Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Бактерицидные механизмы фагоцитоза Yersinia pseudotuberculosis с разным набором плазмид

Актуальность проблемы

Проблема патогенности псевдотуберкулезного микроба представляет собой интересный, но недостаточно изученный раздел его биологии. До сих пор остаются не выясненными механизмы взаимодействия возбудителя псевдотуберкулеза и организма хозяина, особенно на ранних этапах инфекции, когда микроорганизму необходимо преодолеть защитные - гуморальные и клеточные - барьеры макроорганизма и при этом не только выжить, но и увеличить размеры своей популяции. На этой стадии развития инфекционного процесса возбудитель в качестве инструмента воздействия на системы организма хозяина использует макромолекулы, обладающие способностью ингибировать на той или иной стадии фагоцитарный процесс [20, 49].

По мнению ряда авторов, ведущими факторами патогенности возбудителя псевдотуберкулеза являются адгезины и инвазины, а также продукты, обусловливающие внеклеточное выживание бактерий путем подавления фагоцитоза или цитопатического воздействия на фагоциты. Что касается внутриклеточного этапа развития возбудителя, то имеющиеся данные фрагментарны, нередко противоречивы [27, 84].

Накопленные к настоящему времени материалы однозначно свидетельствуют о том, что патогенность бактерий, в частности Y. pseudotuberculosis, является биологически сложным, полидетерминантным признаком, находящимся под контролем регуляторных систем, детерминирующих выражение как хромосомных, так и плазмидных генов, которые ответственны за синтез макромолекул, принимающих участие в развитии генерализованного инфекционного процесса [53, 80, 91]. Резистентость псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу, проявляющуюся в способности к факультативному паразитированию в фагоцитах и вследствие этого играющую важную роль в патогенезе инфекции, многие авторы связывают с наличием у него плазмид и их спектром [66,67, 140].

К настоящему времени выполнено значительное количество исследований, посвященных плазмиде вирулентности иерсиний, однако многие аспекты функционирования антифагоцитарного фенотипа ее генов остаются неясными. Гораздо менее изучен другой внехромосомный репликон Y. pseudotuberculosis -плазмида pVM82 м.м. 82 мДа. Заболеваемость в виде эпидемических вспышек могут обусловливать оба доминирующих плазмидовара - 48 мДа и 48:82 мДа, содержащиеся в геноме основного этиологического агента псевдотуберкулезной инфекции у людей в Сибири и на Дальнем Востоке - Y. pseudotuberculosis 1 се-ровара. При этом для одноплазмидного варианта характерны вспышки с более благоприятным течением, преобладанием легких и стертых форм заболевания. Плазмида pVM82 не оказывает влияния на течение эпидемических вспышек, но обусловливает более тяжелое течение заболевания с частым вовлечением в патологический процесс печени и селезенки, поражением суставов и длительностью клинического течения[1,6,67].

С другой стороны, весьма обоснованно полагать, что характер инфекционного процесса, а также течение иммунных реакций при псевдотуберкулезе зависят не только от вирулентности возбудителя, но и от эффективности бактерицидных систем макроорганизма, в том числе антимикробной активности макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов [56]. С

К настоящему времени накоплены довольно значительные экспериментальные материалы, затрагивающие более или менее основательно отдельные этапы фагоцитарного процесса при контакте клеток хозяина с псевдотуберкулезным микробом [23, 60, 106]. Между тем, главное звено фагоцитоза - бактерицидные реакции фагоцитов при их взаимодействии с Y. pseudotuberculosis, особенно закономерности этих реакций при фагоцитозе бактерий с разным плаз-мидным составом, - изучены в меньшей мере, что затрудняет понимание механизмов как патогенности псевдотуберкулезного микроба, так и ответных реакций макроорганизма.

Основная цель работы - изучение бактерицидных механизмов (кислород-зависимые и кислороднезависимые антимикробные системы) фагоцитоза псевдотуберкулезного микроба с разным набором плазмид макрофагами и поли-морфноядерными лейкоцитами экспериментальных животных.

Задачи исследования:

1. Изучить фагоцитарную активность макрофагов (перитонеальных, альвеолярных) и полиморфноядерных лейкоцитов экспериментальных животных в отношении псевдотуберкулезного микроба бесплазмидного и плазмидсодержа-щих вариантов;

2. Исследовать активность ферментных и других систем макрофагов и ПЯЛ, определяющих бактерицидный потенциал фагоцитов при поглощении псевдотуберкулезного микроба бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов.

3. Сопоставить бактерицидную активность в отношении псевдотуберкулезного микроба перитонеальных, альвеолярных макрофагов и ПЯЛ.

4. Исследовать влияние плазмиды вирулентности Y. pseudotuberculosis на * бактерицидные реакции фагоцитов.

Научная новизна

На основе комплексного сравнительного исследования впервые получены материалы, характеризующие неизвестные ранее особенности воздействия макрофагов и ПЯЛ экспериментальных животных на псевдотуберкулезный микроб бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов на всех основных стадиях фагоцитарного процесса.

Установлено, что показатели хемотаксиса и адгезии при взаимодействии макрофагов (как перитонеальных, так и альвеолярных) и ПЯЛ с псевдотуберкулезным микробом в случае бесплазмидного варианта выше, чем в отношении бактерий, содержащих плазмиду pYV48 или комбинацию плазмид pYV48 и pVM82 (рYV48 :pVM82).

Показано, что плазмидсодержащие бактерии более устойчивы к разрушению макрофагами и ПЯЛ, чем клетки контрольного бесплазмидного штамма. Плазмида pYV48 в сочетании с pVM82 повышает устойчивость иерсиний к фагоцитозу, подавляет реактивность фагоцитов, что приводит к снижению показателей завершенности фагоцитоза псевдотуберкулезного микроба.

Выявлено, что активность ферментов "окислительного взрыва" (глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-Н-оксидазы), а также супероксиддисмутазы и миелопероксидазы в макрофагах при фагоцитозе бесплазмидных клеток выше, чем в случае плазмидсодержащих псевдотуберкулезных микробов. Бактерии, несущие плазмиду pYV48 или комбинацию плазмид (pYV48:pVM82), подавляют окислительный взрыв в макрофагах и ПЯЛ, снижают активность супероксид-дисмутазы, миелопероксидазы и кислой фосфатазы, уменьшают содержание неферментных катионных белков и тем самым угнетают бактерицидную способность фагоцитов.

Теоретическое и практическое значение работы

Охарактеризованы бактерицидные механизмы взаимодействия фагоцитов и псевдотуберкулезного микроба. Адаптированы и внедрены в практику научных исследований экспериментальные приемы с использованием монослоя культуры макрофагов для количественной оценки активности ферментов, определяющих бактерицидный потенциал макрофагов при фагоцитозе псевдотуберкулезного микроба.

Результаты исследования, представленные в диссертации, использованы при составлении двух методических рекомендаций: "Способ определения активности супероксиддисмутазы в полиморфноядерных лейкоцитах и макрофагах при фагоцитозе Y. pseudotuberculosis " и "Способ определения активности глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ Н-оксидазы в макрофагах.

По результатам работы оформлено два рационализаторских предложения № 301 и № 302 от 25.01.99. Разработанные методы внедрены в практику научной работы Иркутского противочумного института, Новороссийской и Тувинской противочумных станций.

Положения, выносимые на защиту

1. Плазмидсодержащий псевдотуберкулезный микроб более устойчив, чем бесплазмидный, к фагоцитозу и последующей деструкции в макрофагах и ПЯЛ.

2. Хемотаксическая и адгезивная активность макрофагов и ПЯЛ в отношении псевдотуберкулезного микроба зависит не только от наличия в нем плазмид, но и их качественного состава.

3. Факторами, повышающим устойчивость плазмидсодержащего псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу, является его большая способность ингиби-ровать системы макроорганизма, обеспечивающие выработку активных форм кислорода, синтез неферментных катионных белков, активность СОД и миело-пероксидазы, что приводит к снижению бактерицидной способности фагоцитов.

Апробация работы. Материалы, изложенные в диссертации, представлены на:

Международных научных конференциях "Проблемы иерсиниозов и других актуальных инфекций" (С.-Петербург, 2000), "Природноочаговые инфекции" (Улан-Батор, 2000), "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000); Всероссийских научных конференциях "Экологозависимая патология" (Чита, 1999) и "Проблемы медицины и биологии" (Кемерово, 1999); Всероссийском научно-практическом молодежном симпозиуме "Экология Байкала и Прибайкалья" (Иркутск, 1999, 2000); научно-практической конференции "Актуальные вопросы инфекционной патологии" (Барнаул, 1999); научных конференциях Иркутского противочумного института (1999-2001).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 7 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 110 страницах

выводы

1. Фагоцитоз бесплазмидного и содержащих плазмиды pYV48 или pYV48:pVM82 псевдотуберкулезных микробов макрофагами морской свинки является незавершенным, что более выражено при поглощении плазмидсодержа-щих клеток. В полиморфноядерных лейкоцитах фагоцитоз в большинстве случаев носит завершенный характер независимо от плазмидного спектра микроба.

2. Псевдотуберкулезный микроб при взаимодействии с макрофагами и по-лиморфноядерными лейкоцитами подавляет активность зависимых от кислорода бактерицидных систем. Наибольшей способностью нарушать продукцию макрофагами и ПЯЛ кислородозависимых факторов бактерицидности обладают штаммы, несущие плазмиды pYV48 и pVM82.

3. Штаммы Y. pseudotuberculosis, несущие плазмиды pYV48 и pVM82, ин-гибируют в макрофагах и полиморфноядерных лейкоцитах дисмутацию супероксида в перекись водорода при участии СОД, снижают активность миелопероксидазы и содержание неферментных катионных белков.

4. Показатели НСТ-теста, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-Н-оксидазы при фагоцитозе псевдотуберкулезного микроба бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов у перитонеальных макрофагов выше, чем у альвеолярных макрофагов и полимофноядерных лейкоцитов.

5. Хемотаксис перитонеальных макрофагов в направлении псевдотуберкулезного микроба, независимо от его плазмидного состава, осуществляется более активно, чем в случае альвеолярных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов. По адгезивной активности в отношении плазмидсодержащих псевдотуберкулезных микробов перитонеальные и альвеолярные макрофаги превосходят полиморфноядерные лейкоциты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Резистентность псевдотуберкулезного микроба к фагоцитозу, обусловливающая способность этого микроорганизма к факультативному паразитирова-нию в фагоцитах, является многофакторным феноменом, многие звенья которого уже достаточно изучены. Однако, главное звено фагоцитоза - бактерицидные реакции фагоцитарноактивных клеток макроорганизма при их взаимодействии с Y. pseudotuberculosis, особенно закономерности этих реакций при фагоцитозе бактерий с разным плазмидным составом, исследованы в меньшей мере, что затрудняет понимание механизмов как патогенности псевдотуберкулезного микроба, так и ответных реакций макроорганизма.

В настоящей работе мы попытались изучить особенности бактерицидных механизмов (кислородзависимых и кислороднезависимых антимикробных систем) перитонеальных и альвеолярных макрофагов, а также полиморфноядерных лейкоцитов восприимчивого к псевдотуберкулезу экпериментального животного - морской свинки.

С целью получения комплексной информации исследовали практически все стадии фагоцитарного процесса: хемотаксисис, адгезию, фагоцитарную активность, образование фаголизосом, завершенность фагоцитоза, активность лизосо-мальных ферментов и ферментов "окислительного взрыва".

Объектами экспериментов служили три штамма псевдотуберкулезного микроба - вирулентные штаммы Y pseudotuberculosis И-727 (содержащий плазмиду pYV48), Y. pseudotuberculosis И-716 (содержащий комбинацию плазмид pYV48: pVM82) и авирулентный Y. pseudotuberculosis 53 (бесплазмидный).

Основные опыты по изучению сравнительной фагоцитарной и ферментативной активности, определяющих бактерицидный потенциал фагоцита в отношении псевдотуберкулезного микроба с разным плазмидным составом, проведе-• * ны в монослое перитонеальных, альвеолярных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов.

Для оценки хемотаксической способности фагоцитов рассчитывали индексы хемотаксиса и адгезии.

Полученные материалы показали, что по скорости хемотаксиса в направлении объекта фагоцитоза очевидным преимуществом обладают перитонеальные макрофаги, которые по этому признаку в 1.8-2.3 раза превосходят альвеолярные макрофаги. Полиморфноядерные лейкоциты по данному признаку занимают промежуточное положение. Различия в скорости миграции фагоцитарноактив-ных клеток обусловлены, кроме того, и наличием у Y. pseudotuberculosis плазмид и их спектром. Наибольшей хемотаксической активностью обладали фагоциты в отношении бесплазмидного варианта псевдотуберкулезного микроба, а скорость хемотаксиса фагоцитов в направлении одноплазмидных клеток была выше, чем в сторону двуплазмидных клеток псевдотуберкулезного микроба (р^0.05). Возможно, это связано с тем, что плазмида pYV48 кодирует структуры, супресси-рующие синтез фактора некроза опухоли а, индуцирующего экспрессию хемотаксиса у фагоцитов. Такими структурами у Y. pseudotuberculosis, по мнению

G.R. Cornells et al. [91], являются Yop В и Lcr V, опосредованно принимающие участие в транслоцирующем механизме высвобождения внутрь макрофагов эф-фекторного белка Yop Р, который отвечает за вызываемую иерсиниями супрессию синтеза TNF а макрофагами инфицированных животных [79].

Аналогичная закономерность отмечена и на следующем этапе - стадии поглощения, то есть непосредственно фагоцитоза. Процесс активного поглощения как плазмидсодержащих, так и бесплазмидных иерсиний зарегистрирован в первые 30 мин контакта их с макрофагами и ПЯЛ, однако и в этом случае имеют место статистически достоверные различия. Клетки Y. pseudotuberculosis, несущие экспрессируемые плазмидопосредованные структуры, в частности, Yops-белки, были менее чувствительны к поглощению альвеолярными, перитонеальными макрофагами и ПЯЛ, чем клетки, не содержащие Yops-белки [116]. В нашем случае при контакте ПЯЛ с бесплазмидными иерсиниями фагоцитарное число составило 5.6+0.8, тогда как в клетках, содержащих одну (pYV48) или две (pVM82 и pYV48) плазмиды, оно составило соответственно 3.3+0.3 и 3.8±0.5. Сходные тенденции отмечены и при контакте Y. pseudotuberculosis с макрофагами. Фагоцитарное число при фагоцитозе бесплазмидных иерсиний перитонеальными макрофагами составило 5.5+0.3, альвеолярными - 7.0±0.6, тогда как при поглощении клеток, содержащих одну или две плазмиды, оно было в 2-2.5 раза меньше.

Установлено, что фагоцитоз псевдотуберкулезного микроба бесплазмидного и плазмидсодержащих штаммов полиморфноядерными лейкоцитами носил преимущественно завершенный характер. При контакте перитонеальных и альвеолярных макрофагов с Y. pseudotuberculosis фагоцитоз был незавершенным. Вероятно, это связано с тем, что зернистые лейкоциты являются местом гибели возбудителей, а макрофаги - местом их внутриклеточного паразитрирования [39]. Фагоцитированные иерсинии с плазмидами pVM82 и pYV48 или только с плазмидой pYV48 отличались большей устойчивостью к разрушению макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами, чем клетки контрольного бесплаз-мидного штамма. Возможно, это связано с тем, что псевдотуберкулезный микроб, несущий плазмиды pYV48 и pVM82, обладает лигандами, способными взаимодействовать с рецепторами фагоцитов и эффекторными белками Yops, обеспечивающими устойчивость иерсиний к фагоцитозу [19, 126].

Различия в показателях частоты слияния фагосом с лизосомами при взаимодействии фагоцитов с псевдотуберкулезными микробами также обусловлены плазмидным составом объекта фагоцитоза в связи с его способностью или неспособностью ингибировать слияние фаго- и лизосом. Как представляется на основании полученных данных, ведущую роль в этом процессе играет плазмида вирулентности pYV48. Присутствие дополнительной плазмиды pVM82 в клетках Y. pseudotuberculosis И-716 усиливает ингибирующий эффект на процесс слияния фагосом и лизосом. Так, если при фагоцитозе бесплазмидного штамма Y. pseudotuberculosis процент слияния фагосом с лизосомами в наших опытах был максимальным - 56.0±1.9, то при фагоцитозе моноплазмидного микроба (И-727) он снижался до 42.0±2.4, а двухплазмидного (И-716) - до 28.0±0.13.

Цитопатическое действие изученных штаммов псевдотуберкулезных микробов на ПЯЛ и макрофаги было слабо выражено.

Полученные материалы свидетельствуют о том, что плазмиды псевдотуберкулезного микроба pYV48 и pVM82 оказывают тормозящее влияние на фагоцитоз бактерий, что подтверждается результатами исследования других авторов [96, 97].

У иерсиний важнейшими pYV плазмидопосредованными факторами для подавления фагоцитоза являются секретируемые белки Yop Е и Yop Н. Благодаря действию Yop Е происходит разрушение структуры актиновых микрофила-ментов клеток хозяина. При проявлении активности Yop Н повреждаются регу-ляторные механизмы клетки-мишени в результате дефосфорилирования белков [95]. По мнению И.С. Севера с соавт. [47], генные детерминанты, локализованные на 25 мДа-фрагменте плазмиды pVM82, обусловливают повышение устойчивости иерсиний к фагоцитозу.

При изучении динамики фагоцитоза на ультраструктурном уровне отмечено, что перитонеальные макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты морских свинок наиболее активно поглощают псевдотуберкулезные микробы независимо от их плазмидного состава в первые 30 мин контакта с ними. На этом этапе фагоцитоза можно наблюдать на поверхности фагоцитов бактерии на стадии поглощения многочисленными псевдоподиями, а также внутри некоторых фаголи-зосом. Через 2 ч контакта количество бактерий, несущих комбинацию плазмид 82:48 мДа, внутри фаголизосом увеличивается, некоторые микробные клетки находились на стадии деления. Таким образом, по морфологическим данным можно говорить о размножении плазмидсодержащих микробов в фагоцитах.

Сходная тенденция отмечена и в работе С. Lian с соавт. [118], которые при оценке взаимодействия Y. enterocolitica с фагоцитами in vivo на примере двух изогенных штаммов этого микроба, различающихся по наличию или отсутствию плазмиды, кодирующей секретируемые факторы патогенности, установили, что через 12 ч после заражения иерсинии почти полностью поглощались мононукле-арными макрофагами и ПЯЛ. Напротив, плазмидсодержащие бактерии были окружены воспалительными клетками, но не были фагоцитированы.

В структуре макрофагов и ПЯЛ в начальные сроки фагоцитоза иерсиний с плазмидами pYV48 и pVM82 или только с плазмидой pYV48 наблюдали изменения, такие как вакуолизация цитоплазмы, слияние нескольких фаголизосом. Вокруг фаголизосом, содержащих бактерии, наблюдали уплотнение цитоплазмы, которое носило электронноплотное гомогенное состояние.

При фагоцитозе микробов бесплазмидного и плазмидсодержащих вариантов проявления их цитотоксичности и деструкции фагоцитов через 30 мин взаимодействия выражены незначительно. Увеличение количества поврежденных клеток наблюдалось через 2 ч контакта фагоцитов с бактериями.

Проведенные исследования показали, что плазмиды pVM82 и pYV48 повышают устойчивость иерсиний к фагоцитозу, подавляют реактивность фагоцитов, что приводит к снижению показателей завершенности фагоцитоза. Наши материалы согласуются с наблюдением, что плазмидопосредованные структуры, в частности, секретируемые белки Yops, действуют как антифагоцитарные факторы, тем самым обеспечивая выживание и размножение микроорганизмов в тканях хозяина [118]. Существенную роль в этом процессе также играет способность иерсиний синтезировать экзометаболиты белково-липополисахаридной природы, обладающие антифагоцитарной активностью [49].

В бактерицидных процессах, осуществляемых на уровне фаголизосом, как известно, ключевую роль играют активные формы кислорода, продукция которых связана с резким увеличением потребления кислорода клетками.

При изучении окислительной активности макрофагов и ПЯЛ в НСТ-тесте, результаты которого оценивали по степени восстановления нитросинего тетразолия в диформазан и количеству формазанположительных клеток, установлено, что показатели НСТ-теста у макрофагов и ПЯЛ, фагоцитирующих Y. pseudotuberculosis 53 (бесплазмидный) выше, чем в случае поглощения ими псевдотуберкулезных микробов, содержащих плазмиды pYV48 и pVM82. Имеются основания предполагать, что плазмида псевдотуберкулезного микроба молекулярной массой 48 мДа, а также кодируемые этой плазмидой Yop-белки оказывают ингибирующее влияние на "окислительный взрыв" в фагоцитах. В связи с этим вероятным механизмом, обеспечивающим вирулентным иерсиниям способность снижать интенсивность окислительного взрыва в фагоцитах, является супрессирующее действие pYV-плазмидопосредованных Yop-белков на синтез ФНОа [77].

Известно, что фактор некроза опухолей а - провоспалительный цитокин, участвующий в развитии иммунного и воспалительного ответа на инфекционный агент, играет важную роль в индукции окислительного взрыва. Секретируемый, в основном, макрофагами, ФНОа стимулирует микробицидную активность клеток разных типов, задействованных в защитных механизмах хозяина, в том числе макрофагов и ПЯЛ [91].

Нами установлено, что направленность количественных изменений кисло-родзависимого метаболизма в принципе тождественна у фагоцитов всех трех исследованных видов - перитонеальных, альвеолярных макрофагов и полиморфноядерных лейкоцитов. Однако, активация кислородзависимого метаболизма при фагоцитозе бесплазмидных клеток Y. pseudotuberculosis 53 происходит значительно интенсивнее, чем в случае псевдотуберкулезных микробов, содержащих плазмиды. Это обстоятельство свидетельствует об ингибировании кислородзависимого метаболизма фагоцитов клетками Y. pseudotuberculosis, несущими плазмиды pYV48 и pVM82, в результате чего снижается выработка активных форм кислорода и соответственно - бактерицидная способность фагоцитов.

В связи с тем, что тирозиновое фосфорилирование является важным компонентом сигнальных путей, ответственных за активацию респираторного взрыва в макрофагах, возможна зависимость между Yop Н тирозинфосфатазной активностью и ингибированием окислительного взрыва. Иерсинии способны минимизировать окислительный взрыв посредством эффективного Yop-белка, которым является Yop Н [96,127].

Для выяснения вопроса, на какие реакции кислородзависимого бактерицидного механизма фагоцитоза влияют плазмиды pYV48 и pVM82 псевдотуберкулезного микроба, исследована активность ферментов этого процесса: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, НАДФ Н-оксидазы, супероксидцисмутазы и миелоперок-сидазы. Объектом исследования служили перитонеальные и альвеолярные макрофаги и ПЯЛ.

Результаты проведенного исследования показали, что фагоцитоз псевдотуберкулезного микроба макрофагами сопровождается активацией глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, что свидетельствует об усилении окисления глюкозы в гексозомонофосфатном шунте и, как следствие, - активной наработке восстановленной формы НАДФ, усилению окислительного метаболизма. В свою очередь активизация кислородзависимого метаболизма обеспечивает фагоцитам более высокий уровень бактерицидной способности, которая, однако, носит дифференцированный характер в зависимости от исходных свойств микроорганизма, в частности, от наличия или отсутствия у него плазмид, и особенностей фагоцитов.

Представленные данные достаточно объективно свидетельствуют о том, что по большинству изученных параметров перитонеальные макрофаги превосходят альвеолярные, хотя в отдельных случаях (супероксидцисмутаза) заметным преимуществом могут обладать и последние.

Представляет несомненный интерес выявленная нами закономерность, проявляющаяся в неодинаковой активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и НАДФ-Н-оксидазы у макрофагов при фагоцитозе клеток штамма Y. pseudotuberculosis 53, не содержащего плазмиды вирулентности, и псевдотуберкулезных микробов с плазмидами pYV48 и pVM82. Активация обоих ферментов в макрофагах при фагоцитозе Y. pseudotuberculosis 53 происходит значительно интенсивнее, чем в случае псевдотуберкулезных микробов, содержащих плазмиды. Это обстоятельство подтверждает данные, полученные в НСТ-тесте, и свидетельствует об ингибировании кислородзависимого метаболизма фагоцитов клетками Y. pseudotuberculosis, несущими указанные плазмиды.

Выявлен существенный ингибирующий эффект плазмидсодержащих псевдотуберкулезных микробов на НАДФ-Н-оксидазную активность макрофагов морской свинки. Основную роль в этом процессе играет плазмида вирулентности pYV48, поскольку дополнительная плазмида pVM82 лишь незначительно изменяет активность фермента.

Об известной синхронности нарушений, обусловленных псевдотуберкулезным микробом при внедрении внутрь макрофага или лейкоцита, свидетельствуют и результаты изучения функционирования еще трех ферментных систем -миелопероксидазы, кислой фосфатазы и супероксиддисмутазы.

В соответствии с полученными данными, активность миелопероксидазы в ПЯЛ в процессе фагоцитоза возбудителя псевдотуберкулеза заметно снижается, что наиболее выражено через 2 ч их контакта в стандартных условиях опыта.

Наибольшие показатели активности кислой фосфатазы имеют место также в случае фагоцитоза перитонеальными макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами бесплазмидного псевдотуберкулезного микроба. Псевдотуберкулезные микробы с комбинацией плазмид (pYV48:pVM82) или даже одной плазмиды (pYV48) существенно снижают активность кислой фосфатазы.

При изучении супероксиддисмутазы отмечена некоторая ступенчатость в проявлении ее активности под влиянием псевдотуберкулезного микроба. На первом этапе - через 30 мин контакта фагоцитов с микробными клетками - в присутствии бесплазмидного штамма Y. pseudotuberculosis 53 наблюдалось значительное увеличение активности СОД, которое, однако, быстро сменялось ее снижением. При фагоцитозе плазмидсодержащих штаммов активность этого фермента также возрастала, но в меньшей степени, причем, альвеолярные макрофаги по активности СОД заметно превосходили ПЯЛ. С учетом этих материалов следует считать установленным, что псевдотуберкулезный микроб, содержащий плазмиды, прежде всего их комплекс, ингибирует в макрофагах и ПЯЛ процесс превращения супероксида в перекись водорода.

Весьма важным, с нашей точки зрения, является наблюдение, что, помимо отмеченных выше нарушений, в процессе фагоцитоза полиморфноядерными лейкоцитами псевдотуберкулезного микроба имеет место прогрессирующее снижение в них содержания неферментных катионных белков. При поглощении псевдотуберкулезного микроба, содержащего плазмиды pYV48 и pVM82, этот процесс протекает более активно, чем в случае фагоцитоза бесплазмидных микробов. Очевидно, что снижение уровня интралейкоцитарных катионных белков, возможно, в силу их секреторной дегрануляции, обусловленного присутствием патогена, облегчает способность последнего к паразитированию в макроорганизме.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что наличие у иерсиний плазмид pVM82 и pYV48 повышает их устойчивость к фагоцитозу. Штаммы Y. pseudotuberculosis, несущие эти плазмиды, подавляют реактивность фагоцитов, ингибируют "окислительный взрыв", снижают активность суперок-сиддисмутазы, миелопероксидазы и кислой фосфатазы и тем самым угнетают их бактерицидную способность.

Очевидно, вклад в реализацию патогенного потенциала псевдотуберкулезного микроба несут гены, локализованные на родоспецифической резидентной плазмиде вирулентности иерсиний (pCad, Lcr, pYV) молекулярной массой 4548 мДа. Значительная часть этих генных детерминант прямо или опосредованно связана, в частности, с проявлением антифагоцитарных свойств возбудителя псевдотуберкулеза [47, 60].

По мнению A. Forsberg, R. Rosquist [96], антифагоцитарной активностью обладают секретируемые белки иерсиний - Yop Е (23 кДа) и Yop Н (51кДа). Проявление активности Yop Н приводит к повреждению регуляторных механизмов клетки-мишени в результате дефосфорилирования белков.

Имеются основания предполагать, что кластер генов плазмиды pVM82, расположенных на фрагменте 25 мДа, определяет ряд дополнительных факторов патогенности, так как штаммы возбудителя псевдотуберкулеза, содержащие обе вышеназванные плазмиды, изолируются, как правило, при эпидемических вспы