Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Закономерности формирования иммунного ответа макроорганизма на введение Yersinia pestis EV в сочетании с иммуномодуляторами (экспериментальное исследование)

а/

На правах рукописи

ВИТЯЗЕВА Светлана Александровна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА МАКРООРГАНИЗМА

НА ВВЕДЕНИЕ YERSINIA PESTIS ЕУ В СОЧЕТАНИИ С ИММУНОМОДУЛЯТОРАМИ (экспериментальное исследование)

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Q03463958

Иркутск - 2009

Работа выполнена в ФГУЗ «Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора

Научный руководитель:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Дубровина Валентина Ивановна

Бодиенкова Галина Михайловна Васильева Людмила Сергеевна

Ведущая организация

ГУ НЦ клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, г. Новосибирск

Защита состоится « $ » 2009 г. в_часов на заседании диссерта-

ционного совета Д.001.038.02 при «Учреждение Российской академии медицинских наук научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН» по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при «Учреждение Российской академии медицинских наук научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения РАМН»

Автореферат разослан » г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Шолохов Л.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Чума нанесла неисчислимые жертвы человечеству исторически и продолжает оставаться серьезной угрозой для здоровья населения не только в природных очагах этой инфекции, но и за пределами энзоотичной территории вследствие возможности выноса возбудителя. Увеличение миграции населения, коммерческий туризм, военные конфликты усиливают не только потенциальную, но и реальную опасность завоза этой инфекции в любую страну мира.

В последние гады возбудитель чумы привлекает внимание с точки зрения наиболее вероятного агента биотерроризма (Онищенко Г.Г., 2003).

Несмотря на большие достижения в борьбе с чумой, связанные с использованием антибактериальных препаратов, контролем за носителями и переносчиками чумного микроба в природных очагах, нет уверенности в том, что эпидемии чумы не будут повторяться. Поэтому проблема специфической профилактики чумы по-прежнему актуальна. Как и раньше, нет единого мнения о преимуществах тех или иных вакцин, методах учета эффективности прививок и способах проведения иммунизации (Домарадский И.В., 1998; Иванова И.А., 1998; Дубровина В.И., 2004; Таран Т.В., 2004; Молдаван И.А., 2005).

Современная стратегия иммунопрофилактики чумы во многом определяется поиском средств, способных потенциировать иммунные реакции макроорганизма в ответ на введение иммуногенного препарата, повышая, таким образом, эффективность вакцины при одновременном снижении ее иммунизирующей дозы и уменьшении побочного действия (Дубровина В.И., 2004, 2007; Молдаван И.А., 2005; Саппо С.Г. и др., 2006; Киреев М.Н. и др., 2008).

Приоритетными являются исследования, направленные на создание средств «неспецифической защиты», в частности, путем стимуляции системы врожденного иммунитета, а также разработки алгоритмов на инфицирование патогеном, независимо от вида возбудителя (Авророва И.В. и др., 1996; Бямбаа А. и др., 1998; Киреев М.Н. и др., 2008).

Для стимуляции неспецифической резистентности организма большое внимание уделяется полисахаридам растительного происхождения, обладающим широким спектром действия и лишенным ряда недостатков, присущих искусственно синтезированным химическим веществам. Из новых природных соединений можно назвать полисахарид, полученный из клеточных стенок древесины лиственницы - арабиногалактан (АГ), обладающий иммуномодулирующим действием, способный вступать в реакции с различными функциональными реагентами, образовывать с ними конъюгаты, уменьшать интенсивность свободно-радикальных процессов, активировать фагоцитоз (Борисов И.М., 2002; Дубровина В.И., 2004; Медведева E.H., 2003; Fitzpatrick А. et al., 2004 и др.).

Одним из актуальных направлений для создания новых наноматериалов (содержащих биогенные металлы и микроэлементы) с заданными биологическими

3

\

свойствами (Александрова Г.П. и др., 2004,2005; Грищенко Л.А., 2007) является использование в качестве биоактивной полисахаридной оболочки макромолекулы арабиногалактана. В связи с тем, что наличие того или иного металла в клетке имеет важное значение для ее жизнедеятельности, изучение характера воздействия металлосодержащих нанобиокомпозитов на основе арабиногалактана (железо-, кобальт- и серебросодержащий нанокомпозиты) на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных перспективно.

Создание новых и усовершенствование уже имеющихся вакцин тесно связано с поиском адекватных методических приемов оценки реакций макроорганизма на эти препараты и эффективности защиты от чумы после иммунизации ими. В этой связи морфологическая характеристика изменений иммунокомпетентных органов, обусловленных вакцинацией, занимает важное место в системе контроля препаратов специфической профилактики инфекционных заболеваний (Исупов И.В. и др., 2004; Труфакин В.А. и др., 2005).

Использование морфометрического метода для изучения морфологических изменений, происходящих в иммунной системе организма, перспективно и позволяет количественно характеризовать состояние клеточных популяций и взаимоотношения отдельных органных структур (Автандилов Г.Г., 1990).

Участие центральных и периферических органов иммунной системы в реализации иммунных реакций и особенности течения вакцинального процесса, вызванного сочетанным применением живой чумной вакцины и иммуномодуля-торов природного происхождения, до настоящего времени мало исследованы. В связи с этим, изучение морфофункционального состояния иммунокомпетентных органов, а также их клеточного состава, весьма актуально и может служить прогностическим критерием действия иммунобиологических препаратов на макроорганизм.

Цель работы

Выявить закономерности формирования иммунного ответа макроорганизма на введение Yersinia pestis EV НИИЭГ в сочетании с металлосодержащими на-нобиокомпозитами на основе арабиногалактана.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:

1. Исследовать характер воздействия металлосодержащих нанобиокомпозитов на основе арабиногалактана на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных.

2. Оценить структурную перестройку иммунокомпетентных органов экспериментальных животных, привитых Y. pestis EV НИИЭГ.

3. Выявить изменения в иммунокомпетентных органах экспериментальных животных в динамике вакцинального процесса, вызванного Y. pestis EV НИИЭГ в сочетании с металлосодержащими нанобиокомпозитами на основе арабиногалактана.

Научная новизна

Впервые для повышения резистентности организма к чуме предложены в качестве эффективных иммуномодуляторов железо- (феррогал), кобальт- (КСНК) и серебросодержащий нанобиокомиозиты (АдАГ) на основе арабиногалактана. Установлено, что эти препараты стимулируют функциональную способность макрофагов морской свинки, активацию систем, способствующих внутриклеточной деградации микроба путем стимуляции кислородзависимых, нитроксидзависи-мых и кислороднезависимых бактерицидных факторов.

В результате впервые проведенного комплексного сравнительного исследования охарактеризованы по ряду важнейших параметров морфологические изменения иммунокомпетентных органов экспериментальных животных в динамике вакцинального процесса, вызванного К рея/й ЕУ в сочетании с металле содержащими нанобиокомпозитами на основе арабиногалактана.

Приоритетными являются данные о том, что арабиногалактан, феррогал и КСНК способствуют усилению иммунного ответа макроорганизма на введение У. резйз ЕУ в сочетании с иммуномодуляторами, повышая тем самым резистентность организма к чуме.

Теоретическое и практическое значение работы

В результате проведенных исследований получены новые данные о морфологических изменениях иммунокомпетентных органов экспериментальных животных, привитых К реяй.ч ЕУ, которые пополняют теоретические знания и определяют направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к возбудителю чумы.

Патогенетически обоснована информативность тестирования клеточного состава центральных и периферических органов иммунной системы экспериментальных животных в динамике вакцинального процесса, вызванного Креийъ ЕУ в сочетании с иммуномодуляторами для оценки иммунной перестройки организма в процессе формирования иммунитета к чуме.

Экспериментально показано, что биоактивная полисахаридная оболочка макромолекулы арабиногалактана может быть использована для создания новых наноматериалов, способных повышать резистентность организма к чуме.

Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении трех методических рекомендаций. По результатам работы оформлено два рационализаторских предложения (2004 г.).

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Иркутского противочумного института, Улан-Удэнского института общей и экспериментальной биологии СО РАН, Новосибирского ГНЦВБ «Вектор», Новороссийской противочумной станции.

Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока.

Положения исследования, выносимые на защиту

1. Фагоциты, стимулированные металлосодержащими нанобиокомпозитами на основе арабиногалактана (феррогал, КСНК, AgAГ), продуцируют медиаторы воспаления (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6), индуцирующие запуск каскада иммунных реакций и активацию систем, способствующих захвату и внутриклеточной деградации чумного микроба путем стимуляции кислородзависимых, нитроксидзависимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов.

2. Применение металлосодержащих нанобиокомпозитов на основе арабиногалактана в условиях иммунизации У. резИя ЕУ активизирует иммунологическую перестройку в тимусе, селезенке и лимфатических узлах животных, которая выражается гиперпластическими процессами (изменение соотношений структурных зон, клеточного состава за счет увеличения количества бластных форм клеток, плазмоцитов и стромальных элементов).

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены на Международной научной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирск, 2004); Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию академика РАМН СССР С.П. Карпова (Москва, 2004); Научно-практической конференции «Противочумная служба в России и ее роль в обеспечении эпидемического благополучия в России» (Москва, 2004); Всероссийской научной конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004); VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); Региональной научной конференции «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения Республики Бурятия» (Улан-Удэ, 2007); Конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008» (Санкт-Петербург, 2008); научных конференциях Иркутского противочумного института (2002-2007).

Диссертация оформлена на основе материалов двух плановых тем НИР с № ГР 01.20.0013859 и № ГР 01.20.0013858 (2000-2008 гг.).

Публикации

По теме диссертации опубликованы 24 научные работы, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, одна монография «Структура и иммуномодулирующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его металлопроизводных».

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, иллюстрирована 42 таблицами и 25 рисунками. Список литературных источников содержит 232 наименования, в том числе 137 - на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальными моделями в основных опытах (иммунизация, получение фагоцитов и т.д.) служили беспородные морские свинки (массой 300-350 г) и белые мыши (18-20 г). Всего в опытах использовано 805 животных: 235 морских свинок, 570 белых мышей. Животных выводили из эксперимента воздушной эмболией сосудов сердца или под наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

При выполнении работы (вакцинация экспериментальных животных, постановка реакций фагоцитоза и т.д.) использовали штамм Y. pestis EV НИИЭГ - вакцинный, авирулентный для экспериментальных животных (далее - EV), который (после двойного пассажа на плотной питательной среде) культивировали на агаре Хоггингера pH 7,2 (производства НИПЧИ) при температуре 28 °С в течение 2 сут.

При изучении фагоцитарной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов использовали переживающую однослойную культуру перитонеальных макрофагов (Фрейдлин И.С., 1984, 1986). Интенсивность фагоцитоза оценивали по фагоцитарному числу, проценту активных фагоцитов, цитопатическому действию бактерий и индексу завершенности фагоцитоза. Активность гаюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ, КФ 1.1.1.49) изучали по методу М.И. Прохоровой (1982), НАДФ Н-оксидазы (КФ 1.6.2.-) R.L. Baehner, D.G. Nathan (1968) в модификации (Голубинский Е.П. и др., 1995), супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.1) - по методу Б.Н. Матюшина и др. (1991), NO-синтазы - по методу S.J. Green с соавг. (1994) в нашей модификации (Дубровина В.И. и др., 2008), миелопероксидазы (МПО, КФ 1.11.1.7) и содержание неферментных катионных белков (НКБ) спектрофотометрически по методу JI.M. Сомовой (2005). Для оценки интенсивности образования в фагоцитирующих клетках метаболитов кислорода использовали НСТ-тест (Park В.Н. et al., 1968). ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а выявляли в культуре макрофагов с помощью иммуноферментного метода (тест-система на основе моноклональных антител, «Calteg», Канада). Для оценки иммуногенеза исследовали иммунокомпетентные органы (регионарные лимфатические узлы, селезенка, тимус) через 3, 7, 14, 21 сут. от момента иммунизации. Материал фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, заливали в парафин. Тканевые срезы толщиной 6 мкм окрашивали гематоксилин-эозином, по Ван-Гизону (Лили Р., 1969), метиловым

зеленым-пиронином (Меркулов Г. А., 1968). В работе использовали методы обзорной микроскопии. Количественную оценку клеточного состава и объемных долей коркового и мозгового вещества лимфатического узла и тимуса, а также белой и красной пульпы селезенки проводили с использованием морфометрии (при увеличении окуляра - 7, объектива - 8, на площади квадрата сетки 360000 мкм2, в 10 полях зрения) (Автандилов Г.Г., 1990) и компьютерной программы «Motic Images Plus» (версия 2) в следующих структурных компонентах: лимфатический узел -герминативный центр (реактивный) и корона лимфатического фолликула; тимус -корковое и мозговое вещество; селезенка-периартериальная зона, реактивный центр, мантийная и краевая зоны лимфатического фолликула (100 измерений клеточных элементов в различных участках на 5 срезах при помощи 25-узловой сетки на условной единице площади гистологического среза, равной 2500 мкм2, с использованием масляной иммерсии при увеличении окуляра - 7, объектива - 90). Автоматический анализ изображения производили с помощью светового микроскопа «Zeiss» (Германия) с видеокамерой «Moticam 2000», разрешение 1392 х 1040 пикселей, об. 100. Подсчитывали число следующих видов клеток с помощью программы «ВидеоТест-Морфология», версия 4 (Санкт-Петербург): властные формы клеток, малые лимфоциты, средние лимфоциты, плазматические клетки, макрофаги, а также стромальные элементы. Критериями дифференцировки являлись форма, размер и цвет клетки, ядерно-цитоплазматическое соотношение, плотность ядра. Относительное содержание венозных сосудов, а также соединительной ткани и телец Гассаля определяли, подсчитывая их количество в узловых точках стереометрической сетки на стандартной площади среза - 14400 мкм2.

Все полученные материалы обработаны статистически стандартными параметрическими методами с использованием t-критерия Стыодента и непараметрическим методом Манна-Уитни с применением стандартного пакета программ «Statistica», версия 6 (CopyrightOStat Soft, Inc. 19842001, ИПЧИ 31415926535897) и пакета программ Microsoft Excel (2003) корпорации Microsoft. Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: М - среднее арифметическое, 5 - среднее квадратичное отклонение, m - ошибка среднего. Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки была меньше 0,05 (р < 0,05) по отношению к контролю.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Действие нанобиокомпозитов на основе арабиногалактана на неспецифическую резистентность организма экспериментального животного

В опытах in vitro исследовали действие экспериментальных препаратов, содержащих высокодисперсные водорастворимые наноразмерные частицы серебра, кобальта или железа, инкапсулированные в полимерную матрицу АГ (содержание металла от 1,0 до 4,0 %), любезно предоставленных нам сотрудниками Иркут-

ского института химии им. А.Е. Фаворского, на функциональную активность иммунокомпетентных клеток морской свинки.

Фагоциты примировали АГ, АдАГ, КСНК или феррогалом в дозах 2 мг/мл в течение 60 мин при 37 °С. Контролем служили интактные перитонеальные макрофаги.

В опытах с использованием морских свинок (235) и белых мышей (75) нами показано, что и АГ, КСНК, АдАГ и феррогал обладают стимулирующими свойствами.

Представленные на рисунке 1 данные свидетельствуют об активирующем действии АГ, КСНК, АдАГ и феррогала на цитокинпродуцирующую функцию макрофагов белых мышей.

Рис. 1. Влияние арабиногалактана, феррогала, КСНК и АдАГ на продукцию ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6 перитонеальными макрофагами белых мышей (М ± т).

Наиболее выраженный стимулирующий эффект в отношении ИЛ-1 отмечен -у феррогала и АдАГ, причем феррогал по степени активации продукции ИЛ-1 заметно превосходил АГ и КСНК (р < 0,05). Показано, что все исследованные препараты также оказывают влияние и на продукцию ИЛ-6 перитонеальными макрофагами, но достоверных различий между АГ и нанобиокомпозитами, синтезированными на его основе не выявлено.

При исследовании продукции ФНО-а под влиянием АГ, КСНК, AgAГ или феррогала отмечено, что АГ и нанобиокомпозиты серебра, железа и кобальта активируют синтез ФНО-а фагоцитов белых мышей. Наиболее высокие показатели активизации синтеза этого цитокина зафиксированы при воздействии КСНК.

АГ, АдАГ, КСНК и феррогал оказывают примерно равной выраженности стимулирующее действие на поглотительную активность фагоцитов. Этот вывод подтверждает положительная тенденция изменения всех трех использованных показателей эффективности фагоцитоза. Однако наиболее впечатляющим в этом плане является почти двукратный рост ИЗФ - показателя, свидетельствующего о качественном сдвиге (с -90,7 ± 18,1 до -45,8 ± 9,6 в случае АГ, -37,3 ± 3,7 -феррогала, +6,3 ± 1,2 - АдАГ и +7,6 ± 1,7 - КСНК) в процессе, определяющем судьбу возбудителя чумы в макроорганизме.

Как АГ, АдАГ, КСНК, так и феррогал стимулируют метаболическую активность перитонеальных макрофагов, усиливая их способность к восстановлению нитросинего тетразолия в диформазан (рис. 2).

0,032 ± 0,005 0,031 ± 0,005 0.03310003

0,035 0,03 0,025 0,02 0,0150,01 0,0050

0,024 ±0,005

rz

АГ

АдАГ

КСНК

Феррогал Контроль

Рис.2. Влияниеарабиногапактана, феррогала,КСНКиАдАГнакислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов морской свинки (НСТ-тест).

Установлено, что значения НСТ-теста у ПМ под воздействием КСНК были в 1,4 раза выше (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем у контрольных. Достоверных различий между исследованными препаратами не выявлены, тем не менее, у фагоцитов, стимулированных АГ, показатели имели тенденцию к повышению.

Показано, что как АГ, так и все использованные нанокомпозиты оказывают стимулирующее воздействие на каталитическую способность Г6ФДГ перитонеальных макрофагов. При сравнительном анализе показателей активности фермента в фагоцитах установлено, что под воздействием AgAr и феррогала они были в 1,7 и 2,2 раза выше по сравнению с АГ и контролем соответственно (р < 0,05).

Установлено, что у макрофагов, стимулированных in vitro препаратами, активность СОД несколько выше, чем в контроле, но, тем не менее, достоверными результаты были только в случае применения АГ и феррогала. При сравнительном анализе всех исследованных нанокомпозитов наибольший стимулирующий эффект выявлен у АГ.

АГ, КСНК, феррогал и AgAr усиливают выработку монооксида азота как перитонеальных макрофагов, так и ПЯЛ. Надо сказать, что действие AgAr на ПЯЛ и ПМ не было равнозначным. Наибольшее стимулирующее действие AgAr на синтез монооксида азота выявлено у ПЯЛ. Показатели активности NO-синтазы ПЯЛ, стимулированных нанобиокомпозитом серебра, были в 6,1 раза выше (р <0,01), чем у ПМ.

Показано, что феррогал оказывал стимулирующее действие на активность НКБ полиморфноядерных лейкоцитов (рис. 3), показатели содержания НКБ в этом случае в 1,9 раза выше, чем в контроле (р < 0,01). Влияние АГ, AgAr и КСНК имело тенденцию к повышению активности НКБ фагоцитов.

В целом, резюмируя представленный фактический материал, можно сделать заключение, что феррогал, КСНК и AgAr на основе арабиногалактана in vitro сти-10

мулируют синтез медиаторов воспаления (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6), обеспечивающих запуск каскада иммунных реакций, способствующих завершенности фагоцитоза чумного микроба с участием кислородзависимых, нитроксидзависимых и кислород-независимых бактерицидных систем фагоцитов экспериментальных животных.

АГ АдАГ КСНК Феррогал контроль

Рис. 3. Содержание неферментных катионных белков полиморфноядерных лейкоцитов морской свинки (М ± т).

Исследованные нами металлосодержащие нанобиокомпозиты на основе АГ сохранили его иммуномодуляторные свойства, а в отдельных случаях феррогал, А£АГ и КСНК даже превосходили арабиногалактан.

2. Изменения в иммунокомпетентных органах животных в динамике вакцинального процесса, вызванного У. ревйв ЕУ с иммуномодуляторами

Учитывая приоритетную роль клеточно-опосредованного иммунного ответа в реализации иммунитета к чуме, а также тот факт, что в литературе отсутствуют сведения о влиянии XреяЧз ЕУ НИИЭГ на клеточный состав иммунокомпетентных органов экспериментальных животных, на первом этапе было проведено исследование в этом направлении, а также дана оценка действия экспериментальных препаратов (АГ, феррогал, КСНК) на эти органы с применением мор-фометрического метода.

При изучении возможности усиления иммунного ответа против чумы нанобио-композитами на основе арабиногалактана использовали 495 беспородных белых мышей. Животных I группы вакцинировали подкожно (в правую заднюю лапу) У. реяйз ЕУ в дозе 104 КОЕ (ИД50) в сочетании с АГ, КСНК или феррогалом (2 мг/кг). Мышам II группы вводили аналогичным способом У. реяШ ЕУ, П1 группы - АГ, КСНК или феррогалом (2 мг/кг). Контролем служили интактные животные.

При изучении клеточного состава структурно-функциональных зон тимуса было установлено, что в III группе животных на 3-7 сут. имеет место увеличение бластных форм клеток в субкапсулярной зоне коры в 1,6-2,1 раза, а на 14 сут. в 1,4—1,6 раза по сравнению с контролем (р < 0,05). Абсолютное содержание лимфоцитов к 7 сут. незначительно повышается от 66,8 ± 0,5 (показатель в контроле) до 75,1 ± 0,60, но в последующие сроки наблюдения (14-21 сут.) не отличается от таковых в контроле.

В мозговом веществе тимуса животных III группы количество лимфоцитов и макрофагов во все сроки наблюдения было приближено к показателям в контрольной группе. Как показал детальный анализ, к 7 сут. наблюдения в III группе животных имело место повышение количества эпителиальных клеток в 1,5 раза, на 14 сут. - в 1,3 раза (р < 0,05), а на 21 сут. - соответствовало контролю.

При оценке действия экспериментальных препаратов на структурные изменения в лимфатических узлах III группы животных нами установлено, что увеличение (р < 0,05) доли коркового вещества на 7-14 сут. (в 1,2-1,4 раза по сравнению с контролем), связано с гиперплазией лимфатических фолликулов и наличием в них центров размножения. К 21 сут. этот показатель достигает уровня в контроле. Увеличение доли корковых структур свидетельствует о повышении функциональной активности клеток, сопровождающемся изменением клеточного состава фолликулов лимфатических узлов. В реактивных центрах с 3 по 14 сут. сохраняется высокий уровень бласттрансформации (увеличение количества бластных клеток в 1,6-2,6 раза по сравнению с контролем при р < 0,05), повышение абсолютного содержания макрофагов (с 1,0 до 1,8) к 7 сут. с последующим снижением к 21 сут.

В селезенке животных III группы выявлены изменения в структурных компонентах белой пульпы, проявляющиеся достоверным (р < 0,05) увеличением периартериальной зоны (в 1,3-1,5 раза к 7 сут.) и реактивного центра (в 1,6-1,8 раза к 3 сут. и в 1,7-2,2 раза к 7 сут.) за счет усиления бласттрансформации, процессов деления и дифференцировки клеток, а именно - появления бластов в этих структурных элементах.

Детальный анализ клеточного состава селезенки мышей, иммунизированных АГ, КСНК или феррогалом показал, что, начиная с 3 сут. эксперимента, наблюдается тенденция к увеличению бластных форм клеток и лимфоцитов в реактивном центре и периартериальной зоне, а также малых лимфоцитов в реактивном центре (р < 0,05), достигая максимальных значений к 7 сут. В мантийной зоне на 7-14 сут. отмечено повышение количества малых лимфоцитов (в 1,2—1,7 раза по сравнению с контролем при р < 0,05), что, возможно, связано с выходом лимфоцитов из реактивного центра.

В мозговых тяжах лимфатических узлов и в красной пульпе селезенки у животных III группы в течение всего эксперимента установлена активная плаз-моцитарная реакция, характеризующаяся повышением количества плазмоцитов по сравнению с контролем (от 0,20 ± 0,01 до 5,25 ± 0,06 при р < 0,01).

Таким образом, показано, что металлосодержащие нанобиокомпозиты на основе АГ, так же как и АГ per se (Belicova А. et al., 2001), усиливают пролиферацию иммунных клеток макроорганизма.

Морфометрическое исследование действия У. pestis EV в сочетании с имму-номодуляторами выявило изменения структурных компонентов тимуса. Так, на 3 сут. у мышей I опытной группы по сравнению со II {Y. pestis EV - 33,9 ± 0,3 %), наблюдалось достоверное увеличение объема коркового вещества (от 39,3 ± 0,3 % до 49,8 ± 0,5 %), которое продолжало повышаться до 21 сут. 12

У мышей, привитых У. реэНз ЕУ, в первые сроки наблюдения (3-7 сут.) уменьшение объема коркового вещества может быть объяснено стресс-реакцией и развитием акцидентальной инволюции тимуса. В то же время у животных, иммунизированных У. резй.ч ЕУ в сочетании с иммуномодуляторами, в течение всего эксперимента отмечалось плавное увеличение объема коркового вещества, что указывало на пролонгированное корригирующее действие АГ, КСНК и фер-рогала и, таким образом, сокращение сроков латентного периода иммунного ответа. Надо отметить, что при применении феррогала и КСНК этот показатель был выше, чем при использовании АГ.

Во все сроки наблюдения в субкапсулярной зоне коркового вещества тимуса мышей, иммунизированных комплексом У. резШ ЕУ с иммуномодуляторами (АГ, КСНК или феррогал), имеет место увеличение в пределах в 1,2-2,8 раза (при р < 0,05) количества малодифференцированных бластов по сравнению со II группой, с последующей их дифференцировкой и созреванием, что приводит к повышению содержания зрелых лимфоцитов, как в корковом, так и в мозговом веществе тимуса животных I опытной группы к 14—21 сут.

В ходе настоящего исследования было установлено, что у животных, иммунизированных У. ре.?//.? ЕУ в сочетании с иммуномодуляторами с 7 по 21 сут. количество ретикулоэпителиальных клеток тимуса мозгового вещества в 1,3-1,6 раза больше, чем во II группе (прир < 0,05). Необходимо отметить, что содержание тимических телец у мышей I группы практически не изменялось и не имело тенденции к снижению, что может служить показателем функциональной активности тимуса.

Показано, что количество активированных макрофагов в мозговом веществе тимуса к 7 сут. (р < 0,05) в 1,4—1,7 раза превышает показатели во II группе, что указывает на функциональную перестройку органа. Однако к 21 сут. в I группе наблюдается тенденция к снижению их содержания.

В результате исследования было выявлено, что у экспериментальных животных имеет место достоверное увеличение объемной доли стромы тимуса во все сроки наблюдения. Причем у животных после введения У. ре.чИ.ч ЕУ в сочетании с иммуномодуляторами этот показатель более выражен, чем во II группе, что свидетельствует об укреплении гематотимуснош барьера. При морфометрии тимуса отмечено увеличение объема сосудистого русла мозгового вещества по сравнению со II группой, но достоверными различия (р < 0,05) были в группах животных, иммунизированных У. реяНв ЕУ в сочетании с феррогалом и КСНК, на 3 сут. и на 21 сут. только в случае применения КСНК.

Сравнительный анализ между группами обследованных животных в зависимости от примененного препарата (АГ, феррогал, КСНК) показал, что тимус экспериментальных животных обладает высокой чувствительностью к воздействию иммуномодуляторов и отвечает значительной морфофункциональной перестройкой. Тем не менее, среди использованных для сочетанного применения с У. /зе.?//'.у ЕV препаратов КСНК обладает наибольшим стимулирующим эффектом, что подтверждает ранее полученные нами данные о повышении этим нанобиокомнозитом протективных свойств чумной вакцины (Дубровина В.И. и др., 2007).

При морфометрии лимфоузлов и селезенки обнаружены структурные признаки развития иммунных реакций по клеточному и гуморальному типам. Это выражалось в увеличении площадей Т-зависимых и В-зависимых зон лимфо-идных узелков, а также в повышении количества малых лимфоцитов, зрелых плазмоцитов и макрофагов.

В лимфатических узлах белых мышей, привитых как У. резИз ЕУ, так и У. рехйя ЕУ в сочетании с АГ, феррогалом или КСНК, имеет место гиперплазия ткани фолликулов. Количество фолликулов со светлыми центрами у опытных животных возрастает уже к 3 сут. после иммунизации, достигает максимума к 7 сут. и постепенно снижается к 21 сут. Это подтверждается увеличением объемной доли коркового вещества в лимфатических узлах животных, получивших У. />е.у/м ЕУ совместно с иммуномодуляторами, в сравнении со II группой. Достоверные различия (р < 0,05) по увеличению объемной доли коркового вещества имели место только на 14 и 21 сут. у мышей, стимулированных У. резНя ЕУ в сочетании с арабиногалактаном, по сравнению с другими препаратами (рис. 4).

кв _ пкз

7 14

Сроки, сутки

7 14 Сроки, сутки

MB

□ Y. pestis EV

□ Y. pestis EV+АГ

□ Y. pestis EV+феррогал , S Y. pestis EV+ KCHK

Контроль

7 14

Сроки (сутки)

Рис. 4. Соотношение структурных компонентов лимфатических узлов.

Примечание: КВ - корковое вещество; ПКЗ - паракортикальная зона; МВ - мозговое вещество; * - р< 0,05 (по сравнению с У. реэйэ Е\/).

В ходе выполнения данной работы было установлено, что увеличение реактивных центров сопровождается увеличением числа бластных форм клеток в результате процессов бласттрансформации. Так, с 7 сут. имеет место незначи-14

тельное повышение содержания бластов в реактивном центре опытных животных I группы, которое к 14 сут. (в 1,3-1,5 раза выше, чем во II группе при р < 0,05) достигает максимальных значений и к 21 сут. снижается, но, тем не менее, превышает показатели во II группе. Количество лимфоцитов в этой зоне лимфатического фолликула во все сроки наблюдения было несколько ниже в I опытной группе, чем во II, а содержание малых лимфоцитов и ретикулярных клеток - в пределах значений II группы животных. Статистически значимые данные по наличию макрофагов в этой зоне выявлены на 7 сут. у мышей, стимулированных У. ЕУ в сочетании как с АГ, так и феррогалом, КСНК.

Принимая во внимание представленные выше материалы, уместно сделать вывод о том, что повышение числа бластных форм клеток в реактивном центре лимфатического фолликула животных I группы, дальнейшее их созревание и миграция приводят к увеличению числа малых лимфоцитов и плазматических клеток в короне узелка на 14-21 сут. эксперимента. Так, содержание плазмоцитов в этой зоне к 14 сут. достоверно повышается в 1,2-1,3 раза (р < 0,05) в I опытной группе по сравнению со II, а к 21 сут. - только у животных, привитых У. ре.чи.ч ЕУ в сочетании с феррогалом и АГ.

Как показало проведенное исследование лимфатических узлов экспериментальных белых мышей I и II группы, объем тимусзависимой зоны (паракорти-кальной) к 14—21 сут. имел тенденцию к увеличению, но, тем не менее, даже незначительное увеличение доли паракортикальной зоны узлов указывает на миграцию малых лимфоцитов из тимуса, хотя местные пролиферативные процессы, безусловно, также имеют значение.

Объемные доли мозгового вещества у животных, иммунизированных У. реяН.ч ЕУ в сочетании с иммуномодуляторами, во все сроки наблюдения были несколько ниже, чем во II группе.

Следует отметить, что количество плазмоцитов в мозговых тяжах регионарных лимфатических узлов к 7 сут. эксперимента достигает максимальных значений у всех групп животных (рис. 5), однако в I опытной группе этот показатель в 1,3-1,5 раза превышает таковой во II (р < 0,05), постепенно снижается к 21 сут.,

а У. резИв ЕУ

□ У. ревИв ЕУ+АГ

В У. рвэйв ЕУ +феррогал

В У. реяНв ЕУ + КСНК -Кошроль

Сроки (сутки)

Рис. 5. Количество плазмоцитов в мозговых тяжах регионарных лимфатических узлах. Примечание: * - р < 0,05 (по сравнению с У. резйэ ЕУ).

но остается достоверно выше в I, чем во II группе.

% 36

Таким образом, АГ, феррогал и КСНК при сочетанием применении с ¥. pe.sli.s-ЕУ стимулируют иммунные реакции организма, а морфологические изменения, как в тимусзависимых, так и тимуснезависимых зонах лимфатических узлов, способствуют эффективной иммунной перестройке защитных систем организма и усилению иммунного ответа.

Показано, что к 7 сут. наблюдения в селезенке мышей всех групп имелась тенденция к увеличению доли белой пульпы (от общего объема органа), показатели которой в I опытной группе животных были больше (рис. 6). К 14—21 сут. отмечается незначительное уменьшение объема белой пульпы в I группе, но, тем не менее, у животных, привитых КЕУ в сочетании с АГ и феррогалом (р < 0,05) были достоверно выше относительно показателей II группы.

% 80 ■

7 14

Сроки (сутки)

СЗ У. реэЧв EV В У. ревМз ЕУ+ДГ

7 14

Сроки (сутки)

В У. ре5Мз ЕУ +феррогал ШУ. реэИз ЕУ + КСНК

Контроль

Рис. 6. Соотношение объемных долей белой и красной пульпы селезенки. Примечание: БП - белая пульпа; КП - красная пульпа; * - р < 0,05 (по сравнению с У. ревив Е\/).

Установлено, что во все сроки наблюдения в селезенке белых мышей I группы независимо от введенного иммуномодулятора имело место увеличение доли периартериальной зоны (от общего объема фолликула селезенки) по сравнению со II группой во все сроки наблюдения, превышая тако'вые показатели во II группе в 1,3-2,6 раза (р < 0,05).

При изучении структурно-функциональных зон белой пульпы селезенки с помощью морфометрического метода установлено, что у животных I группы на 7-14 сут. имела место тенденция к увеличению доли реактивных центров (от общего объема лимфоидного фолликула), но, тем не менее, достоверными различия были только на 14 сут. в случае применения в качестве иммуномодуляторов феррогала и КСНК (р < 0,05). К 21 сут. объемные доли реактивных центров всех экспериментальных животных отличались друг от друга не существенно.

Как показало проведенное исследование клеточного состава герминативных центров лимфатических фолликулов селезенки подопытных белых мышей, коли-

чество бластных форм клеток во всех группах имело тенденцию к повышению, с пиком на 7 сут. и плавным снижением к 21 сут. При этом в группе животных, которым вводили У. рехИя ЕУ совместно с АГ, количество бластов на 3 сут. в 1,2 раза больше (р < 0,05), чем во II группе. Отмечено увеличение в этой зоне во все сроки наблюдения количества малых лимфоцитов в 1,2-1,4 раза в I группе по сравнению с животными, вакцинированными У. реьНз ЕУ (р < 0,05).

Тенденция к увеличению мантийной зоны лимфатического фолликула селезенки связана с миграцией лимфоцитов из реактивного центра к периферии узелка, приводящей к повышению содержания лимфоцитов в этой зоне. Установлено, что на 14-21 сут. содержание малых лимфоцитов в мантийной зоне животных I группы в 1,2-1,3 раза выше по сравнению со II (р < 0,05). У белых мышей, привитых У. резНй ЕУ в сочетании с иммуномодуляторами, количество плазматических клеток в этой зоне лимфоидного фолликула селезенки к 7 сут. эксперимента имеет тенденцию к увеличению, но достоверные различия отмечены только на 21 сут., а на 14 сут. у всех, кроме животных, вакцинированных У. реайя ЕУ с феррогалом. Содержание макрофагов в мантийной зоне на 7 сут. в 1,2 раза выше (р < 0,05) у животных I группы.

При детальном анализе краевой зоны лимфоидного фолликула селезенки установлено, что абсолютное количество лимфоцитов во всех группах животных имело тенденцию к увеличению, но достоверных различий не выявлено. В связи с этим, объемная доля краевой зоны (от общего объема лимфоидного фолликула) во всех экспериментальных группах не отличалась.

Установлено, что у белых мышей I опытной группы (рис. 7) количество плазмоцитов в тяжах красной пульпы селезенки, по сравнению со II группой, значительно увеличивается на 7-14 сут. в 1,3-2,4 раза (р < 0,05 —р < 0,01), а на. 21 сут. в 1,4-1,8 раза только у животных, иммунизированных У реБйх ЕУ в сочетании с АГ и КСНК (р < 0,05).

% 24

в У.реэИэ ЕУ И У-ревКв ЕУ+АГ □ У.реэиэ ЕУ + феррогал б У.реэИз ЕУ + КСНК

7 14

Сроки (сутки)

Рис. 7. Количество плазмоцитов в красной пульпе селезенки. Примечание: р < 0,05; ** - р < 0,01 (по сравнению с У. рев^'в В/).

Сравнительный анализ полученных данных между группами обследованных экспериментальных животных в зависимости от введенного нанокомпозита по-

17

казал разноплановую направленность действия этих препаратов на отдельные структурно-функциональные компоненты селезенки. Наиболее выраженные отличия были выявлены в случае применения АГ и КСНК, что может являться объяснением повышения этими нанокомпозитами протекгивных свойств Кpeslis EV (Дубровина В.И., 2004).

В целом, резюмируя представленный фактический материал по изучению морфологических изменений иммунокомпетентных органов экспериментальных животных в динамике вакцинального процесса, вызванного Y. pestis EV, и влияния металлосодержащих нанобиокомпозитов на основе арабиногалактана на иммунную перестройку организма, следует заключить, что арабиногалактан, феррогал и КСНК при сочетанном применении с Y. pestis EV усиливают иммуноцитопоэтическую функцию органов иммунной системы в большей степени, чем Y. pestis EV.

На основе полученных экспериментальных данных выявлены закономерности усиления иммунного ответа макроорганизма на введение Y. pestis EV в сочетании с металлосодержащими нанобиокомпозитами на основе арабиногалактана, и предложена концептуальная схема механизмов формирования резистентности организма к чуме при одновременном введении Y. pestis EV в сочетании с араби-ногалактаном, феррогалом или КСНК (рис. 8).

ВЫВОДЫ

1. Железо- (феррогал), серебро- и кобальтсодержащие нанобиокомпозиты (КСНК) на основе арабиногалактана in vitro стимулируют кислородзависимые, нитроксидзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных.

2. Металлосодержащие нанобиокомпозиты на основе арабиногалактана in vitro стимулируют синтез медиаторов воспаления (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6), обеспечивающих запуск каскада иммунных реакций, способствующих завершенности фагоцитоза чумного микроба.

3. К pestis Е V при парентеральном применении оказывает влияние на клеточный состав тимуса, лимфоидных фолликулов селезенки и лимфатических узлов экспериментальных животных (увеличение бластоцитарной и плазмоцитарной популяций, гиперплазия ретикулярной ткани, лимфоидная гиперплазия), что свидетельствует об иммунной перестройке организма.

4. Арабиногалактан, феррогал и КСНК усиливают иммуногенное действие вакцинного штамма Y. pestis EV, увеличивая количество лимфоидных клеток в корковом веществе тимуса, Т- и В-зависимых зонах селезенки и лимфатических узлов, что приводит к повышению количества плазмоцитов на 7-14 сут. в 1,3-2,4 раза по сравнению с контролем (X pestis EV).

5. Морфологические изменения в тимусе, лимфатических узлах и селезенке (в тимусзависимых и тимуснезависимых зонах) свидетельствуют о влиянии арабиногалактана, феррогала и КСНК при сочетанном применении с Y. pestis EV как на клеточное, так и на гуморальное звено иммунного ответа.

У. резНз ВУ +иммуномодулятор

Активированные фагоциты

I Фагоцитарная активность

1 Кислородзависимые (НСТ-тест, Г6ФДГ, НАДФН-оксидаза, СОД, МПО) и кислороднезависимые (НКБ) бактерицидные системы

Нитроксидзависимые бактерицидные системы (М0-синтаза)

ИЛ-13, ИЛ-6, ИЛ-8

ИЛ-12. ФНОа

Иммунокомпетентные органы

Активация антигенпрезентирующих клеток

Бласттрансформация, пролиферация и дифференцировка лимфоцитов

Синтез цитокинов и других БАВ

Цитотоксическая активность в отношении возбудителя

Созревание антигенспецифических лимфоцитов и плазмоцитов

Формирование резистентности организма к чуме

Рис. 8. Концептуальная схема механизмов формирования резистентности организма к чуме при одновременном введении У. реэйэ ЕУ в сочетании с арабиногалактаном, феррогалом или КСНК. Примечание: данные литературы выделены курсивом.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние кобальтсодержащего производного арабиногалактана на функциональную активность макрофагов экспериментального животного / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, CA. Медведева, Г.П. Александрова, Ж.А. Коновалова, С. А. Витязева // Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ Микробиологии МО РФ. - Киров, 2003. - С. 79-80.

2. Влияние антигенов Yersiniapestis на синтез окиси азота перитонеальными макрофагами морской свинки / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Т.Ю. Загоскина, Е.Ю. Марков, В.Б. Николаев, A.A. Докорина, С.А. Витязева // Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы: Материалы между-народн. конгр., 4-5 сентября 2003 г. - СПб., 2003. - С. 131.

3. Изучение влияния феррогала на протекгивпые и цитокининдуцирукнцие свойства Yersinia pestis EV / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, С. А. Медведева, Г.П. Александрова, Ж. А. Коновалова, С. А. Витязева// 100-летие академика АМН СССР С.П. Карпова: Материалы межрегиональн. конф., октябрь 2003 г. - Томск,

2003.-С. 71.

4. Studing of ferrogale effect on protective properties of Yersinia pestis EV / V.l. Dubrovina, E.P. Golubinsky, T.A. Ivanova, S.A. Medvedeva, G.P. Aleksandrova, Sh.A. Konovalova, S.A. Vityazeva [et al.] // Scientific J. Centre Control Res. Natural Infect. Diseases.-2003.-N 11.-P. 118-122.

5. Арабиногалактан и феррогал как факторы коррекции функционального состояния системы мононуклеарных фагоцитов при их взаимодействии с Yersinia pestis EV/В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, С.А. Медведева, Г.П. Александрова, Ж.А. Коновалова, С.А. Витязева // Бюл. Вост.-Сиб. науч. центра Сибирского отделения Российской АМН. - 2004. - Т. 2. - № 1. - С. 76-80.

6. Влияние кобальтсодержащего производного арабиногалактана на состояние бактерицидных систем фагоцитов при иммунизации против чумы / В.И. Дубровина, С.А. Витязева, Ж.А. Коновалова [и др.] //Медицинская микробиология - XXI век: Материалы Всерос. науч. конф., 28-30 сентября 2004 г. -Саратов, 2004. - С. 78-79.

7. Влияние Yersinia pestis EV в сочетании с феррогалом или арабиногалак-таном на процесс иммуногенеза / С.А. Витязева [и др.] // Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций: Материалы науч. конф. с международ, участием, 1-2 декабря 2004 г. - СПб,

2004.-С. 198-199.

8. Влияние кобальтсодержащего производного арабиногалактана на повышение резистентности организма к чуме / С.А. Витязева [и др.] // Узловые вопросы борьбы с инфекцией: Материалы Всерос. науч. конф., 1-2 декабря 2004 г. - СПб, 2004.-С. 51.

9. Изучение влияния феррогала на протективные и цитокининдуцирующие свойства Yersinia pestis EV / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, ТА. Иванова, С.А. Медведева, Г.П. Александрова, Ж.А. Коновалова, С.А. Витязева // Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики

актуальных инфекций: Материалы науч. конф. с международ, участием, 1-2 декабря 2004 г. - СПб, 2004. - С. 198.

10. Изучение влияния арабиногалактана и его производных на функциональную активность фагоцитов / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Ж. А. Коновалова, Т. А. Иванова, С. А Витязева [и др.] // Санитарная охрана территорий государств

- участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Материалы VI Межго-суд. науч.-практ. конф., 13-14 сентября 2005 г. - Волгоград, 2005. - С. 141-142.

11. Влияние антигенного комплекса Yersinia pestis EV в сочетании с ара-биногалактаном на функциональную активность фагоцитов / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, Е.Ю. Марков, Т.А. Иванова, В.Б. Николаев, Ж.А. Коновалова, С.А. Витязева // Санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Материалы VI Межгосуд. науч.-практ. конф., 13-14 сентября 2005 г. - Волгоград, 2005. - С. 143-144.

12. Influence of Yersinia pestis EV complex antigenic preparation on functional activiti of phagocytic system cells in the experiment / V.l. Dubrovina, E.P. Golubin-sky, E.Yu. Markov, V.B. Nikolaev, T.A. Ivanova, G.A. Konovalova, S.A. Vityazeva // Scientific journal. - Ulaanbaatar, 2006. -N 14. - P. 193-202.

13. Experimental reasons for combined use of live plague vaccine with plant imunomodulators / S.A. Vityazeva [et al.] // Scientific journal. - Ulaanbaatar, 2006. -N14.-P. 30-36.

14. Влияния серебросодержащего производного арабиногалактана на про-тективные свойства Yersinia pestis EV/В.И. Дубровина, T.A. Иванова, С.А. Медведева, Г.П. Александрова, С.А. Витязева // Фундаментальная наука и практика: Материалы Российского медицинского форума - 2006, 18-20 октября 2006 г. *

- Москва, 2006. - С. 47.

15. Витязева С.А. Методические аспекты гистохимического изучения ферментов иммунокомпетентных клеток макроорганизма / С.А. Витязева // Сиб.-Восток. - 2006. - Вып. 8. - С. 22-26.

16. Применение антигенного комплекса Yersinia pestis EV в сочетании с иммуномодуляторами при экстренной профилактике чумы / В.И. Дубровина, Т.А. Иванова, Е.Ю. Марков, С.А. Витязева [и др.] // Инфекции, обусловленные иерсиниями: вторая науч.-практ. конф. с международ, участием, 12-13 октября 2006 г. - СПб., 2006. - С. 68-70.

17. Нанобиокомпозиты серебра - средства, повышающие неспецифическую резистентность организма к чуме / Г.П. Александрова, Б.Г. Сухов, JI.A. Грищенко, С.А. Медведева, В.И. Дубровина, Т.А. Иванова, С.А. Витязева [и др.] // Создание новых лекарственных препаратов : Материалы научн.-практ. конф., Томск, 12-13 октября 2007 г. - С. 62-63.

18. Структура и иммуномодулирующее действие лиственницы сибирской и его металлопроизводных / В.И. Дубровина, С.А. Медведева, С.А. Витязева [и др.] // Иркутск, 2007. - 145 с.

19. Морфологическая оценка иммунокомпетентных органов животных в динамике вакцинального процесса, вызванного живой чумной вакциной с иммуномодуляторами / С.А. Витязева [и др.] // Деп. в ВИНИТИ 09.07.2007, № 701-В2007. - 11 с.

20. Наноструктурные металлосодержащие биосовместимые материалы -новые потенциальные антимикробные средства / Г.П. Александрова, Б.Г. Сухов, JI.A. Грищенко, С.А. Медведева, Т.В. Фадеева, В.И. Дубровина, Т.А. Иванова, С.А. Витязева [и др.] // Нанотехнологии и наноматериалы для биологии и медицины: Материалы научн.-праюг. конф. 11-12 октября 2007 г. - Новосибирск, 2007.-С. 172-176.

21. Витязева С.А. Изучение возможности применения наноматериалов для повышения иммунного ответа организма / С.А. Витязева [и др.] // Бюл. Вост.-Сиб. науч. центра Сибирского отделения Российской АМН. - 2008. - Т. 60. - № 2. -С. 83-84.

22. Нанобиокомпозиты серебра - перспективные препараты для повышения неспецифической резистентности макроорганизма / Ж.А. Коновалова, С.А. Витязева, О.Б. Колесникова // СПб МАПО «Актуал. вопросы клин, и эксп. медицины - 2008», СПб., 2008 г. - С. 47.

23. Витязева С.А Морфологические изменения в иммунокомпетентных органах животных в динамике вакцинального процесса, вызванного живой чумной вакцины с иммуномодуляторами / С.А. Витязева [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - № 97 (3). - С. 50-53.

24. Влияние комплексного антигенного препарата Yersinia pestis EV на функциональную активность клеток фагоцитарной системы в эксперименте / В.И. Дубровина, Е.П. Голубинский, С.А. Витязева [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008. - № 97 (3). - С. 56-60.

Список документов по внедрению научных достижений в практику

1. Дубровина В.И., Голубинский Е.П., Витязева С.А. Использование показателей NO-синтазной активности макрофагов для оценки иммунной перестройки организма: Метод, рекомендации / Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 2003 - 5 с.

2. Витязева С.А., Старовойтова Т.П., ДубронинаВ.И., Голубинский Е.П. Использование показателей клеточного состава иммунокомпетентных органов экспериментальных животных для оценки иммунной перестройки организма в процессе формирования иммунитета к чуме: Метод, рекомендации / Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 2007 - 7 с.

3. Дубровина В.И., Коновалова Ж.А., Колесникова, О.Б, и др. Определение функциональной способности фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма: Метод, рекомендации / Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. - Иркутск, 2008. - 10 с.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ - арабиногалактан

АдАГ - серебросодержащий нанокомпозит на основе арабиногалактана

БП - белая пульпа

Г6ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ИД50 - доза антигена, вызывающая защитный эффект у 50 % животных

ИЗФ - индекс завершенности фагоцитоза

ИЛИ,-6 - интерлейкины-1, -6

кв - корковое вещество

КОЕ - колонии образующие единицы

кп - красная пульпа

КСНК - кобальтсодержащий нанокомпозит на основе арабиногалактана

мв - мозговое вещество

мкМ - микромоль

мпо - миелопероксидаза

НАДФ - никотинамидадениндинуклеотид фосфат

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный

НСТ-тест - тест с нитросиним тетразолием

НКБ - неферментные катионные белки

ПКЗ - паракортикальная зона

ПМ - перитонеальные макрофаги

ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

СОД - супероксиддисмутаза

ФНО-а - фактор некроза опухолей альфа

Подписано в печать 12.02.2009. Бумага офсетная. Формат 60x84'/,6-Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ № 053-09.

РИО НЦ PBX ВСНЦ СО РАМН (Иркутск, ул. Борцов Революции, 1. Тел 29-03-37. E-mail: arleon@rol.ru)

Актуальность исследования

Чума нанесла неисчислимые жертвы человечеству исторически и продолжает оставаться серьезной угрозой для здоровья населения не только в природных очагах этой инфекции, но и за пределами энзоотичной территории вследствие возможности выноса возбудителя. Увеличение миграции населения, коммерческий туризм, военные конфликты усиливают не только потенциальную, но и реальную опасность завоза этой инфекции в любую страну мира.

В последние годы возбудитель чумы привлекает внимание с точки зрения наиболее вероятного агента биотерроризма [61].

Несмотря.на большие достижения в борьбе с чумой, связанные с использованием антибактериальных препаратов, контролем за носителями и переносчиками чумного микроба в природных очагах, нет уверенности в том, что эпидемии чумы не будут повторяться. Поэтому проблема специс ^ 1 фической профилактики чумы по-прежнему актуальна. Как и раньше, нет единого мнения о преимуществах тех или иных вакцин, методах учета эффективности прививок и способах проведения иммунизации [27, 28, 31, 56, 85]. .

Современная стратегия иммунопрофилактики чумы во многом определяется поиском средств, способных потенциировать иммунные реакции макроорганизма в ответ на введение иммуногенного препарата, повышая, таким образом, эффективность-вакцины при одновременном снижении ее иммунизирующей дозы и уменьшении побочного действия [14, 28, 34, 56, 68].

Приоритетными являются исследования, направленные на создание средств «неспецифической защиты», в частности, путем стимуляции системы врожденного иммунитета, а также разработки алгоритмов на инфицирование патогеном, независимо от вида возбудителя*[34, 35, 36].

Для стимуляции неспецифической резистентности организма большое внимание уделяется полисахаридам растительного происхождения, обладающим широким спектром действия и лишенным ряда недостатков, присущих искусственно синтезированным химическим веществам. Из новых природных соединений можно назвать полисахарид, полученный из клеточных стенок древесины лиственницы - арабиногалактан, обладающий иммуномодулирующим действием, способный вступать в реакции с различными функциональными реагентами, образовывать с ними конъюгаты, уменьшать интенсивность свободно-радикальных процессов, активировать фагоцитоз [62, 28, 54, 137 и др.].

Одним из актуальных направлений для создания новых наноматериа-лов (содержащих биогенные металлы и микроэлементы) с заданными биологическими свойствами [23, 58, 72] является использование в качестве биоактивной полисахаридной оболочки макромолекулы арабиногалактана. В связи с тем, что наличие того или иного металла в клетке имеет важное значение для ее жизнедеятельности, изучение характера воздействия ме-таллосодержащих нанобиокомпозитов на основе арабиногалактана (ферро-гал, кобальт- и серебросодержащий нанокомпозиты) на'неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных перспективно.

Создание новых и усовершенствование уже имеющихся вакцин тесно связано с поиском адекватных методических приемов оценки реакций макроорганизма на эти препараты и эффективности защиты от чумы после иммунизации ими. В этой связи морфологическая характеристика изменений иммунокомпетентных органов, обусловленных вакцинацией, занимает важное место в системе контроля препаратов специфической профилактики инфекционных заболеваний [39, 87].

Использование морфометрического метода для изучения морфологических изменений, происходящих в иммунной системе организма, перспективно и позволяет количественно характеризовать состояние клеточных популяций и взаимоотношения отдельных органных структур [87].

Участие центральных и периферических органов иммунной системы в реализации иммунных реакций и особенности течения вакцинального процесса, вызванного сочетанным применением живой чумной вакцины и им-муномодуляторов природного происхождения, до настоящего времени мало исследованы. В связи с чем, изучение морфофункционального состояния иммунокомпетентных органов, а также их клеточного состава, весьма актуально и может служить прогностическим критерием действия иммунобиологических препаратов на макроорганизм.

Цель работы — выявить закономерности формирования иммунного ответа макроорганизма на введение Yersinia pestis EV НИИЭГ в сочетании с металлосодержащими нанобиокомпозитами на основе арабиногалактана.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:

1. Исследовать характер воздействия металлосодержащих нанобио-композитов на основе арабиногалактана на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных.

2. Оценить структурную перестройку иммунокомпетентных органов экспериментальных животных, привитых Y. pestis EV НИИЭГ.

3. Выявить изменения в иммунокомпетентных органах экспериментальных животных в динамике вакцинального процесса, вызванного Y. pestis EV НИИЭГ в сочетании с металлосодержащими нанобиокомпозитами на основе арабиногалактана.

Научная новизна

Впервые для усиления иммунного ответа на введение Y. pestis EV испытаны железо- (феррогал), кобальт- (КСНК) и серебросодержащий нано-биокомпозиты (AgAT) на основе арабиногалактана. Показано, что эти на-нобиокомпозиты in vitro стимулируют кислородзависимые, нитроксидза-висимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов, способствующие захвату и внутриклеточной деградации микроба путем одновременной активации.

Впервые результаты сравнительного исследования позволили установить ряд важнейших параметров морфологических изменений в иммуно-компетентных органах экспериментальных животных в динамике вакцинального процесса, вызванного У резНБ ЕУ и У. рехйъ ЕУ в сочетании с ме-таллосодержащими нанобиокомпозитами на основе арабиногалактана.

Приоритетными являются данные о том, что арабиногалактан, ферро-гал и КСНК способствуют усилению иммунного ответа макроорганизма на введение У реБШ ЕУ в сочетании с иммуномодуляторами, повышая тем самым резистентность организма к возбудителю чумы.

Теоретическое и практическое значение работы

Получены новые данные о морфологических изменениях в иммуно-компетентных органах экспериментальных животных, привитых У реяНз ЕУ, которые дополняют теоретические знания и определяют направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к чумному микробу.

Патогенетически обоснована возможность тестирования показателей клеточного состава центральных и периферических органов иммунной системы экспериментальных животных в динамике вакцинального процесса, вызванного У резНБ ЕУ в сочетании с иммуномодуляторами для оценки иммунной перестройки организма в процессе формирования иммунитета к чуме.

Экспериментально показано, что биоактивная полисахар и дная оболочка макромолекулы арабиногалактана может быть использована для создания новых наноматериалов, способных повышать неспецифическую резистентность организма.

Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении методических рекомендаций:

Использование показателей ЫО-синтазной активности макрофагов для оценки иммунной перестройки организма» (Иркутск, 2003);

Использование показателей клеточного состава иммунокомпетент-ных органов экспериментальных животных для оценки иммунной перестройки организма в процессе формирования иммунитета к чуме» (Иркутск, 2007).

Определение функциональной способности фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Иркутск, 2008).

По результатам работы оформлено два рационализаторских предложения (Иркутск, 2004).

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы Иркутского противочумного института, Улан-Удэнс-кого института общей и экспериментальной биологии СО РАН, Новосибирского ГНЦВБ «Вектор», Новороссийской противочумной станции.

Материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока.

Положения исследования, выносимые на защиту

1. Фагоциты, стимулированные металлосодержащими нанобиокомпо-зитами на основе арабиногалактана (феррогал, КСНК, AgAГ), продуцируют медиаторы воспаления (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6), индуцирующие запуск каскада иммунных реакций и активацию систем, способствующих захвату и внутриклеточной деградации чумного микроба путем стимуляции кисло-родзависимых, нитроксидзависимых и кислороднезависимых бактерицидных факторов.

2. Применение металлосодержащих нанобиокомпозитов на основе арабиногалактана в условиях иммунизации У. реБ^ ЕУ активизирует иммунологическую перестройку в тимусе, селезенке и лимфатических узлах животных, которая выражается гиперпластическими процессами (изменение соотношений структурных зон, клеточного состава за счет увеличения количества бластных форм клеток, плазмоцитов и стромальных элементов).

Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на:

• Международных научных конференциях: «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2003); «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2004); «Современная ситуация по наиболее часто встречающимся инфекционным болезням» (Улан-Батор, 2006);

• Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003);

• VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств — участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005);

• Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007);

• Второй научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (Санкт-Петербург, 2006);

• Всероссийских научных конференциях: «Медицинская микробиология - XXI век» (Саратов, 2004); «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (Санкт-Петербург, 2004);

• Российском медицинском форуме — 2006 «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006);

• Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию академика АМН СССР С.П. Карпова (Томск, 2003);

• Научно-практических конференциях «Создание новых лекарственных препаратов» (Томск, 2007); «Нанотехнологии и наноматериалы для биологии и медицины» (Новосибирск, 2007);

• Конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008», (Санкт-Петербург, 2008);

• Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2008);

• Научных конференциях Иркутского противочумного института (Иркутск, 2002-2008).

Диссертация оформлена на основе материалов двух плановых тем НИР с № ГР 01.20.0013859 и № ГР 01.20.0013858 (2000-2008 гг.).

Публикации: По теме диссертации опубликованы 24 научные работы, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 3 — в иностранных журналах, одна монография «Структура и иммуномодули-рующее действие арабиногалактана лиственницы сибирской и его метал-лопроизводных».

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 158 страницах машинописного текста, иллюстрирована 42 таб

ВЫВОДЫ

1. Железо- (феррогал), серебро- и кобальтсодержащие (КСНК) нанобио-композиты на основе арабиногалактана in vitro стимулируют кислородзави-симые, нитроксидзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных (морские свинки, белые мыши).

2. Металлосодержащие нанобиокомпозиты на основе арабиногалактана in vitro стимулируют синтез медиаторов воспаления (ФНО-а, ИЛ-1, ИЛ-6), обеспечивающих запуск каскада иммунных реакций, способствующих завершенности фагоцитоза чумного микроба.

3. Арабиногалактан, феррогал и КСНК при парентеральном введении вызывают морфологические изменения в тимусе, лимфатических узлах и селезенке белых мышей (в тимусзависимых и тимуснезависимых зонах), характеризующиеся усилением пролиферации иммунных клеток макроорганизма.

4. Y pestis EV при парентеральном введении способствует изменению клеточного состава тимуса, лимфоидных фолликулов селезенки и лимфатических узлов экспериментальных животных (увеличение бластоцитарной и плазмоцитарной популяций, гиперплазия ретикулярной ткани, лимфоидная гиперплазия), что свидетельствует об иммунной перестройке организма.

5. Арабиногалактан, феррогал и КСНК усиливают иммуногенное действие вакцинного штамма Y. pestis EV, увеличивая количество лимфоидных клеток в корковом веществе тимуса, Т- и В- зависимых зонах селезенки и лимфатических узлов, что приводит к повышению количества плазмоцитов на 7-14 сут. в 1,3-2,4 раза по сравнению с контролем {Y. pestis EV).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Практика многолетнего применения живой вакцины для профилактики чумы позволяет считать этот препарат достаточно эффективным, но не лишенным ряда недостатков, к которым относятся: относительная реакто-генность препарата, выраженное аллергизирующее действие, снижение защитных свойств при заражении атипичными штаммами возбудителя чумы, а главное — непродолжительность вызываемого ею иммунитета [27].

Проведено сравнительное морфологическое исследование с элементами; морфометрического анализа состояния органов иммунной системы и возможного развития нежелательных побочных реакций у белых мышей, связанных с вакцинацией их У резШ ЕУ. Показана перспектива использования морфометрического принципа в морфологическом, исследовании для оценки иммунной перестройки организма [11].

Для исследования выбран: штамм возбудителя чумы - вакцинный У. реяШ ЕУ линии НИИЭЕ. Получены экспериментальные материалы, которые важньь с точки зрения понимания механизмов иммунного ответа,при; внедрении в макроорганизм возбудителя; особо опасной инфекции - чумы и с учетом этого - обоснования направления поиска средств его стимуляции или коррекции.

Как показано ранее, при иммунизации экспериментальных животных живой чумной вакциной в фагоцитах стимулируются биохимические реакции, ответственные за внутриклеточную инактивацию и деструкцию бактерий. Тем не менее, фагоцитоз чумного микроба макрофагами и ПЯЛ привитых морских свинок и тем более — интактных носит незавершенный характер [83].

Известно^ что факторами, лимитирующими эффективность фагоцитоза У. рбБ^Б, являются ингибирующее влияние микроба на процесс слияния фа-госом с лизосомами, дисбаланс окислительного метаболизма фагоцитов,, устойчивость бактерий. к лизосомальным ферментам фагоцитов и их способность, после эндоцитоза попадать в фагосому, избегая губительного действия микробицидных факторов фагоцита [28]. Отсюда становится ясным, что для повышения эффективности фагоцитоза следует направленно воздействовать именно на фагоцитарный процесс, т.е. использовать патогенетически обоснованный подход.

Поскольку макрофаги широко представлены в тканях организма, играют критическую роль в развитии иммунитета, в неспецифическом (врожденном) иммунитете выполняют роль фагоцитирующих клеток с киллер-ной активностью, а также в специфическом адаптивном иммунитете выполняют роль антигенпрезентирующих клеток и продуцируют группу ци-токинов - эндогенных регуляторов иммунного ответа, в связи с этим, моделью для изучения in vitro действия экспериментальных препаратов были выбраны эти клетки [90].

В литературе имеются данные о возможности повышения эффективности фагоцитоза такими препаратами как мурамилдипептид, ликопид, поли-оксидоний, бемитил и другие [36, 64, 69].

Ранее [33] было показано, что для стимуляции специфического иммунитета при чуме может быть использован препарат природного происхождения - арабиногалактан лиственницы сибирской (Larix sibirica, AT) и синтезированные на его основе наноразмерные металлосодержащие композиты: феррогал (железосодержащий) и кобальтсодержащий (КСНК) [14]. Все три препарата водорастворимы, не токсичны и не пирогенны для экспериментальных животных, характеризуются уникальными биологическими свойствами и большими потенциальными возможностями использования их в научных и медицинских целях [5, 45, 46].

В опытах in vitro с использованием морских свинок и белых мышей нами показано, что АГ, КСНК, AgAT и феррогал обладают стимулирующими свойствами. AT, AgAT, КСНК и феррогал, особенно последний, существенно повышали активность НАДФ-Н-оксидазы и супероксиддисмута-зы, стимулировали продукцию монооксида азота, активировали синтез ци-токинов - ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО-а.

АГ, AgAГ, КСНК и феррогал оказывают примерно равной выраженности стимулирующее действие на поглотительную активность фагоцитов. Этот вывод подтверждает положительная тенденция изменения всех трех использованных показателей эффективности фагоцитоза. Однако наиболее впечатляющим в этом плане является рост ИЗФ — показателя, свидетельствующего о качественном сдвиге (с -90,7 ± 18,1 до -45,8 ± 9,6 в случае АГ, -37,3 ± 3,7 - феррогала, +6,3 ± 1,2 — А&АГ и +7,6 ± 1,7 - КСНК) в процессе, определяющем судьбу возбудителя чумы в макроорганизме.

Как АГ, А§АГ, КСНК так и феррогал стимулируют метаболическую активность перитонеальных макрофагов, что показано нами по увеличению их способности к восстановлению нитросинего тетразолия в диформазан.

Установлено, что значения НСТ-теста у ПМ под воздействием КСНК были в 1,4 раза выше (р < 0,05) по сравнению с аналогичным показателем у контрольных. Достоверных различий между исследованными препаратами не выявлены, тем не менее, у фагоцитов, стимулированных АГ и КСНК, показатели были несколько выше, чем в других пробах.

Как показано ранее [28, 83], АГ, КСНК и феррогал при одновременном введении белым мышам с У реБШ ЕУ повышают протективную активность вакцины, что проявляется в существенном снижении средней иммунизирующей дозы в 4,8 раза в случае АГ, в 4,1 раза - феррогала и в 3,5 раза - КСНК (р < 0,05) и, следовательно, снижением реактогенности У. реяия ЕУ. АГ, КСНК и феррогал увеличивают продолжительность жизни белых мышей и сроки их гибели. Аргентоарабиногалактан, введенный белым мышам за сутки и за один час до заражения высоковирулентным штаммом У. резШ И-2683, способствовал повышению продолжительности жизни экспериментальных животных в 1,5 раза, а через один час — 1,8 раза (р < 0,05) по сравнению с контролем (интактные животные). При введении аргентоарабиногалактана вакцинированным У. резШ ЕУ морским свинкам через один час после заражения продолжительность жизни экспериментальных животных увеличивалась в 1,6 раза (р < 0,05), а через 24 часа (6,2 0,2 сут.) незначительно отличалась от контрольной группы (5,2 ± 0,3 сут.).

Установлено, что А§АГ (2 мг/кг, содержание серебра 3,3 %), введенный рег об белым мышам за 14 сут. до заражения вирулентным штаммом чумного микроба У резИя И-2683 (доза 50 ЛД50) и трех суток после, способствовал выживанию 20 % экспериментальных животных по сравнению с контролем (животные, инфицированные У. реъйх И-2683 без предварительной стимуляции AgAГ).

Таким образом, АГ, КСНК, AgAГ и феррогал оказывают комплексное воздействие на макроорганизм, в результате которого в организме животных, получивших иммуномодулирующие препараты, происходит подавление размножения патогенных микробов. Этот факт имеет большое значение, поскольку даже кратковременное замедление размножения микроорганизмов в ходе инфекционного процесса может предотвратить фатальный исход, вызванный возбудителем. Важным достоинством АГ и его металло-содержащих производных является их способность стимулировать синтез ИЛ-1, ФНО-а, для которых в свою очередь характерна иммуномодулирую-щая активность.

Установленные в ходе экспериментов данные указывают на перспективность новых препаратов как корректоров фагоцитоза, а также на возможность использования их в качестве препаратов, повышающих неспецифическую резистентность против бактериальных микроорганизмов. Создание на основе АГ, AgAГ, КСНК и феррогала биологически активных препаратов перспективно и в силу того, что запасы сырья для их производства значительны.

Создание новых и усовершенствование уже имеющихся вакцин тесно связано с поиском адекватных методических приемов оценки ответной реакции макроорганизма на введение вакцинных препаратов. В этой связи, характеристика изменений показателей клеточного состава иммунокомпе-тентных органов, обусловленных вакцинацией, занимает важное место при оценке препаратов специфической профилактики инфекционных заболеваний [28], а традиционные методы регистрации морфологических изменений, оставаясь базовыми, должны дополняться системным количественным исследованием [1, 11]. Анализ соотношения структурных компонентов иммунокомпетентных органов, по мнению М.Р. Сапина [79], позволяет, лучше понять строение иммунных структур, сравнивать их между собой и оценивать их в динамике.

В то же время, изучение морфологических аспектов вакцинации против чумы и развития возможных нежелательных побочных реакций организма с применением морфометрического метода представлены лишь в единичных публикациях [11].

В связи с этим, нами была предпринята попытка, дать характеристику действия Y. pestis EV на иммунокомпетентные органы экспериментальных животных и влияния АГ и синтезированных на его основе металлосодер-жащих нанокомпозитов на иммунную перестройку организма как per se, так и в сочетании с Y. pestis EV.

Учитывая приоритетную роль клеточно-опосредованного иммунного ответа в реализации иммунитета к чуме, а также тот факт, что в литературе отсутствуют сведения о влиянии Y. pestis EV НИИЭГ на клеточный состав иммунокомпетентных органов экспериментальных животных, на первом этапе нами было проведено исследование в этом направлении с применением морфометрического метода.

Большой теоретический и практический интерес представляют изменения в тимусе - центральном органе иммуногенеза при действии профилактических и лекарственных препаратов. Различные воздействия этих средств сопровождаются изменениями клеточного состава тимуса, что, чаще всего, отражается на функциональной активности не только самого органа, но и иммунной системы в целом.

Известно, что тимус, как система, открытая для клеток лимфоидного ряда, находится в тесных взаимодействиях с другими органами иммунной системы. В нем происходит пролиферация костномозговых предшественников Т-лимфоцитов, селекция антигенспецифичных Т-клеток. Лимфоциты мозгового вещества — это зрелые Т—клетки, способные участвовать в реакциях клеточного иммунитета, они постоянно мигрируют в периферические органы иммунной системы — лимфатические узлы, селезенку и др. [21, 86, 87]. Причем, исследователями [2, 94] прослежено заселение лим-фоидными элементами определенных участков периферических органов иммунитета. Такие участки получили название «тимусзависимых зон» лимфоидных органов. К ним относится паракортикальная зона лимфоузлов и зоны, непосредственно прилежащие к центральным артериям лимфатических фолликулов селезенки (периартериальная зона). Вместе с тем, в периферических органах иммунной системы существуют участки, независимые от тимуса. При этом, если в тимусзависимых зонах лимфоидных органов накапливаются лимфоциты, которые по своим иммунологическим параметрам определены как Т—лимфоциты, то в тимуснезависимых зонах обнаруживаются преимущественно лимфоидные элементы, отвечающие на появление антигена трансформацией в плазмоциты и секрецией антител [78, 79].

Как показало проведенное нами исследование, при иммунизации экспериментальных животных У резйз ЕУ в тимусе происходят изменения, характеризующиеся своей двухфазностью. Значительное снижение доли коркового вещества у подопытных животных, увеличение количества бла-стных форм клеток (в 1,3—1,6 раза по сравнению с контролем), установленные в первые дни эксперимента (3-7 сут.), сменяются повышением содержания лимфоцитов с 7 сут. и достижением максимальных значений их к 14—21 сут. (в 1,3 раза выше, чем в контроле).

Возможно, что такое уменьшение объема коркового вещества у подопытных белых мышей связано с миграцией лимфоцитов, а повышение к 21 сут. этого показателя до контрольных значений - активизацией проли-феративных процессов (табл. 17).

Известно, что строма тимуса представлена как эпителиальными, так и соединительнотканными элементами. С эпителиальными клетками, являющимися основными компонентами стромы, и тимическими тельцами (тельца Гассаля) связывают продукцию многочисленных физиологически активных веществ тимуса (тимозин и тимопоэтин). Предполагается также, что кератиноподобный белок тимических телец содержат факторы, воздействующие на дифференцировку тимоцитов и их циркуляцию в токе крови [30, 79, 94]. Существует мнение о том, что при увеличении апоптоза лимфоцитов коры тимуса возрастает число тимических телец [18]. Известно, что апоптоз играет важную роль в обеспечении гомеостаза тканей и осуществляет защитную функцию, элиминируя аутореактивные Т-килле-ры, ограничивая тем самым деструкцию собственных клеток и тканей организма [27]. Повышенный апоптоз рассматривается как один из ключевых механизмов нарушения регуляции иммунного ответа, в связи с чем, увеличение числа телец Гассаля носит отрицательный характер. Можно заключить, что роль тимических телец все ещё остается неясной.

Необходимо отметить, что содержание тимических телец у мышей, иммунизированных К реяНз ЕУ, не изменялось в течение всего эксперимента и не имело тенденции к снижению, что может служить показателем активности тимуса, поскольку значительное уменьшение количества тимических телец приводит к снижению его функциональной активности [67, 79].

Существует мнение, что ретикулоэпителиальные клетки мозгового вещества тимуса обеспечивают не только целостность органа, но и формируют железистоподобные структуры, богатые органеллами внутриклеточного синтеза, а также некоторые из них образуют тельца Гассаля (слоистые эпителиальные тельца) [18]. В связи с этим, выявленные в ходе исследований данные о достоверном увеличении числа эпителиальных клеток в 1,4 раза на 3-7 сут. у животных подопытной группы (привитые К резШ ЕУ) в мозговом слое тимуса, на наш взгляд, связаны с повышением его эндокринной функции, а, следовательно, и иммуностимулирующей функции.

Макрофаги в тимусе признаются в качестве самой динамичной группы клеток, синтезирующие цитокины, участвующие в регуляции созревания Т-лимфоцитов [78, 79, 94]. Поэтому увеличение содержания макрофагов к 7-14 сут. в этой зоне у привитых Y. pestis EV белых мышей указывает на функциональную перестройку органа.

Посткапиллярные венулы мозгового вещества отличаются от капсу-лярных венул высоким призматическим эндотелием, через который могут рециркулировать (уходить из тимуса и вновь возвращаться) лимфоциты [8, 79, 80]. Нами показано, что при морфометрии тимуса подопытных животных на 7-21 сут. процент объема сосудистого русла в 1,4—1,5 раза и объемная плотность стромы в 1,2—5,4 раза больше, чем у контрольных (табл. 19). Морфологически это выражается увеличенными просветами сосудов и их полнокровием. Расширение сосудов в тимусе — неспецифическая реакция, и является проявлением общего адаптационного процесса в органах иммунной системы. Можно предположить, что это направлено на активацию селекционной функции мозгового вещества тимуса в отношении лимфоцитов крови.

При морфометрическом исследовании регионарных лимфатических узлов у животных подопытной группы выявлена реакция со стороны их поверхностной коры, объем которой увеличивается (на 14,7 % по сравнению с контролем) за счет количества и объема лимфоидных узелков с реактивными центрами, находящимися на разных стадиях развития - от молодых до полностью сформированных, с высоким уровнем митотической активности.