом возрасте (Alexander В.Т., 2006; Dodic М. et al., 1999; Moritz KM. et al., 2002). В них было доказано, что воздействие высокой концентрации глюкокортикоидов во время беременности может замедлять рост и развитие плода и перенастраивать состояние функциональной системы гиппокамп-гипоталамус-гипофиз-надпочечники. Для объяснения развития таких нарушений были выдвинуты потенциальные механизмы так называемого "программирования плода".

Основным барьером для проникновения большого количества кортизола к плоду является работа фермента llß-гвдроксистероиддегидрогеназы П типа в плаценте (Burton PJ.et al., 1999; Dodic M. et al., 1999; 2002; Myatt L., 2006; Moritz K.M. et al., 2002; Yang K., 1997). При физиологическом течении гестации этот энзим превращает 95% кортшола в неактивный кортизон, предохраняя плод от воздействия высоких концентраций кортикостероидов.

В плацентах и ворсинчатых хорионах от женщин, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции наблюдалось снижение активности llß-гидроксистероиддегндрогеназы П типа по сравнению с контрольной группой. Так при регистрации тигра антител к вирусу простого герпеса класса G 1:12800 цигофотометрический показатель уменьшился до 1,88±0,095 усл. ед. на сроке 9-10 недель (цигофотометрическая оценка в

контрольной группе - 4,51±0,077 усл. ед.) н до 3,18±0,046 усл. ед. в зрелой плаценте (контрольная группа - 6,79±0,051 усл. ед.).

Таким образом, изучение активности данного эшима в плаценте необходимо, особенно в тех случаях, когда гестация сопровождалась увеличением содержания кортизола в крови матери. Такое исследование позволит предсказать, подвергался ли новорожденный во время внутриутробного развития влиянию большого количества глкжокортиковдов и спрогнозировать развитие патологий в будущей жизни.

Остановимся на том, что могло привести к нарушению работы фермента, инактивирующего кортизол. В регуляции деятельности llß-гидроксистероиддегидрогеназы П типа участвует оксид азота (Sun К., Yang К., 1997). Мы оценили интенсивность работы NO-сиотазы и обнаружили резкое увеличение ее активности до 6,4±0,07 усл. ед. при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности по сравнению с контрольной группой (цитофотометрическая оценка - 2,9±0,08 усл. ед.). Такая высокая концентрация N0 будет приводить к ингибированию активности llß-гвдроксистероиддегидрогеназы П типа, и, следственно, к повышению количества активных глюкокортикоидов.

Следующим фактором, участвующим в регуляции работы llß-гвдроксистероиддегидрогеназы П типа является цГМФ. Была произведена оценка работы эшима, катализирующего его образование - гуанилатциклазы. В ворсинчатых хорионах и плацентах, полученных от беременных с обострением герпес-вирусной инфекции, была выявлена высокая активность фермента, ответственного за накопление данного вторичного мессенджера в клетках (при тигре антител к вирусу простого герпеса класса G 1:12800 цитофотометрическая оценка составила 4,9±0,09 усл. ед. (контрольная группа - 1,8±0,04 усл. ед.)). Наши результаты позволяли прийти к выводу о том, что увеличение интенсивности продукции цГМФ ингибировало активность llß-гвдроксистеровдцегидрогеназы П типа, тем самым, повышая количество кортизола.

Для выяснения следующей причины повышенного содержания стероидного гормона в гомогенате плаценты мы оценили интенсивность работы другого энзима, участвующего в обмене кортикостероидов. В плаценте 11р-гидроксистероиддегидрогеназой I типа катализируется обратная реакция - образование кортизола из неактивной кето-формы предшественника. Было обнаружено цитофогометрически доказанное увеличение активности 11Р-гидроксистероиддегидрогеназы I типа по сравнению с контрольной группой. Например, при регистрации тигра антител к вирусу простого герпеса класса в 1:12800 интенсивность гистохимической реакции повысилась до 4,99±0,101 усл. ед. на сроке 9-10 недель (контрольная группа - 3,02±0,098 усл. ед.) и до 6,68± 0,057 усл. ед. в зрелой плаценте, взятой при родах в срок (контрольная группа - 5,21±0,089 усл. ед.). Усиление работы данного фермента в плаценте и стало, по нашему мнению, еще одной причиной повышения продукции стероидного гормона.

Кроме нарушения работы энзимов, отвечающих за метаболизм кортизола, вероятны и другие причины столь значительного увеличения содержания кортизола. Среди соединений, о которых известно, что они способны влиять на соотношение кортикостероидов, упоминается дегвдроэпиандростерон. По данным литературы он способствует образованию неактивных кето-форм (Обут Т.А. и др., 2004). Содержание дегидроэпиандростерона при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности, как мы выявили, уменьшалось. Мы считаем, что снижение концентрации дегидроэпиандростеронатакже являлось причиной увеличения количества кортизола.

Кроме этого, оценка этих двух гормонов может дать еще один результат. По мнению ряда ученых (НесЫег О. е! а1., 1997; Огг&а Н., е( а1., 1990) соотношение дегидроэпиандростерон/кортизол характеризует устойчивость организма к различным нарушениям. При обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности, это соотношение существенно уменьшалось. Падение резистентности, о котором свидетельствовало

уменьшение отношения дег идроэ пиандросте рон/кортиз ол, способствует повышению риска для беременности. В частности, может повыситься восприимчивость к другим инфекциям, либо развиться уже имеющаяся хроническая патология.

Итак, мы получили доказательства снижения интенсивности образования половых стероидных гормонов при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности. Об этом свидетельствовало как уменьшение количества самих гормонов в плазме периферической крови и гомогенате плаценты, так и подавление активности ферментов, отвечающих за их образование. Основным фактором вышеупомянутого патологического явления, как уже неоднократно упоминалось, на наш взгляд, является снижение количества холестерина во время беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции. Предстояло сделать следующий логический шаг и выявить обстоятельства, которые способствовали появлению этого недостатка. Мы посчитали целесообразным проанализировать процесс синтеза холестерина при беременности, протекающей на фоне обострения герпес-вирусной инфекции.

Синтез холестерина при герпес-вирусной инфекции во время беременности

Первым этапом холестериногенеза, на котором мы остановили свое внимание, стало образование мевалоната. Обнаруженная четкая локализация фермента, маркирующего преобразование мевалоната, в хориальном синцигиотрофобласте и циготрофоблаете доказывала наличие данной стадии синтеза холестерина в плаценте. Присутствие этой стадии холестериногенеза в данном органе было доказано практически всеми исследователями, занимающимися данной проблемой на биохимическом уровне.

При обострении герпес-вирусной инфекции обнаружено снижение количества продукта гистохимической реакции, что указывало на низкую активность преобразований мевалоновой кислоты. Цигофотометрический показатель на сроке 9-10 недель беременности уменьшился до 0,73±0,001

усл. ед. (контрольная группа - 2,45±0,030 усл. ед.), в зрелой плаценте (39-40 недель при тигре антител к вирусу герпеса 1:12800) интенсивность реакции уменьшилась до 2,34±0,07 усл.ед. (контрольная группа - 4,67±0,07 усл. ед.). Данный факт свидетельствовал о том, что влияние инфекционного процесса сказывалось уже на самых ранних этапах синтеза холестерина.

Следующий этап холестериногенеза - образование сквалена. Стадия образования сквалена в синцитиотрофобласте плаценты в наших исследованиях выявлена совершенно точно, что совпадает с данными других ученых, несмотря на то, что, по их мнению, синтез холестерина в ней идет не до конца (Telegdy О.ДУеекз 1ЛУ., 1970). При обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности были отмечены доказанные цитофотометрически изменения, находящиеся в зависимости от степени выраженности инфекционного процесса, которую мы определяли по величине тигра антител к вирусу простого герпеса. При регистрации повышения тигров антител к вирусу простого герпеса до 1:12800 цитофотометрическая оценка интенсивности гистохимической реакции на сквалевдегвдрогеназу на ранних сроках беременности снизилась до 0,94±0,004 усл.ед. на сроке 9-10 недель (контрольная группа - 2,31±0,003 усл.ед.), а в зрелой плаценте - до 2,07± 0,013 усл. ед. (контрольная группа -3,81±0,015 усл. ед.). Объяснением данной патологии, по-нашему мнению, является падение содержания прекурсоров для образования сквалена, а, следовательно, и холестерина.

Последним этапом холестериногенеза является превращение сквалена в ланостерин, который уже имеет в своем составе тетрациклическое ядро, и, непосредственно, в сам холестерин. Примечательно, что до сих пор не выявлен окончательный путь реакций преобразования ланостерина в холестерин и не идентифицированы ферменты, в нем участвующие. В различных источниках либо представлено несколько версий данного этапа, либо просто указывается общая схема. Наиболее вероятным считается путь через 7а-дегидрохолестерин. Активность преобразований 7а-

дегцдрохолестерина выявлялась в ворсинчатых хорионах контрольной группы, начиная с конца первого месяца беременности, в синцитиотрофоблаете и циготрофобласте ворсин. Цигофотометрическая оценка в ворсинчатых хорионах и плацентах женщин, перенесших обострение герпеса, показала уменьшение интенсивности гистохимической реакции на 7а-дегидрохолестерицдегидрогеназу до 0,93±0,013 усл. ед. на сроке 9-10 недель беременности (контрольная группа - 1,88±0,011 усл. ед.), в зрелой плаценте - до 2,67±0,007 усл. ед. (контрольная группа - 4,89^0,013 усл. ед). Как и во всех предыдущих случаях, падение интенсивности происходило в прямой зависимости от тигра антител к вирусу простого герпеса. Данный факт свидетельствовал о том, что интенсивность превращений 7а-дегцдрохолестерина при осложненной герпесом беременности уменьшалась.

Главной причиной выявленного нарушения стало истощение пула субстрата для 7а-дегидрохолестерина. К такому выводу мы пришли при изучении активности превращений мевалоната и сквалена. Основой для этого заключения стало то, что параметром, влияющим на течение любого синтетического процесса, является наличие достаточного содержания исходных продуктов. Снижение же интенсивности преобразования вышеназванных соединений свидетельствует о том, что таких продуктов стало меньше.

При анализе причин, приводящих к снижению концентрации стероидных гормонов, уже упоминалось способствовавшее этому обстоятельство. Это присутствие необходимого количества коферменга -НАДФ, участвующего в биосинтезе стероидов.

Из вышесказанного следует логичный вывод о том, что падение активности преобразования соединений, участвующих в биосинтезе холестерина указывает на снижение интенсивности процесса образования данного стероида. Следствием чему будет уменьшение его концентрации,

которое мы и отмечали при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности.

Резюмируя можно сказать, что нами получены результаты, свидетельствующие о присутствии в плаценте с самых ранних сроков гестации системы преобразования предшественников холестерина. Мы обнаружили соединения, участвующие в трех основных этапах его формирования - мевалонат, сквален, 7а-дегидрохолестерин. Активация герпес-вирусной инфекции в гравидарный период приводила к снижению синтеза холестерина. Результаты, свидетельствующие о нарушении интенсивности превращений исследуемых прекурсоров стероцца, позволяют прийти к выводу о том, что эти этапы способны изменяться под воздействием герпеса во время гестации, тем самым, представляя собой «уязвимые участки» холестериногенеза.

Уменьшение активности биосинтеза холестерина приводило к падению его концентрации и, как следствие, к снижению содержания половых стероидных гормонов в плаценте, которое и было отмечено в наших исследованиях.

Изменение ферментативных процессов холестеринового обмена под влиянием лучевого воздействия и токсинов герпес-вирусной инфекции

Мы продолжили поиск причин снижения активности

холестериногенеза, и следующим этапом нашей работы стало выявление механизма нарушения активности реакций, задействованных в процессе. Инфекционное начало способствует изменению конформационных свойств макромолекул (Мо1оикт А. е1а1., 2010; Росйаг Я.К. ^а!., 1982; \Уик^ш1 Е е1 а1., 2004). Поэтому было решено проанализировать, как в нарушении биосинтеза задействовано конформационное состояние молекул, так как именно от него зависит их биологическая активность. Обосновано это стереоспецифичностью действия всех стероидов, что связанно с их трехмерной структурой. В молекулах стероидов переходы из одной конформации в другую возможны только при дополнительном воздействии.

Таким дополнительным воздействием, по нашему мнению, стала активация герпес-вирусной инфекции.

Но сначала мы решили наглядно посмотреть, как на ферментативных реакциях, визуализируемых гистохимически, отразиться изменение конформационного состояния молекул. Оно может изменяться под действием ультрафиолетового и рентгеновского излучения, а также при лазерном облучении (Leshenyuk N.S. et al., 2007; Weiss S., 1999). В своих экспериментах мы проверили, как влияние лазерного облучения макромолекул отражается на результатах ферментативных реакций. Для этого мы подействовали лучами лазера на инкубационный раствор, содержащий субстрат и провели гистохимические реакции. Такое предварительное воздействие на биологическую активность, при котором изменялась конформационная структура молекул, оказывало сильное негативное влияние на интенсивность ферментативных гистохимических реакций. Энзиматическая активность гистохимической реакции на 7а-дегидрохолестериндегидрогеназу в результате опыта цигофотометрически оценивалась при сроке 5-6 недель беременности в 0,20±0,003 усл. ед. (контроль - 1,88±0,011 усл. ед.); на сроке 7-8 недель в 0,22±0,002 усл. ед. (контроль - 2,02±0,0Об усл. ед.); на сроке 9-10 недель в 0,25±0,003 усл. ед. (контроль - 2,26±0,004 усл.ед.). В зрелой плаценте цитофотометрический показатель после воздействия лазерного излучения снизился до 0,31 ± 0,002 усл. ед. по сравнению с контролем (4,89±0,013 усл. ед.).

Таким образом, было продемонстрировано, что путем внешнего воздействия можно влиять на активность биологических процессов, а также иллюстрировать результаты на гистохимическом уровне.

Как уже говорилось выше, нами было сделано предположение о том, что инфекционный процесс вызывает такие же изменения макромолекул. Для проверки данной теории был проведен ряд экспериментов непосредственно с самим инфекционным агентом. Мы присоединяли содержимое герпетических пузырьков, полученных при обострении хронической герпес

вирусной инфекции I типа, к инкубационному раствору и провели те же самые гистохимические реакции. В результате проведенных опытов оказалось, что активность гистохимических реакций точно также изменялась, как и в эксперименте с предварительным лазерным облучением. Эюимэтическая активность 7а-дегидрохолестеривдегцдрогеназы, оцененная цигофотометрически снизилась до 0,33±0,001 усл. ед. на сроке беременности 5-6 недель (контроль - 1,88±0,011 усл. ед.); на сроке 7-8 недель - до 0,36±0,002 усл. ед. (контроль - 2,02±0,006 усл. ед.); на сроке 9-10 недель - до

0.37.0,001 усл. ед. (контроль - 2,26±0,004 усл.ед.). В зрелой плаценте значение цигофотометрического показателя уменьшилось до 0,42 ± 0,006 усл. ед. (контроль - 4,89±0,013 усл. ед.). Таким образом, полученные данные доказывали верность нашего предположения о том, что одной из причин, которая привела к снижению активности ферментативных реакций стероадогенеза, может быть изменение конформационных особенностей стероидных молекул. Так как биологическая активность основывается на строгом соответствии пространственной структуры молекул, участвующих в реакции, то закономерно, что любые ее нарушения будут способствовать понижению данной активности вплоть до полного ее исчезновения. Именно такие негативные процессы происходили при активации герпес-вирусной инфекции.

То есть мы предложили механизм формирования патологии синтетических процессов. В частности, для изученного нами нарушения синтеза одного из важнейших веществ - холестерина, что будет приводить к изменению образования стероидных гормонов.

ВЫВОДЫ

1. Активация герпес-вирусной инфекции во время беременности является важным фактором снижения содержания холестерина в периферической крови и плаценте.

2. Гистохимическая оценка синтеза холестерина обеспечивает визуализацию в плаценте ферментов, отвечающих за превращения 7а-

дегидрохолестерита, сквалена и мевалоната, начиная с второго меся! внутриутробного развития.

3. Снижение активности превращений 7а-дегидрохолестерина, сквалена мевалоната свидетельствует, что нарушение биосинтеза холестерина плаценте от женщин, перенесших обострение герпеса, происходит различных стадиях его образования.

4. Снижение интенсивности гистохимических реакций биосинтез холестерина является следствием изменения конформационных свойст макромолекул под влиянием токсинов герпес-вирусной инфекции.

5. Активация герпес-вирусной инфекции в гестационный перио способствует уменьшению в периферической крови и плаценте конценграци прогестерона, дегвдроэпиандростерона, эстрадиола, эстриола, увеличени содержания корпвола и снижению соотношен дег идроэ пиа вдростерон/кортю ол.

6. Обострение герпес-вирусной инфекции во время беременност способствует подавлению в плаценте активности ферментов стероидогенеза ЗР-гидроксистероиддегвдрогеназы, 17Р-гидроксистероидцегвдрогеназы, За гидроксистероиддегидрогеназы и 11Р(Н)-гидроксистероидцегидрогеназы.

7. Обострение герпес-вирусной инфекции является важным фактором нарушения регуляции ферментов стероидогенеза в плаценте: снижен; активности вторичного мессенджера - аденилатциклазы и акгивност поставщиков необходимого коферменга НАДФ.

8. Ингибирование активности 11Р(П)-гидроксистероиддегидрогеназы в плаценте является следствием повышения интенсивности работы гуанилатциклазы иЖ>-синтазы при обострении герпес-вирусной инфекции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фетоплаценгарная система при герпесной инфекции / М.Т. Луценко, A.C. Соловьева, И.В. Довжикова [и др.]. - Благовещенск, 2003. - 200 с.

2. Довжикова И.В. Гистохимическое изучение фосфатвдилинозитола в плаценте беременных при герпесе // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. -2003.-Вып. 14.-С. 10-13.

3. Довжикова И.В. Гистохимическая характеристика активности НАДФН-диафоразы (маркера NO-синтазы), аденилат- и гуанилатциклаз в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. -2003. -Вып.15. - С. 14-19.

4. Довжикова И.В. Гистохимическое исследование фосфолипидов в плаценте беременных при герпесе // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2003. -Вып. 15. -С. 19-23.

5. Довжикова И.В. Гистохимическая характеристика холестерина в плаценте при беременности, осложненной герпесом // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2006. - Вып. 22. - С. 4244.

6. Довжикова И.В. Фермент дегвдроэпиацдростерондегвдрогеназа при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2006. - Вып. 22. - С. 50-52.

7. Довжикова И.В. Гистохимическая характеристика мевалоната в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2006. - Вып. 23. -С. 9-11.

8. Довжикова И.В., Луценко М.Т. Гистохимическая характеристика гуанилатциклазы в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. -2006. - Вып. 23 (Приложение). - С. 7-9.

9. Довжикова И.В., Луценко М.Т. Изменение интенсивности обмена а-глицерофосфата в плаценте при герпетической инфекции // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2006. - Вып. 23 (Приложение).-С, 11-13.

Ю.Изменение микровязкости мембран эритроцитов крови у беременных, инфицированных вирусом герпеса / Н.А. Ишутина, И.А. Андриевская, Н.Н. Дорофиенко, ИВ. Довжикова, СМ. Боле лова // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2006. - Вып. 23 (Приложение). - С. 16-18.

11.Довжикова И.В. Активность обмена 7-дегидрохолестерина в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2007. -Вып. 24. - С. 55-56.

12. Довжикова И.В. Гистохимическая характеристика lip-гвдроксистероидцегидрогеназы в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2007. - Вып. 24. -С. 61-62.

13.Довжикова ИВ. NO-сингаза в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией» / мат-лы третьей Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» 7-9 ноября 2007г., Новосибирск // Сибирский Консилиум. - 2007. - № 7. - С. 185.

14.Довжикова И.В. Активность пируватдегвдрогеназы в плаценте при беременности, осложненной обострением герпетической инфекции // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. -2008. - Вып.28. -С.20-22.

15. Довжикова И.В. Гистохимическая характеристика процессов стероидогенеза в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Т. 23, №4 (вып.1). -С. 50-52.

16. Довжикова ИВ. Метод оценки активности дегидрогеназы 7-дегвдрохолестерина в плаценте человека / VI Сибирский физиологический съезд. Тезисы докладов. - Барнаул: Прингэкспресс, 2008 . - В 2 томах. - Т.1. -С. 224.

17. Довжикова И.В. Взаимосвязь активности аденилатциклазы и процессов стеровдогенеза в плаценте / VI Сибирский физиологический съезд. Тезисы докладов. - Барнаул: Прингэкспресс, 2008. -В 2томах, - Т. 1. — С. 224-225.

18.Довжикова И.В.Активность фермента АТФазы вплаценге при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции / Актуальные проблемы клинической и экспериментальной медицины: Всероссийская научно-практическая конференция, посвященная 55-летию ЧГМА. - Чита, 1-2 октября 2008 г.: Мат. конф. - Чита: ИИЦ Ч1МА, 2008. -С. 77-78.

19.Довжикова И.В. Гистохимическая характеристика этапов синтеза холестерина в плаценте беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. -2008. - Вып. 28. - С. 17-20.

20.Довжикова И.В. Холестериновый обмен в плаценте у беременных с герпес-вирусной инфекцией / Фундаментальные аспекты оценки фетоплацентарной недостаточности при вирусных заболеваниях во время беременности. - Благовещенск: ГУ ДНЦ ФПД СО РАМН, АМГУ, 2008. - 181 с.

21. Довжикова И.В. Изменение ферментативной активности 11р-гцдроксистероиддегидрогеназы I и II типов в плаценте беременных с обострением герпес-вирусной инфекции / Мат-лы международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования» 20 февраля -3 марта 2009, Бразилия // Фундаментальные исследования. - 2008. - №12. -С. 41.

22.Довжикова И.В. Изменение ферментативной активности 110-гвдроксистероиддегидрогеназы I и II типов в плаценте беременных с обострением герпес-вирусной инфекции / Мат-лы международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования» 20 февраля -3 марта 2009, Бразилия // Успехи современного естествознания. - 2008. - № 12.-С.41.

23.Клинико-эхографические и иммуноморфологические факторы риска частого развития ОРВИ у детей от матерей с обострением хронической герпесвирусной инфекции в период беременности / Гориков И.Н., Приходько В.Б., Рабинович Б.А. Горикова И.А., Довжикова И.В. // Уральский медицинский журнал. -2008. -Приложение. - С.5.

24.Довжикова ИБ. Характер изменений процессов стеровдогенеза в плаценте при обострении герпес-вирусной инфекции // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2008. -Вып. 30. -С. 17-21.

25.Довжикова ИВ. Нарушение гормонообразовательных процессов в плаценте при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции И Якутский медицинский журнал. - 2009. -№1 (25). - С. 41-44.

26.Довжикова И.В., Луценко М.Т. Активность процессов образования НАДФ в плаценте при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции // Якутский медицинский журнал. - 2009. -№2 (26). - С. 159-160.

27.Довжикова И.В Дегидроэпиандростерон и кортизол в плаценте при обострении герпес-вирус ной инфекции П Дальневосточный медицинский журнал.-2009. -№ 1. - С. 52-55.

28.Довжикова И.В., Луценко М.Т. Изменение интенсивности работы вторичных мессенджеров и процессов гормонообразования в плаценте при беременности, осложненной герпес-вирусной инфекцией // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. — 2009. - № 14. - С. 74-76.

29.Довжикова И.В. Гистохимическая характеристика За-гвдроксистероиддегидрогеназы в ворсинчатом хорионе женщин, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции // Вестник РУДН. Серия Медицина. -2009,-№6.-С. 253-255.

30.Довжикова И.В., Луценко М.Т. Воздействие лазерного излучения на активность гистохимических реакций холестеринового обмена in vitro // Информатика и системы управления. - 2009. -№2 (20). - С. 29-32.

31.Способ ранней диагностики церебральной ишемии различной степени тяжести у новорожденных / Гориков И.Н., Самсонов В.П.. Нахамчен Л.Г., Довжикова И.В. // Патент России № 2372620 . 2009.

32.Луценко М.Т., Довжикова И.В. Строение плаценты при физиологически протекающей беременности (обзор литературы) // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. -2009. -Вып. 32. -С. 30-40.

33.Морфологические маркеры неразвивающейся беременности у женщин с персистирующими вирусными инфекциями / Гориков И.Н., Тарабурова Н.Г., Хамула НМ., Довжикова И.В., Ушакова ЕВ. // Проблемы и перспективы современной науки: сборник научных трудов. - Томск, 2009. -Т.2, № 1. - С. 38-39.

34.Dovzhikova LV. Changes of ferment activities of llß hydroxysteroid dehydrogenase I and II types in placentas of pregnant patients with acute heipetic infection / mat. international scientific conference «Basic and applied research», Brasil (Río de Janeiro), February 19 - Martch 3, 2009 // European journal of natural history. - 2009. - N 2. - P. 54-55.

35.Довжикова ИВ., Луценко M.Т. Плацента при герпетической инфекции (обзор литературы) // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2010. - Вып. 35. - С. 33-37.

36.Луценко М.Т. , Довжикова И.В. Роль липидов при беременности // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2010. - Вып. 36. -С. 7-14.

37.Довжикова И.В. Прогестерон в плаценте при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции // Фундаментальные исследования. -2010.-№4— С. 44-49.

38.Довжикова И.В. Изменение содержания холестерина у женщин с обострением герпес-вирусной инфекции на разных сроках беременности // Фундаментальные исследования. -2010. -№5. -С. 21-25.

39.Довжикова И.В. Изменение активности синтеза эстрогенов в плаценте на фоне обострения герпес-вирусной инфекции Н Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2010. - Вып. 37. - С. 11-14.

40.Довжикова И.В. Ферменты стероидогенеза (обзор литературы) // Бюллетень физиологии и патологии дыхания СО РАМН. - 2010. - Вып. 37. -С. 60-64.

41.Довжикова И.В.Кортизол при беременности (обзор литературы) // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -2010. - №6 (75) Часть 1. - С. 231 -233.

42.Довжикова ИВ. Изменение обмена гестагена при гестации, протекающей на фоне обострения герпес-вирусной инфекции // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -2010. -№6 (76) Часть 2. - С. 106-110.

43.Довжикова И.В. Активность энергетических процессов в плаценте при обострении герпес-вирусной инфекции // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -2010. -№6 (76) Часть 2. - С.111-112.

44.Луценко М.Т., Андриевская И.А., Довжикова И.В. Морфофункциональная характеристика фетоплаценгарного комплекса у беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции, и патоморфологические изменения в органах плода П Архив патологии. - Т. 72, №4. - С. 47-49.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АЦ - аденилатциклаза

ВПГ-вирус простого герпеса

Е2 - 17р-эстрадиол

ИФА - иммуноферменгный анализ

ЛПВП-липопротеиды высокой плотности

ЛПНП - липопротеиды низкой плотности

НАДФ - никотин

ам вдаде нинд ину кдеотидф осф ат

ФР - физиологический раствор

цГМФ - циклический гуанозинмонофосфат

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

1§М — иммуноглобулин класса М

^ в - иммуноглобулин класса О

N0-оксид азота

Довжикова Инна Викторовна

Закономерности холестеринового обмена в плаценте при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции

Автореферат

Подписано в печать 20.12.10. Тираж 100 экз.

Самой распространенной, неконтролируемой и длительное время существующей в организме преимущественно в латентной- форме среди вирусных инфекций человека считается герпетическая. Её возбудитель! — вирус простого герпеса (ВПГ) выявляется у 95-98% всех людей в возрасте старше 30 лет. Долгое время герпес-вирусной инфекции уделялось намного меньше внимания, чем другим вирусным инфекциям, несмотря на то, что герпес известен человечеству более двух тысяч лет, а сам ВПГ выделен более девяноста лет назад (в 1912 г.). Только в последние годы в результате прогресса в изучении вирусов стала, очевидной истинная роль ВПГ в патологии человека и раскрылась вся значимость проблемы герпес-вирусной инфекции. По статистике Всемирной организации, здравоохранения (ВОЗ) заболеваемость простым герпесом крайне высока и занимает 2-е место среди вирусных поражений человека, уступая-лишь гриппу. Такая'же ситуация, по данным ВОЗ, наблюдается и по причинам смертности от вирусных инфекций: 35,8% - вирус гриппа и- 15,8% - ВПГ [164]. Установлено, что герпетическая- инфекция может приводить как к развитию системных заболеваний, так. и к поражению отдельных органов: центральной и» периферической нервной системы, глаз и внутренних органов, слизистых оболочек и кожных покровов [48, 104, 132, 259-261, 471]. Вирусы, при поступлении в организм внедряются не только1 в нервные клетки, но и в стволовые клетки, где также депонируются. В этом случае перенос вируса в сосуды осуществляется моноцитами и лимфоцитами крови, инфицированными при моноцито- и лимфоцитопоэзе. Генерализация вирусного инфицирования осуществляется как из нервной ткани, так и из стволовых клеток костного мозга и периферической крови [1, 10].

Приоритетность, и значимость проблем, связанных с вирусной инфекцией не-вызывает сомнений у акушеров-гинекологов [26, 82, 139; 178, 179, 220, 233, 345, 376]. Герпетическая инфекция может приобретать крайне тяжелые формы, если она протекает на фоне иммунодефицита, к числу которых относится беременность [104, 119, 187]. Физиологический иммунодефицит беременных или индуцируемый ранее до его возникновения или после его развития на фоне действия патогенных факторов (стресс, гормональный дисбаланс, экстрагенитальная и генитальная патология), создает благоприятную основу для внутриутробного инфицирования плода.

В период имплантации и раннего эмбриогенеза при негативном, воздействии вируса простого герпеса возникает первичная плацентарная недостаточность, которая приводит к самопроизвольному прерыванию беременности, задержке внутриутробного развития плода [48, 99, 133]. Инфицирование плода в более поздние сроки не вызывает формирования грубых дефектов развития, тем не менее, в этих случаях может произойти нарушение функциональных механизмов дифференцировки клеток и тканей [39, 48]. Наличие активной герпес-вирусной инфекции у матери после 32 недель беременности приводит к инфицированию плода по разным данным в 40-60% случаев [39, 41, 132, 177, 187]. В это время регистрируется также развитие плацентарной недостаточности [36, 39, 68, 198-200]. Появляется нарушения функционального ■ состояния плода, многочисленные органические изменения во всех отделах плаценты, развиваются патологии ее различных ферментных систем, изменения маточно-плацетарно-плодового кровотока [36, 121-123, 177, 200,1 212, 377].

Следует отметить также, что в большинстве случаев неонатальная передача вируса (70%) происходит именно от матерей с бессимптомным течением герпеса [26, 133, 154, 537]. Происходит это потому, что не каждая реактивация вируса герпеса вызывает рецидив соответствующего заболевания [211]. Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности изучаемой проблемы.

Подобная ситуация привела к пересмотру взгляда на герпетическую инфекцию, как на исключительно латентную, и заставила признать ее роль в развитии различной акушерской и перинатальной патологии. Мы считаем, что с целью снижения частоты неблагоприятных явлений у женщин с различными формами герпес-вирусной инфекции необходимо раскрытие всех патогенетических звеньев развивающейся патологии.

Несмотря на значительное число научных публикаций в данном направлении, изучаемую проблему нельзя считать полностью решенной. На наш взгляд, в первую очередь, это касается этиопатогенетической роли ВПГ в развитии недостаточности фетоплацентарной системы, практически всегда сопровождающейся нарушением гормонального баланса. Мы считаем, что недостаточно зарегистрировать изменения, происходящие в гормональном фоне, необходимо раскрытие причин найденной патологии. Так как предшественником всех стероидных гормонов является» холестерин, то мы остановили свое внимание на нем и его обмене. Изучив доступную современную литературу, мы не обнаружили исследований холестеринового метаболизма при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной' инфекции. Также мы не нашли работ, посвященных изучению факторов, приводящих к изменениям концентрации стероидов при герпес-вирусной и других инфекциях. Существуют единичные работы, посвященные нарушению липидного обмена при герпесе [6, 7], но не во время,гестации.

Холестерин представляет собой один из основных липидов организма человека. Важнейшее его значение заключается в том, что он, входя в состав мембран всех клеток, обеспечивает выполнение ими своих физиологических функций [34, 40, 72, 94, 112]. Не менее значима роль холестерина в том, что он является предшественником при биосинтезе всех классов стероидных гормонов, желчных кислот и витамина Б [89, 90, 148, 437].

Эндогенный холестерин синтезируется в клетках всех органов и тканей организма. Субстратом для его образования является ацетил-КоА. Более тридцати реакций биосинтеза можно разделить на три стадии: синтез мевалоната; образование сквалена; циклизация сквалена и формирование холестерина. Для данного метаболического пути используется 18 молекул НАДФ, 18 молекул АТФ и свыше 35 различных ферментов [89, 90, 148]. По анализу основополагающих стадий холестериногенеза и кофакторов, в нем участвующих можно будет судить об активности этого процесса.

Синтез гормонов в период внутриутробного развития происходит в фетоплацентарной системе и требует участия различных ферментов, кофакторов« и их регуляторов [27, 28, 374, 424, 511]. От работы всех этих элементов будет зависеть состоятельность гормонального фона, поэтому анализировать проблему адекватности продукции стероидных гормонов, по нашему мнению, необходимо комплексно, учитывая все факторы.

Цель исследования

Целью нашей работы являлось раскрытие основных закономерностей синтеза и превращения холестерина, в плаценте при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции.

Задачи исследования

1. Оценить процессы- синтеза холестерина в фетоплацентарной ' системе при нормально протекающей беременности и выявить их нарушения при гестации, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции.

2. Проанализировать влияние изменений холестеринового обмена на содержание стероидных гормонов при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекцией, в сравнении с физиологически протекающей гестацией.

3. Выявить процессы деградации холестерина и стероидогенеза в плаценте при беременности, осложненной обострением герпес-вирусной инфекции.

4. Установить взаимосвязь изменений холестеринового обмена и ферментативного метаболизма путем определения гистохимической картины тканей плаценты.

5. Разработать модель, позволяющую рассмотреть изменения конформационной структуры стероидов в плацентарном барьере и отметить ее вариабельность в физиологических условиях и при поражении организма* вирусной инфекцией.

Научная новизна и научная значимость

Выявлена динамика изменения содержания холестерина в плаценте в зависимости от тяжести инфекционного процесса (герпес-вирусного) на различных этапах беременности, заключающаяся в том, что наибольшее уменьшение концентрации стероида было обнаружено при титре антител класса ^ в к ВПГ 1:12800.

Установлено, что при изменении содержания холестерина снижается концентрация половых стероидных гормонов: прогестерона, дегидроэпиандростерона, эстриола, эстрадиола в периферической крови беременной и в плаценте во время обострения герпес-вирусной инфекции.

Изучены этапы биосинтеза холестерина в плаценте и получены гистохимические доказательства его нарушения при обострении герпес-вирусной инфекции во время беременности.

Обнаружено, что в нарушении биосинтеза холестерина в плаценте, возможно, важную роль играют изменения конформационной структуры молекул под влиянием токсических продуктов герпес-вирусной инфекции.

Новым является и нарушение адекватности регуляторных механизмов ферментативных реакций, участвующих в обмене холестерина в плаценте при обострению герпес-вирусной инфекции. На основании комплексной оценки гистохимических реакций, доказано изменение активности вторичных мессенджеров: гуанилатциклазы и аденилатциклазы, 1МО-синтазы, поставщиков кофермента НАДФ, а также источников свободных радикалов.

Разработаны новые модификации способов, позволяющих на гистохимическом уровне оценить в плаценте активность процесса биосинтеза холестерина на различных его этапах.

Практическая значимость работы Результаты работы пополняют фундаментальные знания, позволяющие прогнозировать нарушения продукции основных стероидных гормонов, на основании изменения холестеринового метаболизма во время беременности, протекающей на фоне обострения герпес-вирусной инфекции.

Установленные закономерности изменения содержания холестерина при обострении герпес-вирусной инфекции, оказывающее влияние на синтез гормонов фетоплацентарного комплекса (прогестерона, эстрадиола, эстриола, дегидроэпиандростерона и кортизола) могут служить основой» для разработки эффективных методов прогнозирования и профилактики плацентарной недостаточности.

Полученные данные о закономерностях синтеза холестерина в плаценте позволяют спрогнозировать не только течение беременности, рост и развитие плода, но и сформировать представление о первых годах жизни ребенка.

Положения, выносимые на защиту

1. При обострении герпес-вирусной инфекции уменьшается активность биосинтеза холестерина в плаценте в сопоставлении с физиологической беременностью, что доказывается гистохимической оценкой этапов образования холестерина.

2. В плаценте и в периферической крови на разных сроках осложненной обострением герпес-вирусной инфекции беременности происходят существенные сдвиги содержания стероидных гормонов: снижение концентрации прогестерона, дегидроэпиандростерона, эстрогенов и повышение концентрации кортизола.

3. Нарушение биосинтеза холестерина В1 плаценте при активации герпес-вирусной инфекции оказывает прямое влияние на интенсивность процессов синтеза гормонов.

4. Изменение метаболизма холестерина в фетоплацентарной системе при осложненной герпес-вирусной инфекцией беременности сопровождалось нарушением регуляторных процессов, таких как активность вторичных мессенджеров, источников свободных радикалов, поставщиков кофактора НАДО.

5. Биосинтез холестерина в плаценте изменяется под воздействием лазерного облучения и при добавлении взвеси вируса герпеса в инкубационный раствор реакции на выявление ферментов, участвующих в данном процессе.

Публикации Потеме диссертации опубликовано 44 печатных работ, из них в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ -19:

Структура и. объем диссертации Диссертация изложена на, 273 страницах, состоит из введения, 10 глав собственных данных,, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 2 схемами, 41 рисунком и 15 таблицами. Библиографический список включает 567 литературных источников: 231 отечественных и 336 зарубежных авторов.

ВЫВОДЫ

1. Активация герпес-вирусной инфекции во время беременности является важным фактором снижения содержания холестерина в периферической крови и плаценте.

2. Гистохимическая оценка синтеза холестерина обеспечивает визуализацию в плаценте ферментов, отвечающих за превращения 7а-дегидрохолестерина, сквалена и мевалоната, начиная с второго месяца внутриутробного развития.

3. Снижение активности превращений 7а-дегидрохолестерина, сквалена и мевалоната свидетельствует, что нарушение биосинтеза холестерина в плаценте от женщин, перенесших обострение герпеса, происходит на различных стадиях его образования.

4. Снижение интенсивности гистохимических реакций биосинтеза холестерина является следствием изменения конформационных свойств макромолекул под влиянием токсинов герпес-вирусной инфекции.

5. Активация герпес-вирусной инфекции в гестационный период способствует уменьшению в периферической крови и плаценте концентраций прогестерона, дегидроэпиандростерона, эстрадиола, эстриола, увеличению содержания кортизола и снижению соотношения дегидроэпиандростерон/кортизол.

6. Обострение герпес-вирусной инфекции во время беременности способствует подавлению в плаценте активности ферментов стероидогенеза: Зр-гидроксистероиддегидрогеназы, 17р-гидроксистероидцегидрогеназы, За-гидроксистероиддегидрогеназы и 11 Р(П)-гидроксистероиддегидрогеназы.

7. Обострение герпес-вирусной инфекции является важным фактором нарушения регуляции ферментов стероидогенеза в плаценте: снижения активности вторичного мессенджера — аденилатциклазы и активности поставщиков необходимого кофермента НАДФ. 8. Ингибирование активности 11 р(И)-гидроксистероиддегидрогеназы в плаценте является следствием повышения интенсивности работы гуанилатциклазы и >Ю-синтазы при обострении герпес-вирусной инфекции.

215

Заключение

Таким образом, можно сделать вывод, что основные достижения в изучении синтеза и деградации холестерина- были достигнуты в середине двадцатого века. Исследования в области холестеринового обмена последних лет носят прикладной характер. Внимание современных отечественных и зарубежных ученых сосредоточено на изучении оксистеринов и синтезе новых лекарственных средств. В российской литературе имеются единичные публикации, посвященные ферментам надпочечникового стероидогенеза. Зарубежные исследователи получают данные, в основном, о ферментах стероидогенеза, особое место среди которых занимает 11(3-гидроксистероиддегидрогеназа, о регуляции этих энзимов на транскрипционном и геномном уровнях, и расширяются знания о роли гормонов в организме. Каких-либо фундаментальных знаний по этой теме не накапливалось.

Анализируя доступную нам литературу можно прийти к выводу, что подробной оценки холестеринового метаболизма при беременности, осложненной наличием герпетической инфекции, а также выявления причин, которые могли вызвать в данном случае серьезные сдвиги в обмене холестерина, не проводилось.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Обследование беременных осуществлялось на базе научной лаборатории «Механизмов этиопатогенеза и восстановительных процессов дыхательной системы при неспецифических заболеваниях легких» совместно с отделением акушерской патологии беременных клиники Учреждения Российской академии медицинских наук Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания Сибирского отделения РАМН. Работа основана на результатах комплексного обследования женщин с применением общеклинических, биохимических, морфологических и статистических методов исследования.

Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и нормативных документов «Правила клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом № 266 от 19.06.03 Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

Работа была одобрена комитетом по биомедицинской этике ДНЦ ФПД СО РАМН в соответствии с принципами конвенции о биомедицине и правах человека, а также общепризнанными нормами международного права. От всех здоровых и больных лиц было получено информированное согласие.

Обследованы 273 беременные женщины в возрасте 17-35 лет. Все пациентки обследовались в динамике по триместрам беременности (10-12 недель, 19-24 недели, 26-34 недели). Проводилось лабораторные исследования периферической крови: клинический анализ крови, липидный статус (общие липиды, ЛПВП, ЛПНП, триглицериды, общий холестерин), содержание гормонов (прогестерон, эстриол, эстрадиол, дегидроэпиандростеронсульфат, кортизол). После родоразрешения этих беременных были получены плаценты, в гомогенатах которых определяли содержание гормонов и холестерина.

Материалом для исследования послужили зрелые плаценты, взятые при родоразрешении в срок практически здоровых матерей (30 случаев -контрольная группа) и, перенесших обострение хронической герпес-вирусной инфекции I типа в третьем триместре беременности (78 случаев). Аналогичные исследования проведены в 165 ворсинчатых хорионах, полученных при проведении медицинских абортов на сроке 5-10 недель у беременных с обострением герпеса (75 случаев) и не имевших такового (90 случаев). В зависимости от срока и течения беременности, материал был разделен на группы: контрольную и с обострением хронической герпес-вирусной инфекции. Диагностическими критериями обострения хронической герпес-вирусной инфекции служили характерная клиническая картина заболевания с подтверждением методами клинико-лабораторного обследования. По значимым параметрам (возраст, акушерско-гинекологический анамнез, наличие других хронических соматических заболеваний и осложнений беременности) на момент обследования сравниваемые группы достоверно не различались.

Для исключения влияния других факторов помимо герпес-вирусной инфекции мы не включали женщин, имеющих другие острые и хронические инфекционные заболевания.

Биохимические методы исследования

В определении типоспецифических антител класса М и О к вирусу простого герпеса 1 иммуноферментным методом использовали стандартные тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия) на аппарате спектрофотометр к^а^Бах 2100» (США).

Для изучения- липидного обмена выявляли следующие показатели: общие липиды (сульфофосфованильным реактивом); общий холестерин сыворотки и триглицериды с помощью коммерческих наборов «Новохол» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия); липопротеиды высокой плотности посредством' коммерческих наборов «ЛВП-Холестерин-Ново» ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия); липопротеиды низкой плотности находили расчетным методом.

Исследование гормонов (прогестерон; эстриол, эстрадиол, дегидроэпиандростеронсульфат, кортизол) в периферической' крови и плацентарном гомогенате проводили методом иммуноферментного анализа, используя наборы ЗАО «Алкор Био» (Санкт-Петербург, Россия) на спектрофотометре «Stat-Fax 2100» (США).

Для приготовления гомогената плаценту забирали в течение 10-15 мин после родов. Её поверхность со стороны базальной пластинки отмывали большим количеством физиологического раствора. Плодовая часть плаценты срезалась скальпелем, пластинками площадью 2-3'см и толщиной не более 1 мм. Кусочки ткани помещали в 200 мл физиологического раствора, отмывали от клеток крови, перемешивая 15 мин на магнитной мешалке. Для получения экстрактов, отмытые кусочки плаценты слегка подсушивали на1 фильтровальной1 бумаге; взвешивали, растирали пестиком в. фарфоровой ступке и гомогенизировали до.- однородной кремообразной массы. К полученному гомогенату-'добавляли' физиологический раствор в объеме, равном изначальному весу ткани (на Г г - 1 мл физиологического раствора). Взвесь помещали в пластиковые пробирки Falcon* и подвергали замораживанию при -20°С в течение суток. Затем гомогенат размораживали и центрифугировали при 4000 об/мин при температуре +4°С. Надосадочную жидкость разливали мелкими аликвотами и хранили при -20°С до проведения. ИФА. Аналогичным способом готовили гомогенат и ворсинчатого хориона, который забирали в течение 10-15 мин после проведения медицинского аборта. Исследования ворсинчатых хорионов I триместра проводилось в группах со сроком 5-7 недель, 6-8 недель и 9-10 недель беременности.

Гистохимические методы исследования

Выявление: 30-, За-, 110- и 17р-гидроксистероиддегидрогеназ производилось по методу- с солями гетразолия прописи; 3. Лойда с соавт. [113] . Для г определения локализации энзимов в качестве акцептора применялась соль тетразолия фирмы ICN Biomedicals (США) в конечной концентрации 5мМ: Как. кофактор использовали; НАДФ (Reanal, Венгрия) в конечной концентрации ГмМ. Инкубационный раствор готовился на основе 0,1М фосфатного буфера рЫ 7,4. Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 минут. По .окончании инкубации срезы промывали дистиллированной; водой, фиксировали, в 10%-м нейтральном формалине и заключали в глицерин-желатин; Для исключения участия: других факторов в восстановлен'ии5тетразолиевой соли проводили контрольные опыты.

Субстратом для выявления* 17[3-гидроксистероиддегидрогеназы. являлся 2мМ раствор, в диметилформамиде 5андростен-17Р-ол-Зо1г (SERVA, Германия).

Субстратом', для выявления Зр-гидроксистероиддегидрогеназы являлись 2мМ растворы в диметилформамиде андростан-3 Р-олт 17он (SERVA, Германия), Д5-прегнен-ЗР-ол-20-он (SERVA, Германия).

Субстратом для выявления 11 p-гидроксистероиддегидрогеназы (I ' типа) являлся- 2мМ растворы в диметилформамиде 11 р-кетоэтиохоланолонш (SERVA, Германия) и 11-дегидрокортикостерона (SERVA, Германия).

Субстратом для выявления Пр-гидроксистероиддегидрогеназы (И типа) являлись 2мМ растворы в диметилформамиде Ир-гидроксиэтиохоланолона (SERVA, Германия), гидрокортизона (Хемофарм, Сербия).

Субстратом для выявления, дегидроэпиандростерондегидрогеназы являлся 2мМ раствор в диметилформамиде 5андростен-ЗР-ол-17ои (дегидроэпиандростерона) (SERVA, Германия);

Субстратом для выявления За-гидроксистероиддегидрогеназы являлся 2мМ раствор в диметилформамиде 5р~андростан-За-ол-17он (SERVA, Германия).

Выявление аденилатциклазы проводили по J". Reik et al. (1970) [477] в модификации Б .Я. Рыжавского (1979) [162] и лаборатории «Нейроэндокринной регуляции дыхательной системы» ДНЦ ФПД СО РАМН. Метод выполнялся на криостатных срезах после фиксации 1% раствором глютаральдегида на какодилатном буфере (рН 7,4). Инкубация продолжалась в . течении 30 минут при 37° С с последующей обработкой срезов 0,5% раствором сульфида натрия. Осадок сульфида свинца маркировал места локализации фермента. Заключение обычное.

Гистохимическое определение гуанилатциклазы основано • на осаждении высвобождающегося пирофосфата при помощи ионов свинца по аналогии с методом Reik et al. (1970) [477] в. модификации. Рыжавского (1979) [162]. Выявление фермента было адаптировано, для1 анализа на световом микроскопе. Реакция проводилась нах нефиксированных криостатных срезах после фиксации 1% раствором глютаральдегида'. на-какодилатном буфере (рН 7,4). В качестве субстрата* использовали литиевую соль гуанозинтрифосфатной кислоты фирмы ICN Biomedicals (США). Использовалась инкубационная среда Wachstein М., Meisel Е. (1957) [536] с нитратом свинца в качестве реагента для осаждения фосфата. Инкубация продолжалась в .течении 30 минут при 37° С с последующей обработкой срезов 0,5% раствором' сульфида натрия. Специфичность выявления проверялась путем' исключения субстрата- из инкубационного раствора.

Для изучения работы НАДФ+-зависимой малатдегидрогеназы был применен метод с солями тетразолия для определения дегидрогеназ по прописи Z. Lojda (1965) [113].

Для оценки работы пентозофосфатного пути применялся метод с солями тетразолия для выявления глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы по прописи Z. Lojda (1965) [113].

Для оценки активности NO-синтазы был применен метод выявления ее маркера - НАДФН-диафоразы по G. Nakos и R. Gossrau (1994) [442].

Для определения АТФаз клеточных мембран и митохондрий был применен метод Wachstein М., Meisel Е. (1957) в модификации Lojda Z., Gossrau R., Schiebler Т.Н. (1982) [113].

Выявление перекисей жирных кислот проводилось по методу Винклера-Шульце [109].

Для анализа активности синтеза холестерина были разработаны гистохимические способы для определения активности превращений мевалоната, сквалена, 7а-дегидрохолестерина. Суть их базировалась на том, j что окисление веществ в тканях происходит посредством включения, промежуточных переносчиков водорода соответствующими ферментами при помощи кофакторов. Метод основан на восстановлении акцептора, в качестве которого использовался нитросиний тетразолий.

Изучалась активность 7а-дегидрохолестерина - производного* холестерина, который является одним из его предшественников. На основе метода с солями тетразолия прописи, приведенной 3. Лойда, Р. Госсрау, Т. Шиблер [113] был разработан способ» гистохимического выявления 7а-дегидрохолестериндегидрогеназы. Для определения локализации энзима в качестве акцептора* применялась соль тетразолия фирмы ICN Biomedicals (США) в конечной концентрации 1 мг/мл. Субстратом реакции являлся* 2 мМ раствор в диметилформамиде 7а-дегидрохолестерина фирмы SERVA, Германия. Как кофактор использовали НАДФ (Reanal, Венгрия) в концентрации 1 мг/мл. Инкубационный раствор готовился на основе 0,1М фосфатного буфера рН 7,4. Инкубацию проводили при 37°С в течение 30 минут. По окончании инкубации срезы промывали дистиллированной водой, фиксировали в 10%-м нейтральном формалине и заключали в глицерин-желатин.

Оценку активности преобразований мевалоната и сквалена проводили полностью аналогичным способом. В качестве субстрата использовали 0; 1 М' раствор мевалоната фирмы ICN Biomedicals (США) и 2 мМ раствор сквалена фирмы Ferak (Германия), соответственно.

Для исключения участия других факторов в восстановлении тетразолиевой соли мы проводили контрольные опыты.

В своей работе мы поставили цель — разработать модель, позволяющей проанализировать изменения конформационной структуры стероидов! в плацентарном барьере и отметить ее вариабельность в физиологических условиях и при поражении организма вирусной инфекцией. Для определения роли конформационных изменений в активности ферментативной реакции« были проведены следующие опыты. Фактором, способным - изменять конформационное состояние макромолекул, является лазерное излучение.

Оно инициирует колебательно-возбужденное состояние макромолекул, в результате чего меняется их конформация [45, 57, 218, 390, 394, 544]. Действие стероидов тесно связано с их химической структурой. Считается; что даже незначительные вариации в структуре стеранового скелета и функциональных заместителей приводит к существенному изменению биологической активности молекул; то есть процессов транспорта, ассоциации со специфическими рецепторами, ферментативной трансформации [173, 206, 326, 366]. Для наглядной демонстрации того, как изменение структуры стероидной молекулы отражается на ее ферментативной активности, нами были выполнены эксперименты с предварительной обработкой стероида (субстрата реакции) лазерным излучением.

Мы воздействовали на инкубационный раствор, содержащий субстрат гистохимической реакции для> выявления ферментов обмена холестерина — стероиддегидрогеназ, лучами лазера. Лазерное облучение проводилось с помощью гелий-неонового лазера ЬА-2;, с длиной волны 633 нм. Выходная мощность на световоде 4-6 мВт. Время облучения - 30 секунд. После чего проводились гистохимические реакции на выявление дегидрогеназы, специфичной к искомому стероиду по приведенной выше прописи1 [Г13].Мы< провели подобные опыты с использованием следующих субстратов: 5а-холестан и р-стерол (для общего изучения влияния лазерного излучения на активность стероиддегидрогеназных реакций); 7а-дегидрохолестерин (для оценки непосредственно процессов синтеза холестерина); 5андростен-17р-ол-Зон и 5андростен-Зр~ол-17он (для прямой оценки реакций гормоногенеза). Для контроля параллельно выполняли обыкновенные гистохимические реакции с теми же'субстратами.

Нами было предположено, что' и инфекция может действовать на стероидные молекулы, изменяя именно- их конформацию. Для того; чтобы проверить это предположение и показать непосредственное воздействие инфекционного начала, на активность гистохимической реакции были проведены опыты, вкоторых в инкубационную среду добавляли содержимое герпетических везикул, взятое при обострении хронической герпес-вирусной инфекции-1 типа (титр антител класса к вирусу простого герпеса I -1:12800), в количестве 0;1 мл на 1 мл'раствора. После* того, как между компонентами; произошло взаимодействие, проводилось гистохимическое выявление искомой стероидцегидрогеназы по описанной^ выше схеме. Все опыты проходили одновременно с контролем, в качестве которого служили обычные гистохимические определения тех же самых стероиддегидрогеназ (без какого-либо дополнительного воздействия).

Все гистохимические препараты обрабатывались на персональном компьютере. Количество образующихся продуктов реакции проводили путем подсчета на постоянном размере изображения (10x6) по программе компьютерной цитофотометрии методом измерения на стандартную единицу площади 0,1 (зонд) в ЮО различных точках анализируемого объекта.

Статистические методы исследования

Данные, полученные в результате работы, обрабатывались при помощи персонального компьютера с использованием программ Microsoft Excel.

Статистический анализ полученного материала проводился на основе стандартных методов вариационной статистики с вычислением необходимых параметров. Для всех признаков вычислялась среднеарифметическая величина (М) и стандартная ошибка среднего значения (m), 95% доверительный интервал для средних значений (М±т), где t определяется по таблице граничных значений критерия Стъюдента при доверительном уровне 95% и числе степеней свободы f = п-1 (п - число наблюдений).

Оценка достоверности средних значений сравниваемых параметров устанавливалась с помощью непарного критерия Стъюдента (t). Принимались во внимание уровни значимости (р) 0,05; 0,01; 0,001. Различия считали достоверными при р<0,05.

ГЛАВА 3. ЛИПИДНЫЙ ПРОФИЛЬ БЕРЕМЕННЫХ ПРИ

ОБОСТРЕНИИ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Липиды — сложные органические вещества, которые выполняют в организме очень важные функции. Во время беременности их обмен перестраивается в соответствии с физиологической потребностью организма матери и плода. Усиленная утилизация жирных кислот в печени и гиперинсулинемия вызывают увеличение синтеза липидов. Жирные кислоты, холестерин, фосфолипиды и другие липиды расходуются на формирование тканей плода. В крови присутствуют липиды четырех основных групп — холестерин, триглицериды, фосфолипиды, жирные кислоты.

Исследование липидного обмена, выполненное у практически здоровых женщин, показало, что' во время гестации физиологически повышалось количество общих липидов с 4,88±0;06 г/л в I триместре, до-5,46±0,09 г/л во II триместре, и до 6,81±0,07 г/л в III триместре беременности (табл. 1). По-видимому, это связано с характером протекающих метаболических процессов, требующих больших расходов энергетического и пластического материала для роста и развития плода, а также с обеспечением высоких затрат материнского организма.

Анализ полученных данных выявил, что у женщин, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции, происходило накопление общих липидов периферической крови. При регистрации титра антител класса О к вирусу простого герпеса 1:3200 наблюдалась только небольшая-направленность на повышение концентрации общих липидов по сравнению со значениями контрольной группы (табл. 1). При титре антител класса ^Эк вирусу простого герпеса класса 1§ О 1:6400 происходил более выраженный рост показателей: в I триместре - на 5% (5,12±0,09 г/л); во II триместре — всего на 3% (5,60±0,02 г/л); в III триместре - на те же 5% (7,10±0,03 г/л). При тире антител 1:12800 их содержание статистически достоверно увеличивалось в I триместре до 5,31±0,12 г/л (контроль - 4,88±0,06 г/л), что на 9% больше, чем аналогичные данные в контрольной группе; во II триместре до 5,78±0,03 г/л (контроль - 5,46±0,09 г/л) это на 6% по сравнению с контрольной группой- и до 7,29±0,06 г/л в III триместре беременности (контроль - 6,81±0,07 г/л), что составило 7%. Увеличение- содержания липидов связано, по-видимому, с усилением их синтеза на фоне воспалительного процесса, вызванного инфекцией.