Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Взаимосвязь морфо-функциональных характеристик и структурной организации цитомембраны эозинофилов при токсокароносительстве

004617211

Ишкова Наталия Михайловна

взаимосвязь морфо-фуншщоналышх характеристик и структурной организации цитомембраны

эозинофилов при токсокароносительсгве

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 2010

- 9 1Г[( ЧП7П

004617211

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ставропольский государственный университет».

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Бондарь Татьяна Петровна.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Кузнецова Валентина Александровна;

доктор медицинских наук, профессор Коршунов Геннадий Васильевич.

Ведущая организация: Государственное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертации состоится « » 2010 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 208.094.04 при ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Большая Казачья, 112.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава.

Автореферат разослан « » 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Бородулин В.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Паразитарные заболевания человека занимают по распространенности одно из первых мест в мире. По данным ВОЗ, каждый третий житель Европы страдает тем или иным паразито-зом. В последние десятилетия во многих странах мира отмечается возрастающий интерес к заболеваемости токсокарозом (Антонов H.H., 2004; Гузеева Т.М., 2006; Лебедева О.В., 2006; Абдулазизов А.И., 2007: Они-щенко Г.Г., 2007; Андронова Т. А., 2009; и др.).

Токсокароз — заболевание, вызываемое миграцией личинок аскарид животных семейства псовых. Особенностью токсокароза является чрезвычайное разнообразие клинических проявлений. Характеризуется длительным рецидивирующим течением и полиорганным поражением иммунологической природы. Специфических проявлений заболевания нет. Ограниченная возможность паразитологической диагностики приводит к тому, что основой в диагностике токсокарозной инвазии является сочетание клинической симптоматики и положительных иммунологических тестов. Многими авторами отмечается, что имеется положительная линейная зависимость между количеством личинок токсокар, попавших в организм, и уровнем антигена в кровотоке (Лобзин Ю.В., 2007; Фадеева, Т.Г., 2009). Титр специфических антител 1:800 и выше с большей степенью вероятности свидетельствует о заболевании, а титр менее 1:800 — о носигеяь-стве токсокар (Дедкова Л.М., 1996; Лысенко АЛ, 1999; Адаменко Г.П., 2004; Антонов H.H., 2004; Сергиев В.П., 2006).

До настоящего времени проблема диагностики токсокароза не может считаться решенной в связи с большим количеством перекрестных иммунологических реакций, возникающих при проведении основного метода диагностики тканевых паразитозов — иммуноферментного анализа. В изученных нами литературных источниках не описано четких патогенетических механизмов развития токсокароза у токсокароносителей.

Поскольку токсокароз наблюдается преимущественно у детей, эта проблема становится наиболее актуальной для прогнозирования механизмов развития, прогноза и исхода заболевания. Безусловно доказано, что ведущим лабораторным признаком висцерального токсокароза является гиперэозинофильная реакция крови.

Своеобразие состава цитоплазмы эозинофилов заключается в наличии специфических гранул, которые содержат бактерицидные ферменты, обладающие выраженной антимикробной активностью.

Возникающее в условиях развития токсокарозной инфекции изменение эозинофилов выражается в комплексе нарушений, связанных с дегрануляцией и цитохимической активностью клеток. В настоящее время выделяют две основные субпопуляции эозинофилов, различающиеся по своей плотности.

Радом исследователей (Анаев Э.Х., 2002; Пампура А.Н., 2002; Сопе&а А., 2002; Рики(!а Т., 1989) было показано, что эозинофилы периферической крови являются гетерогенной популяцией по плотностным характеристикам. Активированные (низкоплотностные) эозинофилы характеризуются повышенной способностью к синтезу и выделению из гранул биологически активных веществ, что приводит к снижению числа гранул и вакуолизации цитоплазмы. Механизм синтеза и дифференцировки эозинофилов нормальной и низкой плотности не до конца изучен. В литературе имеются разрозненные данные, касающиеся изменений плотностных характеристик эозинофилов при паразита?ах, но нет четких представлений о зависимости плотностных характеристик эозинофилов от уровня специфических внтител при токсокароносительстве и токсокарозе. Сложность и актуальность этих проблем определили цель и задачи исследования.

Цель исследования: Изучение взаимосвязи морфо-функциональных характеристик и структурной организации цитомембраны эозинофилов у токсо-кароносителей для оценки риска развития клинического токсокароза у носителей специфических антител.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности клеточного состава периферической крови у пациентов с различным уровнем антител к антигенам токсокар.

2. Установить закономерности изменений геометрических и свето-оптических характеристик в субпопуляциях эозинофилов у токсокароно-сителей и больных висцеральной формой токсокароза.

3. Выявить особенности цитохимического состава эозинофилов в зависимости от уровня антител к антигенам токсокар.

4. Определить особенности строения мембраны эозинофилов в зависимости от оптической плотности клеток у токсокароносителей и больных висцеральной формой токсокароза.

5. Вьигаигь признаки риска развития клинического токсокароза у носителей специфических антител на основании изменений морфо-функциональных характеристик и нарушений архитектоники мембраны эозинофилов.

Научная новизна. Впервые выявлены особенность изменения количества, морфологии эозинофилов в зависимости от титра специфических антител к токсокарозу у детей и взрослых.

В работе впервые показано, что компьютерная цитоморфометрия изображения эозинофилов может быть положена в основу оценки гетерогенности морфологических особенностей эозинофильных субпопуляций при токсокароносительстве и токсокарозе.

Доказана возможность применения атомно-силовой микроскопии в исследовании фиксированных эозинофилов. Впервые с помощью атомно-силовой микроскопии получены изображения плазматических мембран эозинофилов у лиц, имеющих в крови специфические антитела к

токсокарозу; показаны характерные особенности ультраструктуры поверхности мембран в зависимости от цитохимического состава и оптических характеристик эозинофилов.

Изменение количественных геометрических, оптических и цитохимических характеристик эозинофилов могут использоваться как критерии риска развития токсокароза у носителей специфических антител.

Практическая значимость. Полученные результаты расширяют современные представления о значении морфо-функционального состояния эозинофилов периферической крови в формировании противо-паразитарного иммунитета при токсокарозе. Проведенное комплексное изучение структуры и функции эозинофилов с выделением признаков, характерных для различных субпопуляций эозинофилов, создало предпосылки для использования результатов в клинической практике.

На основании выявленных морфо-функциональных особенностей эозинофилов разработаны критерии риска развития клинического токсокароза у носителей специфических антител. Предложенные в работе методы и таблицы диагностических критериев имеют значение для практического здравоохранения как мониторинга риска развития токсокароза у токсокароносителей в диспансерных группах наблюдения.

Реализация результатов исследования. Внедрение полученных результатов в практику осуществляется следующими путями:

1. Основные результаты исследований, представленные в диссертации, опубликованы в печатных работах, были доложены на меисдународном и междисциплинарном конгрессах, научных и научно-практических конференциях по клинической лабораторной диагностике.

2. Результаты работы используются в диагностическом процессе клинико-диагностических лабораторий.

3. Результаты работы используются при обучении студентов по специальности «Медицинская биохимия» и врачей-интернов по специальности «Клиническая лабораторная диагностика» на кафедре физико-химических основ медицины, лабораторной диагностики и фармакологии медико-биолого-химического факультета Ставропольского государственного университета (заведующая кафедрой - проф., д-р. мед. наук Т.П. Бондарь).

4. По результатам исследования издано методическое пособие, рекомендованное министерством здравоохранения Ставропольского края «Клиническая лабораторная диагностика: Лабораторная диагностика паразитарных инфекций (курс по выбору)» для студентов медико-биолого-хнмического факультета по специальности «медицинская биохимия» и врачей-интернов по специальности «клиническая лабораторная диагностика».

Положения, выносимые на защиту

1. У токсокароносителей и больных висцеральной формой токсокароза имеются различия гематологических показателей (количества лей-

коцитов, эритроцитов концентрации гемоглобина, эозинофильного индекса и индекса аллергизации), которые ярче выражены у детей.

2. Вариабельность геометрических и оптических характеристик эо-зинофилоЕ;, выявленных методом компьютерной цитоморфометрии, характеризует напряжение механизмов микробицидности эозинофилов и более выражены у детей с высоким титром специфических антител к антигенам токсокар.

3. Системные нарушения структурно-функционального состояния эозинофилов зависят от цитохимического состава гранул эозинофилов. При токсокароносительстве в периферической крови превалирует пул эозинофилов с низким содержанием пероксидазы и повышенным содержанием катионных белков.

4. Атомно-силовая микроскопия выявляет различие поверхности мембраны эозинофилов при токсокароносительстве и висцеральной форме токсокароза. Дегрануляция и снижение оптической плотности клеток приводят к увеличению высоты профиля мембраны эозинофилов периферической крови.

5. Наиболее значимыми морфо-функциональными факторами риска развития висцеральной формы токсокароза у токсокароносителей являются повышение ядерно-цитоплазматического и ядерно-клеточного соотношений, изменение площади, высоты и оптических характеристик эозинофила.

Апробация диссертации. Материалы работы докладывали и обсуждали на П междисциплинарном конгрессе «Ребенок, врач, лекарство» (Санкт-Петербург, 2007); IV научно-практической конференции Южного федерального округа с международным участием (Анапа, 2009); 54-й научно - практической конференции «Университетская наука — региону» (Ставрополь, 2009); V ежегодной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр южного научного центра РАН (Ростов-на Дону, 2009); X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009); научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009); 14-й ежегодной Недели медицины Ставрополья (Ставрополь, 2010).

Публикации!. По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 5 в рецензируемых журналах перечня ВАК РФ и методическое пособие для студентов медико-биолого-химического факультета по специальности «медицинская биохимия» и врачей-интернов по специальности «клиническая лабораторная диагностика», рекомендованное министерством здравоохранения Ставропольского края.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 161 странице, содержит 31 таблицу и иллюстрирована 22 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав с из-

ложением результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 253 наименования (131 отечественный и 122 иностранных источника).

Диссертация подготовлена и выполнена в соответствии с федеральной целевой программой «Развитие научного потенцигша высшей школы» министерства образования и науки РФ «Биохимические и патофизиологические нарушения наноструктуры эозинофильных гранулоцитов при социально-значимых болезнях».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Для реализации поставленных задач проводили обследование пациентов паразитологического ценгра Краевой клинической инфекционной больницы города Ставрополя в период с 2004 по 2009 годы. В исследование были включены 3652 человека.

С помощью анализа историй болезни и амбулаторной карты наблюдения проводился селективный скрининг для выявления клмнико-анамнестических признаков токсокароза. Критерием отбора являлось наличие у больного специфических антител к антигенам токсокар. Из общего числа обследованных антитела к антигенам токсокар были обнаружены у 649 человек. Из группы были исключены пациенты, находящиеся на диспансерном учете в течение нескольких лег и имеющие антитела не только к антигенам токсокар, но и другим паразитарным заболеваниям. В результате тщательного отбора нами выделены следующие группы (данные распределения представлены в таблице 1).

Таблица 1

Распределение обследованных по группам

Контингент обследуемых Группа сравнения (чел.) Токсокаро-носители (чел.) Бальные токсокаро-зом (чел.) ВСЕГО (чел.)

Взрослые женщины 31 20 16 67

мужчины 23 12 10 45

Средний возраст 43,7±2,5 43,1±5,7 44,7±6,1

Дети девочки 17 18 10 45

мальчики 12 7,2±0,7 22 8,8,±2,5 11 8,4±1,6 45

Средний возраст

ВСЕГО: 83 72 47 202

Пациенты с впервые клинически установленным при обращении диагнозом «токсокароз, висцеральная форма» составили группы больных токсокаро'юм детей и взрослых. В группах больных токсокарозом, имеющих титр специфических антител более 1:800 обследование проведено до назначения терапии. Инвазированные лица с положительными результатами серологических реакций на токсокароз в титре антител, не превышают,их 1:800, без клинических проявлений заболевания, составили группы токсокароносителей детей и взрослых. Группы сравнения детей и взрослых были сформированы из добровольцев, не имеющих в крови антитела к паразитарным инфекциям. Им проведено тщательное изучение биохимических, гематологических и иммунологических параметров крови, позволяющее исключить существенные заболевания, способные повлиять на фушщиональное состояние внутренних органов.

Для подтверждения диагноза и исследования эозинофильных грану-лоцитов пациентам выполнялись как унифицированные лабораторные методики - гемгаологические, иммуноферментные, цитохимические, так и исследования с применением компьютерных технологий - компьютерная цитоморфометрия и атомно-силовая микроскопия эозино-филои. Этапы, методы исследования и контингент обследуемых представлены в таблице 2.

Материалом для исследования служила венозная кровь, взятая из кубитальной вены утром до приема пищи. Обнаружение специфических иммуноглобулинов к паразитарным инфекциям и количественное определение уровня антител к токсокарозу выявлялись твердофазным иммуноферментным анализом тест-системами отечественного («Вектор-Бест») и импортного производства («EUROIMMUN») на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Personal-LAB» (Италия). Учет результатов проводился согласно инструкции к набору и рекомендациям выполнения иммуноферментных методик (Гузеева Т.М., 2006; Полетаева О.Г., 2007).

Оценка функционального состояния периферической крови и определение относительного количества эозинофилов выполнялись с помощью автоматического гематологического анализа, визуальной микроскопии мазка с подсчетом процентного соотношения различных видов лейкоцитов и последующим расчетом эозинофильного индекса:

п„ (Пал.% + Нейтр.%)- Эоз.% ч т п . ,

( ЗИ =----) (N - 0,8 усл.ед), и

(Пал.% + Нейтр.%) + Эоз.%

(Ламф%+]0*(Эоз.%-1) . ... л индекса аллергизации (ИА =---- ). (N - 0,8-2 усл.ед.)

Нейтр.% + Mo/t%+Баз.%

Таблица 2

Этапы, методы исследования и контингент обследуемых__

Методы исследования Цель исследования Используемые методики Кол-ю исследований

1-й этап исследования

Селективный скрининг Выявление клшшко-анамнестических признаков токсокароза Анатиз историй болезни и анкет 3652

Иммунологический Выявление наличия титра AT к АГт Твердофазный имму-ноферметный ¡шализ 3652

2-й этап исследования

Иммунологический Количественное определение уровня титра АТ к АГт Твердофазный имму-пофермешный анализ (549

Выявление наличия титра АТ к 6 паразитарным инфекциям Твердофазный имму-нофермешный анализ (649+83) хб

Гематологический Оценка функционального состояния периферической крови определение относительного количества эози-нофилов Автоматический гематологический анализ 202

Лейкоцитарная формула 202

Определение абсолютного количества эозинофилов Метод Пирашкили с подсчетом в камерг Фукса-Розенгаля 202

Цитохимический Полуколичественное определение пероксидазы в эо-зинофилах Микроскопия по методу Эпштейна 202

Полуколичесгвенное определение нефермешных катонных белков в эозинофилах Микроскопия по методу Шубина 202

Компьютерная морфомегрия Изучение морфометриче-ских параметров эозинофилов Определение геомет-рическихи оптических показателей :юзино-филов 202

Сканирующая зондовая микроскопия Изучение закономерности изменения структурных свойств мембраны эозинофилов АСМ на нанометроюм пространственном разрешении мембраны эозинофилов 202

Математические Установление сходства мор-фометрических параметров Эо. Определение наиболее значимых морфометриче-ских показателей Эо Описательная статистика, корреляционный анализ, анализ Валвда

Определение абсолютного количества эозинофилов проводили с помощью метода И.С. Пирашвили. Содержание пероксидазы в гранулах эозинофилов периферической крови определяли по методу нади-реакции в модификации Эпштейна. Для установления содержания неферментативных катионных белков эозинофильных гранулоцитов использовался метод М.Г. Шубича с бромфеноловым синим. Количественное выражение результатов цитохимического исследования рассчитывали по среднему цитохимическому коэффициенту (СЦК); результаты выражали в баллах по 4- балльной шкале.

Оценку фотометрической неоднородности эозинофилов осуществляли методом компьютерной цитоморфометрии на аппаратно-программном комплексе «МЕКОС-Ц» (ЗАО «Медицинские компьютерные системы», Россия) с помощью программы «Анализ мазков крови» по 9 геометрическим параметрам (средний диаметр, фактор формы, площадь поверхности и.т.д.). Характеристику зернистости цитоплазмы эозинофилов оценивали при помощи модели световых пространств по красной (УОЦ;), синей (УОПс) и зеленой (УОП3) компонентах. Для повышения информативности анализа использовали индекс интегральной оптической плотности, с помощью которого устанавливали степень насыщенности клеток гранулами и степень их функциональной активности.

Для изучения закономерности изменения структурных свойств мембраны эозинофилов на нанометровом пространственном разрешении использовали метод сканирующей зондовой микроскопии. Исследование проводилось при помощи атомно-силового микроскопа «Интегра Прима» в ИТЦКП «Нанотехнологии и наноматериалы» Ставропольского государственного университета. Попытка установить молекулярные изменения в топологии мембраны эозинофилов была предпринята в режиме полуконтактной резонансной атомно-силовой микроскопии с использованием зонда NSG-20. С помощью метода АСМ появилась возможность оценить органную специфичность изучаемых объектов и структуру их поверхности. В фазово-контрастном режиме и в режиме 3D были получены двух - и трехмерные изображения плазматической мембраны эозинофила. При сканировании в фазово-контрастном режиме на поверхности мембраны четко контурировался рельеф цитоскелета эозинофила, имеющего неровную, бугристую поверхность, выявлялись глобулы, предположительно являющиеся белковыми комплексами. На трехмерном изображении поверхности мембраны выделялись контуры ядра и гранулы, находящиеся в цитоплазме клетки и над ядром.

В настоящей работе статистическую обработку данных проводили с привлечением методов параметрического анализа с использованием пакета «Microsoft Excel». Определяли основные характеристики описательной ста-

тистики: среднее (X), ошибку среднего (м) и среднеквадратичное отклонение (8). Достоверность различия средних величин определяли по критерию Стьюдента (t) для коэффициентов вариации; уровень значимости р выбран менее 0,05. Для выделения наиболее информативных признаков и предварительного суждения риска развития токсокароза у носителей специфических антител использовали методику Вальда. Для каждого признака был получен соответствующий диагностический коэффициент Куб альта, рассчитанного по формуле log х (Р1/Р2), где

Р1 - частота встречаемость признака у больных токсокарозом,

Р2 - частота встречаемость признака у токсокароносигелей (Гублер Е.В., 1978). Теорему Байеса применяли для выявления наиболее информативного сочетания признаков риска развития заболевания. Расчет вероятности варианта развития токсокароза (PD1/S) проводили по формуле:

рт, Р (01) х P(S1 / Д1) х P(S1 lm ) х РС%,)... P(SY / n,)

P I si =----->гДе

P{D2) xP ( /Д2 )... P( ID2) + показатель... числителя

PD1/S - вероятность определенного варианта D при наличии конкретных признаков 1,2,3...X;

Ps/- частота симптомов при конкретном варианте Dl, D2 и т.д.

Результаты исследований и их обсуждение. С целью изучения особенности клеточного состава периферической крови у пациентов с различным уровнем антител к антигенам токсокар исследованы основные показатели гемограммы, представленные в таблице 3.

Статистический анализ полученных данных позволил установить, что при токсокароносительстве отмечаются повышение количества эо-зинофилов в относительном и абсолютном количестве против значений в группах сравнения детей, снижение эозинофильного индекса и повышение индекса аллергизации. У больных висцеральным токсокарозом с нарастанием титра специфических антител отмечается дальнейшее увеличение количества эозинофилов как в абсолютных, так и в относительных величинах, снижение эозинофильного индекса и повышение индекса аллергизации. Полученные результаты закономерно соответствуют приведенным в использованной литературе сведениям об изменении гематологических параметров при токсокарозной инвазии (Лобзин Ю.В., 2007; Лысенко АЛ., 1999).

Таблица 3

Изменение показателей гемограммы в группах_

Показатели (Х±ш) Лейкоциты Эо% Абс, Эо ЭИ ИА

Дети

Группа сравнения 5,91±0,24 3,0±0,40 174,9*27,2 0,86±0,02 1,51±0,24

Токшкаро-носители 8,72±0,75 7,5±0,7 605,4±56,3 0,77±0,06 2,63±0,49

Больные токсокарозом 12,45±1,60 11,3±0,90 1890Д±317,5 0,65±0,09 3,36±0,33

Р <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 <0,05

Р1 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Р2 <0,05 <0,05 33,05 >0,05 >0,05

Взрослые

Группа сравнения 6,19±0,27 1,94±0,20 114,9±24,2 0,93±0,01 0,75±0,12

Токсокаро-носитеяи 5,&Ь0,42 4,0±0,40 220,9±53,9 0,85±0,04 0,96±0,18

Вольные токсокарозом 7,5±0,57 5,78±0,66 531,1 ±68,9 0,82±0,03 1,79±0,3

Р >0,05 <0,05 >0,05 <0,05 >0,05

Р. <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 <0,05

Р2 >0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Р1 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 <0,05

Р, <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 <0,05

Р5 <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 <0,05

Примечание:

Р - уровень достоверности внутригрупповых различий показателей в группе сравнения и у токсокароносителей;

Р] - уровень достоверности внутригрупповых различий показателей в группе сравнения и у больных токсокарозом;

Р2 — уровень достоверности внутригрупповых различий показателей у токсокароносителей и у больных токсокарозом;

Р3 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей в группах сравнения;

Р4 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у токсокароносителей;

Р5 - >ровень достоверности межгрупповых различий показателей у больных токсокарозом.

Изменения геометрических характеристик эозинофилов у пациентов, имеющих в крови специфические антитела к токсокарозу, проявлялись в уменьшении средней площади и среднего диаметра клеггки за счет снижения площади цитоплазмы. При этом в группах детей-токсокароносителей наблю-

далось понижение средней площади эозинофилов на 23%, а у взрослых-токсокароносителей — на 21%, по сравнению с данными групп сравнения. В группах с впервые установленным диагнозом «токсокароз» снижение средней площади клеток составило 28% и 5% соответственно.

При анализе соотношения ядро/цитоплазма отмечается достоверное повышение коэффициента у детей-токсокароносителей на 15%, а у взрослых-токсокароносителей — на 56%, по сравнению со значением показателя у здоровых лиц. В группе больных висцеральной формой ток-сокароза увеличение ядерно-клеточного соотношения составило 55% и 25% соответственно. Анализ геометрических характеристик цитоморфо-метрического исследования показал, что наиболее выраженные изменения параметров эозинофилов отмечены в группе взрослых-токсокароносителей, а у детей - в группе больных висцеральным токсокарозом. При распределении гистограммы яркости по объекту выявлено, что наиболее выраженное снижение оптической плотности, независимо от возраста, отмечается в группах пациентов с уровнем специфических антител, не превышающих 1:800 как по сравнению с группами сравнения, так и с пациентами страдающими висцеральной формой токсокароза. Снижение спектрального диапазона отражает степень увеличения «прозрачности» цитоплазмы для прохождения светового пучка, а значит, может свидетельствовать о морфологической перестройке структурных элементов цитоплазмы или о вакуолизации цитоплазмы в активированных эозинофилах. Изменение показателей КЦМЭо в группах представлено в таблице 4.

Цитотоксический потенциал эозинофилов, направленный на элиминацию чужеродных антигенов, реализуется за счет кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов микробицидности. К важнейшим в функциональном отношении кислородозависимым факторам относят пероксидазу, а к кислородонезависимым - внутриклеточные катионные протеины. В норме реакция на присутствие в клетках пероксидазы и ка-тионных белков эозинофилов положительная. Для подтверждения де-грануляции эозинофилов, было проведено изучение цитохимического состава клеток на присутствие в гранулах пероксидазы и катионных белков с помощью вычисления среднего цитохимического коэффициента (СЦК). Снижение уровня СЦКп носило однонаправленный характер во взрослой и детской группах токсокароносителей и у больных висцеральной формой токсокароза. Максимальное снижение уровня пероксидазы, независимо от возраста, отмечалось в группах токсокароносителей, у детей - на 33,4%, у взрослых на 65%, по сравнению со значениями здоровых лиц. Полученные данные о снижении количества пероксидазы в гранулах подтверждают усиление кислородозависимых механизмов киллинга в эозинофилах периферической крови.

Таблица 4

Изменение показателей КЦМЭо в группах_

Показатели (Х±т) вк Я« ЯЦС УОПк ИОП

Дети

Группа сравнения 179,93±3,28 121,98±4,38 0,497±0,01 0,327±0,01 0,784±0,02

Токсокаро-носигели 156,61:12,01 107,08±5,07 0,587±0,02 0,231 ±0,01 0,639^0,03

Больные токсокарозом 129,83±3,11 81,13±7,12 1,1 №0,07 0,294±0,02 0,677±0,02

Р <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Р> <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 <0,05

Р2 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 >0,05

Взрослые

Группа сравнения 162,78±ЗД1 110,18±4,21 0,55 Ш, 03 0,282±0,01 0,721±0,02

Токсокаро-носигели 145,25±2,42 85,35±3,23 1,254±0,07 0,352±0,04 0,687±0,02

Больные токсокарадом 154,83±2,07 100,07±4,11 0,732±0,04 0Д84±0,02 0,736±0,02

Р <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Р. <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05

Р2 <0,05 >0,05 <0,05 >0,05 <0,05

Рз >0,05 >0,05 <0,05 >0,05 <0,05

Р4 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 >0,05

Р5 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Примечание:

Р - уровень достоверности внугригрупповых различий показателей в группе сравнения и у токсокароносителей;

Р1 - уровень достоверности внугригрупповых различий показателей в группе сравнения и у больных токсокарозом;

Р2 - уровень достоверности внугригрупповых различий показателей у токсокароносителей и у больных токсокарозом;

Р3 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей в группах сравнения;

Р4 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у токсокароносителей;

Р5 - уровень достоверности межгрупповых различий показателей у больных токсокарозом.

Сравнивая значения СЦКкб , следует отметить повышение показателя в группах токсокароносителей у детей на 5,7%, взрослых на - 7,9% и тенденцию к снижению в группах больных токсокарозом у взрослых и детей. Данные, полученные при цитохимическом исследовании эозинофильных

гранулоцитов, согласуются с полученными результатами компьютерной цитоморфометрии об изменении оптической плотности клеток и являются подтверждением повышенной функциональной активности эозинофи-лов при формировании противопаразитарного иммунитета у токсокароно-сителей детей и взрослых.

Регуляция метаболизма клетки и его адаптационная организация в ответ на различные воздействия связаны с физико-химическими процессами, происходящими в мембране. Для количественной оценки морфо-функционального состояния мембраны эозинофилов использовали сканирование клеток методом атомно-силовой микроскопии. Высоту клетки определяли как максимальную высоту профиля относительно подложки с установленным нулевым значением. Выявленные особенности характеристик рельефа цитоплазматической мембраны эозинофильных гранулоцитов были неоднородны и зависели от плотностных характеристик и цитохимического состава гранул клеток.

Эозинофильная субпопуляция в группах токсокароносителей с низкой оптической плотностью, при пространственном измерении в формате ЗВ характеризовалась увеличением высоты профиля мембраны эози-нофила в группе детей-токсокароносителей (0,48±0,05х10~9, р<0,05) и взрослых носителей специфических антител (0,61±0,05х10"9, р<0,05), по сравнению со значениями контрольных групп (0,29±0,04 х 10 9 и 0,45±0,04 х 10 9).В группах больных висцеральным токсокарозом увеличение профиля мембраны составило у детей 0,63±0,07х10"9, р<0,05 и у взрослых 0,67±0,07х10"9, р<0,05.

Реализуя принцип индивидуального подхода к детальному анализу, сходство цитохимического состава и перепада высоты мембраны эозинофильных гранулоцитов позволило выделить несколько характерных признаков эозинофилов нормальной и пониженной плотности. Так, перепад высот цитоплазматической мембраны и ядра эозинофилов нормальной плотности не превышали 0,2±0,02х10~9 м. У эозинофилов с пониженным уровнем пероксидазы и нормальными значениями уровня катионных белков высота профиля ядра составляла 0,5-1,6x10"9 м, а перепад высоты цитоплазмы не превышал 0,6x10 9 м. Эозинофилы пониженной плотности с низкими значениями как СЦКп, так и СЦКкб имели наиболее значительный перепад высот. Максимальная высота профиля ядра составляла 0,5-1,2х10"9м, а перепад высоты цитоплазмы достигал 1,6х10"9м. Повторяемость результатов исследования в группах позволила сделать вывод, что при токсокароносительстве превалирует пул эозинофилов, представленный на рисунке 1А, а при заболевании -на рисунке 1Б.

Рисунок 1. Изображение эозинофилов, полученных методом АСМ в полуконтактном режиме А — с пониженным уровнем пероксидазы (СЦКП=2,1усл.ед); Б — с низким уровнем пероксидазы (СЦКП=0 усл. ед).

Атомно-силовая микроскопия выявляет различие поверхности мембраны эозинофилов при токсокароносительстве и висцеральной форме токсокароза. Секреция и выделение в повышенном количестве пероксидазы и катионных белков, содержащихся в гранулах, приводит к набуханию и вакуолизации гранул, а петля позитивной обратной связи способствует нарастанию клеточного объема. Модификация скелета эозинофи-ла проявляется в уменьшении площади клетки при анализе плоского изображения и увеличении параметров при объемном изображении. Изменение фазовой высоты эозинофилов, полученной методом трехмерного изображения плазматической мембраны, согласуется с изменением геометрических параметров и светооптических показателей.

В рамках настоящего исследования вызывает интерес вероятность взаимосвязи между уровнем антител и морфо-функциональными характеристиками эозинофилов. Использование корреляционного анализа позволило выявить силу зависимости (р >0,05) (таблица 5).

В исследовании нами выявлена корреляционная связь не только между уровнем специфических антител и количеством циркулирующих в периферической крови эозинофилов (г=0,319, р<0,05), но и между геометрическими характеристиками клеток (таблица 5).

С целью оптимизации процесса прогнозирования риска развития токсокароза у носителей специфических антител нами изучена частота признаков и лабораторных показателей в группах носителей и больных висцеральной формой токсокароза. На основе математической обработки данных была разработана таблица лабораторных прогностических коэффициентов для пациентов, имеющих в крови антитела к антигенам токсокар в титре ниже 1:800, которая позволяет с высокой точностью

Таблица 5

Корреляционный анализ взаимосвязи лабораторных показателей

Титр АТ Абс. Эо ЭИ ИА Бк ЯЦС иоп СЦКп СЦКкб 11 мемб.

Титр АТ 1

Абс.Эо 0,319 1

эи -0,124 -0,825 1

НА 0,087 0,344 -0,894 1

Эк -0,327 -0,218 0,229 -0,173 1

яцс -0,179 0,064 -0,132 0,068 -0,358 1

поп -0,349 -0,085 -0,019 -0,062 0.224 -0,346 1

СЦКп 0,021 -0311 0,286 -0,270 0,319 -0,415 0338 1

СЦКкб 0,187 -0,036 -0,390 0,266 -0,045 -0,105 -0,045 0310 1

Ь мемб. 0,214 0,326 -0,047 0,213 -0,162 0,488 0309 -0,657 -0321 1

предсказывать возможность развития токсокароза у носителей специфических антител для взрослых и детей. С помощью последовательного статистического анализа Вальда был получен соответствующий диагностический коэффициент Кубальта для каждого признака. Математический анализ прогностических коэффициентов позволил с высокой степенью достоверности предсказывать возможность прогрессирования заболевания у носителей специфических антител. Предположение о риске развития токсокароза у носителей специфических антител становится статистически вероятным при сумме баллов более 18. При этом было установлено, что ведущими лабораторными критериями являются показатели, полученные методом компьютерной цитоморфометрии эозино-филов. Наиболее значимые параметры, имеющие достоверные отличия, приведены для детей в таблице 6, для взрослых - в таблице 7.

С целью выявления наиболее информативного сочетания лабораторных показателей для априорной вероятности развития заболевания мы использовали метод вероятной оценки по теореме Байеса.

Наиболее значимыми доклиническими критериями риска развития висцеральной формы токсокароза у детей-токсокароносителей являются снижение индекса поляризации (+8,0), площади (+7,5), диаметра (+7,5) эозино-фила и удельной оптической площади по красной компоненте (+6,7).

Повышение высоты контура клетки (+4,3), абсолютного (+3,3) и относительного (+3,5) количества эозинофилов со смещенными геометрическими характеристиками и оптическими показателями является наиболее значимым доклиническим критерием риска развития висцеральной формы токсокароза у взрослых токсокароносителей.

Таблица 6

Прогностические коэффициенты развития токсокароза _у детей-токсокароносителей _

№ п/п Показатели Прогностический коэффициент Кубальта

1 Индекс поляризации клетки <0,100 усл.ед +8,0

2 Средняя площадь клетки <147 мкм2 +7,5

3 Средний диаметр клетки < 13,5 мкм +7,5

4 УОПкусл.ед.< 0,270 усл.ед. +6,7

5 Относительное число эозинофилов >10% +5,6

6 Средняя площадь цитоплазмы < 95 мкм2 +4,0

7 СЦКкб <3,0 усл.ед. +3,9

8 Высота контура клетки > 400x10~у м +3,8

9 СЦКп <2,0 усл.ед +3,6

10 Абсолютное число эозинофилов > 400x106/л +2,8

11 Индекс аллергизации >2,0 усл.ед. +2,7

12 Эозинофильный индекс < 0,8 усл.ед. +2,2

13 Коэффициент выпуклости ядра <0,170 усл.ед. +1,8

14 ИОП < 690 усл.ед. +1,8

Таблица 7 Прогностические коэффициенты развития токсокароза у взрослых-токсокароносителей

№ п/п Показатели Прогностический коэффициент Кубальта

1 Высота контура клетки >400х10"ум +4,3

2 Относительное число эозинофилов >10% +3,5

3 Абсолютное число эозинофилов > 400x10ь/л +3,3

4 УОПкусл.ед.< 0,270 усл.ед. +3,3

5 Средний диаметр клетки < 13,5 мкм +2,9

6 Эозинофильный индекс < 0,8 усл.ед. +2,4

7 Сре дняя площадь клетки <147 мкм7 +2,1

8 Индекс поляризации клетки <0,100 усл.ед. +1,9

9 Коэффициент выпуклости ядра <0,170 усл.ед. +1,6

10 ИОП < 690 усл.ед. +1,6

11 СЦКП <2,0 усл.ед +1,4

12 Индекс аллергизации >2,0 усл.ед. +1,3

13 СЦКкб <3,0 усл.ед. +1,2

14 Средняя площадь цитоплазмы < 95 мкм + 1,2

Применение предложенной таблицы риска развития висцеральной формы токсокароза у носителей специфических антител позволяет с высокой степенью достоверности предсказывать возможность развития заболевания для наиболее раннего выявления возможного варианта развития токсокароносительства и, следовательно, дальнейшего совершенствования лечебных и профилактических мероприятий. Выводы:

1. У токсокароносителей и больных висцеральной формой токсокароза в зависимости от уровня специфических антител к токсокарозу и возраста увеличивается абсолютное и относительное число эозинофилов, снижается эозинофильный индекс и повышается индекс аллергизации. Для детей при развитии висцеральной формы токсокароза характерно снижение количества эритроцитов и гемоглобина.

2. Токсокарозная инфекция активирует появление в периферической крови пула эозинофильных гранулоцитов с измененными геометрическими и оптическими характеристиками, проявляющихся микроци-тозом клеток, за счет уменьшения размеров цитоплазмы и снижение« интегрального индекса оптической плотности цитоплазмы эозинофила. У детей изменение геометрических показателей наступает при уровне специфических антител ниже 1:800.

3. Активация циркулирующего пула эозинофилов приводит к выделению из клеток повышенного количества пероксидазы и увеличению синтеза катионного белка. Снижение уровня пероксидазы и рост содержания лизосомальных катионных протеинов эозинофилов при токсока-роносительстве являются компенсаторной реакцией организма, направленной на выживание в системе паразит-хозяин. У детей, вследствие несформированного механизма иммунного ответа, дегрануляция эозинофилов проявляется в меньшей степени, чем у взрослых.

4. Метод атомно-силовой микроскопии выявляет особенности строения мембраны эозинофильных гранулоцитов в зависимости от оптической плотности. Снижение интегрального индекса оптической плотности и изменение цитохимического состава эозинофильных гранулоцитов сопровождаются повышением высоты профиля мембраны клетки. У токсокароносителей превалирует пул эозинофилов с перепадом высоты цитоплазмы до 0,6х10"9 м и ядра до 0,5-1,6х10"9 м. В группе больных висцеральной формой токсокароза перепад высоты цитоплазмы до 1,6х10"9м превышает высоту профиля ядра (0,5-1,2х109 м),

5. Повышение абсолютного и относительного количества эозинофилов со смещенными геометрическими (площадь клетки, ядерно-клеточное, ядерно-цитоплазматическое соотношения, индекс поляризации) и оптическими характеристиками (интегральный индекс оптической плотности, удельная оптическая плотность по красной Компоненте), являются наиболее значимыми доклиническими критериями риска развития висцеральной формы токсокароза у токсокароносителей.

Практические рекомендации. Предложенная таблица прогностических коэффициентов у токсокароносителей детей и взрослых, с учетом клинических проявлений заболевания, позволяет рекомендовать использование ее в специализированных учреждениях здравоохранения.

Применение предложенного способа морфо-функциональной оценки состояния эозинофильного пула приведет к раннему прогнозированию развития токсокароза у носителей специфических антител.

Разработанные клинико-лабораторные критерии способствуют дифференцированному подходу формирования групп риска при проведении профилактических мероприятий.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ишкова, Н.М. Клинико-лабораторная диагностика токсокароза в педиатрической практике / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова, О.И. Галимова // Ребенок, врач, лекарство : Материалы II междисциплинарного конгресса.-Спб., 2007. - С. 30.

2. Ишкова, Н.М. Особенности диагностики токсокароза / Н.М. Ишкова /./ Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сборник научных трудов. - Вып.З. - Ставрополь: Изд-во СевКавГТУ,

2007.-С. 159.

3. Ишкова, Н.М. Клиническая лабораторная диагностика токсокароза / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова // Справочник заведующего КДЛ. -

2008. - № 3. - С.37-40.

4. Ишкова, Н.М. Лабораторно-клинические ассоциации у лиц с титром антител к антигенам токсокар / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова // Клин. лаб. диагностика. - 2008. - №9. — С. 85.

5. Ишкова, Н.М. Лабораторно-эпидемиологические аспекты диагностики токсокароза у детей / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сборник научных трудов. -Вып.4. - Ставрополь: Изд-во СевКавГТУ, 2008. - С. 65.

6. Ишкова, Н.М. О диагностической значимости метода ИФА при токсокарозе / Т.Ф. Киселева, Н.М. Ишкова II Материалы IV научно-практической конференции Южного федерального округа с международным участием. — Анапа, 2009. - С. 90-91.

7. Ишкова, Н.М. Особенности наностроения поверхности мембран эозинофилов у пациентов с эозинофилией различного генеза / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: Сборник научных трудов. - Вып.5. - Ставрополь: Изд-во СевКавГТУ, 2.009. - С. 17-19.

8. Ишкова, Н.М. Наностроение поверхности мембран эозинофилов у пациентов с токсокарозом / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова,

Е.А. Мельченко // Вестник Ставропольского государственного университета. - 2009. - № 63 (4). - С. 223-227.

9. Ишкова, Н.М. Особенности наностроения поверхности мембран эозинофилов у пациентов с эозинофилией / Н.М. Ишкова, Т.П. Бондарь // Университетская наука - региону: Материалы 54 — й научной конференции. - Ставрополь, 2009. - С 8-9.

10. Ишкова, ИМ., Использование метода сканирующей зондовой микроскопии в оценке качества активности эозинофилов при токсокарозе / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова, О.И. Запарожцева // Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года: Труды научно-практической конференции. - М.: Изд-во Набора, 2009. — С. 187-188.

11. Ишкова, Н.М. Применение атомно-силовой микроскопии для исследования наноструктуры мембраны эозинофилов / Н.М. Ишкова // Материалы V ежегодной научной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр Южного научного центра РАН. - Ростов н/Д, 2009. - С. 19-20.

12. Ишкова, Н.М., Строение поверхности мембран эозинофилов у школьников с эозинофилией различного генеза / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова, Е.А. Мельченко // Инновационные технологии в биологии и медицине: Научные труды X Международного конгресса «Здоровье в XXI веке». - М.:Изд-во РУДН, 2009. - С. 956-957.

13. Ишкова, Н.М. Возможности компьютерной цитоморфомет-рии эозинофилов при эозинофилиях различного генеза / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова, О.И. Запарожцева Н Саратовский научно-медицинский журнал. -2010. - Т. 6. - № 1. - С. 108-111.

14. Ишкова, Н.М. Морфо-функциональное состояние эозинофилов у больных токсокарозом / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова, О.И. Запарожцева // Клин. лаб. диагностика. - 2010. - № 9. — С 53.

15. Ишкова, Н.М. Использование атомно-силовой микроскопии для изучения особенности архитектоники мембран эозинофилов в зависимости от цитохимического состава клеток у токсокароносителей и больных токсокарозом / Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова, Е.А. Мельченко, АД. Эль-канова // Вестник медицины Северного Кавказа.—2010. - №4. — С. 57-61

16. Ишкова, Н.М. Изменение количественных и качественных мор-фометрических показателей у больных токсокарозом / Н.М. Ишкова, Т.П. Бондарь, О.И. Запарожцева // Университетская наука - региону: Материалы 55-й научно-методической конференции. — Ставрополь, 2010.-С. 121-123.

17. Ишкова, Н.М. Об актуальности лабораторных исследований в диагностике токсокароза / Н.М. Ишкова // Материалы научно-практической конференции 14-й ежегодной Недели медицины Ставрополья: Сборник научных работ. - Ставрополь: Изд-во В.Л. Сыровец, 2010. - С. 64-66.

Список принятых сокращений Абс. Эо - абсолютное число эозинофилов АТ к АГт — антитела к антигенам токсокар ИОП- интегральная оптическая плотность КЦМЭо - компьютерная цитоморфометрия эозинофилов СЦКп - средний цитохимический коэффициент пероксидазы СЦКкб — средний цитохимический коэффициент катионных белков УОПк - удельная оптическая площадь по красной компоненте Эо% - относительное количество эозинофилов ЯЦС - ядерно-цитоплазматическое соотношение Ь мемб. - высота контура клетки Бк — площадь эозинофила вц —площадь цитоплазмы

Подписано в печать 8.11.10 Формат 60x84 Усл.печ.л. 1,00 Уч.-изд.л. 1,08

Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ 423

Отпечатано в Издательско-полиграфическом комплексе Ставропольского государственного университета. 355009, Ставрополь, ул.Пушкина, 1.

Актуальность темы

По данным крупномасштабных эпидемиологических исследований токсокароз является одним из распространенных тканевых гельминтозов. В различных странах заболевание поражает около 1,5% населения- от числа серопозитивных лиц (токсокароносителей) [68]. В связи с прогрессивным ростом численности собак, их безнадзорным содержанием, массивным заражением внешней среды инвазивным материалом, это стало серьезной проблемой для многих стран мира. Высокая зараженность почвы яйцами собачей аскариды, теплый влажный климат делает эту проблему актуальной для Северо-Кавказского ФО.

Считается- подтвержденным факт более частого заражения личинками токсокар детей, причем как в мировой, популяции, так и в Российской Федерации отмечается не только рост заболеваемости токсокарозом среди детей и взрослых, но и увеличение частоты тяжелых, трудно поддающихся терапии случаев, а также инвалидизирующих форм заболевания. С 1991г. (начало официальной регистрации в РФ) за счет совершенствования методов диагностики ежегодно увеличивается уровень заболеваемости этой инвазией. В Российской Федерации, в 2000 г. заболеваемость токсокарозом составила 0,8 на 100 тыс. населения и увеличилась в 2 раза, по сравнению с 1999 г. В 2006 году количество заболевших токсокарозом увеличилась на 61%, по сравнению с 2005 г. и составила 2,1 на 100 тыс. населения [128]. В СевероКавказском ФО в 2009 году заболеваемость токсокарозом, по сравнению с 2008 годом увеличилась на 30% и составила 1,9 на 100 тыс. населения. Заболеваемость токсокарозом значительно ухудшает качество жизни пациентов, их социальную, а нередко и трудовую адаптацию. Существенными являются финансовые затраты на продолжительное лечение токсокароза.

До настоящего времени проблема диагностики токсокароза не может считаться решенной в связи с большим количеством перекрестных иммунологических реакций, возникающих при проведении основного метода диагностики паразитозов - иммуноферментного анализа. Безусловно доказано, что одним из постоянных лабораторных показателей подтверждения развития токсокароза является стойкая эозинофилия. Возникающие в условиях развития токсокарозной инфекции изменения в субпопуляциях эозинофилов выражаются в комплексе нарушений, связанных с дегрануляцией и изменениями цитохимического состава клеток. В результате биохимических процессов, происходящих в эозинофиле, происходит преобразование цитоскелета клетки, ведущих за собой нарушение геометрических и интегральных показателей эозинофилов. Необходимо учитывать, что при обычных методах исследования невозможно оценить модификацию поверхностной архитектоники и оптических характеристик эозинофилов. В изученной нами литературе не имеется четких представлений об изменениях морфо-функциональной активности эозинофилов при токсокароносительстве. Благодаря значительному расширению методов лабораторных исследований и внедрению новых технологий в клинической практике появилась возможность детального изучения морфо-функциональных особенностей эозинофилов с помощью компьютерной цитоморфометрии и атомно-силовой микроскопии. Особый интерес представляет изучение структуры популяции эозинофильных гранулоцитов периферической крови у токсокароносителей, в зависимости .от титра специфических антител, что является немаловажным в разработке мероприятий по предотвращению риска развития клинического токсокароза у человека.

В соответствии с вышеизложенным, исследование количества и морфо-функциональных особенностей эозинофилов, их взаимосвязь с изменением архитектоники клеток имеет практический и теоретический интерес, что и определило цель и задачи исследования.

Цель исследования:

Изучение взаимосвязи морфо-функциональных характеристик эозинофилов и структурной организации цитомембраны эозинофилов у токсокароносителей, для оценки риска развития клинического токсокароза у носителей специфических антител.

Задачи исследования:

1. Изучить особенности клеточного состава периферической крови у пациентов с различным уровнем антител к антигенам токсокар.

2. Установить закономерности изменений геометрических и светооптических характеристик в субпопуляциях эозинофилов у токсокароносителей и больных висцеральной формой токсокароза.

3. Выявить особенности цитохимического состава эозинофилов в зависимости от уровня антител к антигенам токсокар.

4. Определить различия строения мембраны эозинофилов в зависимости от оптической плотности клеток у токсокароносителей и больных висцеральной формой токсокароза.

5. Выявить признаки риска развития клинического токсокароза у носителей специфических антител, на основании изменений^ морфо-функциональных характеристик и нарушении архитектоники мембраны эозинофилов.

Научная новизна

Впервые выявлены особенность изменения количества, морфологии эозинофилов в зависимости от титра специфических антител к токсокарозу у детей и взрослых.

В работе впервые показано, что компьютерная цитоморфометрия изображения эозинофилов может быть положена в основу оценки гетерогенности морфологических особенностей эозинофильных субпопуляций при токсокароносительстве и токсокарозе.

Доказана возможность применения атомно-силовой микроскопии в исследовании фиксированных эозинофилов. Впервые с помощью атомно-силовой микроскопии получены изображения плазматических мембран эозинофилов у лиц, имеющих в крови специфические антитела к токсокарозу, показаны характерные особенности ультраструктуры поверхности мембран в зависимости от цитохимического состава и оптических характеристик эозинофилов.

Изменение количественных геометрических, оптических и цитохимических характеристик эозинофилов могут использоваться как критерии риска развития токсокароза у носителей специфических антител. А

Практическая значимость

Полученные результаты расширяют современные представления о значении морфо-функционального состояния эозинофилов периферической крови в формировании противопаразитарного иммунитета при токсокарозе. Проведенное комплексное изучение структуры и функции эозинофилов с выделением признаков, характерных для различных субпопуляций эозинофилов создало предпосылки использования результатов в клинической практике.

На основании выявленных морфо-функциональных особенностей эозинофилов разработаны критерии риска развития клинического токсокароза у носителей специфических антител. Предложенные в работе методы и таблицы диагностических критериев целесообразно внедрить в практику здравоохранения для мониторинга риска развития токсокароза у серопозитивных к токсокарозу лиц в диспансерных группах наблюдения.

Положения, выносимые на защиту

1. У токсокароносителей и больных висцеральной формой токсокароза имеются изменения гематологических показателей (количества лейкоцитов, эритроцитов концентрации гемоглобина, эозинофильного индекса и индекса аллергизации), которые ярче выражены у детей.

2. Вариабельность геометрических и оптических характеристик эозинофилов, выявленных методом компьютерной цитоморфометрии, характеризуют напряжение механизмов микробицидности эозинофилов и более выражены у детей с высоким титром специфических антител к антигенам токсокар.

3. Системные нарушения структурно-функционального состояния эозинофилов зависят от цитохимического состава гранул эозинофилов. При токсокароносительстве в периферической крови превалирует пул эозинофилов с низким содержанием пероксидазы и повышенным содержанием катионных белков.

4. Атомно-силовая микроскопия выявляет различие поверхности мембраны эозинофилов при токсокароносительстве и висцеральной форме токсокароза. Дегрануляция и снижение оптической плотности клеток приводит к увеличению высоты профиля мембраны эозинофилов периферической крови.

5. Факторами риска развития висцеральной формы токсокароза у токсокароносителей являются повышение ядерно-цитоплазматического и ядерно-клеточного соотношения, изменение площади, высоты и оптических характеристик эозинофила.

Реализация результатов исследования

Внедрение полученных результатов в практику осуществляется следующими путями:

1. Основные результаты исследований, представленные в диссертации опубликованы в печатных работах, докладывались на международном и междисциплинарном конгрессах, научных и научно-практических конференциях по клинической лабораторной диагностике.

2. Результаты работы используются в диагностическом процессе клинико-диагностических лабораторий.

3. Результаты работы используются при обучении студентов специальности «Медицинская биохимия» и врачей-интернов по специальности" «Клиническая лабораторная диагностика» на кафедре физико-химических основ медицины, лабораторной диагностики и фармакологии Медико-биолого-химического факультета Ставропольского государственного университета (заведующий кафедрой профессор, д.м.н. Т.П. Бондарь).

4. По результатам исследования издано методическое пособие, рекомендованное Министерством здравоохранения Ставропольского края «Клиническая лабораторная диагностика: Лабораторная диагностика паразитарных инфекций (курс по выбору)» для студентов Медико-биолого-химического факультета1 по специальности* «Медицинская биохимия» и врачей-интернов по специальности «Клиническая лабораторная диагностика».

Апробация диссертации

Материалы работы докладывались и обсуждались на:

1. II Междисциплинарном конгрессе «Ребенок, врач, лекарство» (Санкт-Петербург, 2007).

2. IV Научно-практической конференции Южного Федерального Округа с международным участием (Анапа, 2009) ,

3. 54 Научно — практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2009).

4. V Ежегодной конференции студентов и аспирантов базовых кафедр южного научного центра РАН (Ростов-на Дону, 2009). г

5. X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2009).

6. Научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете Концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009).

7. 55 Научно - практической конференции «Университетская наука — региону» (Ставрополь, 2010).

8. Научно-практической конференции «Лабораторная наука -практике: первое десятилетие XXI века» (Москва, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 научных работ, из них 5 в рецензируемых журналах перечня ВАК РФ и методическое пособие для студентов медико-биолого-химического факультета по специальности «Медицинская биохимия» и врачей-интернов по специальности «Клиническая лабораторная диагностика», рекомендованное Министерством здравоохранения Ставропольского края.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав с изложением результатов исследования, заключения, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя, включающего 253 наименований (131 отечественных и 122 иностранных источника). Изложена на 161 страницы, содержит 31 таблицу и иллюстрирована 22 рисунками.

ВЫВОДЫ

1. У токсокароносителей и больных висцеральной формой токсокароза в зависимости от уровня специфических антител к токсокарозу и возраста увеличивается абсолютное и относительное число эозинофилов, снижается эозинофильный индекс и повышается индекс аллергизации. Для детей, при развитии висцеральной формы токсокароза характерно снижение количества эритроцитов и гемоглобина.

2. Токсокарозная инфекция активирует появление в периферической крови пула эозинофильных гранулоцитов с измененными геометрическими и оптическими характеристиками, проявляющихся микроцитозом клеток, за счет уменьшения размеров цитоплазмы и снижением интегрального индекса оптической плотности цитоплазмы эозинофила. У детей различие геометрических показателей наступает при уровне специфических антител ниже 1:800.

3. Активация циркулирующего пула эозинофилов приводит к выделению из клеток повышенного количества пероксидазы и увеличению синтеза катионного белка. Снижение уровня пероксидазы и, рост содержания лизосомальных. катионных протеинов эозинофилов при токсокароносительстве является компенсаторной реакцией организма, направленной на выживание в системе паразит-хозяин. У детей, вследствие несформированного механизма иммунного ответа, дегрануляция эозинофилов проявляется в меньшей степени, чем у взрослых.

4. Метод атомно-силовой микроскопии выявляет особенности строения мембраны эозинофильных гранулоцитов в зависимости от оптической плотности. Снижение интегрального индекса оптической плотности и изменение цитохимического состава эозинофильных гранулоцитов сопровождается повышением высоты профиля мембраны клетки. У токсокароносителей превалирует пул эозинофилов с перепадом высоты цитоплазмы до 0,6x10"9 м и ядра 0,5-1,6*10"9 м. В группе больных висцеральной формой токсокароза перепад высоты цитоплазмы до 1,6x10"9 м, превышает высоту профиля ядра (0,5-1,2x10"9 м).

5. Повышение абсолютного и относительного количества эозинофилов со смещенными геометрическими (площадь клетки, ядерно-клеточное, ядерно-цитоплазматическое соотношение, индекс поляризации), и оптическими характеристиками (интегральный индекс оптической плотности, удельная оптическая плотность по красной компоненте), являются наиболее значимыми доклиническими критериями риска развития висцеральной формы токсокароза у токсокароносителей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложенная таблица прогностических коэффициентов у токсокароносителей детей и взрослых, с учетом клинических проявлений заболевания позволяет рекомендовать использование в специализированных учреждениях здравоохранения.

Применение предложенного способа морфо-функциональной оценки состояния эозинофильного пула приведет к раннему прогнозированию развития токсокароносительства у носителей специфических антител.

Разработанные клинико-лабораторные критерии способствуют дифференцированному подходу формирования групп риска при проведении профилактических мероприятий.

137